Cap 30 - Metodos De Estudio De Bacterias Y Virus

METODOS DE ESTUDIO DE BACTERIAS Y VIRUS DIAGNOSTICO Gabriela Algorta INTRODUCCION Uno de los propósitos de la Microbiología médica es trabajar en asociación con la clínica para brindar un diagnóstico y un manejo adecuado de las enfermedades infecciosas de los pacientes, así como prevenir la diseminación de la infección a otros individuos. En general es importante documentar la presencia de infección, determinar su naturaleza específica, y orientar la terapéutica adecuada temprano en el curso de la enfermedad. La buena calidad de esta labor lleva implícita actividades propias de laboratorio pero también otras. 1. Criterio de selección de exámenes a solicitar por los clínicos, 2. recolección, rotulado y transporte de las muestras, 3. evaluación de las muestras y tests de laboratorio, 4. procedimientos que conducen a verificar los resultados, 5. apropiado uso de los resultados por los médicos para el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades infecciosas. Existen una gran variedad de métodos que se utilizan para el diagnóstico de laboratorio de las infecciones microbianas. Estas incluyen examen directo, aislamiento por cultivo, detección de antígenos y ácidos nucleicos, y tests serológicos para detectar la respuesta en anticuerpos del individuo a la infección. No hay un único abordaje que llene las necesidades de diagnóstico microbiológico, por lo que debe implementarse una combinación de métodos. La elección de los mismos dependerá de diferentes factores que incluyen el conocimiento de las patogénesis de los agentes sospechados, el estado de la enfermedad y la disponibilidad y utilidad de los diferentes métodos para la infección particular en cuestión. ESTRATEGIA DE LA ELECCION DE LOS METODOS El laboratorio de Microbiología deberá tener a disposición del clínico todos los tests necesarios para el diagnóstico y la atención de la población de pacientes a servir. Pero no todos los tests pueden realmente ser realizados por el laboratorio; éste deberá decidir cuáles realizará, cuáles enviará a un laboratorio de referencia y cuál laboratorio usará.

Las necesidades de los pacientes dictarán el número y variedad de métodos que el laboratorio ofrecerá. Basado en estudios numéricos históricos y predictivos de los tests solicitados, el laboratorio puede discontinuar tests poco utilizados, que resultan caros y de poca calidad. Por otra parte, antes de decidir implementar un nuevo test diagnóstico éste deberá ser seleccionado. El conocimiento de la población deberá influir esta decisión, ya que un test varía en cuanto a su eficiencia para detectar un resultado positivo en relación con la prevalencia de esta enfermedad en la población. Comúnmente las medidas de performance de un test incluyen sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivo y negativo. Inherente a la determinación de sensibilidad y especificidad de un test es el concepto del "gold standard" o patrón de oro, contra el que el test se compara. No siempre esto es realizable. Existen, por ejemplo, nuevos tests de detección de antígenos como son los ensayos para virus respiratorio sincicial que pueden ser más sensibles e igual de específicos que el cultivo convencional. En tales circunstancias no debe juzgarse la performance de un test contra métodos standard. Estando las condiciones dadas para una comparación con standards, la sensibilidad y la especificidad de un método es independiente de la población de pacientes a testar. De esta forma los laboratorios no necesitan realizar grandes estudios de evaluación de nuevos tests y utilizarán evaluaciones llevadas a cabo por microbiólogos competentes y respetados y publicados en literatura científica. La elección de un test a realizar deberá basarse en la performance publicada y la utilidad detectada por el laboratorio, de acuerdo a la prevalencia percibida desde el laboratorio de la enfermedad en cuestión en la población a atender. Es conveniente definir en este momento sensibilidad y especificidad. La sensibilidad de un test diagnóstico puede tener definiciones diferentes: puede explicar la habilidad de un test para detectar muy pequeñas cantidades de lo analizado (por Ej.: Anticuerpos). Una segunda definición es la habilidad de un test para detectar casos positivos (ausencia de falsos negativos). Otra definición es la probabilidad de que un test sea positivo cuando la enfermedad está presente. La especificidad de un test es la habilidad de este

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para identificar correctamente a todos los negativos (ausencia de falsos positivos). Otra definición es la probabilidad de que un test sea negativo cuando la enfermedad no está presente. Por otra parte, la eficacia de un test es la habilidad general de detectar correctamente todos los positivos y todos los negativos. Es una combinación de sensibilidad y especificidad y da una idea de la eficacia total de un test. Aunque citaremos frecuentemente ejemplos de bacterias o virus, en este capítulo nos referiremos fundamentalmente a las muestras y los métodos de estudio de las bacterias; en otro capítulo se hace especial referencia a los métodos aplicados en Virología. RECOLECCION Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS La utilidad de un procedimiento analítico está directamente influida por la calidad de la muestra. La primera apreciación a realizar es si la muestra es representativa de la enfermedad que se considera. Por ejemplo: si el paciente tiene una neumonía es incorrecto realizar un exudado faríngeo para aislar el germen causal porque las muestras respiratorias altas no son representativas de infecciones del aparato respiratorio inferior, los gérmenes que causan estas infecciones son habitantes normales de la flora de la nasofaringe. Tampoco es correcto en enfermos con otitis media buscar el germen en el exudado nasal, por las mismas razones. En las neumonías se puede aislar el germen de la sangre, ya que son enfermedades que pueden cursar con bacteriemia, o del líquido pleural si está presente. En otitis media se puede aislar el germen del líquido del oído medio por punción de la membrana del tímpano. Los materiales provenientes de sitios normalmente estériles son siempre muestras excelentes, cuando las tomas se realizan en condiciones adecuadas. Para estudio de gérmenes anaerobios, nunca se deben recoger muestras contaminadas con flora, en general, los gérmenes anaerobios forman parte de la flora normal y su aislamiento en muestras recogidas en contacto con piel o mucosas son de imposible interpretación. En la recolección de las muestras el médico debe tener en cuenta que para hacer una toma es fundamental la transmisión adecuada de las indicaciones y que estas sean racionales para que aquellos que las deban realizar sepan y entiendan lo que deben hacer (personal de enfermería, técnicos de laboratorio, etc.). En la selección de qué muestra se debe realizar, debe considerarse la representatividad como ya fue mencionado. Por otra parte, debe siempre prepararse el sitio de extracción de la muestra. Si se realiza una punción, desinfección correcta de la piel; si es un estudio de orina, limpieza de la región y recolección de la mitad de la micción, etc.

Las muestras se recogerán en recipientes estériles, con tapa de rosca, serán bien rotuladas con los datos del paciente y la información de las características de la muestra (líquido pleural, pus de absceso de muslo, exudado faríngeo, etc.). Luego de extraída la muestra, debe ser enviada al laboratorio para su procesamiento. En general se acepta que el tiempo que transcurra entre la toma y su procesamiento en el laboratorio no debe exceder las 4 hs. Existen formas de conservar las muestras cuando debe transcurrir un período de tiempo más largo. La utilización de medios de transporte para la conservación de muestras extraídas con hisopo, es de uso corriente en nuestro medio. Cuando se sospecha Neisseria gonorrhoeae en exudado uretral o Shigella sp en materias fecales, por ejemplo, es necesario proteger estas muestras frente a la desecación o cambios de pH que se producen naturalmente, debido a la interacción de los diferentes componentes en muestras con flora. Es importante destacar en este momento que es frecuente recibir materiales inadecuados -por diferentes razones- para estudio microbiológico. Describiremos algunas de estas solicitudes no racionales: - Hemocultivos: - muestras únicas - más de tres muestras en 24hs Las muestras únicas de sangre dificultan la interpretación, en el laboratorio, al aislar gérmenes de la flora normal de piel y no poder evaluar si se trata de una contaminación en el momento de la extracción de la muestra o dicho germen se encuentra en el origen de la enfermedad del paciente. - Muestras seriadas Para la mayoría de las muestras no debe realizarse tomas seriadas que recargan innecesariamente el trabajo del laboratorio y no aportan nuevos datos de interés. - Muestras inadecuadas de heridas o secreciones respiratorias. Si estas muestras presentan un predominio de células epiteliales sobre el resto de la población celular, no son representativas del estudio que se pretende. - Otras muestras como: muestras de objetos y superficies inanimados exudados de lesiones de boca contenido intestinal abscesos perirectales colostomías exudados de lesiones de decúbito puntas de sondas vesicales o catéteres pleurales. Entre los requisitos para una correcta recolección de las muestras debe tenerse en consideración: - Estas deben realizarse previo al inicio de la antibióticoterapia. Un ejemplo demostrativo es la realización de la punción lumbar en meningitis aguda

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supurada. En esta grave situación, luego del diagnóstico clínico, se realiza en primer lugar la punción para diagnóstico citoquímico y bacteriológico y luego, sin esperar los resultados, se inicia el tratamiento. Posteriormente, con los resultados obtenidos en las mejores situaciones, se podrá ajustar la terapéutica o adoptar otras conductas que se encuentren pertinentes. - La muestra se dirigirá a buscar el germen en el sitio donde este se halle y se buscará que la muestra se encuentre exenta de contaminación externa, para lo que el técnico deberá brindar al paciente la instrucción necesaria. - Se deberá tener en cuenta la etapa de la enfermedad; por ejemplo para aislar Salmonella typhi en la fiebre tifoidea, se podrá hacerlo de la sangre en los primeros días de enfermedad, pero a medida que avanza el tiempo, esta posibilidad se aleja y habrá que recurrir a otras muestras tales como materias fecales que tienen menor significación clínica. - La muestra deberá tener un volumen suficiente para su procesamiento y ser recogida en recipiente rotulado y limpio por fuera. Es imperativo el que sea acompañada de datos clínicos. - El envío debe realizarse en forma rápida preservando la muestra de temperaturas extremas y desecación. Para ello se utilizan medios de transporte como ya fue mencionado. Los hisopos son de diferentes materiales: algodón, Alginato, etc. Existe la posibilidad de que algunos de ellos sean tóxicos para algunas especies bacterianas y se desaconseja su uso para algunas muestras. En general, los hisopos de algodón son de uso generalizado, teniendo en cuenta que pueden contener ácidos grasos no saturados inhibitorios para N. gonorrhoeae, por lo que se recomiendan de Alginato de Calcio o de Dacron para muestras uretrales. METODOS CONVENCIONALES Y RAPIDOS TRADICIONALES Y NO TRADICIONALES El cultivo y la identificación de los patógenos específicos a partir de los materiales recogidos de los pacientes en los que se sospecha que tengan una infección es todavía la mejor herramienta diagnóstica disponible, aunque no es la más rápida. En algunos casos esto resulta difícil, y, a veces, es imposible, por ejemplo en rickettsiosis o en sífilis. En esos casos debe recurrirse a la serología u otros métodos, ya sea por que no se conocen las condiciones necesarias para su cultivo in vitro por los riesgos que implica la manipulación de estos microorganismos. Se dispone en la actualidad de técnicas para detectar y cuantificar diversos marcadores específicos de enfermedades infecciosas. Por un lado, técnicas inmunológicas para cuantificación de inmunoglobulinas específicas o detección de antígenos en tejidos; por otro, el más

espectacular avance que es el comienzo de la introducción de la genética molecular en el laboratorio clínico. MICROSCOPIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LAS 4 ENFERMEDADES INFECCIOSAS El microscopio de luz es una de las herramientas más útiles en el diagnóstico. Aun hoy día con el desarrollo de métodos rápidos -muchos de los cuales requieren instrumentos complicados o reactivos caros- la simple visualización microscópica de muestras clínicas es todavía la más rápida y específica forma de orientar un diagnóstico clínico. En el capítulo práctico de morfología y estructura bacteriana se describen en detalle los diferentes métodos microscópicos. Basta recordar la utilidad del examen en fresco para la visualización de algunas bacterias (Ej.: campo oscuro para Treponema) y las muestras fijadas y coloreadas por coloraciones simples o diferenciales, como son las coloraciones de Gram o de Ziehl-Neelsen. Microscopía de fluorescencia Con los mismos principios de óptica, las diferencias están relacionadas con la generación y transmisión de luz útil para la excitación de colorantes fluorocromos o de fluorescencia natural de los microorganismos. Algunos microorganismos producen luz luego de haber absorbido luz ultravioleta. Otros lo hacen luego de haber tomado un fluorocromo, por ejemplo: bacterias ácido-alcohol resistentes. Por último, otros producen luz, luego de la unión del antígeno a un anticuerpo conjugado previamente con un colorante fluorescente, por ejemplo: Chlamydia, virus respiratorio sincicial. Microscopía electrónica Utiliza electrones en lugar de luz. Se utiliza en el diagnóstico de agentes virales de gastroenteritis, pero es caro para uso rutinario. CULTIVO Y AISLAMIENTO DE PATOGENOS VIRALES El cultivo es todavía el patrón de oro ("gold standard") y permanecerá como herramienta importante de diagnóstico. Permite, además, identificar el microorganismo aislado y realizar estudios de sensibilidad a los antimicrobianos. Para el microbiólogo el dilema es decidir cuál o cuáles de los microorganismos aislados en una muestra clínica están involucrados en la enfermedad en cuestión. Son pocos los microorganismos a los cuales el término "patógeno" puede aplicarse invariablemente, definiendo patógeno aquel microorganismo que siempre que se encuentra está causando una enfermedad infecciosa. La mayoría pueden integrar la flora del huésped y ésta es dinámica en su composición. Por lo

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tanto, es interesante definir los sitios estériles y los que poseen flora, no existiendo categorías claras que delimiten entre especies patógenas e inocuas. Las conclusiones se basarán en los criterios establecidos para un buen procesamiento del material. Como regla general, la elección de métodos y medios de cultivo se ajusta a la naturaleza y origen de la muestra y a los interrogantes que se pretende responder. Por ejemplo: Pus de absceso drenado. ¿Qué microorganismos están presentes como agentes causales? Se supone que cualquier microorganismo presente puede ser el agente causal y que el tratamiento dirigido hacia él debe resultar beneficioso. La estrategia debe ser: recuperar cualquiera y todos los medios de cultivo y enriquecimiento. En contraste con este enfoque abierto, algunos cultivos se realizan para determinar si un patógeno particular está presente o no. Por ejemplo: Exudado faríngeo. ¿Qué microorganismos están presentes como agentes causales? S. pyogenes. La estrategia debe ser: único agente tratable y cultivable. El método: se debe utilizar medios de cultivo sólo para S. pyogenes. De esto se desprende que existe una variedad muy importante de medios de cultivo con propósitos diferentes. Por un lado tenemos medios simples que permiten el desarrollo de microorganismos con una gran capacidad metabólica, que de pocos nutrientes son capaces de extraer todo lo necesario para multiplicarse. Por el contrario, existen medios complejos que agregan diferentes sustancias necesarias a algunos microorganismos. También los medios de cultivo pueden definirse como determinados, aquellos que tienen su composición químicamente definida, o aquellos no bien definidos. Para el cultivo pueden utilizarse medios de cultivo diferenciales que ponen en evidencia alguna característica metabólica de algún grupo de bacterias. También pueden utilizarse medios selectivos que inhiban el desarrollo de algunos microorganismos, permitiendo el desarrollo particular de otros. Por último, los medios de enriquecimiento son medios líquidos que facilitan el desarrollo de algunos microorganismos inhibiendo flora asociada y modificando la relación cuantitativa entre estos. El aislamiento posterior en medios sólidos permite la recuperación de estas bacterias. En el laboratorio clínico al realizar estos cultivos debe tenerse en cuenta su sensibilidad para las diferentes muestras. No es lo mismo el diagnóstico de infección urinaria por medio del urocultivo (técnica de muy buena sensibilidad) y la sensibilidad del cultivo de esputo para el diagnóstico de neumonía, técnica de muy baja sensibilidad.

Otro elemento importante a tener en cuenta es la valoración de resultados positivos. ¿El germen aislado de un sitio normalmente estéril es un contaminante? ¿forma parte de la flora normal de otros sitios en el huésped? Un ejemplo interesante es cuando se realiza una única muestra de hemocultivo y se aísla S. epidermidis; se trata de un aislamiento de sangre, sitio normalmente estéril, de un germen habitante normal en la piel del ser humano. Es imperativo en estas situaciones tener más de una muestra para poder interpretar estos resultados y definir si es una contaminación accidental o el microorganismo aislado es el responsable del proceso patológico. Por último, el aislamiento del germen permitirá completar el estudio con la identificación de éste y realizar los estudios necesarios para determinar la sensibilidad del mismo a los antimicrobianos. METODOS ALTERNATIVOS Otros métodos pueden utilizarse en forma alternativa a los cultivos. Ellos tienen ventajas y desventajas con respecto a éstos. La especificidad puede ser imperfecta. Otra gran desventaja es la incapacidad de estudiar aún más el patógeno en cuestión, como lo permite el tener el germen aislado. Por otra parte, pueden ser más sensibles, permitiendo llegar a un diagnóstico con cultivos negativos. Además se realizan en un tiempo menor. Inmunoquímicos Estos ensayos se basan en la detección de anticuerpos (Ac) específicos que permiten señalar a determinado microorganismo como presente en una infección. La otra posibilidad es la detección de antígenos (Ag) solubles en los materiales patológicos. Son todas reacciones de tipo Ag-Ac. La especificidad de los antisueros de uso corriente en el laboratorio suele ser muy variada. En general, los microorganismos son un mosaico de antígenos expuestos. Desde el punto de vista de su especificidad podemos encontrar tres tipos de inmunoglobulinas. Por ejemplo: supongamos que dos bacterias A y B son diferentes. Que la bacteria A presenta en su superficie 3 Ag diferentes. Que la bacteria B posee un Ag idéntico a A, un Ag propio y único y un Ag con reacción cruzada con A. Un antisuero policlonal contra la bacteria A reconocerá a A en todos sus Ag, pero también reconocerá a B por el Ag idéntico y por aquel con el que tiene reacción cruzada. Si pensamos en un antisuero monoespecífico contra el Ag en que B tiene reacción cruzada con A, también reconocerá las dos bacterias. Por reconocimiento específico y por reacción cruzada. Por último, un Ac monoclona sólo reconocerá a A, ya que no hay posibilidades de reacción cruzada. Es importante destacar que, en general, todas las

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pruebas mejoran en especificidad y sensibilidad con la utilización de Ac monoclonales y su utilización debe ser valorada junto a necesidades, costos, etc. Existen técnicas diferentes para la detección de Ag o de Ac. En este capítulo sólo las nombraremos, ya que están descriptas en otros. Todas se basan en diferentes formas de poner en evidencia una reacción Ag-Ac. La contrainmunoelectroforesis (CIE) fue de las primeras en utilizarse. Se basa en la carga negativa que presentan los Ag bacterianos en medio alcalino cuando son sometidos a una corriente eléctrica, los Ac permanecen neutros. Esta técnica es poco utilizada en la actualidad por ser menos sensibles a las desarrolladas posteriormente y de mayor costo económico. Otras técnicas muy utilizadas y de sencilla realización son las que se basan en aglutinación de partículas: la aglutinación de Látex o la coaglutinación, que utiliza S. aureus y su proteína A fijadora de inmunoglobulinas. Las técnicas inmunoenzimáticas (ELISA) utilizan Ac unidos a enzimas que catalizan reacciones colorimétricas son de uso corriente. Las técnicas inmunomicroscópicas que utilizan la fluorescencia (IF) se describieron oportunamente; son también utilizadas para la detección de Ag o Ac. Mención aparte debe realizarse de la técnica de Western blot, que reconoce componentes proteicos de un microorganismo separados por electroforesis. Permite la detección de Ac específicos para cada uno de los componentes. Se utiliza para HIV y se describe en otro capítulo. La interpretación de los tests serológicos que detectan Ac tienen como concepto central el aumento del título. El título de Ac es la recíproca de la mayor dilución del suero del paciente, en que los Ac son aun detectables. Los pacientes con cantidades grandes de Ac tienen títulos altos, ya que los Ac serán detectables aun a diluciones muy altas del suero. Los pacientes con respuesta humoral íntegra aumentarán el título de Ac durante la enfermedad. Se debe, por lo tanto, realizar 2 extracciones de suero con un intervalo de 2 semanas para poder detectar las modificaciones en el título, que para ser significativas deben ser cuatro veces mayores (2 diluciones). En algunas infecciones se pueden necesitar períodos de tiempo mayores para evidenciar los cambios. Una forma alternativa es la detección de IgM específica. Como método directo, la detección de antígenos es de uso corriente en el laboratorio para el diagnóstico de agentes de meningitis, para la detección de Ag de S. pyogenes en la faringe y para numerosos virus (CMV, VRS y otros virus respiratorios). Como método indirecto para la detección de

anticuerpos contra el patógeno se utiliza, sobre todo en Brucelosis y Fiebre Tifoidea, en infecciones por Chlamydia o Mycoplasma y en infecciones virales (Hepatitis, HIV). Diagnóstico de las infecciones basado en los ácidos nucleicos En los últimos años ha ganado aceptación en el laboratorio clínico el uso de técnicas basadas en la hibridización de los ácidos nucleicos. La combinación del reconocimiento de fragmentos de ácidos nucleicos por medio de sondas y la amplificación previa continúan en desarrollo. En general, el ADN nativo (blanco) es desnaturalizado por calor, y a él se agrega la sonda consistente en un fragmento de ADN marcado. Se permite una nueva unión, donde la sonda de ADN hibridizará con el ADN blanco si hay homología, permitiendo, gracias al marcado, la emisión de una señal. El marcado puede ser con radioisótopos o con sustancias trazables con enzimas, en forma similar a como fue descripto para los tests inmunoenzimáticos. La utilidad de estas técnicas estará dada por las condiciones de trabajo y de la sonda elegida que si es específica dará mejores resultados. Esto se puede combinar con la fragmentación del ADN con endonucleasas, la separación de los fragmentos por electroforesis, la transferencia de los geles a membranas y la posterior hibridización con sondas marcadas (Southern blot). La amplificación previa de los fragmentos a hibridar por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), aumenta notablemente la sensibilidad de las técnicas de detección de ADN. Aunque todavía costosos, estos métodos de Microbiología Molecular, ya tienen su espacio en el laboratorio clínico. Son útiles en la investigación de importantes patógenos bacterianos como Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia spp, Mycoplasma, así como la detección de genes de resistencia a algunos antibióticos, por ejemplo, meticilino resistencia de S. aureus y betalactamasas de N. gonorrhoeae. En Virología han introducido importantes cambios en el diagnóstico de enfermedades tales como la encefalitis herpética.

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