Metodos De Estudio Y Control De Los Microorg

MÉTODOS DE ESTUDIO Y CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS

Dra. M. E. Arias Fernández Dpto. Microbiología y Parasitología E-mail: [email protected]

PROGRAMA • Métodos de observación de los microorganismos
El microscopio. Tipos de microscopios. Preparación y examen de muestras. Tipos de tinciones.

• Métodos de aislamiento de los microorganismos • Crecimiento de los microorganismos:







•

Nutrición microbiana: requerimientos nutritivos Cultivo de los microorganismos: medios de cultivo Crecimiento microbiano: curva de crecimiento Determinación del crecimiento. Influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento Microorganismos extremófilos

Control de poblaciones microbianas:
Métodos físicos: Esterilización y otros métodos
Métodos químicos: desinfectantes, antisépticos y esterilizantes
Agentes antimicrobianos: antibióticos y quimioterapéuticos de síntesis

MÉTODOS DE OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS PROTOZOOS BACTERIAS VIRUS

HONGOS ALGAS

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO MICROSCOPIO ÓPTICO VIRUS 1 nm

10

SUBVIRICAS

102

BACTERIAS 103

EUCARIOTAS 104

1 µm

RANGO DE TAMAÑO DE LOS MICROORGANISMOS

105

106 1 mm

TIPOS DE MICROSCOPIOS • Microscopio óptico:






Microscopio de campo claro Microscopio de campo oscuro Microscopio de contraste de fases Microscopio de fluorescencia Microscopio de láser confocal

• Microscopio electrónico:
De barrido
De transmisión

• Microscopio de fuerza atómica (AFM)

EL EL MICROSCOPIO MICROSCOPIO ÓPTICO ÓPTICO

CAMPO CLARO

CAMPO OSCURO

CONTRASTE DE FASES

FLUORESCENCIA

CONFOCAL

EL EL MICROSCOPIO MICROSCOPIO ELECTRÓNICO ELECTRÓNICO MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (SEM) Haz de electrones que “barre” la superficie de un objeto sólido

Resolución: < 7nm MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (TEM) Haz de electrones que atraviesa cortes ultrafinos de una muestra

Resolución: 5 Å

Manipulando átomos...

Microscopio de efecto túnel Microscopio de fuerza atómica Obtiene imágenes con resolución de menos de 1 nm

Observación de una espora de Aspergillus oryzae atrapada en un poro con microscopio de fuerza atómica

TIPOS TIPOS DE DE TINCIONES TINCIONES TINCIÓN TINCIÓN SIMPLE SIMPLE

TINCIÓN TINCIÓN DIFERENCIAL DIFERENCIAL TINCIÓN DE Ziehl-Neelsen

TINCIÓN DE GRAM

TINCIONES TINCIONES ESPECÍFICAS ESPECÍFICAS TINCIÓN DE CÁPSULA

TINCIÓN DE FLAGELOS

TINCIÓN DE ESPORAS

MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS

MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS

• Siembra por estría en placa Petri • Vertido en placa • Extensión en placa: - Diluciones seriadas - Asa de Digralsky

MÉTODOS MÉTODOS DE DE AISLAMIENTO AISLAMIENTO DE DE CULTIVOS CULTIVOS PUROS PUROS SIEMBRA POR ESTRÍA EN PLACA DE PETRI

MÉTODOS MÉTODOS DE DE AISLAMIENTO AISLAMIENTO DE DE CULTIVOS CULTIVOS PUROS PUROS DILUCIONES SERIADAS

Extensión en placa

Vertido en placa

MEDIOS DE CULTIVO


Medios definidos
Medios complejos
Medios selectivos
Medios diferenciales
Medios selectivos y diferenciales
Medios de enriquecimiento

MEDIOS DE CULTIVO COMPOSICIÓN DE UN MEDIO DEFINIDO Y UN MEDIO COMPLEJO • Medio definido       

Glucosa…………. 10 g (NH4)2SO4…………. 2 g CaCl2 ……….......0,01 g FeSO4.7H2O…..0,005 g MgSO4.7H2O…..0,02 g Agua destilada…… 1 L Agar……………… 15 g

• Medio complejo: caldo nutritivo Peptona…………… 5 g Extracto de carne.. 3 g NaCl…………………8 g Agua destilada…….1 L

MEDIOS DE CULTIVO Medios selectivos y diferenciales

Agar BairdParker

Agar Entérico de Hektoen (Enterobacterias patógenas)

(Estafilococos)

Agar Levine (EMB) (Coliformes)

Agar Wilson-Blair (Salmonella)

Medios de enriquecimiento

Caldo Giolitti-Cantoni (Estafilococos)

Caldo Müller-Kauffmann (Salmonella)

CRECIMIENTO Y CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS

NUTRICIÓN NUTRICIÓN MICROBIANA: MICROBIANA: REQUERIMIENTOS REQUERIMIENTOS NUTRITIVOS NUTRITIVOS
Fuente de carbono: - CO2: Autótrofos - Compuestos orgánicos: heterótrofos


Fuente de energía: generación de ATP y poder reductor - Luz: fototrofos - Compuestos químicos: quimiotrofos - compuestos orgánicos: quimioorganotrofos - compuestos inorgánicos: quimiolitotrofos


Tipos nutricionales de los microorganismos:  Fotoautótrofos  Fotoheterótrofos  Quimiolitotrofos autótrofos  Quimiolitotrofos heterótrofos: mixotrofos  Quimioorganotrofos heterótrofos (quimioheterótrofos)

CADENA CADENA METABÓLICA: METABÓLICA: ETAPAS ETAPAS

1- ENTRADA DE NUTRIENTES

CADENA CADENA METABÓLICA: METABÓLICA: ETAPAS ETAPAS

2- REACCIONES CATABÓLICAS

CADENA CADENA METABÓLICA: METABÓLICA: ETAPAS ETAPAS

3- BIOSÍNTESIS

CADENA CADENA METABÓLICA: METABÓLICA: ETAPAS ETAPAS

4- POLIMERIZACIÓN

CADENA CADENA METABÓLICA: METABÓLICA: ETAPAS ETAPAS

5- ENSAMBLAJE

FUENTE DE NITRÓGENO (Nitrosomonas, Nitrobacter)

(Azotobacter, Cianobacterias)


Inorgánica: - NH4+ - NO3- N2

(Clostridium, fototrofas rojas y verdes) (Bacillus, Pseudomonas)


Compuestos orgánicos nitrogenados: - aminoácidos - bases nitrogenadas, etc.

OTROS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
Fósforo: Fosfato


Azufre: - SO4 2- SH2 - Compuestos orgánicos azufrados

(Thiobacillus, Beggiatoa,Fototrofos erobios)

(Desulfovibrio, Desulfobacter)

(Desulfuromonas, Archaea term.) (B. Fototróficas rojas y verdes)


K, Mg, Na, Ca, Fe, etc.
Micronutrientes: Cr, Co, Cu, Mn, Mo, etc.
Factores de crecimiento: vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas, etc.

CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES

• División celular en procariotas Fisión binaria

1 2 3 4

El tiempo para completar el ciclo depende de factores nutricionales y genéticos

1.

Contraste de fases

2.

Tinción de nucleoide

3.

Tinción del anillo FtsZ

4.

Tinción de nucleoide y anillo

CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES

• Crecimiento de poblaciones - Velocidad de crecimiento - Tiempo de generación - Expresión del crecimiento Crecimiento exponencial de un cultivo bacteriano que se inicia con una sola célula y que tiene un tiempo de generación de 30 min:

Datos de una población que se duplica cada 30 minutos

Datos representados en distintas escalas

CRECIMIENTO CELULAR Y DE POBLACIONES

• Curva de crecimiento: sus fases

DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO RECUENTO DIRECTO AL MICROSCOPIO

TURBIDIMETRÍA

DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO RECUENTO DE VIABLES

EFECTO EFECTO DE DE FACTORES FACTORES AMBIENTALES AMBIENTALES SOBRE SOBRE EL EL CRECIMIENTO CRECIMIENTO

• Temperatura

Tasa de Crecimiento

Reacciones enzimáticas a la máxima velocidad posible Reacciones enzimáticas incrementando sus velocidades de reacción

Gelificación de membrana; proceso de transporte demasiado lento para soportar el crecimiento

Desnaturalización de Proteínas; Colapso de la membrana; citoplasmática; lisis térmica

Temperatura mínima y óptima

EFECTO EFECTO DE DE FACTORES FACTORES AMBIENTALES AMBIENTALES SOBRE SOBRE EL EL CRECIMIENTO CRECIMIENTO

• Temperatura

Tipos de microorganismos según su temperatura óptima

Termófilos Mesófilos

Psicrófilos

Hipertermófilos

Hipertermófilos

EFECTO EFECTO DE DE FACTORES FACTORES AMBIENTALES AMBIENTALES SOBRE SOBRE EL EL CRECIMIENTO CRECIMIENTO

Salinidad

Halófilo: discretos (1-6 %) y moderados (6-15 %) de NaCl  Halotolerante: crecen en amplio rango de actividad de agua Halófilos extremos: 17-36 % NaCl

Anaerobios aerotolerantes

Microaerófilos

Facultativos

Anaerobios

Aerobios

Medio Medio concon tioglicolato tioglicolato y y resazurina resazurina

Tipos de microorganismos en relación con el oxígeno

CULTIVO DE ANAEROBIOS

Catalizador (Pd) 2H2+O2

2H2O H2

Radicales tóxicos del oxígeno

Pyrococcus furiosus

Enzimas que destruyen radicales tóxicos del O2

MÉTODOS MÉTODOS DE DE CONTROL CONTROL MICROBIANO: MICROBIANO: TERMINOLOGÍA TERMINOLOGÍA
Esterilización: destrucción total de formas vivas/material inerte
Desinfección: destrucción/inhibición de agentes infecciosos en estado vegetativo en material inerte desinfectantes
Antisepsia: destrucción/inhibición de agentes infecciosos en estado vegetativo en la superficie de tejidos vivos antisépticos
Saneamiento: reducción población microbiana en material inerte o tejidos vivos hasta niveles seguros limpieza mecánica/productos
Quimioterapia: control crecimiento microbiano dentro de un hospedador agentes quimioterapéuticos antimicrobianos

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

• Métodos físicos: esterilización por calor
Calor seco  Flameado (incineración)

 Horno Pasteur (170°C/ 1-2h)

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

• Métodos físicos: esterilización por calor
Calor húmedo  Hervido (100°C)

 Esterilización a temperatura ultraelevada (UHT)

 Tindalización (100°C)  Vapor de agua a presión: el autoclave (121°C/ 20min)

 Pasteurización: Reducción de población microbiana y alargamiento vida útil

HTST: 71-72°C durante 15 seg.

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Métodos físicos: esterilización por filtración
Filtración de soluciones termosensibles


Filtración del aire:  Algodones en los tubos de vidrio, mascarillas  Filtro de alta eficacia de retención de partículas (HEPA)  Cabinas de seguridad biológica de flujo laminar  Habitaciones especiales de hospitales (inmunosuprimidos)

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Métodos físicos: esterilización por radiación
Depende de la energía (λ), intensidad y duración


Radiaciones utilizadas:  IONIZANTES (λ < 200nm) (60Co

137Cs)

 Rayos γ y  Rayos de electrones  Rayos X

 NO IONIZANTES (λ > 200nm)  Luz UV (λ = 260nm)  Microondas

Suministros quirúrgicos, medicamentos, materiales de laboratorio, industria alimentos, productos cárnicos

Desinfección de superficies, aire, etc.

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Métodos físicos: otros métodos
Control por bajas temperaturas  Congelación  Refrigeración (0-5°C)


Desecación  Evaporación (Industria alimentaria)  Liofilización (conservar cultivos, hemoderivados, etc)


Soluciones hipertónicas (salazón, miel, mermeladas, etc)

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

• Métodos químicos Propiedades de los agentes químicos: 1. 2. 3. 4. 5.

Inocuo para las personas y no corrosivo para materiales Amplio espectro Eficaz a diluciones altas y en presencia de materia orgánica Soluble en agua Estable, inodoro y económico Tipos de agentes químicos:
Antisépticos
Desinfectantes
Esterilizantes

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

• Métodos químicos Principales grupos de antisépticos: AGENTE

APLICACIÓN



Alcohol (60-85% etanol)

Piel



Fenoles (hexaclorofeno,

Jabones, lociones, cosméticos y desodorantes



Detergentes catiónicos



Peróxido de hidrógeno al 3%

Piel



Compuestos de yodo (Betadine)

Piel



Nitrato de Plata

Ojos neonatos

triclosan, clorhexidina) (cloruro de benzalconio)

Jabones y lociones

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

• Métodos químicos Principales grupos de desinfectantes y esterilizantes AGENTE

APLICACIÓN



Alcohol (60-85% etanol)

Instrumental médico



Gas Cloro

Suministro de agua



Compuestos Clorados

Industria alimentaria (equipos)



Detergentes catiónicos



Formaldehído (3-8%)

Superficies



Sulfato de cobre

Algicida



Óxido de etileno (gas)

Esterilizante de material termosensible

(amonio cuaternario)

Instrumental médico, alimentos y equipos de industria lácteas

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

• Métodos químicos Agentes antimicrobianos: antibióticos y quimioterapéuticos de síntesis

Antibiogramas

Howard Florey y Ernst Chain Alexander Fleming

Penicilinas Sulfanilamida Gerhardt Domagk

Bacteriostático

Bactericida

Tipos de agentes antimicrobianos

Bacteriolítico

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO Antibióticos: microorganismos productores
Bacterias  Actinomicetos (4600)  Bacillus (950)
Hongos (1600)
Plantas 5Metoxihidrocarpaina


Animales

PROBLEMAS ACTUALES EN TERAPIA


Aumento de resistencias:  Abuso y mal uso de los antibióticos  Enfermedades crónicas


Soluciones:  Uso restringido de los antibióticos

 Búsqueda de nuevos antimicrobianos

 Mejora de los ya existentes