Microsatellites For Ecologists Es.docx

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Ecology Letters, (2006) 9:615–629

doi: 10.1111/j.1461-0248.2006.00889.x

REVISIONES A ND SÍNTESIS

Microsatélites para ecologistas: una guía práctica de utilización y evaluación de marcadores de microsatélites Resumen Kimberly A. Selkoe1,2* y Robert J. Toonen2 1Departamento de Ecología, Evolution and Marine Biology, University of California, Santa Barbara, CA 93106, USA 2University

of Hawai'i at Manoa, School of Ocean & Earth Science & Technology, Hawai'i Institute of Marine Biology, Coconut Island, PO Box 1346, Kane'ohe, Hawai'i 96744 *Correspondencia: Correo electrónico: [email protected]

Las recientes mejoras en el análisis genético y los métodos de genotipado han dado lugar a una rápida expansión del poder de los marcadores moleculares para abordar cuestiones ecológicas. Los microsatélites han surgido como el tipo de marcador más popular y versátil para aplicaciones ecológicas. El aumento de los servicios comerciales que pueden aislar microsatélites para nuevas especies de estudio y muestras de genotipos a precios razonables ofrece a los ecologistas la capacidad sin precedentes de emplear enfoques genéticos sin grandes inversiones en equipo especializado. Sin embargo, la falta de información accesible y sintetizada sobre los aspectos prácticos y los riesgos de la utilización de herramientas genéticas impide a los ecologistas tomar decisiones informadas sobre la utilización de enfoques moleculares y crea el riesgo de que algunos utilicen microsatélites sin comprender los pasos necesarios para evaluar la calidad de un conjunto de datos genéticos. El primer objetivo de esta síntesis es proporcionar una visión general de los puntos fuertes y las limitaciones de los marcadores de microsatélites, así como de los riesgos, los costes y los plazos de aislamiento y utilización de los microsatélites con la ayuda de los servicios comerciales. El segundo objetivo es fomentar el uso y la presentación de informes coherentes de un cribado exhaustivo de los marcadores para garantizar unos datos de alta calidad. Para ello, presentamos un proceso de selección de varios pasos para evaluar los loci candidatos para su inclusión en un estudio genético que está ampliamente dirigido tanto a genetistas principiantes como a genetistas experimentados por igual. Palabras clave

Homoplastia, acoplamiento, aislamiento de marcadores, herencia mendeliana, microsatélites, ecología molecular, neutralidad, alelos nulos, genética de poblaciones, repeticiones de secuencias simples. Cartas ecológicas (2006) 9: 615-629

IN T R OD U C TI ÓN

En la última década, los enfoques genéticos para responder a las preguntas ecológicas se han vuelto más eficientes, poderosos y flexibles, y por lo tanto más extendidos. Los marcadores genéticos como las alozimas, los microsatélites y las secuencias de ADN mitocondrial y nuclear pueden utilizarse para estimar muchos parámetros de interés para los ecologistas, como las tasas de migración, el tamaño de la población, los cuellos de botella, el parentesco y otros

(véase el Cuadro 1). Los microsatélites han surgido como una de las opciones más populares para estos estudios, en parte porque tienen el potencial de proporcionar estimaciones contemporáneas de la migración, tienen el poder de resolución para distinguir tasas relativamente altas de migración de la panmixia y pueden estimar la relación de los individuos. Varias revisiones recientes detallan la miríada de técnicas de análisis genético ahora disponibles y las cuestiones ecológicas que pueden abordar (Bossart & Prowell 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

1998; Cruzan 1998; Davies et al. 1999; Luikart & England 1999; Shoemaker et al. 1999; Sunnucks 2000; Manel et al. 2003, 2005; Beaumont & Rannala 2004; Pearse & Crandall 2004). Estas revisiones animan a los ecologistas a utilizar enfoques genéticos, pero todavía no hay textos o manuales publicados que guíen a los recién llegados en la parte más práctica de la adopción y aplicación de estas técnicas. Esta síntesis pretende ser una pieza complementaria a estas revisiones para ayudar a aplanar la curva de aprendizaje de la genética aplicada a las poblaciones. Sin embargo, aquellos que intentan usar microsatélites por primera vez necesitarán también leer muchos de los documentos más técnicos citados aquí y buscar la orientación de un genetista de poblaciones experimentado. Hay dos factores distintos que contribuyen a los recientes avances técnicos de la ecología molecular. En primer lugar, las técnicas de laboratorio se han racionalizado y son menos costosas, lo que permite el uso de un gran número de muestras y muchos loci. En segundo lugar, las mejoras en la tecnología informática

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Tabla 1 Breve resumen de algunas cuestiones ecológicas que pueden abordarse utilizando marcadores genéticos neutros, ordenados por tipo

de datos requeridos Requiere datos de frecuencia de alelos multilocales* ¿De qué población se originaron estos individuos? ¿Cuántas poblaciones hay? Requiere una secuencia altamente polimórfica o microsatélite data† ¿Se expandió o contrajo la población en el pasado reciente? ¿Las poblaciones difieren en tamaño pasado y presente ? Requiere genotipo multilocus identification‡ ¿Cuáles son las relaciones genéticas de los individuos? ¿Qué personas se han mudado? (es decir, marcar/recapturar marcas naturales) ¿Qué individuos son clones? Funciona con muchos marcadores types† ¿Cuál es la distancia media de dispersión de la descendencia (o gametos)? ¿Cuáles son las relaciones fuente-fregadero entre las poblaciones? ¿Cómo afectan las características del paisaje a la estructura de la población y a la migración? ¿Cuál es la dinámica de extinción/recolonización de la metapoblación? ¿Cambió la estructura o conectividad de la población en el pasado reciente ? Ver Pearse & Crandall (2004) y otras referencias en el texto para más detalles. *Estos análisis podrían requerir >10 microsatélites - el número está inversamente correlacionado con el grado de diferenciación genética entre las poblaciones. Las especies con bajas tasas de migración y/o poblaciones pequeñas requerirán menos loci. †Using >1 locus atenuará sustancialmente el error de muestreo del interlocus. ‡Often requiere microsatélites, pero también es posible con técnicas de huellas dactilares de AFLP y RAPD - ver Sunnucks 2000 para la comparación de marcadores. RAPD, ADN polimórfico amplificado aleatoriamente; AFLP, polimorfismo de longitud de fragmento amplificado.

han inspirado el uso de enfoques estadísticos intensivos tales como la teoría de la probabilidad bayesiana y la simulación de la cadena de Monte Carlo Markov. Estas nuevas aprobaciones utilizan más información en un conjunto de datos que las estadísticas resumidas de los enfoques tradicionales (por ejemplo, FST, una medida de las diferencias de frecuencia de alelos entre poblaciones), y porque el conjunto de datos típico hoy en día contiene 102103

cualquier especie, y muchas otras empresas e instalaciones universitarias centralizadas que extraerán y genotiparán ADN de una colección de muestras de tejido y enviarán un conjunto completo de datos en cuestión de semanas por un precio razonable. Estos servicios y sus costos relativamente bajos son el resultado directo del uso ubicuo del aislamiento de marcadores y el genotipado en las ciencias médicas para aplicaciones tales como el mapeo de la vinculación de enfermedades.

de los individuos muestreados en muchos loci, hay más poder para describir la demografía y la historia de las poblaciones y las relaciones de los individuos de una manera detallada. Estos avances permiten que muchas cuestiones ecológicas básicas sean abordadas con herramientas genéticas por primera vez o de nuevas maneras (Tabla 1). En los últimos 5-10 años, se han desarrollado docenas de programas de software que utilizan las herramientas estadísticas mencionadas anteriormente para abordar estas líneas de interrogatorio (ver Pearse & Crandall 2 0 0 4 ). Muchos ecologistas aún no son conscientes de que, en muchos casos, el uso de herramientas genéticas ya no requiere inversiones en equipos costosos y en técnicas de laboratorio. Ahora hay servicios comerciales que desarrollarán nuevos marcadores para prácticamente 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

Con el fin de facilitar el uso exitoso de los microsatélites por parte de los recién llegados a la ecología molecular, nuestro primer objetivo en esta síntesis es proporcionar una visión general de los pros y contras del empleo de los microsatélites. Aunque el aislamiento con marcadores de microsatélites sigue siendo problemático en algunos taxones, el nuevo aislamiento con marcadores y el genotipado se ha convertido en una práctica habitual en una amplia gama de taxones (incluidos la mayoría de los vertebrados, muchos insectos y algunas plantas), lo que permite su uso sin necesidad de un laboratorio propio. Nuestro segundo objetivo es esbozar el proceso de llevar a cabo el aislamiento de nuevos marcadores de microsatélites y sus costes asociados, con el fin de proporcionar a los ecologistas y a los recién llegados a la genética de poblaciones la información necesaria para decidir si invierten en el uso de herramientas genéticas. Nuestro tercer objetivo es fomentar la realización de pruebas de calidad de los conjuntos de datos genéticos mediante la presentación de un protocolo de selección de microsatélites de seis etapas. Un recién llegado al campo es especialmente vulnerable a omitir uno o más de estos pasos importantes porque no se ha establecido un protocolo formal en la literatura. Es importante destacar que esperamos que nuestro protocolo de evaluación anime a todos los eco-genéticos, principiantes y experimentados, a adoptar un informe más consistente y completo de estos importantes pasos.

PARTE I: EVALUACIÓN DE LOS M ICROSATÉLITES

¿Qué son los microsatélites?

Los microsatélites son repeticiones en tándem de 1-6 nucleótidos que se encuentran a alta frecuencia en los genomas nucleares de la mayoría de los taxones. Como

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También se conocen como repeticiones secuenciales simples (SSR), repeticiones tándem de número variable (VNTR) y repeticiones tándem cortas (STR). Como resultado del uso generalizado de microsatélites, nuestra comprensión de su comportamiento mutacional - violeta, función, evolución y distribución en el genoma y entre taxones - está aumentando rápidamente (Li et al. 2002; Ellegren 2004). Un locus de microsatélites suele tener una longitud de entre 5 y 40 repeticiones, pero es posible que se produzcan secuencias de repeticiones más largas. Las repeticiones de dinucleótidos, trinucleótidos y tetranucleótidos son las opciones más comunes para los estudios de genética molecular. Las repeticiones de dinucleótidos representan la mayoría de los microsatélites de muchas especies (Li et al. 2002). Las repeticiones de trinucleótidos y hexanucleótidos son las clases de repetición más probables que aparecen en las regiones de codificación porque no causan un desplazamiento de fotogramas (Toth et al. 2000). Las repeticiones de mononucleótidos son menos confiables debido a los problemas con la amplificación; los tipos de repeticiones más largas son menos comunes, y existen menos datos para examinar su evolución (Li et al. 2002). El ADN que rodea al locus de un microsatélite se denomina región de flanqueo. Dado que las secuencias de las regiones adyacentes se conservan generalmente (es decir, son idénticas) en individuos de la misma especie y, a veces, de especies diferentes, un locus microsatélite determinado puede identificarse a menudo por sus secuencias adyacentes. Se pueden diseñar pequeñas extensiones de ADN, llamadas oligonucleótidos o primers, para que se unan a la región lateral y guíen la amplificación de un locus microsatélite con reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Un par específico de cebadores PCR es el producto tangible del aislamiento de marcadores de microsatélites (elaborado más adelante; véase el Apéndice S1 en Material de Suplemento). La amplia disponibilidad de oligonucleótidos de los servicios comerciales hace que sea sencillo pedir cualquier secuencia de imprimación no etiquetada y que se la entreguen dentro de los plazos establecidos. días por £ 20 USD (se necesitan imprimaciones etiquetadas fluorescentemente para en un secuenciador de ADN son actualmente ‡ USD 80). A diferencia de las regiones laterales, las secuencias de repetición microsatélites mutan con frecuencia por errores de deslizamiento y de corrección durante la replicación del ADN que cambian principalmente el número de repeticiones y, por lo tanto, la longitud de la cadena de repetición (Eisen 1999). Debido a que los alelos difieren en longitud, pueden distinguirse por la electroforesis en gel de alta resolución, que permite un genotipado rápido de muchos individuos en muchos loci por una fracción del precio de la secuenciación del ADN. Muchos microsatélites tienen una alta mutación

(entre 10)2 y 10)6 mutaciones por locus por y en promedio 5 - 10)4) que generan los altos niveles de diversidad alélica necesarios para los estudios genéticos de procesos que actúan en escalas de tiempo ecológicas (Schlo¨tterer 2000). ¿Por qué elegir microsatélites?

Existen varios tipos de marcadores ampliamente utilizados en los estudios de ecología molecular, y muchas preguntas pueden ser respondidas con más de un tipo de marcador (Tabla 1). Se ofrece una revisión exhaustiva de los diferentes tipos de marcadores.

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ded en otros lugares (Avise 1994; Sunnucks 2000; Zhang & Hewitt 2003; Schlo¨tterer 2004) y está fuera del alcance de este estudio. Los microsatélites son de particular interés para los ecologistas porque son uno de los pocos marcadores moleculares que permiten a los investigadores comprender las cuestiones ecológicas a gran escala. Imagínese, por ejemplo, un ecologista de plantas estudiando el tiempo de floración. Utilizando marcadores de microsatélites, nuestro investigador pudo responder a una variedad de preguntas interesantes, como por ejemplo: ¿Son los individuos o poblaciones que florecen temprano genéticamente distintos de los que florecen tarde? ¿Tienden los inmigrantes a florecer en sintonía con sus vecinos o con su población natal? ¿Existe una relación entre las medidas de aptitud (tiempo de floración, número de flores, conjunto de semillas, etc.) y la identidad genotípica? ¿Los mejores resultados (en términos de esas medidas de aptitud física) en un año en particular son parientes? Independientemente de la pregunta, un marcador molecular debe ser fundamentalmente neutro y seguir la herencia mendeliana para ser utilizado como herramienta para detectar patrones demográficos, y estos rasgos deben ser siempre confirmados para cualquier tipo de marcador (ver Parte III: A Protocolo de Cribado de Microsatélites). A continuación se describen los rasgos deseables de los microsatélites en comparación con otros tipos de marcadores como las alozimas, los polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), los loci secuenciados y los polimorfismos nucleares simples (SNP), centrados tanto en aspectos prácticos como en consideraciones ecológicas. Fácil preparación de muestras Un marcador ideal permite el uso de pequeñas muestras de tejido que se conservan fácilmente para su uso futuro. A diferencia de los métodos alogénicos, las técnicas basadas en el ADN, como los microsatélites, utilizan la PCR para amplificar el marcador de interés a partir de una muestra de tejido diminuta. La estabilidad del ADN en comparación con las enzimas permite el uso de conservantes de tejidos simples (como el 95% de etanol) para el almacenamiento. Además, debido a que las élites de microsatélites son generalmente más cortas en longitud que los loci secuenciados (100- 300 vs. 500-1500 pb), pueden ser amplificadas con PCR a pesar de cierta degradación del ADN (Taberlet et al. 1999). A medida que el ADN se degrada, se rompe en trozos más pequeños y la posibilidad de amplificar con éxito un segmento largo es proporcional a su longitud (Frantzen et al. 1998). Este rasgo permite que las élites de microsatélites se utilicen con métodos de extracción de ADN rápidos y baratos, con ADN antiguo, o ADN de muestras de pelo y heces utilizadas en muestras no invasivas (Taberlet et al. 1999). Además, debido a que los microsatélites son específicos para cada especie, la contaminación cruzada por organismos no objetivo es mucho menos problemática en 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

comparación con las técnicas que emplean cebadores universales (es decir, cebadores que amplifican el ADN de cualquier especie), como el AFLP. Esta característica es de particular importancia cuando se trabaja con muestras fecales o especies, como los corales escleractínidos, en los que la con-aminación endosimbiontes es prácticamente inevitable.

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Alto contenido de información Cada locus de marcadores puede considerarse una muestra del genoma. Debido a la recombinación, selección y deriva genética, diferentes genes y diferentes regiones del genoma tienen historias genealógicas ligeramente diferentes. Confiar en un solo lugar para estimar los rasgos ecológicos a partir de los datos genéticos crea una alta tasa de error de muestreo. Por lo tanto, tomar múltiples muestras del genoma combinando los resultados de muchos loci proporciona una forma más precisa y estadísticamente poderosa de comparar poblaciones e individuos. Además, los enfoques estacionales de las cuestiones de mayor interés para los ecologistas a menudo requieren múltiples loci comparables (ver Tabla 1 y Pearse & Crandall 2004). Aunque el AFLP, las alozimas y las técnicas de ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) también son multilocus, ninguno de ellos tiene la resolución y el poder de un estudio microsatélite multilocus (pero por razones distintas; ver Sunnucks 2000). Mientras que los marcadores AFLP pueden ser una buena alternativa a los microsatélites (Bensch & Akesson 2005). Gerber et al (2000) mostraron que 159 loci de AFLP proporcionaron un poder ligeramente menor para determinar la paternidad que seis marcadores microsatélites polimórficos. La tecnología de secuenciación ha avanzado rápidamente, pero su coste sigue prohibiendo la duplicación o triplicación de la carga de trabajo mediante el uso de múltiples secuencias de genes independientes en paralelo (Zhang & Hewitt 2003). Los marcadores de SNP son muy prometedores para estudios futuros, pero su uso en organismos no modelo es todavía incipiente (Morin et al. 2004). Los microsatélites se han vuelto tan populares porque son marcadores de locus único y codominantes, por lo que muchos loci pueden combinarse eficazmente en el proceso de genotipado para proporcionar un muestreo replicado del genoma rápido y económico. Los marcadores de microsatélites generalmente tienen altas tasas de mutación, lo que resulta en una alta diversidad alélica. En especies para las que las poblaciones son pequeñas o que han sufrido un cuello de botella recientemente, los marcadores con tasas de mutación más bajas, como las alozimas, pueden ser en gran medida invariables y es probable que sólo los loci con las tasas de mutación más altas sean informativos (Hedrick 1999). Un proceso mutacional lento permite que la firma de eventos en el pasado lejano persista por más tiempo. Por lo tanto, la selección de los loci con alta o baja diversidad alélica dependerá de la cuestión de interés. Por ejemplo, si uno está interesado en una barrera histórica potencial para el flujo de genes o en rastrear la recolonización del territorio desde la última edad de hielo, es probable que los marcadores con tasas de mutación más bajas sean los más informativos. En contraste, si uno está interesado en la demografía actual o en los patrones de conectividad, o en detectar cambios en el pasado reciente (10-100 generaciones), los microsatélites

con tasas mutacionales más altas son preferibles. Las cuestiones de paternidad o de estructura clonal se abordan mejor utilizando microsatélites con la mayor diversidad alélica, que pueden proporcionar a cada individuo un genotipo único 'etiqueta de identificación' utilizando sólo unos pocos loci (Queller et al. 1993). Del mismo modo, para los estudios de la estructura de la población y la migración que emplean alelos de población

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los numerosos alelos de los microsatélites de alta diversidad actúan como réplicas estadísticas para dar más poder para distinguir poblaciones (Kalinowski 2002; Wilson & Rannala 2003). ¿Cuáles son los inconvenientes de los marcadores de microsatélites?

A pesar de sus muchas ventajas, los marcadores de microsatélites también tienen varios desafíos y trampas que, en el mejor de los casos, complican el análisis de los datos y, en el peor, limitan en gran medida su utilidad y confunden su análisis. Sin embargo, todos los tipos de marcadores tienen algunos inconvenientes, y la versatilidad de los microsatélites para abordar muchos tipos de cuestiones ecológicas supera sus inconvenientes para muchas aplicaciones. Afortunadamente, muchas de las trampas comunes a los marcadores de microsatélites pueden evitarse mediante una cuidadosa selección de loci durante el proceso de aislamiento . Aislamiento de marcadores específicos de cada especie El análisis de marcadores basado en la PCR requiere secuencias de primer que apuntan a las regiones marcadoras para su amplificación. Para utilizar la misma secuencia de cebado para amplificar el mismo objetivo de muchos individuos, la región donde el cebado se une debe ser idéntica, con pocas o ninguna mutación que cause diferencias interindividuales. Para las regiones genéticas comúnmente utilizadas como marcadores secuenciales, las regiones de cebado están altamente conservadas, de tal manera que son invariables dentro de las especies y a veces incluso a través de amplios grupos taxonómicos. Esta conservación de la secuencia requiere sólo un trabajo menor para optimizar un juego de cebadores para una nueva especie. En contraste, un par dado de primers de microsatélites rara vez funciona en grupos taxonómicos amplios, por lo que los primers se desarrollan de nuevo para cada especie (Glenn & Schable 2005). Sin embargo, el proceso de aislamiento de nuevos marcadores microsatélites se ha vuelto más rápido y menos costoso, lo que reduce sustancialmente la tasa de fallos y/o el coste del aislamiento de nuevos marcadores en muchos casos (Glenn & Schable 2005). Además, muchos laboratorios comerciales y académicos pueden proporcionar un conjunto de loci microsatélites polimórficos para una nueva especie a un coste razonable en 3-6 meses (véase la Parte II: Adquisición de microsatélites). Sin embargo, hay algunos taxones para los cuales el nuevo aislamiento de marcadores todavía está plagado de una tasa de fracaso considerable, como algunos invertebrados marinos (por ejemplo, Cruz et al. 2005), lepidópteros (Meglecz et al. 2004) y aves (Primmer et al. 1997). Mecanismos mutacionales poco claros Uno de los retos a los que se enfrentan actualmente los genetistas es que los procesos mutacionales de los 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

microsatélites pueden ser complejos (Schlo¨tterer 2000; Beck et al. 2003; Ellegren 2004). Para la mayoría de las aplicaciones ecológicas, no es importante conocer el mecanismo mutacional exacto de cada locus, ya que los análisis más relevantes son insensibles al mecanismo mutacional (Neigel 1997). Sin embargo, varias estadísticas basadas en estimaciones de las frecuencias de los alelos (por ejemplo, FST y RST) se basan en

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explícitamente en un modelo de mutación. Tradicionalmente, el modelo de alelo infinito (IAM), en el que cada evento de mutación crea un nuevo alelo (cuyo tamaño es independiente del alelo progenitor) ha sido el modelo de elección para el análisis genético de la población, y debido a que es el modelo más simple y general, sigue siendo ampliamente utilizado por defecto. Un modelo específico para microsatélites, el modelo mutacional escalonado (SMM), añade o resta una o más unidades de repetición de la cadena de repeticiones a un ritmo constante para imitar el proceso de errores durante la replicación del ADN que genera mutaciones, creando una distribución de frecuencia de alelos en forma gaussiana (Ellegren 2004). Sin embargo, también se sabe que ocurren procesos de mutación no escalonados, incluyendo mutaciones puntuales y eventos de recombinación como el cruce desigual y la conversión de genes (Richard & Paques 2000). Mientras continúa el debate sobre la prevalencia de la mutación no escalonada para los microsatélites, el consenso actual es que la frecuencia y los efectos son generalmente bajos, y la mutación escalonada parece ser la fuerza dominante que crea nuevos alelos en los pocos organismos modelo estudiados hasta la fecha (Eisen 1999; Ellegren 2004). Sin embargo, las métricas que emplean el SMM tienden a ser muy sensibles a las violaciones de este modelo mutacional (por ejemplo, los loci con mutaciones no escalonadas o limitaciones en el tamaño de los alelos) y, por lo tanto, las métricas que utilizan el IAM suelen ser más robustas y fiables (Ruzzante 1998; Balloux y Lugon-Moulin 2002; Landry et al. 2002). Los modelos mutacionales más complejos y realistas que añaden la probabilidad de mutación no gradual al SMM están empezando a sustituir al SMM en los análisis genéticos comunes, y ya están disponibles en varios paquetes estadísticos (por ejemplo, Piry et al. 1999; Van Oosterhout et al . 2004).

tamaño de un alelo sin cambios, y las inserciones o supresiones en la región de los flancos podrían crear un nuevo alelo con el mismo tamaño que un alelo existente. La homoplastia detectable parece afectar sólo una fracción de los genotipos en una fracción de los loci, y este sesgo parece ser marginal en la mayoría de los casos (Viard et al. 1998; Adams et al. 2004; Curtu et al. 2004).

Diversidad alélica oculta La identificación de alelos basada en el tamaño (es decir, electroforesis en gel - véase el Apéndice S2 en el Material Complementario) reduce en gran medida el tiempo y los gastos del genotipado de microsatélites en comparación con la secuenciación de cada alelo en cada individuo. Sin embargo, este atajo requiere la suposición de que todos los alelos difieren en longitud. De hecho, los alelos del mismo tamaño pero de diferentes linajes pueden ser bastante comunes, un fenómeno llamado"homoplastia". La homoplastia amortigua la diversidad alélica visible de las poblaciones y puede inflar las estimaciones del flujo genético cuando la tasa de mutación es alta (Garza & Freimer 1996; Rousset 1996; Viard et al. 1998; Blankenship et al. 2002; Epperson 2005). Hay dos tipos distintos de homoplastia, `detectable' e `indetectable'. La homoplastia detectable puede revelarse mediante la secuenciación de alelos. Por ejemplo, las mutaciones puntuales dejarán el 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

Adams et al (2004) encontraron que la homoplastia sólo era común para las repeticiones compuestas y/o interrumpidas. Las estimaciones empíricas de la homoplastia detectable informaron sólo una ligera subestimación (1-2%) de la diferenciación genética (Adams et al. 2004; Curtu et al. 2004). La homoplastia indetectable ocurre cuando dos alelos son idénticos en secuencia pero no por descendencia (es decir, tienen historias genealógicas diferentes). Esta falta de identidad se produce por el comportamiento aleatorio del proceso de mutación por pasos cuando hay una "retromutación" a un tamaño previamente existente (por ejemplo, un alelo muta de 5 a 6 repeticiones y luego una copia de este alelo muta de 6 a 5 repeticiones) o cuando dos alelos no relacionados convergen en secuencia cambiando el número de repeticiones en dos lugares diferentes de la secuencia. Como el SMM predice un 50% de probabilidad de retro-mutación, la homoplastia indetectable puede ser extensa cuando la tasa de mutación es alta, pero puede ser considerada en los análisis (Slatkin 1995; Estoup & Cornuet 1999). En general, la homoplastia es a menudo una fuente mínima de sesgo para los estudios de genética poblacional limitados a poblaciones con un historial"poco profundo" o con un tamaño de población efectiva moderado, ya que la probabilidad de una homoplasia es proporcional a la distancia genética de dos individuos o poblaciones (Estoup et al. 2002). Sin embargo, cuando se utiliza para grupos muy divergentes, como para la reconstrucción filogenética, los loci de alta tasa de mutación pueden ser problemáticos (Estoup et al. 1995). Es importante tener en cuenta que la homoplastia no detectada afecta a todos los tipos de marcadores. Cuando sea apropiado, hay varios métodos que pueden emplearse para evaluar la homoplastia detectable (ver Parte III: Un Protocolo de Cribado de Microsatélites). Problemas con la amplificación Para encontrar un locus útil de marcadores de ADN es necesario identificar una región del genoma con una tasa de mutación lo suficientemente alta como para que existan múltiples versiones (alelos) en una población determinada, y que también se encuentre adyacente a un tramo de ADN de baja tasa de mutación que se unirá a los primers de la RCP en la gran mayoría (casi el 100%) de los individuos de la especie. Si las mutaciones ocurren en la región del primer, algunos individuos tendrán sólo un alelo amplificado, o fallarán en amplificar en absoluto (Paetkau & Strobeck 1995). Además, los cebadores deben unirse bajo condiciones de PCR repetibles para que el genotipado pueda realizarse en serie, por diferentes trabajadores y por diferentes laboratorios. La amplificación consistente a través de todas las muestras sólo puede ser asegurada por ensayo y error, de tal manera que en la mitad o al final del genotipado de todas las muestras en un estudio, algunos loci tendrán que ser descartados debido a problemas de amplificación. Si se 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

planea este desgaste de los marcadores en el aislamiento inicial de los marcadores de microsatélites, la probabilidad de que los problemas de amplificación arruinen un estudio es mínima. Sin embargo, varios taxones parecen estar más afectados por problemas de amplificación que otros, en particular, los bivalvos, los corales y algunos otros taxones invertebrados (por ejemplo, Hedgecock et al. 2004). Una baja tasa de alelos nulos

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puede tener un impacto insignificante en muchos tipos de análisis, aunque para algunos tipos de análisis de parentesco puede ser sustancial (Dakin & Avise 2004).

PARTE I I I : UN MICROSATÉLITE CURIOSO

Paso 1: Búsqueda existentes

de

marcadores

microsatélites

La tasa de éxito de los cebadores puede disminuir proporcionalmente a la distancia genética entre la especie focal y la especie de origen (Primmer et al. 1996; Wright et al. 2004). Además, la diversidad alélica a menudo disminuye cuando los cebadores se utilizan en especies que no son fuente (Primmer et al. 1996; Ellegren et al. 1997; Neff & Gross 2001; Wright et al. 2004), un tipo de"sesgo de determinación" que puede ser explicado si es necesario (Petit et al. 2005). En general,

El primer paso para considerar un estudio de marcadores de microsatélites es buscar en la literatura publicada cualquier primers de microsatélites existente para la especie objetivo y especies estrechamente relacionadas. La disponibilidad de marcadores de microsatélites para una especie determinada será una combinación del interés pasado en esa especie (y especies relacionadas) y la tasa inherente de éxito del desarrollo de microsatélites para ese taxón. Existen claras diferencias en la frecuencia de las regiones de microsatélites en los genomas de plantas, animales, hongos y procariotas (Toth et al. 2000), y la tasa de éxito del aislamiento de los marcadores de microsatélites suele escalar con su frecuencia en el genoma (Zane et al. 2002). Por ejemplo, los microsatélites tienden a ser relativamente raros en lepidópteros, aves, murciélagos y procariotas, mientras que los peces y la mayoría de los mamíferos tienden a tener una alta frecuencia de repetición de motivos (Neff & Gross 2001). Además, las especies con altas tasas de endogamia, bajos tamaños de población y cuellos de botella frecuentes o severos suelen tener un polimorfismo y heterocigosidad promedio bajos, y microsatélites más cortos en promedio (DeWoody & Avise 2000; Neff & Gross 2001). Actualmente, la mayoría de los marcadores de microsatélites se reportan en"notas de fondo" en las Notas de Ecología Molecular. Existe una base de datos en línea en la que se pueden realizar búsquedas de cualquier primers de microsatélites publicados en esta revista (http://tomato.bio.trinity.edu/). Las secuencias en sí mismas se archivan en GenBank y a menudo se presentan mucho antes de que su uso aparezca en estudios publicados. Se puede buscar en GenBank con un motor basado en la web administrado por el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) escribiendo la especie, el género o el nombre de la familia, el término"microsatélite" y seleccionando la base de datos de nucleótidos. A veces las regiones adyacentes están muy conservadas a través de los taxones, lo que permite la amplificación entre especies de loci microsatélites a partir de cebadores desarrollados a partir de otras especies del mismo género o incluso de la misma familia, especialmente para vertebrados tales como peces, reptiles y mamíferos (Rico et al. 1996; Peakall et al. 1998). Por lo tanto, es útil buscar en las bases de datos anteriores los cebadores desarrollados para parientes congéneres y confamiliares de la especie objetivo. 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

intentar amplificar los cebadores existentes de especies relacionadas es menos costoso y lleva menos tiempo que aislar nuevos cebadores (Squirrell et al. 2003), y cualquier éxito ahorrará dinero incluso si se necesitan marcadores adicionales para aumentar estos apropiados. Paso 2: Aislar nuevos marcadores

En la última década, el proceso de aislamiento de nuevas elites de microsatélites ha sido racionalizado con avances tecnológicos y optimización de protocolos para hacer el proceso más barato, eficiente y exitoso (Zane et al. 2002; Glenn & Schable 2005). Véase el Apéndice S1 para un esquema conceptual de un proceso de aislamiento de locus de microsatélites. Una búsqueda rápida en la web utilizando términos de búsqueda apropiados, tales como"servicio de aislamiento de élite microsat", producirá una larga lista de proveedores en lugares de todo el mundo. Algunos servicios se especializan en ciertos taxones, como plantas o mamíferos, y generalmente trabajan con usted para adaptar el producto a sus necesidades. Estos laboratorios suelen necesitar de 2 a 6 meses para desarrollar marcadores, y la mayoría cuestan menos de 1.500 dólares por locus, o de 10 a 15 loci por aproximadamente 10.000 dólares. Aunque este gasto no es trivial, es aproximadamente el costo de una máquina de PCR, y es mucho menos costoso que equipar un laboratorio molecular completo si no se tiene acceso a uno. El costo y el tiempo de entrega también dependen de si los loci se someten a pruebas de calidad y si los protocolos de amplificación se optimizan como parte del servicio de aislamiento. Algunos servicios incluso escriben una publicación de notas iniciales con autoría compartida. Muchos de los laboratorios que ofrecen aislamiento de microsatélites también ofrecen servicios de genotipado, y pueden llevarlo de principio a fin para todo su estudio. Como alternativa al envío de muestras, también es posible establecer una colaboración con un laboratorio académico con los conocimientos técnicos y el equipo necesarios, o en muchas universidades, trabajar en estrecha colaboración con una instalación central de secuenciación. PARTE II I: A M ICROSATELLI T E S CREENING PROTOCOL

Aunque cualquiera puede enviar muestras de tejido a un servicio comercial y recibir un conjunto completo de marcadores microsatélites en cuestión de meses, no es trivial desarrollar un conjunto óptimo de loci que proporcione resultados fiables. Existen varios supuestos básicos detrás de los análisis que se aplican comúnmente a los datos de microsatélites y cada uno de ellos debe abordarse explícitamente (Cuadro 2). Los loci que se incluyen en los análisis a pesar de las graves violaciones de estas suposiciones o de las altas tasas de error podrían conducir a estimaciones genéticas inexactas y sesgadas. Con la esperanza de motivar una 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

consideración más crítica del control de calidad de los marcadores, presentamos aquí una guía detallada para evaluar los loci para su inclusión en un estudio genético de poblaciones. Como más detalles

Microsatélites para ecologistas 621

Tabla 2 Summary of the quality control screening protocol with checklist of suggested tests

Assumption

Pruebas sugeridas para el control

deSummary of the quality control screening protocol with checklist of suggested tests Assumption

calidad del locus

1. Puntuación precisagenotypes 2. Amplificación de todas lasalleles CHECKER);

Vuelva a puntuar un subconjunto de genotipos y calcule la tasa degenotypes error. pruebas de patrones de exceso de homocigotos consistentes con alelos nulos ( MICRO-

3. Enlaceequilibrium 4. neutrality 5. Mendelianoinheritance por d i p l o i d e . 6. Cada alelo difiere enlength que

calcular la frecuencia de las muestras que no amplifican ningún alelo en un solo lugar Utilice una prueba exacta para buscar correlaciones entre alelos en diferentes lugares (disponible en muchos programas) Prueba selectivaneutrality de conformidad con la distribución de muestreo de Ewens (ENUMERATE o PYPOP), prueba de loci atípicos (FDIST2, DETSEL) Realizar cruces definidos cuando sea posible*; descartar los loci con casos de >2 alelos individuo Secuencia un subconjunto de alelos o emplea SSCP - si existe una buena razón para creer la homoplastia es un problema

importante* *Estas pruebas están actualmente más allá de las normas requeridas para la mayoría de los usos ecológicos de los microsatélites y deben considerarse opcionales (véase el texto para más detalles).

sobre el comportamiento de las mutaciones de los microsatélites, los mecanismos de herencia y la distribución a través de los cromosomas, es probable que la lista de pruebas sugeridas evolucione. Aunque no se puede saber si la mayoría de los estudios emplean o no tales medidas de control de calidad, la mayoría de las publicaciones no informan los resultados de la mayoría de estas pruebas (Tabla 3). En nuestra encuesta de 50 estudios recientes de microsatélites, el 28% de los estudios mencionan la importancia del control de calidad, pero no informan los resultados de las pruebas estadísticas. Además, la mayoría de las pruebas se llevaron a cabo de forma post hoc y se basaron en gran medida en las pruebas de Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). La Tabla 3 muestra que aproximadamente el doble de la tasa de fracaso se detecta con pruebas explícitas de alelos nulos, herencia y neutralidad en comparación con las inferencias indirectas basadas en pruebas de HWE. Si bien la tendencia continua de acortar los manuscritos hace más difícil la presentación de informes exhaustivos de las pruebas de control de calidad, el uso de repositorios de datos basados en la web, que suelen estar vinculados a los manuscritos impresos, sería una solución fácil a este problema, y facilitaría la comparación y el metanálisis de los conjuntos de datos. Una vez que se hayan desarrollado los cebadores de trabajo (véase el Apéndice S1), se pueden genotipar de 20 a 30 individuos de cada una de las 3 a 5 poblaciones ampliamente distribuidas (véase el Apéndice S2) para el cribado preliminar que se describe a continuación. Cuando toda la colección de muestras del estudio esté genotipada,

deberán repetirse los análisis de las pruebas en el proceso de cribado y los resultados se comunicarán en cualquier publicación posterior. Los pasos recomendados en el proceso de selección se describen a continuación (con referencias que proporcionan una visión más amplia de estos temas), y en la Tabla 2 se presenta una lista de comprobación de las pruebas necesarias. Observamos aquí que algunos análisis estadísticos especializados hacen otras suposiciones críticas, como la conformidad con un modelo mutacional específico, el tamaño constante de la población o el equilibrio entre migración y deriva, que se consideran fuera del alcance de esta revisión.

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Error de puntuación de alelos

Hay muchos pasos entre la extracción de ADN y la introducción de un genotipo en una base de datos, y en cada punto pueden surgir una variedad de errores. Una tasa de error de genotipado de hasta el 1% (es decir, el 1% de los alelos de un conjunto de datos completo están mal identificados), que es un valor extraordinariamente bueno para la mayoría de los estudios, puede conducir a un número sustancial de genotipos multilocales incorrectos en un gran conjunto de datos (Hoffman & Amos 2005). Las fuentes de error incluyen una amplificación deficiente, errores de impresión (es decir, interpretación errónea de un pico/banda de un artefacto como un verdadero alelo microsatélite y su inclusión en el genotipo), interpretación incorrecta de patrones de tartamudeo o picos de artefactos (véase el Apéndice S2), contaminación, errores de etiquetado o de introducción de datos (Bonin et al. 2004). En muchos casos, conocer las fuentes de error en los datos del genotipo puede permitir corregirlo, como por ejemplo, volver a genotipar a los individuos homocigóticos para capturar alelos de amplificación deficiente. Un conjunto de datos genéticos de alta calidad comienza con una buena conservación de las muestras. La preservación adecuada de las muestras puede reducir sustancialmente las dificultades técnicas de la amplificación en la línea, por lo que debe planificarse cuidadosamente (Dawson et al. 1998). Nótese que aunque el muestreo no invasivo (basado en muestras de piel, pelo o heces) suele ser útil, a menudo requiere un protocolo más intensivo para el genotipado y conduce a una tasa de error más alta que cuando se utilizan muestras de tejido adecuadamente conservadas (revisado por Taberlet et al. 1999; Piggott & Taylor 2 0 0 3 ). Para asegurar que la amplificación de los alelos sea consistente a lo largo de la duración de un estudio, se debe realizar un control positivo con cada lote de PCR, especialmente cada vez que se utilicen secuenciadores múltiples para el genotipado en un solo estudio, o se utilicen nuevos lotes de cebadores (Delmotte et al. 2001). Se debe prestar atención a las señales de alerta reextrayendo y reamplificando genotipos cuestionables (por ejemplo, heterocigotos con alelos de gran tamaño, alelos débiles; véanse los ejemplos de genotipos difíciles de llamar en el Apéndice S2). Si es necesario, todo el conjunto de datos

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622 K. A. Selkoe y R. J. Toonen

Paso de selección de control de calidad Tasa de error en la puntuación del genotipo Pruebas indirectas de alelos nulos* Pruebas explícitas de alelos nulos Evidencia para el equilibrio del varillaje Evidencia de la vinculación sexual Evidencia indirecta para desviarse de las expectativas neutrales* Pruebas explícitas de conformidad con las expectativas neutrales Signos encontrados en el conjunto de datos consistentes con Herencia'no mendeliana'* Pruebas explícitas para la herencia"no mendeliana" con cruces o pedigríes definidos. Incidencia de alelos homoplásicos segúnlocus

Frecuencia de presentación 10 de informes 84 (%) 36 78 12 26 8 34

Resultado de la encuesta 2.1 ± 2.4 (%) 13.6 ± 25.2 34.6 ± 33.5 10.8 ± 24.2 5.3 ± 7.7 1.6 ± 5.8 5.3 ± 10.5 1.8 ± 7.8

16

4.7 ± 11.2

4

1.4 ± 1.9

Tabla 3 Estudio de control de calidad de los

loci de microsatélites reportado en 25 estudios de microsatélites recientemente publicados en cada una de las revistas Evolution and Molecular Ecology

La frecuencia de reporte indica el porcentaje de los 50 estudios que realizaron cada prueba. Los valores de los resultados de la encuesta son el porcentaje medio de loci que no pasaron la prueba ± 1 SD. Presentamos tanto los valores de aquellos estudios que se probaron explícitamente para cada paso de control de calidad, como aquellos que dedujeron una violación post hoc después de detectar una desviación inesperada del Equilibrio HardyWeinberg (HWE; anotado por asterisco). Se excluyeron los estudios que utilizaron marcadores de microsatélites tomados de estudios de investigación previamente publicados para minimizar la posibilidad de que las pruebas de suposiciones se llevaran a cabo previamente y, por lo tanto, no se informaran en el estudio actual. En el Apéndice S3 del Material Complementario se incluye una lista de las referencias de los 50 estudios. *Incluye pruebas de desviación de HWE.

puede ser genotipado por duplicado (o más), como en el caso de la filiación humana o la medicina forense. La tasa de error puede calcularse repitiendo la amplificación de marcadores en un subconjunto aleatorio del 10-15% del número total de muestras, y contando el número de genotipos de carpas inconsistentes entre el primer y el segundo intento. La tasa de error se expresa entonces como el número de genotipos incorrectos dividido por el número de reacciones repetidas, o el número de alelos incorrectos dividido por el número total de alelos (Hoffman & Amos 2005). Al examinar las fuentes de cada error, es posible determinar si la mayoría de los errores están ampliamente distribuidos (como los errores tipográficos), o si están sesgados hacia algún subconjunto de los datos (como los homocigotos en el caso de los alelos nulos). La información sobre el tipo de error y la frecuencia permite estimar los efectos del error en los resultados (por ejemplo, homocigosidad inflada, estimaciones de parentesco reducido, etc.; Bonin et al. 2004). El efecto del error en las medidas de la estructura genética puede estimarse usando una técnica de bootstrapping desarrollada por Adams et al. (2004), y el programa de parentesco CERVUS puede estimar la tasa de error mientras que también toma en cuenta la mutación (Marshall et al. 1998). Los análisis basados en genotipos multilocales individuales son más sensibles al error que los basados en frecuencias medias de alelos. Por

ejemplo, una tasa de error por locus del 5% en un conjunto de datos de tres locus resulta en una precisión del 95% en la estimación de la frecuencia de alelos, pero significa que sólo el 85% de los individuos fueron genotipados correctamente en los tres loci. Algunos

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La cantidad de error es inevitable, pero argumentamos que la tasa de error dentro de cada estudio debe ser cuantificada y reportada. En algunos casos, la eliminación de los loci con las tasas de error más altas de los análisis puede mejorar la potencia estadística. Equilibrio Hardy-Weinberg y alelos nulos

La prueba de loci más comúnmente reportada es la conformidad con la HWE, en la cual las frecuencias observadas del genotipo son comparadas con las frecuencias esperadas para una población ideal (apareamiento aleatorio, sin mutación, sin deriva, sin migración). Un"exceso de heterocigotos" (también conocido como"déficit de homocigotos") ocurre cuando el conjunto de datos contiene menos homocigotos de los esperados bajo HWE, y un"déficit de heterocigotos" (también conocido como"exceso de homocigotos") ocurre cuando hay más homocigotos de los esperados bajo HWE. Actualmente, las pruebas utilizadas para determinar la desviación estadísticamente significativa del HWE tienen baja potencia cuando la diversidad alélica es alta y los tamaños de la muestra son moderados (Guo & Thompson 1992). Sin embargo, no cumplir con HWE no es típicamente motivo para descartar un locus. El déficit de heterocigotos, la dirección más común de la desviación de HWE, puede deberse a realidades biológicas que violan los criterios de una población ideal, como una fuerte endogamia o selección a favor o en contra de un determinado alelo. Alternativamente, cuando dos grupos genéticamente distintos son agrupados inadvertidamente en una sola unidad de muestreo, ya sea

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Microsatélites para ecologistas 623

debido a que ocurren conjuntamente pero rara vez se cruzan (sin que el muestreador lo sepa), o debido a que la escala espacial elegida para el muestreo de un sitio es mayor que la escala real de una población, habrá más homocigotos de los que se esperan bajo HWE. Este fenómeno se denomina efecto Wahlund y puede ser una causa común de déficit de heterocigotos en estudios genéticos de poblaciones (Johnson & Black 1984; Nielsen et al. 2003). Ambas causas del déficit de heterocigotos deberían afectar a todos los loci, en lugar de sólo a uno o a unos pocos. Otra causa común del déficit de heterocigotos es la insuficiencia de amplificación de ciertos alelos en un solo lugar. Los'alelos nulos' son aquellos que no se amplifican en una PCR, ya sea porque las condiciones de la PCR no son las ideales o porque la región de unión de la imprimación contiene mutaciones que inhiben la unión. Como resultado, algunos heterocigotos son genotipados como homocigotos y algunos individuos pueden no amplificar ningún alelo. A menudo, las mutaciones que causan los alelos nulos sólo se producen en una o unas pocas poblaciones, por lo que un déficit de heterocigotos podría no ser aparente en todas las poblaciones. Una manera sencilla de identificar un problema de alelo nulo es determinar si algún individuo falla repetidamente en amplificar cualquier alelo en un solo lugar, mientras que todos los demás loci se amplifican normalmente (lo que sugiere que el problema no es simplemente ADN de baja calidad). Si la reextracción y la amplificación aún no logran producir ningún alelo en ese lugar, es probable que el individuo sea homocigótico para un alelo nulo. Además, un enfoque estadístico para identificar los alelos nulos puede hacer coincidir el patrón de exceso de homocigotos (alelos grandes, distribución aleatoria de alelos, etc.) con las firmas esperadas de varias causas diferentes de exceso de homocigotos y estimar la frecuencia de los alelos nulos para cada lugar. El programa de software MICRO- CHECKER está diseñado para este fin (Van Oosterhout et al. 2004). Una forma más técnica de detectar los alelos nulos es examinar los patrones de herencia en un pedigrí (por ejemplo, Paetkau & Strobeck 1995). Rediseñar los cebadores para unirlos a una región diferente de la secuencia de flanqueo, o ajustar las condiciones de la PCR puede a menudo mejorar los problemas de alelos nulos (Callen et al. 1993; Pember- ton et al. 1995). Muchos investigadores utilizan rápidamente condiciones de PCR muy estrictas sin tener en cuenta el inconveniente de que inflan las posibilidades de que se produzcan alelos nulos. Una baja incidencia de alelos nulos suele ser sólo una fuente menor de error para la mayoría de los tipos de análisis. Sin embargo, el efecto de los alelos nulos en las estimaciones de la diferenciación genética sigue sin evaluarse hasta la fecha. Además, para ciertos análisis que requieren una alta precisión en el genotipado, como el análisis de parentesco, incluso los alelos nulos raros pueden confundir los resultados, por lo que debe excluirse cualquier

loci con fuerte evidencia de alelos nulos. La"gran pérdida de alelos" es otra forma en que los alelos pueden ser perdido - el alelo más largo en un heterocigoto no se amplifica tan bien como el más corto y parece demasiado débil para ser detectado en el proceso de puntuación del genotipo (Wattier et al. 1998). La gran pérdida de alelos ocurre debido a que la replicación

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en la PCR es más eficaz para secuencias más cortas que para secuencias más largas, por lo que será más pronunciado cuando los alelos en un heterocigogoto sean muy diferentes en tamaño. Una manera de combatir esta fuente de error de genotipado es reamplificar el homocigoto de los individuos para obtener pequeños alelos y aumentar la concentración de la muestra en el secuenciador de ADN. Desquilibrio cinético

Cuando dos loci están muy juntos en un cromosoma, es posible que no se clasifiquen de forma independiente y se transmitan a la descendencia como un par. Incluso si los loci no están ligados físicamente en un cromosoma, pueden estar funcionalmente relacionados o bajo selección para ser transmitidos como un par (de ahí que el término más preciso de desequilibrio cinético esté comenzando a reemplazar el término"desequilibrio de ligamiento"). Mientras que la conexión funcional sería inusual para los loci de microsatélites, los microsatélites pueden agruparse en el genoma (Bachtrog 1999) y el desequilibrio gametico siempre debe ser probado. El desequilibrio cinético crea una pseudo-replicación para los análisis en los que se supone que los loci son muestras independientes del genoma. Para evitar un mayor error de tipo I, se debe descartar un locus de la pareja si se encuentra un desequilibrio significativo de forma consistente entre los loci. Al igual que las pruebas de HWE, las pruebas de desequilibrio cinético tienen baja potencia para loci altamente polimórficos, por lo que se recomienda examinar los intervalos de confianza en las estimaciones. Varios programas de software fáciles de usar, como ARLEQUIN (Schneider et al. 2000), FSTAT (Goudet 1995), GENEPOP (Raymond & Rousset 1 9 9 5 ), GENETIX (Belkhir et al. 1998) y MICROSATELLITE ANALYZER (Dieringer & Schlo¨tterer 2003), incluyen pruebas de desequilibrio cinético mediante la búsqueda de correlaciones entre alelos en diferentes loci. Un tipo de vinculación que esta prueba no detectará es la vinculación sexual; sin embargo, la vinculación sexual producirá un aparente déficit heterocigótico que se asemeja a un problema de alelo nulo. La prueba de la conexión sexual es razonablemente sencilla cuando se dispone de muestras de individuos de sexo conocido: cuando un sexo es consistentemente homocigótico en un lugar, se indica la conexión sexual (Wilson et al. 1997). Por último, hay muchas cuestiones ecológicas que pueden beneficiarse del estudio de los loci vinculados (Gupta et al. 2005). Por ejemplo, la variación de la interpoblación en la vinculación puede correlacionarse con el historial de cuellos de botella (Tishkoff et al. 1996). Neutralidad selectiva

Las revisiones de Kashi & Soller (1999) y Li et al. (2002) detallan una serie de funciones supuestamente funcionales 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

del ADN de los microsatélites (como la organización de la cromatina y la regulación de la actividad y recombinación de los genes), demostrando que los propios litro-microsatélites pueden estar bajo selección. Además, varias enfermedades humanas hereditarias, como la enfermedad de Huntington, son causadas directamente por mutaciones en los loci microsatélites (Ranum &

624 K. A. Selkoe y R. J. Toonen

Día 2002). Alternativamente, un microsatélite puede estar junto a un gen en selección y no parecer neutral debido a que hace autostop. El uso de microsatélites para construir mapas de vinculación de enfermedades sugiere que muchos de ellos pueden estar estrechamente relacionados con los genes que se están seleccionando. Estos ejemplos indican que la neutralidad de los marcadores de microsatélites no debe darse por sentada, sino que debe probarse e informarse en estudios publicados. Las pruebas de neutralidad existentes adoptan varios enfoques diferentes, pero todas carecen del poder para detectar cualquier cosa menos las firmas más fuertes de selección (Ford 2002). En muchos casos, esta baja potencia no es un problema grave, porque los métodos más comunes para estimar el nivel promedio de flujo genético entre las poblaciones (por ejemplo, FST, alelos raros y máxima probabilidad) son relativamente robustos a la selección débil (Slatkin & Barton 1989). Incluir múltiples loci ayuda a promediar la selección, porque no se espera que la selección fije las similitudes mutacionales a través de muchos genes independientes en diferentes poblaciones (Lewontin & Krakauer 1973). Las estimaciones de la estructura genética de Jackknifing multilocus pueden revelar la influencia de cada locus en el patrón; el programa FSTAT proporciona esta prueba. Se pueden aplicar pruebas explícitas de neutralidad a cada lugar individualmente. La prueba de Ewens-Watterson se basa en la premisa de que un locus libre de fuerzas de selección debe tener una distribución de frecuencias alélicas que coincida con la distribución estadística de muestreo de Ewens, pero sólo se detecta una fuerte desviación (Slatkin 1994). Además de la selección, los cambios anteriores en el tamaño de la población, la subdivisión de la población y la desviación de un IAM (probablemente para muchos microsatélites - véase Schlo¨tterer et al. 2004) pueden causar desviación de la distribución de Ewens, por lo que también puede parecer que un locus está siendo seleccionado si viola gravemente las suposiciones del modelo. Un enfoque diferente para detectar la selección se basa en la premisa de que la selección no debe afectar a muchos genes independientes de manera similar; por lo tanto, una forma de probar la neutralidad es evaluar la varianza en las frecuencias alélicas (estimadas con FST) entre muchos loci. Los loci atípicos se consideran sospechosos y pueden eliminarse de los conjuntos de datos si se justifica (Lewontin & Krakauer 1973). Dos paquetes de software utilizan este enfoque para evaluar la neutralidad, pero hacen un esfuerzo por reducir los supuestos poco realistas por los que el método Lewontin & Krakauer (1973) fue criticado originalmente. FDIST2 considera el número total de subpoblaciones en su prueba de valores atípicos en la relación entre FST y heterocigosidad (Beaumont & Nichols 1996). DETSEL (Vitalis et al. 2001) modifica este enfoque considerando parejas de poblaciones individualmente, eliminando la necesidad de conocer el número exacto de

subpoblaciones. Cualquier locus que no supere una prueba de selección debe ser excluido de los análisis basados en supuestos neutrales, tales como inferencias de conectividad, tasa de migración, FST, RST, etc. Sin embargo, los loci bajo selección pueden resultar extremadamente interesantes por sí mismos cuando se examinan los patrones biológicos.

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herencia mendeliana

La herencia mendeliana de alelos es un requisito para casi todos los análisis genéticos de poblaciones y la primera revisión importante de los estudios de herencia microsatélites encontró que la herencia mendeliana casi nunca fue rechazada para las especies de vertebrados diploides (Jarne & Lagoda 1996; Dakin & Avise 2004). Sin embargo, cada vez hay más informes de lo que parecen ser patrones"no mendelianos" de herencia de microsatélites (Smith et al. 2000; Dobrowolski et al. 2002). Siempre que sea posible, la herencia debe ser evaluada e informada. Realizar cruces definidos es la única manera de probar explícitamente la herencia mendeliana. Debido a que relativamente pocos estudios reportan pruebas para la herencia mendeliana, todavía no está claro qué tan común es la herencia no mendeliana en los taxones. Sin embargo, nuestra encuesta de 50 estudios recientes encontró que, en promedio, más de un locus de cada 15 parecía violar la herencia mendeliana cuando se examinaba explícitamente (Tabla 3). Una gran fracción de las proporciones de alelos'no Mendelianos' en la descendencia de cruces definidos es aparentemente causada por alelos nulos. En este caso, el patrón de herencia"no mendeliano" es simplemente un artefacto técnico; el lugar sigue las leyes de Mendel, pero los alelos invisibles enmascaran este hecho. Las causas potenciales del verdadero comportamiento no mendeliano son la vinculación sexual, la asociación física con genes bajo fuerte selección, los centros de recombinación, los elementos transponibles o los procesos durante la meiosis, como la no conjunción o el impulso meiótico (distorsión de la segregación). Estos procesos pueden tener efectos graves, como la transmisión de un solo alelo parental a toda la descendencia. La realización de cruces definidos y el genotipado de un gran número de crías puede ser bastante difícil o poco práctico en algunas especies, y directo en otras, como las que crían a sus crías. Los loci microsatélites en cualquier especie de poliploide tienen una alta probabilidad de ocurrir múltiples veces a lo largo del genoma y esto confundirá el análisis, por lo que en particular la herencia debe examinarse siempre en busca de poliploides (Ardren et al. 1999). Incluso en especies diploides o haploides, la duplicación de loci puede ser común y potencialmente problemática. Cualquier caso de un locus que muestre más de dos alelos por individuo (que no pueda rastrearse hasta la contaminación cruzada de las muestras) deberá descartarse de la mayoría de los análisis. Es importante tener en cuenta que los secuenciadores automáticos están configurados por defecto para llamar sólo a dos alelos por locus, y devolverán llamadas de alelos aparentemente válidas independientemente del número real de productos de amplificación producidos; por esta razón, la llamada de alelos del secuenciador automático siempre debe ser verificada por un operador experimentado.

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Homoplastia

La simple suposición de que cada alelo puede ser identificado inequívocamente por su tamaño probablemente no es satisfecha por muchos loci

Microsatélites para ecologistas 625

(Estoup et al. 2002). La homoplastia se vuelve más pronunciada cuando se comparan individuos o grupos muy distantes genealógicamente (y a menudo geográficamente distantes), ya que uno o ambos linajes deben haber experimentado dos eventos de mutación después de su divergencia para crear un par de alelos homoplásicos (Angers et al. 2000). Por lo tanto, se espera que la homoplastia sea más problemática para aplicaciones en las que las poblaciones están distantemente relacionadas, pero también puede ser problemática para especies con tamaños de población muy grandes o para loci con fuertes limitaciones de tamaño de alelos y alta tasa de mutación (Estoup et al. 2002). En particular, las aplicaciones filogenéticas en las que las poblaciones son en realidad especies distintas son particularmente propensas a sufrir sesgos a causa de la homoplasia con marcadores. Debido a que se espera que el sesgo introducido por la homoplastia sea leve, la estimación cuantitativa de la tasa de homoplasia mediante las técnicas descritas a continuación sólo se justifica en casos especiales. La homoplastia'detectable' puede ser evaluada mediante la secuenciación de una alelo de cierto tamaño de varios individuos y buscando diferencias en la secuencia. La elección de individuos de diferentes poblaciones puede aumentar la probabilidad de detectar alelos homoplásicos, ya que es menos probable que ocurra un evento de mutación homoplásica en el tiempo transcurrido desde que se formó una sola población (Estoup et al. 2002). Un método más eficiente que la secuenciación es emplear el polimorfismo conformacional de una sola hebra (SSCP; Angers et al. 2000), que utiliza electroforesis en gel para separar alelos de la misma longitud pero diferente secuencia (Sunnucks et al. 2000).

número de loci necesarios para las pruebas estadísticas deseadas. EASYPOP es un programa gratuito que permite la simulación de conjuntos de datos para el análisis de potencia (Balloux 2001). En muchos casos, el poder puede ser incrementado igualmente (1) añadiendo individuos de la población muestreada, (2) añadiendo loci, o (3) seleccionando loci con más alelos sobre loci con pocos alelos. Sin embargo, el efecto de la

Elección de un conjunto final de loci

El consenso general en el campo de la ecología molecular es que en la mayoría de los casos, cuantos más loci se incluyan en un estudio, más fiable será el conjunto de datos resultante. Sin embargo, la inclusión de los loci que no pasan el proceso de cribado anterior puede disminuir tanto la precisión como la exactitud de las estimaciones genéticas. Por lo tanto, el uso de sólo los mejores resultados de este proceso de selección debería minimizar los errores que surgen de las fuentes discutidas anteriormente. Al mismo tiempo, la reducción del número de loci también reduce el poder estadístico y la disminución del muestreo en todo el genoma. Es evidente que existe una compensación entre estas fuentes de sesgo, y se aconseja a los recién llegados que consulten a un estadístico o genetista experimentado para llevar a cabo este proceso. La simulación de conjuntos de datos con niveles similares de diferenciación de frecuencia de alelos entre las poblaciones que se observan en los datos preliminares puede ayudar a determinar el tamaño de la muestra y el

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la adición de individuos satura más rápidamente que las otras dos opciones para las estimaciones de FST (Kalinowski 2005). Las dos últimas opciones, añadiendo alelos mediante la adición de más loci y utilizando loci con mayor polimorfismo, producen un efecto similar. La adición de loci reducirá la varianza en las estimaciones genéticas causadas por fenómenos específicos del locus, como la deriva genética o la selección débil, porque cada locus es una muestra independiente del genoma (Kalinowski 2002). Además, el uso de loci con mayor polimorfismo puede inflar el error en las estimaciones de la frecuencia de alelos a menos que el tamaño de la muestra también aumente simultáneamente (Ruzzante 1998; Gomez-Uchida & Banks 2005; Kalinowski 2005). Los microsatélites altamente variables (por ejemplo, los loci con >25 alelos o un 85% de heterocigosidad) tienen un conjunto distinto de pros y contras. El error de puntuación del genotipo puede aumentar debido al aumento del abandono de los alelos grandes (Buchnan et al. 2005) y al aumento de la tartamudez (Hoffman & Amos 2005). Las altas tasas de homoplasia asociadas con altas tasas de mutación (la causa típica de la alta diversidad alélica) pueden introducir sesgos en las estimaciones de la frecuencia de los alelos, atenuando las estimaciones de FST y provocando una inflación sustancial de las estimaciones del flujo genético (Jin & Chakraborty 1995; Slatkin 1995; Gaggiotti et al. 1999; Epperson 2005). Una correlación negativa entre heterocigosidad y FST puede ocurrir aparentemente en loci de alta tasa de mutación (O'Reilly et al. 2004; Olsen et al. 2004), pero puede explicarse dividiendo los loci en subgrupos para el análisis, o usando modificadores que hacen que los loci sean más comparables (Buonaccorsi et al. 2002; Olsen et al. 2004; Hedrick 2005). Por otro lado, los loci altamente variables tienen mayor poder para estimar la estructura genética (Epperson 2004), distinguir parientes cercanos por parentesco (Queller et al. 1993) y asignar individuos a la población fuente correcta (Wilson & Rannala 2003). CONCLUSIÓN Y N EXT S TEPS

Gran parte de las dudas de los investigadores sobre el uso de marcadores de microsatélites en ecología se deben al hecho de que los estudios detallados o metaanálisis de los microsatélites y sus comportamientos mutacionales y de amplificación siguen siendo en gran medida competencia de los organismos modelo y de la genética humana. Aunque los microsatélites siempre requieren una evaluación cuidadosa, problemas tales como un mecanismo mutacional poco claro, alelos nulos y homoplasia son a menudo intrascendentes para las mediciones ecológicas. Sin embargo, siempre es importante examinar explícitamente los supuestos detrás de los datos, incluso cuando son difíciles de verificar, y siempre que sea posible abordar las fuentes de error y sesgo en los estudios moleculares. Aunque todavía no es la norma en el campo realizar y reportar todas estas pruebas 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

(Tabla 3), argumentamos que cualquier estudio publicado debe esforzarse por probar y presentar esta información. El aumento de la información sobre las características de los nuevos loci acelerará nuestra comprensión del comportamiento de este marcador.

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Los países en vías de desarrollo deben ser capaces de escribir y mejorar los enfoques existentes para hacer frente a sus problemas. Del mismo modo, la mayor disponibilidad de estas potentes herramientas moleculares para un grupo más amplio acelerará la nueva aplicación de los marcadores de microsatélites, los enfoques conceptuales para la resolución de problemas y el análisis de datos, y la disponibilidad de marcadores, muestras y conjuntos de datos. Aunque un estudio de marcadores de microsatélites puede realizarse hoy en día en menos tiempo, por menos dinero y con menos conocimientos técnicos que antes, el uso adecuado de los datos de los micro satélites requiere una formación adecuada, así como un conocimiento exhaustivo de los principios de la genética de las poblaciones y de la evolución molecular. Incluso cuando los loci son cuidadosamente examinados y seleccionados, interpretar el significado ecológico de los análisis genéticos incluso los análisis de parentesco más simples o las estimaciones del flujo genético- puede ser delicado. Aquellos que intentan utilizar microsatélites por primera vez necesitarán una lectura en profundidad sobre la evolución de los microsatélites y el análisis genético estadístico, muchos de los cuales se citan a lo largo de este estudio. Varias otras revisiones especializadas en microsatélites que recomendamos como punto de partida son Estoup & Angers (1998), Chambers & MacAvoy (2000), Schlo¨tterer (2000), Sunnucks (2000) y muchos de los capítulos de Goldstein & Schlo¨tterer (1999). Además, varios volúmenes sobre el análisis estadístico de los datos genéticos presentan la base de los enfoques estadísticos para evaluar los datos de los marcadores genéticos, entre ellos Nei (1987), Weir (1996) y Balding y otros (2003). Sin embargo, muchos detalles técnicos importantes sobre el uso adecuado de los marcadores genéticos todavía están mal descritos en la literatura. Aunque los apéndices incluidos aquí tienen por objeto proporcionar una visión general conceptual de algunos de los aspectos prácticos de la utilización de microsatélites, no son en absoluto exhaustivos. Buscar la colaboración de un ecólogo molecular que tenga un historial comprobado con las técnicas y análisis de interés (no necesariamente los taxones de interés) al principio del diseño de un experimento es un imperativo para los recién llegados y sin duda hará que el proceso de aprendizaje sea más eficiente y exitoso.

Estudio Interdisciplinario de los Océanos Costeros (PISCO), financiada por la Fundación David y Lucile Packard y la Fundación Gordon y Betty Moore (KAS) y el Programa Nacional de Santuarios Marinos, NMSP MOA 2005008/66832 (KAS y RJT). Esta es la publicación de PISCO No. 202, contribución No. 1221 del Hawaii Institute of Marine Biology y SOEST No. 6729.

RECONOCIMIENTOS

Este estudio se benefició de la crítica constructiva y las sugerencias editoriales de Brian Bowen, Rob Cowie, Ross Crozier, Arnold Estoup, Brant Faircloth, Steve Gaines, Rick Grosberg, Steve Karl, Joe Neigel, Paul Sunnucks, Andrea Taylor, Neil Tsutsui, Alex Wilson y dos árbitros anónimos. Este estudio contó con el apoyo de la Asociación para el 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

REFERENCIAS Adams, R.I., Brown, K.M. & Hamilton, M.B. (2004). El impacto de la homoplasia electromorfa microsatélite sobre las estimaciones de la estructura de poblaciones multilocales en un árbol tropical (Corythophora alta) y un pez anádromo (Morone saxatilis). Mol. Ecol. , 13, 2579–2588. Angers, B., Estoup, A. & Jarne, P. (2000). Microsatellite size homoplasy, SSCP, and population structure: a case study in the freshwater snail Bulinus truncatus. Mol. Biol. Evol. 17, 19261932. Ardren, W.R., Borer, S., Thrower, J.E. & Kapuscinski, A.R. (1999). Herencia de 12 loci microsatélites en Oncorhynchus mykiss. J. Hered. , 90, 529–536. Avise, J.C. (1994). Marcadores moleculares, historia natural y evolución. Chapman y Hall, Nueva York, EE.UU. Bachtrog, D., Weiss, S., Zangerl, B. & Schlo¨tterer, C. (1999). Distribución de microsatélites dinucleótidos en el genoma de Drosophila melanogaster. Molec. Biol. Evol. 16, 602-610. Balding, D.J., Bishop, M. & Cannings, C. (2003). Manual de Genética Estadística. John Wiley and Sons, West Sussex, Reino Unido. Balloux, F. (2001). EASYPOP (versión 1.7): programa informático para simulaciones de genética de poblaciones. J. Hered. , 92, 301–302. Balloux, F. & Lugon-Moulin, N. (2002). La estimación de la diferenciación de la población con marcadores microsatélites. Mol. Ecol. , 11, 155–165. Beaumont, M.A. & Nichols, R. (1996). Evaluación de loci para su uso en el análisis genético de la estructura poblacional. Proc. R. Soc. Lond, B, Biol. Sci. 263, 1619-1626. Beaumont, M.A. & Rannala, B. (2004). La revolución bayesiana en genética. Nat. Rev. Genet. , 5, 251–261. Beck, N.R., Double, M.C. & Cockburn, A. (2003). Evolución de microsatélites en dos loci hipervariables revelados por extensos pedigríes de aves. Mol. Biol. Evol. 20, 54-61. Belkhir, K., Borsa, P., Goudet, J., Chikhi, L. & Bonhomme, F. (1998). Genetix, software de Windows para genética de poblaciones. Laboratorio de Genomas y Poblaciones, Universidad de Montpellier, Montpellier. Bensch, S. & Akesson, M. (2005). Diez años de AFLP en ecología y evolución: ¿por qué tan pocos animales? Mol. Ecol. , 14, 2899–2914. Blankenship, S.M., mayo, B. & Hedgecock, D. (2002). Evolución de un locus de repetición de secuencia simple perfecta en el contexto de su secuencia de flanqueo. Mol. Biol. Evol. 19, 19431951. Bonin, A., Bellemain, E., Eidesen, P.B., Pompanon, F., Brochmann, C. & Taberlet, P. (2004). Cómo rastrear y evaluar los errores de genotipado en los estudios de genética de poblaciones. Mol. Ecol. , 13, 3261–3273. Bossart, J.L. & Prowell, D.P. (1998). Estimaciones genéticas de la estructura de la población y del flujo genético: limitaciones, lecciones y nuevas direcciones. Tendencias Ecol. Evol. 13, 202206. Buchnan, J.C., Archie, E.A., Van Horn, R.C., Moss, C.J. & Alberts, S.C. (2005). Efectos localizados y fuentes de error en el genotipado no invasivo. Mol. Ecol. Notas, 5, 680-683. Buonaccorsi, V.P., Kimbrell, C.A., Lynn, E.A. & Vetter, R.D. (2002). La estructura poblacional del pez roca de cobre (Sebastes caurinus) refleja la colonización postglacial y los patrones contemporáneos de dispersión larvaria. Puedo. J. Fish. Aquat. Sci. 59, 1374-1384. Callen, D., Thompson, A. & Shen, Y. (1993). Incidencia y origen de los alelos "nulos" en los marcadores de microsatélites (CA). 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

Am. J. Human Genet. , 52, 922–927.

Microsatélites para ecologistas 627

Chambers, G.K. & MacAvoy, E.S. (2000). Microsatélites: consensus y controversia. Comp. Bioquímica. Fisiol. B, Bioquímica. Mol. Biol. , 126, 455–476. Cruz, F., Pérez, M. y Presa, P. (2005). Distribución y abundancia de micosatélites en el genoma de los bivalvos. Gene, 346, 241-247. Cruzan, M.B. (1998). Marcadores genéticos en la ecología evolutiva de las plantas. Ecología, 79, 400-412. Curtu, A.L., Finkeldey, R. & Gailing, O. (2004). La secuenciación comparativa de un locus microsatélite revela una homoplasia de tamaño dentro y entre especies de roble europeo (Quercus spp.). Planta Mol. Biol. Rep., 22, 339-346. Dakin, E.E. & Avise, J.C. (2004). Alelos nulos de microsatélites en el análisis de parentesco. Herencia, 93, 504-509. Davies, N., Villablanca, F.X. & Roderick, G.K. (1999). Determinación de la fuente de los individuos: genotipado multilocal en genética de poblaciones de desequilibrio. Tendencias Ecol. Evol. 14, 17-21. Dawson, M.N., Raskoff, K.A. & Jacobs, D.K. (1998). Conservación en campo de tejido de invertebrados marinos para análisis de ADN. Mol. Marine Biol. Biotecnología. , 7, 145–152. Delmotte, F., Leterme, N. & Simon, J.C. (2001). Dimensionamiento de alelos microsatélites: diferencia entre la electroforesis capilar automatizada y la técnica manual. Biotechniques, 31, 810. DeWoody, J.A. & Avise, J.C. (2000). Variación microsatélite en peces marinos, de agua dulce y anádromos en comparación con otros animales. J. Fish Biol. , 56, 461–473. Dieringer, D. & Schlo¨tterer, C. (2003). Microsatellite Analyser (MSA): una herramienta de análisis independiente de la plataforma para grandes conjuntos de datos micro satelitales. Mol. Ecol. Notas, 3, 167-169. Dobrowolski, M.P., Tommerup, I.C., Blakeman, H.D. & O'Brien, A.P. (2002). Herencia no mendeliana revelada en un análisis genético de la progenie sexual de Phytophthora cinnamomi con marcadores microsatélites. Fungal Genet. Biol. , 35, 197–212. Eisen, J.A. (1999). Base mecanicista para la inestabilidad de los microsatélites. In: Microsatélites: Evolution and Applications (eds Goldstein, D.B. & Schlo¨tterer, C.). Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, pp. 34-48. Ellegren, H. (2004). Microsatélites: secuencias simples de evolución compleja. Nat. Rev. Genet. , 5, 435–445. Ellegren, H., Moore, S., Robinson, N., Byrne, K., Ward, W. & Sheldon, B.C. (1997). Evolución de los microsatélites - un estudio recíproco de las longitudes de repetición en los loci homólogos de bovinos y ovinos. Mol. Biol. Evol. 14, 854-860. Epperson, B.K. (2004). Estimación multilocal de la estructura genética de las poblaciones. Theor. Popul. Biol. , 65, 227–237. Epperson, B.K. (2005). La mutación a altas tasas reduce la estructura espacial dentro de las poblaciones. Mol. Ecol. , 14, 703–710. Estoup, A. y Angers, B. (1998). Microsatélites y minisatélites para ecología molecular: consideraciones teóricas y empíricas. In: Advances in Molecular Ecology (ed. Carvahlo, G.). NATO Press, Amsterdam, Países Bajos, pp. 55-86. Estoup, A. & Cornuet, J.M. (1999). Evolución de los microsatélites: inferencias a partir de datos poblacionales. In: Microsatélites: Evolution and Applications (eds Goldstein, D.B. & Schlo¨tterer, C.). Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, pp. 49-64. Estoup, A., Tailliez, C., Cornuet, J.M. & Solignac, M. (1995). Homoplasia de tamaño y procesos mutacionales de micro satélites interrumpidos en dos especies de abejas, Apis mellifera y

Bombus terrestris (Apidae). Mol. Biol. Evol. 12, 1074-1084. Estoup, A., Jarne, P. & Cornuet, J.M. (2002). Homoplastia y modelo de mutación en loci de microsatélites y sus consecuencias para el análisis genético de la población. Mol. Ecol. , 11, 1591–1604.

2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

Frantzen, M.A.J., Silk, J.B., Ferguson, J.W.H., Wayne, R.K. & Kohn, M.H. (1998). Evaluación empírica de los métodos de preservación del ADN fecal. Mol. Ecol. , 7, 1423–1428. Ford, M.J. (2002). Aplicaciones de las pruebas de neutralidad selectiva a la ecología molecular. Mol. Ecol. , 11, 1245–1262. Gaggiotti, O.E., Lange, O., Rassmann, K. & Gliddon, C. (1999). Una comparación de dos métodos indirectos para estimar los niveles medios de flujo genético utilizando datos de microsatélites. Mol. Ecol. , 8, 1513–1520. Garza, J.C. & Freimer, N.B. (1996). Homoplastia para tamaño en loci microsatélites en humanos y chimpancés. Genome Res. , 6, 211-217. Gerber, S., Mariette, S., Streiff, R., Bodenes, C. & Kremer, A. (2000). Comparación de microsatélites y marcadores de polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados para el análisis de parentesco. Mol. Ecol. , 9, 1037–1048. Glenn, T.C. & Schable, N.A. (2005). Aislando loci de ADN de microsatélites. In: Evolución molecular: Producing the Biochemical Data, Part B (eds. Zimmer, E.A. & Roalson, E.). Academic Press, San Diego, USA, pp. 202-222. Goldstein, D.B. & Schlo¨tterer, C. (1999). Microsatélites: Evolución y Aplicaciones. Oxford University Press, Oxford, Reino Unido. Gómez-Uchida, D. & Banks, M.A. (2005). Análisis microsatélites de la estructura genética espacial en peces de roca de manchas oscuras (Sebastes cra- meri): ¿es seguro reunir muestras? Puedo. J. Fish. Aquat. Sci., 62, 1874-1886. Goudet, J. (1995). FSTAT (Versión 1.2): un programa de ordenador para calcular las estadísticas F. J. Hered. , 86, 485– 486. Guo, S. & Thompson, E. (1992). Realizando la prueba exacta de la proporción de Hardy-Weinberg para múltiples alelos. Biometría, 48, 361-372. Gupta, P.K., Rustgi, S. & Kulwal, P.L. (2005). Linkage disequilibrium and association studies in higher plants: present status and future prospects. Planta Mol. Biol. , 57, 461–485. Hedgecock, D., Li, G., Hubert, S., Bucklin, K. & Ribes, V. (2004). Amplios alelos nulos y pobre amplificación entre especies de loci de ADN microsatélites clonados a partir de la ostra del Pacífico, Cras- sostrea gigas. J. Shellfish Res. , 23, 379385. Hedrick, P.W. (1999). Perspectiva: loci muy variables y su interpretación en evolución y conservación. Evolución, 53, 313318. Hedrick, P.W. (2005). Una medida estandarizada de diferenciación genética. Evolución, 59, 1633-1638. Hoffman, J.I. & Amos, W. (2005). Errores de genotipado de microsatélites: detección, enfoques, fuentes comunes y consecuencias para la exclusión paterna. Mol. Ecol. , 14, 599– 612. Jarne, P. & Lagoda, P.J.L. (1996). Microsatélites, de moléculas a poblaciones y viceversa. Tendencias Ecol. Evol. 11, 424-429. Jin, L. & Chakraborty, R. (1995). Estructura de la población, mutación por pasos, deficiencia de heterocigotos y sus implicaciones en el análisis forense de ADN. Herencia, 74, 274285. Johnson, M.S. & Black, R. (1984). El efecto Wahlund y la escala geográfica de variación del lapa intermareal Siphonaria sp. Mar. Biol. , 79, 295–302. Kalinowski, S.T. (2002). ¿Cuántos alelos por locus se deben utilizar para estimar las distancias genéticas? Herencia, 88, 6265. Kalinowski, S.T. (2005). ¿Los loci polimórficos requieren grandes tamaños de muestra para estimar las distancias genéticas? Herencia, 94, 33-36. Kashi, Y. & Soller, M. (1999). Funciones funcionales de los 2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

microsatélites y minisatélites. In: Microsatélites: Evolución y Aplicaciones

628 K. A. Selkoe y R. J. Toonen

(eds. Goldstein, D.B. & Schlo¨tterer, C.). Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, pp. 10-23. Landry, P.A., Koskinen, M.T. & Primmer, C.R. (2002). Derivar relaciones evolutivas entre las poblaciones mediante micro satélites y Dl2: todos los loci son iguales, pero algunos son más iguales que otros. Genética, 161, 1339-1347. Lewontin, R.C. & Krakauer, J. (1973). Distribución de la frecuencia génica como prueba de la teoría de la neutralidad selectiva del polimorfismo. Genética, 74, 175-195. Li, Y.C., Korol, A.B., Fahima, T., Beiles, A. & Nevo, E. (2002). Microsatélites: distribución genómica, funciones putativas y mecanismos mutacionales: una revisión. Mol. Ecol. , 11, 2453– 2465. Luikart, G. & England, P.R. (1999). Análisis estadístico de datos de ADN micro satelital. Tendencias Ecol. Evol. 14, 253-256. Manel, S., Schwartz, M.K., Luikart, G. & Taberlet, P. (2003). Genética del paisaje: combina la ecología del paisaje y la genética de la población. Tendencias Ecol. Evol. 18, 189-197. Manel, S., Gaggiotti, O.E. & Waples, R.S. (2005). Métodos de asignación: emparejar las preguntas biológicas con las técnicas apropiadas. Tendencias Ecol. Evol. 20, 136-142. Marshall, T.C., Slate, J., Kruuk, L.E.B. & Pemberton, J.M. (1998). Confianza estadística para la inferencia de la paternidad basada en la probabilidad en poblaciones naturales. Mol. Ecol. , 7, 639– 655. Meglecz, E., Petenian, F., Danchin, E., D'Acier, A.C., Rasplus, J.Y. & Faure, E. (2004). Alta similitud entre regiones flanqueantes de diferentes microsatélites detectados dentro de cada una de las dos especies de Lepidópteros: Parnassius apollo y Euphydryas aurinia. Mol. Ecol. , 13, 1693–1700. Morin, P.A., Luikart, G. & Wayne, R.K. (2004). SNPs en ecología, evolución y conservación. Tendencias Ecol. Evol. 19, 208-216. Neff, B.D. & Gross, M.R. (2001). Evolución de los microsatélites en los ver-brados: inferencia a partir de repeticiones de dinucleótidos AC. Evolución, 55, 1717-1733. Nei, M. (1987). Genética evolutiva molecular. Columbia University Press, Nueva York, EE.UU. Neigel, J.E. (1997). Una comparación de estrategias alternativas para estimar el flujo de genes de marcadores genéticos. Annu. Rev. Ecol. Syst. , 28, 105–128. Nielsen, E.E., Hansen, M.M., Ruzzante, D.E., Meldrup, D. & Grønkjær, P. (2003). La evidencia de una zona híbrida en el bacalao del Atlántico (Gadus morhua) en el Mar Báltico y en el Mar del Cinturón Danés revelada por el análisis de mezclas individuales. Mol. Ecol. , 12, 1497–1508. O'Reilly, P.T., Canino, M.F., Bailey, K.M. & Bentzen, P. (2004). Relación inversa entre el FST y el polimorfismo microsatélite en los peces marinos, abadejo (Theragra chalco- gramma): implicaciones para la resolución de la estructura poblacional débil. Mol. Ecol. , 13, 1799–1814. Olsen, J.B., Habicht, C., Reynolds, J. & Seeb, J.E. (2004). Los microsatélites moderados y altamente polimórficos proporcionan estimaciones discordantes de la divergencia poblacional en el salmón rojo, Oncor- hynchus nerka. Medio ambiente. Biol. Peces, 69, 261-273. Paetkau, D. & Strobeck, C. (1995). La historia molecular y evolutiva de un alelo nulo microsatélite en osos. Mol. Ecol. , 4, 519–520. Peakall, R., Gilmore, S., Keys, W., Morgante, M. & Rafalski, A. (1998). Amplificación interespecífica de la soja (Glycine max), repeticiones de secuencia simple (SSR) dentro del género y otros géneros de leguminosas: implicaciones para la

transferibilidad de los SSR en las plantas. Mol. Biol. Evol. 15, 12751287.

2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

Pearse, D.E. & Crandall, K.A. (2004). Beyond FST: análisis de los datos genéticos de la po- pulación para la conservación. Conservar. Genet. , 5, 585–602. Pemberton, J.M., Slate, J., Bancroft, D.R. & Barrett, J.A. (1995). Alelos no amplificadores en los loci microsatélites - una precaución para los pary estudios de población. Mol. Ecol. , 4, 249–252. Petit, R.J., Deguilloux, M.F., Chat, J., Grivet, D., Garnier-Gere, P. & Vendramin, G.G. (2005). Estandarización de la longitud de los microsatélites en las comparaciones de la diversidad genética. Mol. Ecol. , 14, 885– 890. Piggott, M.P. & Taylor, A.C. (2003). Recolección remota de ADN animal y sus aplicaciones en la gestión de la conservación y comprensión de la biología poblacional de especies raras y crípticas. Wildl. Res. 30, 1-13. Piry, S., Luikart, G. & Cornuet, J.M. (1999). Cuello de botella: un programa de comunicación para detectar reducciones recientes en el tamaño efectivo de la población utilizando datos de frecuencia de alelos. J. Hered. , 90, 502– 503. Primmer, C.R., Moller, A.P. & Ellegren, H. (1996). Un estudio de amplio espectro de la amplificación microsatélite cruzada en aves. Mol. Ecol. , 5, 365–378. Primmer, C.R., Raudsepp, T., Chowdhary, B.P., Moller, A.R. & Ellegren, H. (1997). Baja frecuencia de microsatélites en el genoma aviar. Genome Res. , 7, 471-482. Queller, D.C., Strassmann, J.E. & Hughes, C.R. (1993). Microsatélites y parentesco. Tendencias Ecol. Evol. 8, 285-288. Ranum, L.P.W. & Day, J.W. (2002). Trastornos de expansión microsatélites no codificantes y predominantemente hereditarios. Curr. Opinión. Genet. Dev. , 12, 266–271. Raymond, M. y Rousset, F. (1995). Genepop (versión 1.2) software de genética de poblaciones para pruebas exactas y ecumenismo. J. Hered. , 86, 248–249. Richard, G.F. & Paques, F. (2000). Expansiones miniaturizadas y microsatélites: la conexión de recombinación. EMBO Rep. , 1, 122- 126. Rico, C., Rico, I. & Hewitt, G. (1996). 470 millones de años de conservación de los loci microsatélites entre las especies de peces. Proc. R. Soc. Lond, B, Biol. Sci. 263, 549-557. Rousset, F. (1996). Valores de equilibrio de las medidas de subdivisión de la población para procesos de mutación graduales. Genética, 142, 1357-1362. Ruzzante, D.E. (1998). Una comparación de varias medidas de distancia genética y estructura poblacional con datos de microsatélites: sesgo y varianza de muestreo. Puedo. J. Fish. Aquat. Sci., 55, 1-14. Schlo¨tterer, C. (2000). Dinámica evolutiva del ADN microsatélite. Cromosoma 109, 365-371. Schlo¨tterer, C. (2004). La evolución de los marcadores moleculares: ¿una cuestión de moda? Nat. Rev. Genet. , 5, 63– 69. Schlo¨tterer, C., Kauer, M. & Dieringer, D. (2004). Exceso de alelos en microsatélites en evolución neutra y las implicaciones para las pruebas de neutralidad. Proc. R. Soc. Lond, B, Biol. Sci., 271, 869-874. Schneider, S., Roessli, D. & Excoffier, L. (2000). Arlequín ver. 2.000: un programa informático para el análisis de datos genéticos de poblaciones. Laboratorio de Genética y Biometría, Universidad de Ginebra, Ginebra, Suiza. Shoemaker, J.S., Painter, I.S. & Weir, B.S. (1999). Estadísticas bayesianas en genética - una guía para los no iniciados. Tendencias Genet. , 15, 354– 358. Slatkin, M. (1994). Una prueba exacta de neutralidad basada en la distribución del muestreo de Ewens. Genet. Res. 64, 71-74.

2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS

Microsatélites para ecologistas 629

Slatkin, M. (1995). Medida de la subdivisión de la población basada en frecuencias de alelos microsatélites. Genética, 139, 457-462. Slatkin, M. & Barton, N.H. (1989). Una comparación de 3 métodos indirectos para estimar los niveles medios de flujo de genes. Evolución, 43, 1349-1368. Smith, K.L., Alberts, S.C., Bayes, M.K., Bruford, M.W., Altmann, J. & Ober, C. (2000). Amplificación entre especies, genotipado no invasivo y herencia no mendeliana de los STRPs humanos en los babuinos de Savannah. Am. J. Primatol. , 51, 219–227. Squirrell, J., Hollingsworth, P.M., Woodhead, M., Russell, J., Lowe, A.J., Gibby, M. et al. (2003). ¿Cuánto esfuerzo se requiere para aislar los microsatélites nucleares de las plantas? Mol. Ecol. , 12, 1339– 1348. Sunnucks, P. (2000). Marcadores genéticos eficientes para la biología de poblaciones. Tendencias Ecol. Evol. 15, 199-203. Sunnucks, P., Wilson, A.C.C., Beheregaray, L.B., Zenger, K., French, J. & Taylor, A.C. (2000). El SSCP no es tan difícil: la aplicación y utilidad del polimorfismo de conformación monocatenario en biología evolutiva y ecología molecular. Mol. Ecol. , 9, 1699–1710. Taberlet, P., Waits, L.P. & Luikart, G. (1999). Muestreo genético no invasivo: mire antes de saltar. Tendencias Ecol. Evol. 14, 323-327. Tishkoff, S.A., Dietzsch, E., Speed, W., Pakstis, A.J., Kidd, J.R., Cheung, K. y otros (1996). Los patrones globales de desequilibrio de los vínculos. rium en el lugar CD4 y los orígenes humanos modernos. Science, 271, 1380-1387. Toth, G., Gaspari, Z. & Jurka, J. (2000). Microsatélites en diferentes genomas eucariotas: estudio y análisis. Genome Res. , 10, 967- 981. Van Oosterhout, C., Hutchinson, W.F., Wills, D.P.M. & Shipley, P. (2004). Micro-Checker: software para la identificación y corrección de errores de genotipado en datos de microsatélites. Mol. Ecol. Notas, 4, 535- 538. Viard, F., Franck, P., Dubois, M.-P., Estoup, A. & Jarne, P. (1998). Variación de la homoplastia de tamaño de microsatélites a través de electromorfos, loci y poblaciones en tres especies de invertebrados. J. Mol. Evol. 47, 42-51. Vitalis, R., Dawson, K. & Boursot, P. (2001). Interpretación de la variación entre los loci de los marcadores como prueba de selección. Genética, 158, 1811-1823. Wattier, R., Engel, C.R., Saumitou-Laprade, P. & Valero, M. (1998). Predominio de alelos cortos como fuente de heterocigoto

deficiencia en loci microsatélites: evidencia experimental en el locus dinucleótido Gv1CT en Gracilaria gracilis (Rhodophyta). Mol. Ecol. , 7, 1569–1573. Weir, B.S. (1996). Genetic Data Analysis II: Methods for Discrete Population Genetic Data. Sinauer, Sunderland, MA, USA. Wilson, G.A. & Rannala, B. (2003). Inferencia bayesiana de las tasas de migración recientes utilizando genotipos multilocales. Genética, 163, 1177-1191. Wilson, A.C.C., Sunnucks, P. & Hales, D.F. (1997). Pérdida aleatoria del cromosoma X en la determinación masculina en un pulgón, Sitobion cerca de fragariae, detectada usando un marcador polimórfico polimórfico micro satelital ligado al cromosoma X. Genet. Res. 69, 233-236. Wright, T.F., Johns, P.M., Walters, J.R., Lerner, A.P., Swallow, J.G. & Wilkinson, G.S. (2004). Variación microsatélite entre poblaciones divergentes de moscas de ojos saltones, género Cyrtodiopsis. Genet. Res. 84, 27-40. Zane, L., Bargelloni, L. & Patarnello, T. (2002). Estrategias para el aislamiento de microsatélites: una revisión. Mol. Ecol. , 11, 1–16. Zhang, D.X. & Hewitt, G.M. (2003). Análisis de ADN nuclear en estudios genéticos de poblaciones: práctica, problemas y perspectivas. Mol. Ecol. , 12, 563–584. MATE SUPLEMENTARIO

El siguiente material suplementario está disponible en línea para este artículo en http://www.Blackwell-Synergy.com: Apéndice S1 Diagrama de flujo del desarrollo de microsatélites. Apéndice S2 Guía para la puntuación de genotipos de microsatélites. Apéndice S3 Referencias de los estudios utilizados para generar el Cuadro 3.

Editor, Ross Crozier Manuscrito recibido el 26 de agosto de 2005 Primera decisión adoptada el 20 de octubre de 2005 Texto aceptado el 20 de diciembre de 2005

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Apéndice S1. Diagrama de flujo conceptual para el desarrollo de nuevos marcadores microsatélites basados en la técnica de enriquecimiento (uno de los muchos métodos que se utilizan - véase Zane et al. 2004 y Glenn 2005), y pasos de optimización de la imprimación.

A. Extraer ADN de una sola muestra de tejido. B. Cree una biblioteca de ADN: 1. Corte el genoma en fragmentos de 500 pb con un digerido de enzimas de restricción. 2. Adjuntar ADN'linker' a los extremos de cada fragmento - el ADN del linker tiene una secuencia conocida para que los primers puedan ser diseñados para unirse a ellos. 3. Amplificar los fragmentos de ADN utilizando cebadores para los extremos del enlazador con PCR. C. Separe los fragmentos con secuencias repetidas: 1. Mezcle los fragmentos de ADN con una sonda microsatélite (un oligonucleótido hecho de una secuencia de repetición de su elección) que pueda recuperarse magnéticamente. 2. Promover la hibridación de las sondas a cualquier secuencia de repetición complementaria en los fragmentos de ADN mediante el calentamiento para desnaturalizar el ADN y el enfriamiento lento. 3. Sostenga un imán en el tubo para atraer las sondas (ahora unidas al ADN) y lave el resto del ADN no unido con una serie de enjuagues. D. Secuencia los fragmentos para encontrar loci microsatélites: 1. Usando cebadores para el ADN del enlazador, amplifique el ADN con PCR para concentrarlo. 2. Clonar el ADN para prepararlo para la secuenciación - insertarlo en un plásmido, inocular bacterias con el plásmido, cultivar las bacterias para replicar el ADN. 3. Aislar el ADN de las bacterias. 4. Secuenciar el ADN microsatélite en el plásmido con cebadores dirigidos a los puntos de inserción en el plásmido. E. Examine las secuencias para encontrar repeticiones de microsatélites. F. Diseñe cebadores para la región de flanqueo de los microsatélites (con la ayuda de un programa de selección de cebadores como Primer3, que selecciona los sitios óptimos de cebadores) y hágalos fabricar. G. Intentar amplificar los loci con los nuevos primers. Utilice un gradiente de condiciones de PCR en el que las temperaturas, tiempos, concentraciones de magnesio e imprimación varían para encontrar las condiciones óptimas. H. Utilizar electroforesis en gel para confirmar la presencia de productos de PCR. Deseche los pares de cebadores que no se amplifican después de varios intentos. I. Verifique si hay polimorfismo ejecutando los pares de imprimaciones exitosas en 10-20 individuos. Estimar la diversidad alélica y los niveles de heterocigosidad. Descartar los loci invariantes. J. Compruebe la fiabilidad. Vuelva a ejecutar los pares de cebadores exitosos en los mismos individuos dos veces más para asegurarse de que la puntuación del genotipo sea reproducible de manera consistente. Descarte los loci con una amplificación poco fiable. H. Ordene imprimaciones etiquetadas fluorescentemente para el resto de los loci. Completar el proceso completo de selección detallado en el texto. Descartar los loci problemáticos. K. Agilizar el genotipado del conjunto de datos completo con los loci restantes mediante el establecimiento de un protocolo de PCR "multiplex" - los cebadores para loci múltiples (etiquetados con diferentes colorantes) se amplifican en una sola reacción de PCR.

Apéndice S2. Puntuación de genotipos de microsatélites a partir de la salida de datos del secuenciador. Antecedentes del genotipado de microsatélites con un secuenciador de ADN Un secuenciador de ADN es un aparato de electroforesis en gel de alta precisión. Los productos de PCR se cargan en el gel y se separan por tamaño aplicando una carga. Un láser escanea el gel para detectar bandas que contienen tinte fluorescente. Los primers utilizados en la reacción PCR están marcados con diferentes colorantes fluorescentes para permitir esta detección. El software del secuenciador convierte el patrón de bandas en un gráfico con picos correspondientes a la anchura e intensidad (altura) de cada banda. La posición del pico a lo largo del eje x corresponde al tamaño del producto de ADN en la banda medido en pares de bases (BP). La altura/intensidad corresponde a la concentración del producto de ADN, que es consecuencia de la eficacia del proceso de amplificación en la PCR. Se utiliza un color para un patrón de tamaño para calibrar las posiciones de la banda con el tamaño del producto de ADN (aquí es rojo). Un asterisco identifica todos los verdaderos alelos de los microsatélites en las figuras siguientes.

A

B

C

D

100

125

150

175

200

A Un rendimiento ideal: Los dos alelos de este heterocigoto son uniformes en altura y fáciles de distinguir de los "picos de tartamudeo" adyacentes a ellos - durante la PCR algunos productos son de 1, 2 ó 3 repeticiones cortas debido a errores en la replicación (similar a la mutación escalonada) y aparecen como picos espaciados uniformemente con una altura decreciente a la izquierda del verdadero pico. Algunos loci muestran tartamudez extensiva y otros prácticamente ninguno. Las bandas de tartamudeo son útiles para distinguir los productos de microsatélites de los productos no específicos o no objetivo. Observe que hay "picos de pull-up" en la sección verde del espectro. El pull-up se debe principalmente al solapamiento espectral en los espectros de emisión de los colorantes que el secuenciador registra como un falso pico en un color diferente. Este es un artefacto común del proceso de análisis del secuenciador de ADN que puede crear confusión en algunas situaciones. B Dos ejemplos de salidas más complicadas: El genotipo azul es un heterocigoto pero los 2 alelos son sólo una repetición diferente en tamaño. Esto crea un patrón característico para los loci con tartamudeo en los que el segundo pico es más alto que el primero debido a la intensidad aditiva del primer pico de tartamudeo del alelo más grande y el pico real del alelo más pequeño. Si los dos primeros picos fueran iguales en altura, sería difícil determinar si el

el genotipo tiene uno o dos alelos. Una pista es que hay 4 picos de tartamudeo a la derecha del pico más grande en lugar de 3 (asumiendo que el patrón de la parcela A es característico del locus azul). El segundo locus de esta gráfica se muestra con tinte negro y tiene alelos más grandes. Este locus no tiene tartamudez quizás porque hay pocas repeticiones de modo que la Taq polimerasa no comete errores paso a paso. Este genotipo también es heterocigoto, pero el alelo más grande es débil. Los alelos más grandes suelen presentar al menos picos ligeramente más cortos porque la PCR es menos eficaz para los productos más largos. Aquí, el alelo más grande es tan pequeño que podría ser fácilmente pasado por alto o confundido con ruido. Si se cargara menos producto de PCR en el gel, podría no aparecer en absoluto - en cuyo caso sería un ejemplo de "gran pérdida de alelos", otra fuente común de recuentos de homocigocidad inflados. C Más ejemplos: Cuando se cargan varios loci en el mismo carril de gel para mayor eficiencia, o se amplifican juntos en una reacción PCR "multiplex", los picos alélicos pueden solaparse y a veces ser fáciles de pasar por alto. Aquí los loci verdes y azules comparten un tamaño de alelo. La distinción de los verdaderos alelos se hace aún más difícil debido a la aparición de picos de pull-up de color verde. Si el producto de alelo verde fuera menos intenso que el producto de alelo azul (en lugar de igual como se muestra aquí), podría confundirse con un pico de estiramiento. Si se vuelve a ejecutar el locus verde por separado en estos casos, se minimizará el error de puntuación. Aquí también, el locus azul muestra dos alelos que difieren en un par de bases. Las alturas son las mismas porque este lugar no muestra un tartamudeo fuerte. Pero el locus azul muestra pequeños picos flanqueantes - el lado izquierdo es un tartamudeo muy tenue, por lo que sólo se puede ver el pico de tartamudeo más grande, y el lado derecho puede ser un "A-Tail", cuando el Taq agrega un nucleótido de adenina extra en algunas copias del producto, aumentándolo en 1 pb. No se confundirá con un alelo de microsatélite porque no se produciría una diferencia de altura extrema para dos alelos de tamaño tan cercano, ya que sus eficiencias de amplificación deberían ser similares. El locus negro es un homocigoto. Aunque hay un pequeño pico negro en el lado izquierdo de la parcela, un alelo más pequeño casi nunca es más corto que un alelo más grande. Una pista adicional es que el pico negro más grande es bastante gordo y alto - la PCR produce aproximadamente el doble de la cantidad de producto cuando un alelo es homocigótico porque no compite por la Taq con un segundo alelo. El locus púrpura representa un problema de "pico dividido" que ocurre por las altas tasas de A- Tailing por la Taq. Los picos "+A" se dan en todos los picos de tartamudez, lo que dificulta la puntuación, especialmente en los heterocigotos con alelos de gran tamaño. Aunque el verdadero alelo se denota aquí, un lugar con alelos que se parecen al púrpura sería demasiado difícil de puntuar de forma fiable. Por lo general, el problema se puede corregir añadiendo un paso de extensión adicional al programa de PCR que da tiempo a la Taq para añadir un A-Tail a todas las copias del producto de forma consistente (haciendo que todos los alelos y el tartamudeo aumenten de tamaño en 1 pb de su longitud real). D Loci inescrutables: El locus azul es un "estegosaurio" con un tartamudeo inaceptablemente alto. El locus negro tiene demasiados picos de artefactos inespecíficos como para elegir de forma fiable los alelos de los microsatélites. El locus verde se ha sobrecargado en el gel o tiene una concentración de producto de PCR inusualmente alta y se está manchando en el carril.

Apéndice S3. Citas de los documentos utilizados para generar el Cuadro 3. Examinamos los artículos más recientes de las revistas Molecular Ecology and Evolution y elegimos los primeros 25 de cada revista, en orden cronológico inverso de los números de julio de 2005, que utilizaban microsatélites para evaluar los rasgos ecológicos y genéticos de una o varias especies. Se excluyeron los estudios que utilizaron marcadores de microsatélites tomados de estudios de investigación previamente publicados para minimizar la posibilidad de que algunas pruebas se realizaran previamente y por lo tanto no se informaran en el estudio actual. A continuación, se examinaron estos documentos para estimar la frecuencia y los resultados del cribado de marcadores notificado, tal como se explica en la Parte III del texto y en el Cuadro 2. Ecología Molecular Astanei, I., Gosling, E., Wilson, J. & Powell, E. (2005). Variabilidad genética y filogeografía del mejillón cebra invasor, Dreissena polymorpha (Pallas). Molecular Ecology, 14, 1655-1666. Baums, I.B., Miller, M.W. & Hellberg, M.E. (2005). Poblaciones aisladas regionalmente de un coral caribeño en peligro, Acropora palmata. Molecular Ecology, 14, 1377-1390. Bottin, L., Verhaegen, D., Tassin, J., Olivieri, I., Vaillant, A. & Bouvet, J.M. (2005). Diversidad genética y estructura poblacional de un árbol insular, Santalum austrocaledonicum en el archipiélago de Nueva Caledonia. Ecología molecular, 14, 1979-1989. Bowen, B.W., Bass, A.L., Soares, L. & Toonen, R.J. (2005). Implicaciones para la conservación de una estructura de población compleja: lecciones de la tortuga boba (Caretta caretta). Molecular Ecology, 14, 2389-2402. Charmantier, A. & Reale, D. (2005). ¿Cómo afectan las paternidades mal asignadas a la estimación de la heredabilidad en la naturaleza? Molecular Ecology, 14, 2839-2850. Colautti, R.I., Manca, M., Viljanen, M., Ketelaars, H.A.M., Burgi, H., Macisaac, H.J. & Heath, D.D. (2005). Invasion genetics of the Eurasian spiny waterflea: evidence for bottlenecks and gene flow using microsatellites. Molecular Ecology, 14, 1869-1879. Fredsted, T., Pertoldi, C., Schierup, M.H. & Kappeler, P.M. (2005). Los análisis de microsatélites revelan una estructura genética a escala fina en lémures de ratón gris (Microcebus murinus). Molecular Ecology, 14, 2363-2372. Funk, W.C., Blouin, M.S., Corn, P.S., Maxell, B.A., Pilliod, D.S., Amish, S. & Allendorf, F.W. (2005). La estructura de la población de la rana manchada de Colombia (Rana luteiventris) está fuertemente afectada por el paisaje. Molecular Ecology, 14, 483-496. Goossens, B., Chikhi, L., Jalil, M.F., Ancrenaz, M., Lackman-Ancrenaz, I., Mohamed, M., Andau, P. & Bruford, M.W. (2005). Patrones de diversidad genética y migración en poblaciones cada vez más fragmentadas y en declive de orangutanes (Pongo pygmaeus) de Sabah, Malasia. Molecular Ecology, 14, 441-456. Hauswaldt, J.S. & Glenn, T.C. (2005). Genética poblacional de la tortuga diamante (Malaclemys terrapin). Molecular Ecology, 14, 723-732. Jones, K.L., Krapu, G.L., Brandt, D.A. & Ashley, M.V. (2005). Estructura genética de la población en las grullas migratorias de las montañas de arena y el papel de las glaciaciones del Pleistoceno. Molecular Ecology, 14, 2645-2657. Keeney, D.B., Heupel, M.R., Hueter, R.E. & Heist, E.J. (2005). Análisis de ADN microsatélite y mitocondrial de la estructura genética de los viveros de tiburón punta negra (Carcharhinus limbatus) en el Atlántico noroccidental, el Golfo de México y el Mar Caribe. Molecular Ecology, 14, 1911-1923. Magalon, H., Adjeroud, M. & Veuille, M. (2005). Los patrones de variación genética no se correlacionan con la distancia geográfica en el arrecife de coral Pocillopora meandrina en el Pacífico Sur. Molecular Ecology, 14, 1861-1868. Maki-Petays, H., Zakharov, A., Viljakainen, L., Corander, J. & Pamilo, P. (2005). Cambios genéticos asociados a la disminución de las poblaciones de hormigas formica en un paisaje forestal fragmentado. Molecular Ecology, 14, 733-742. McRae, B.H., Beier, P., Dewald, L.E., Huynh, L.Y. & Keim, P. (2005). Las barreras del hábitat limitan el flujo de genes e iluminan los eventos históricos en un carnívoro de amplio rango, el puma americano. Molecular Ecology, 14, 1965-1977. Mesquita, N., Hanfling, B., Carvalho, G.R. & Coelho, M.M. (2005). Filogeografía del ciprínido Squalius aradensis y sus implicaciones para la conservación de la fauna endémica de agua dulce del sur de Portugal. Molecular Ecology, 14, 1939-1954. Michaux, J.R., Hardy, O.J., Justy, F., Fournier, P., Kranz, A., Cabria, M., Davison, A., Rosoux, R. &

Libois, R. (2005). Genética de conservación e historia de la población del visón europeo amenazado

Mustela lutreola, con énfasis en la población de Europa Occidental. Molecular Ecology, 14, 2373-2388. Otero-Arnaiz, A., Casas, A., Hamrick, J.L. & Cruse-Sanders, J. (2005). Variación genética y evolución de Polaskia chichipe (Cactaceae) bajo domesticación en el Valle de Tehuacán, México central. Molecular Ecology, 14, 1603-1611. Oyler-McCance, S.J., Taylor, S.E. & Quinn, T.W. (2005). Un estudio genético de la población multilocal del área de distribución de la enfermedad. Molecular Ecology, 14, 1293-1310. Shrivastava, J., Qian, B.Z., McVean, G. & Webster, J.P. (2005). Un vistazo a la variación genética de Schistosoma japonicum en la China continental utilizando marcadores de microsatélites de ADN. Molecular Ecology, 14, 839-849. Spear, S.F., Peterson, C.R., Matocq, M.D. & Storfer, A. (2005). Genética paisajística de la salamandra tigre manchada (Ambystoma tigrinum melanostictum). Molecular Ecology, 14, 2553-2564. Sutherland, D.R., Spencer, P.B.S., Singleton, G.R. & Taylor, A.C. (2005). Interacciones de Kin y cambios en la estructura social durante un brote de población de ratones domésticos salvajes. Molecular Ecology, 14, 2803- 2814. Westneat, D.F. & Mays, H.L. (2005). Pruebas de los factores espaciales y temporales que influyen en la paternidad extra-pareja en mirlos de alas rojas. Molecular Ecology, 14, 2155-2167. Whitehead, A., Anderson, S.L., Kuivila, K.M., Roach, J.L. & May, B. (2003). Variación genética entre poblaciones interconectadas de Catostomus occidentalis: implicaciones para distinguir los impactos de los contaminantes de la estructuración biogeográfica. Molecular Ecology, 12, 28172833. Wright, T.F., Rodriguez, A.M. & Fleischer, R.C. (2005). Dialectos vocales, dispersión sesgada por sexo y estructura de la población de microsatélites en el loro Amazona auropalliata. Molecular Ecology, 14, 1197-1205.

Evolució n Allendorf, F.W. & Seeb, L.W. (2000). Concordancia de la divergencia genética entre las poblaciones de salmón rojo en aloenzimas, ADN nuclear y marcadores de ADN mitocondrial. Evolución, 54, 640-651. Arnegard, M.E., Bogdanowicz, S.M. & Hopkins, C.D. (2005). Múltiples casos de sorprendente similitud genética entre peces eléctricos alternos señalan morfos en simpatría. Evolución, 59, 324-343. Bacles, C.F.E., Burczyk, J., Lowe, A.J. & Ennos, R.A. (2005). Patrones de apareamiento históricos y contemporáneos en poblaciones remanentes del árbol forestal Fraxinus excelsior L. Evolution, 59, 979-990. Castric, V., Bonney, F. & Bernatchez, L. (2001). Estructura del paisaje y diversidad genética jerárquica en el arroyo charr, Salvelinus fontinalis. Evolución, 55, 1016-1028. Chapuisat, M., Bocherens, S. & Rosset, H. (2004). Número de reina variable en las colonias de hormigas: No hay impacto en la rotación de reinas, la consanguinidad y la diferenciación genética de la población de la hormiga Formica selysi. Evolución, 58, 1064-1072. Clarke, K.E., Rinderer, T.E., Franck, P., Quezada-Euan, J.G. & Oldroyd, B.P. (2002). La africanización de las abejas melíferas (Apis mellifera L.) de Yucatán: Un estudio de un evento de hibridación masiva a través del tiempo. Evolución, 56, 1462-1474. Dutech, C., Maggia, L., Tardy, C., Joly, H.I. & Jarne, P. (2003). Seguimiento de una señal genética de eventos de extinción-recolonización en una especie arbórea neotropical: Vouacapoua americana aublet en francés guiana. Evolución, 57, 2753-2764. Evans, B.J., Supriatna, J. & Melnick, D.J. (2001). Hibridación y genética poblacional de dos especies de macacos en Sulawesi, Indonesia. Evolución, 55, 1686-1702. Goodisman, M.A.D. & Crozier, R.H. (2002). Estructura genética de la población y colonia de la termita primitiva Mastotermes darwiniensis. Evolución, 56, 70-83. Hansson, B., Westerdahl, H., Hasselquist, D., Akesson, M. & Bensch, S. (2004). ¿El desequilibrio de los enlaces genera correlaciones heterocigocidad-aptitud física en los grandes carriceros? Evolución, 58, 870-879. Hendry, A.P., Taylor, E.B. & McPhail, J.D. (2002). La divergencia adaptativa y el equilibrio entre la selección y el flujo de genes: El lago y el arroyo se agolpan en el sistema nebuloso. Evolución, 56, 1199-1216.

Heuertz, M., Hausman, J.F., Hardy, O.J., Vendramin, G.G., Frascaria-Lacoste, N. & Vekemans, X. (2004). Los microsatélites nucleares revelan patrones contrastantes de la estructura genética entre los países occidentales.

y del sudeste de Europa de la ceniza común (Fraxinus excelsior L.). Evolución, 58, 976-988. Hoffman, J.I., Boyd, I.L. & Amos, W. (2003). Estrategia reproductiva masculina y la importancia de la situación materna en el lobo fino antártico Arctocephalus gazella. Evolución, 57, 1917-1930. Hufford, K.M. & Hamrick, J.L. (2003). Selección de la viabilidad en tres etapas tempranas de la vida del árbol tropical, Platypodium elegans (Fabaceae, Papilionoideae). Evolución, 57, 518-526. Lampert, K.P., Lamatsch, D.K., Epplen, J.T. & Schartl, M. (2005). Evidencia de un origen monofilético de los clones triploides de la molly amazónica, Poecilia formosa. Evolución, 59, 881-889. Noor, M.A.F., Pascual, M. & Smith, K.R. (2000). Variación genética en la propagación de Drosophila subobscura de una población sin equilibrio. Evolución, 54, 696-703. Peakall, R., Ruibal, M. & Lindenmayer, D.B. (2003). El análisis de autocorrelación espacial ofrece nuevas perspectivas sobre el flujo genético en la rata australiana Rattus fuscipes. Evolución, 57, 1182-1195. Pujolar, J.M., Maes, G.E., Vancoillie, C. & Volckaert, F.A.M. (2005). Growth rate correlates to individual heterozygosity in the european eel, Anguilla anguilla L. Evolution, 59, 189-199. Scribner, K.T., Arntzen, J.W., Cruddace, N., Oldham, R.S. & Burke, T. (2001). Environmental correlates of toad abundance and population genetic diversity. Biol. Conserv., 98, 201-210. Storz, J.F. (2002). Contrasting patterns of divergence in quantitative traits and neutral DNA markers: analysis of clinal variation. Molecular Ecology, 11, 2537-2551. Storz, J.F., Bhat, H.R. & Kunz, T.H. (2001). Genetic consequences of polygyny and social structure in an Indian fruit bat, Cynopterus sphinx. I. Inbreeding, outbreeding, and population subdivision. Evolution, 55, 1215-1223. Thelen, G.C. & Allendorf, F.W. (2001). Heterozygosity-fitness correlations in rainbow trout: Effects of allozyme loci or associative overdominance? Evolution, 55, 1180-1187. Turgeon, J. & Bernatchez, L. (2001). Clinal variation at microsatellite loci reveals historical secondary intergradation between glacial races of Coregonus artedi (Teleostei: Coregoninae). Evolution, 55, 2274-2286. Vargo, E.L. (2003). Hierarchical analysis of colony and population genetic structure of the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes, using two classes of molecular markers. Evolution, 57, 2805-2818. Vassiliadis, C., Saumitou-Laprade, P., Lepart, J. & Viard, F. (2002). High male reproductive success of hermaphrodites in the androdioecious Phillyrea angustifolia. Evolution, 56, 1362-1373.