Outline

Protein phosphorylation and receptor tyrosine kinase signaling Overview, protein kinases and phosphatases I.

Kinase

Ia.

Family A.

Ser/Thr:  intracellular, PKA, MAPK, CDK, PKC,  AMPK receptor, TGFbR, ActR

B.

Tyr:  intracellular, Src, Abl, oncogene, membrane  associated, nuclear Jak, ZAP70, receptor coupled Receptor, EGFR, IR, NGFR, EphR, growth,  metabolism, differentiation, axon guidance

C. Dual specific: MEK, Myt1, activating MAP kinase or  inhibition of CDC2 Ib.

Structure and sequence conservation

A

A.

Conserved ~300 residues

B.

Three dimensional structure 

1

Two domains, N­terminal small domain, β ­sheet; C­ terminal large domain, α­helix ATP binding pocket Activation loop

Ic.

Id.

Mechanisms of regulation A. Small molecules Ca++, DAG, cAMP, cGMP, AMP, PIP2 B.

Ligand, growth factor receptor, receptor coupled kinase

C.

Regulatory subunits, R and PKI for PKA, cyclin for  CDK

D.

Regulators, calmodulin for CamK, Ras for Raf, Cdc42  for PAK

E.

Regulatory domain, Raf, Pak

F.

Phosphorylation, activating, inhibitory

G.

Localization

H.

Example, CDK or PKA

Function, ~30% of cellular proteins are phosphorylation, in  every aspect of biology in eukaryotes, 518 kinases in human Activation/Inhibition 2

Localization Protein­protein interaction Stability II.

Ser/Thr phosphatase

IIa. Classification, PP1, PP2A, PP2B, PP2C (diverse subfamily)

IIb. Regulation, inhibitory subunit, PI Regulatory subunits, PP2A, A, B, C subunits Calcium, calmodulin, PP2B IIIc. Function, Not always negative, for example,  calcineurin/PP2B

III. Tyrosine phosphatase, IIIa. Family, receptor­like PTP, intracellular PTP, dual specific  PTP IIIb. Regulation, ligand, modification, localization, expression IIIc. Function, example SHP­1, CDC25, MKP­1

3

Analysis of phosphorylation I.

Phosphoamino acid analysis Phosphorylated protein Run SDS gel Transfer to Immobilon Hydrolyzed in HCl Electrophoresis on thin layer cellulose plate Stained with ninhydrin for standard Expose to X­ray film

II.

Phosphopeptide mapping Digest with protease, trypsin Run electrophoresis Run TLC Identify spot, which can be recovered and used for  sequencing

III. Determination of phosphorylation sites Sequence phosphopeptide  Site directed mutation coupled with phosphopeptide mapping Mass spectrometry

4

IV.

In vivo labeling with 32P­phosphate, immunoprecipitation,  mobility shift

V. In vitro phosphorylation,  phosphorylation by kinase,  dephosphorylation by phosphatase VI. Antibodies Anti­phosphotyrosine antibody Anti­phosphopeptide antibody, convenience for in vivo  experiments

5

Receptor tyrosine kinase signaling I.

Receptor tyrosine kinase structure and regulation

Ia.

Classification based on structure

Ib.

Receptor activation Ligand induced dimmerization, bivalent ligands Trans­autophosphorylation, activation of kinase activity

Ic.

Autophosphorylation and substrates A.

Autophosphorylation and recruiting of associated  molecules

B.

Phosphorylation of adaptor and docking proteins,  IRS1, FRS2, GAB, Dos, creating docking sites for  downstream signaling molecules C.

Id.

Phosphorylation of substrates PLC, Stat

Molecules implicated in RTK signaling A.

Enzymes, phospholipase C, Phosphatidyl inositol 3­ kinase, Src, SHP2

B.

Adaptor, Grb2, Shc

6

II.

C.

Docking protein, FRS2, IRS1, Dos

D.

Regulator, SOS, GAP, VAV

E.

Transcription factor, Stat

F.

Small GTPase, Ras 

Receptor associated molecules

IIa. Phospholipase Cγ Structure, SH2, SH3, catalytical domain Regulation, tyrosine phosphorylation Function, chemical reaction, products, IP3, DAG IP3  Ca2+ calmodulin  ion channel,  phosphodiesterase, Cam kinase, calcineurin, myosin light  chain kinase, adenylyl cyclase, PKC DAG  protein kinase C IIb. Phosphoinositide 3­kinase, PI3K Structure, regulatory subunit p85 containing SH2 and SH3  domains, catalytic subunit p110 Regulation, activation by physical association with tyrosine  phosphorylated receptor, activation by Ras, activation by the  SH3 domain of Src, recruit to membrane proximity 7

Function, chemical reaction, products, PI3P; PI3,4P2;  PI3,5P2, essential for mitogenic effect, anti­apoptosis  Downstream effectors,  PI3,4P2; PI3,5P2,  PH domain containing proteins, PDK,  AKT, Vav.  The PI3K  PDK AKT Bad, FKHR  pathway.  AKT  S6K (+), Glut­4 (+), GSK3 (­) PI3P  FYVE domain, many involved in intracellular vesicle  trafficking  IIc. Grb2 and Shc adapter molecules Association with tyrosine phosphorylated receptors Association with SOS, a guanine nucleotide exchange factor  (GEF) for Ras Activation of Ras IId. Other associated molecules, Src, GAP, SHP­2, Nck  IIe. Protein interaction domains, SH2, SH3, PDZ, WW, PH,  FYVE, PTB A.

SH2 domain

Structure, ~100 amino acid residues, three dimensional  structure Recognize phosphotyrosine with high affinity, also recognize  flanking sequences

8

Present in enzymes, Tyr kinase, PTP, phospholipase, GEF,  GAP, PI3K, transcription factor B.

SH3 domain

Structure, ~50 amino acid residues. Three dimensional  structure Recognize proline­rich sequence. PΦPpXP, left­handed  polyproline helix Present in many signaling proteins and cytoskeletal proteins C.

PH domain

Bind PIP2, PIP3, membrane translocation D. Phosphoserine/threonine recognition domains 14­3­3, WW, WD, FHA, PBD

III. Regulation of the Ras family small GTPases IIIa. Biochemical properties of Ras Guanine nucleotide binding, GTPase, conformational  changes, membrane association, interaction with downstream  molecules A.

The GTPase cycle,  9

Low GTPase activity, t1/2 1­5 hours Slow nucleotide exchange rate, t1/2 ~14 hours Largely in GDP form in the resting state

B.

Membrane association

Membrane association is essential for biological functions H­Ras C­terminal CMSCKCAAX Lipid modification, farnesylation, cleavage,  carboxymethylation, palmitoylation.

C.

Conformational change upon nucleotide binding

Effector domain (residue 32­40)

IIIb. Ras regulators A. GEF (guanine nucleotide exchange factor), SOS,  RasGRP Connection from RTK Grb2 (or Shc)  SOS  Ras Genetic evidence from Drosophila, yeast (Cdc25) Promote nucleotide release

10

E.

GAP (GTPase activating protein)

Stimulate GTPase activity, RasGAP. NF­1 Associated with receptor Could serve as a downstream effector

F.

GDI (GDP dissociate inhibitor), found for the Rho  family

IIIc. Ras effectors, Raf, PI3K, RalGDS, GAP, MEKK, PKC, AF­6,  Rin­1

A.

Raf Kinase activates the MAP kinase pathway Activated by growth factors Oncogene Genetic evidence functions downstream of Ras N­terminal Ras binding domain, RBD Activated by Ras

B.

 PI3K Associated with Ras and activated by Ras 11

C.

RalGDS Activated by Ras Regulate Ral activation

IIId. Biological function Growth promotion, neutralizing antibody or dominant negative  blocks cell proliferation Oncogenic transformation, 30­40% human cancers contains  activated Ras mutation Differentiation, in PC 12 cells Development, knock out is early lethal, mutation in Drosophila and  C. elegans Immune response Mating in S. pombe, nutrient response in S. cerevisiae

IV. The MAP kinase pathway IVa. Biochemical mechanisms of MAP kinase activation,  phosphorylation and dephosphorylation Raf  MEK  ERK Phosphorylation of TXY motif

12

Dephosphorylation by PTP and MKP Nuclear translocation IVb. The MAP kinase module, kinase cascade, conservation in  eukaryotes The JNK pathway The p38 pathway IVc. Genetic evidence for the Ras­MAP kinase pathway,  Drosophila and C. elegans Pathways Genetics IVd. Function, cell proliferation, differentiation, stress response,  transcription regulation Substrates of MAPK, Elk­1, EGFR, SOS, MAPKAPK, PLA V.

MAP kinase pathways in yeast 

Va. Distinct MAP kinase pathways in yeast A. The pheromone response pathway, FUS3, a MAPK  coupled to trimeric G­protein B. High osmolarity response, the HOG1 pathway coupled  to a eukaryotic two component system, histidne kinase

13

C.

Filamentous growth, KSS1, a unique differentiation  pathway

D.

Hypotonic response, MPK1, similar to mammalian PKC

E.

Sporulation SMK1, required for spore maturation

Vb. Specificity of MAP kinase pathway Biochemical level, specificity of kinase kinase Organizational level, scaffold protein, Ste5, Pbs2 Vc. Scaffold proteins Ste5, JIP, MP1, SUR­8 Vd. Inactivation by phosphatases Dual specificity phosphatase PTP VI. Cell growth and cell size control VIa. The AKT pathway and cell size regulation PI3K, PDK1, PTEN, AKT, mTOR, S6K VIb. The mTOR pathway

14

TSC1/TSC2. Rheb, mTOR, Raptor, GβL, S6K, 4EBP1 MTOR regulation and substrate selection, TOS motif VIc. Translation control and cell growth regulation Translation initiation, elongation Growth factors, nutrients, cellular energy levels VId. Cell growth and coordination with energy level Structure and regulation of AMPK AMPK function, substrates VIe. Cell growth regulation and diseases Cancer/tumor, Peutz­Jeghers syndrome, tuberous sclerosis Hypertrophy, Wolff­Parkison­White syndrome VII. The Rho family small GTPase VIIa. Rho family members, Rho, Rac, Cdc42 VIIb. Downstream effectors Rho effectors, PIP5K, PKN, Rho kinase Rac and Cdc42 effectors, PAK, PI3K, WASP, ACK, PIP5K Activation of PAK by Cdc42 VIIc. Function, regulation of cytoskeletal structure and cell  morphology, axon guidance Stress fiber, filopodia, lamellipodia, cell motility 15

16

References Chapter 15, Molecular Biology of the Cell, 4th edition, by Alberts  et al Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell,  Vol. 103, 211–225, October, 2000  Bar­Sagi, D. and Hall, A. Ras and Rho GTPases: A Family  Reunion. Cell, Vol. 103, 227–238, 2000 Davis, R.J. Signal Transduction by the JNK Group of MAP  Kinases. Cell, 103, 239–252, 2000 Shamji et al. Integration of growth factor and nutrient signaling:  implication for cancer biology.  Mol. Cell 12, 271­280, 2003

17