Metabolismo Microbico

METABOLISMO MICROBICO Parecchi aspetti del metabolismo microbico sono comuni a quelli degli organismi superiori: ad esempio il trasporto di elettroni associato alle reazioni di ossido-riduzione, o l’uso della molecola di ATP (adenosina trifosfato) come principale fonte di energia chimica e forma di utilizzazione dell’energia. Le varie analogie sono alla base della teoria dell’unitarietà biochimica tra gli esseri viventi (Kluiver, 1925) e i batteri sono stati spesso usati come modello sperimentale per studi di reazioni biochimiche, essendo essenzialmente identiche, dal punto di vista molecolare, con quelle degli altri organismi. Tuttavia nei microrganismi, e nei procarioti in particolare, sono presenti parecchi tipi di processi (ad esempio, per generare energia) che sono sconosciuti negli organismi superiori. I microrganismi sono caratterizzati da una grande versatilità metabolica, sia tra le varie specie sia all’interno della stessa specie o ceppo. Ad esempio, E. coli può produrre energia per respirazione o fermentazione, può utilizzare l’O2 come accettore finale di elettroni (respirazione aerobia) o al contrario respirare in condizioni anaerobiche utilizzando un diverso accettore terminale di elettroni, inoltre può utilizzare il glucosio e il lattosio come fonte di carbonio ottenendo tutte le biomolecole necessarie (aminoacidi ecc.). Da un punto di vista nutrizionale e metabolico esistono, per semplificare, tre principali gruppi di microrganismi: 1. Gli eterotrofi chemiorganotrofi 2. I chemioautotrofi o chemiolitotrofi 3. I fotosintetici

1.Gli eterotrofi chemiorganotrofi In questo caso l’energia si ottiene per ossidazione dei composti organici. I carboidrati (il glucosio in particolare) sono i più comuni composti organici utilizzati sia come fonte di energia sia come fonte di carbonio. L’ossidazione di questi composti ha come risultato la sintesi di ATP come fonte di energia chimica utilizzabile per tutti i processi vitali. L’ATP può essere generato con un processo di fosforilazione a livello di substrato, o con un processo di fosforilazione ossidativa. Il primo caso è tipico della fermentazione: in tale processo si ha un’ossidazione non completa della molecola 1

organica e l’accettore finale di elettroni è un’altra molecola organica interna allo stesso processo. Quando l’ossidazione della molecola organica è completa e l’accettore finale di elettroni è l’O2 si parla di respirazione (aerobia in questo caso). L’ossidazione completa del glucosio coinvolge tre vie biochimiche: a) la glicolisi (via di Embden Meyerhof Parnas) b) il ciclo degli acidi tricarbossilici (ciclo di Krebs) c) la fosforilazione ossidativa. La glicolisi è una delle possibili vie, nei procarioti, di utilizzazione del glucosio ed è un processo comune anche al metabolismo anaerobico e fermentativo.

Glicolisi

Figura 1. La via Embden Meyerhof. Tale via è comune anche al metabolismo anaerobico e fermentativo

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Ritornando alla fermentazione, è bene fissare alcuni concetti che riguardano questo processo. Si tratta di un’ossidazione parziale di una molecola organica; il NAD+ (nicotinammide adenina dinucleotide) è sempre ridotto a NADH che funge da trasportatore di elettroni; l’eccesso di NADH è un fattore limitante del processo fermentativo e il pool di NAD+ è rigenerato con la riduzione di un composto organico interno al processo; l’acido piruvico è un intermedio fondamentale nel processo fermentativo; l’energia (ATP) è prodotta con reazioni di fosforilazione a livello di substrato; le rese energetiche sono basse e vanno da un minimo di 1 ATP a un massimo di 4 ATP. A partire dall’acido piruvico è possibile ottenere vari prodotti finali che distinguono le varie fermentazioni batteriche. Nella fermentazione omolattica l’unico prodotto finale è l’acido lattico che si ottiene per riduzione diretta dell’acido piruvico e quindi rigenerazione di NAD+. Questa fermentazione è tipica di Lactobacillus sp ed è usata per ottenere vari prodotti alimentari (yogurth ecc.). La fermentazione acido-mista è tipica degli Enterobatteri. I prodotti finali sono un miscuglio di acidi organici (acido lattico, acetato, acido propionico ecc.), alcool (l’etanolo si ottiene per decarbossilazione dell’acido piruvico e riduzione dell’acetaldeide ad opera del NADH) e gas (CO2, H2 ). Nella fermentazione butanediolica, oltre al miscuglio di acidi, alcool e gas, prima descritta, si forma il butanediolo per condensazione di due molecole di acido piruvico. L’uso di questa via causa il decremento della formazione di acidi (il butanediolo è neutro) e la formazione di un particolare intermedio, l’acetoino. Coloro che si occupano di analisi microbiologica dell’acqua possono distinguere i coliformi fecali (fermentazione acido mista) dai coliformi non fecali (formazione di butanediolo tipica di generi come Klebsiella) andando a svelare la presenza di acetoino e un pH più alto.

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Figura 2. Fermentazioni batteriche In base alla presenza di un unico prodotto finale di fermentazione o di più prodotti, possiamo distinguere i microrganismi rispettivamente in omofermentanti o eterofermentanti. Gli eterofermentanti non usano in genere la glicolisi, ma utilizzano delle vie alternative di catabolizzazione del glucosio, come lo shunt degli esoso-monofosfati (o via dei pentoso-fosfati). In tale via si ha l’ossidazione diretta del glucosio-6 fosfato a acido 6-fosfogluconico e per decarbossilazione e ulteriore ossidazione si ha la sintesi del pentosofosfato. Il pentosofosfato, ad opera dell’enzima chiave fosfochetolasi, è scisso in 3-fosfogliceraldeide e acetilfosfato. A partire dalla 3-fosfogliceraldeide si ha la stessa sequenza di reazioni della glicolisi e quindi la formazione di acido piruvico che viene ridotto ad acido lattico. L’acetilfosfato per riduzione dà origine all’acetaldeide che verrà ridotta ad etanolo. Questa via metabolica è impiegata da alcune specie appartenenti al genere Leuconostoc e da alcune specie di Lactobacillus eterofermentanti.

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Shunt degli esoso-monofosfati (via dei pentoso-fosfati)

Figure 3. Tale via è utilizzata nella fermentazione eterolattica

Un’altra via metabolica tipica dei batteri e alternativa alla glicolisi è la via denominata EntnerDoudoroff. Questa via è tipica dei batteri aerobi-obbligati (ad esempio alcune specie appartenenti al genere Pseudomonas) che sono privi di un enzima fondamentale nel processo glicolitico, la fosfofruttochinasi (formazione del fruttosio 1-6 difosfato). Il glucosio viene ossidato a chetodeossifosfogluconato, a sua volta questa molecola viene scissa dall’enzima chiave chetodeossifosfogluconato-aldolasi, in due molecole più piccole: l’acido piruvico e la 3Pgliceraldeide. A partire dalla 3P-gliceraldeide, con le stesse modalità della glicolisi, si arriva alla formazione di acido piruvico. La via Entner-Doudoroff può essere usata come via fermentativa da batteri come lo Zymomonas sp (yeast like bacterium) che produce etanolo a partire dall’intermedio acido piruvico con le reazioni già descritte (decarbossilazione con formazione dell’acetaldeide e successiva riduzione).

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Figura 4. La via di fermentazione Entner-Doudoroff Tabella 1. Prodotti finali di alcune fermentazioni microbiche Via metabolica

Enzima -chiave

Etanolo Lattato CO2 ATP

Embden-Meyerhof

Saccharomyces

fructose1,6 diP aldolase

2

0

2

2

fructose1,6 diP aldolase

0

2

0

2

phosphoketolase

1

1

1

1

KDPG aldolase

2

0

2

1

Embden-Meyerhof

Lactobacillus Eterolattici

Streptococcus Entner-Doudoroff

Zymomonas

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La respirazione è invece un processo in cui si ha una completa ossidazione del substrato organico. Il ciclo di Krebs è richiesto proprio per tale processo: infatti, l’acido piruvico, dopo la conversione in Acetil CoA, imbocca la via degli acidi tricarbossilici, ciò conduce a una completa ossidazione del glucosio a CO2 e alla formazione di intermedi che verranno utilizzati per la biosintesi di molecole come gli aminoacidi (aspetto anabolico del ciclo di Krebs). L’accettore finale di elettroni (nella respirazione aerobica) è l’O2 che non riceve subito gli elettroni da parte del NADH, ma dopo una sequenza di passaggi in cui sono coinvolti sistemi di trasporto con un potenziale di ossidoriduzione via via sempre più positivo, fino ad arrivare alla coppia con potenziale redox più alto (O2/H2O). Tale sistema di trasporto degli elettroni (catena respiratoria) è associato alla membrana citoplasmatica (nei procarioti) e la sua costituzione varia parecchio tra una specie batterica e l’altra, oltre che tra procarioti e eucarioti. Alcuni trasportatori sono comuni, oltre al NADH reduttasi e alla Flavoproteina, il coenzima Q (unico trasportatore non proteico) e i citocromi. Nei batteri sono presenti citocromo-ossidasi multiple, mentre nei mitocondri è presente un solo tipo di citocromo-ossidasi. Tuttavia, a parte le differenze di organizzazione della catena respiratoria, la funzione è comune: al sistema di trasporto degli elettroni, attraverso trasportatori a diverso potenziale redox, è associata la formazione di un gradiente di protoni H+ tra la membrana e lo spazio periplasmatico (nei batteri), questo stato ad alta energia è denominato forza protono-motrice. L’enzima trans-membranario, ATP-asi, utilizza questo stato ad alta energia per la sintesi di ATP. Il processo di respirazione aerobica può essere schematizzato in questo modo:

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Respirazione aerobica PMF: forza protono-motrice Tratto da.: The Diversity of Metabolism in Procaryotes, Department of Bacteriology University Wisconsin, USA

La reazione generale del processo respiratorio che interessa il glucosio è: Glucosio + 6 O2 ----------> 6 CO2 + 6 H2O + energia (ATP) A tale reazione esoergonica corrispondono circa 700.000 calorie per molecola di glucosio; la produzione massima di energia utilizzabile è di 38 ATP (pari a circa 380.000 calorie), la resa energetica si avvicina quindi al 50% (il resto dell’energia viene dissipato come calore).

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Figura 5. Ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA) o ciclo di Krebs

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Figura 6. Aspetti anabolici del ciclo degli acidi tricarbossilici

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In alcune specie batteriche la completa ossidazione del substrato organico avviene utilizzando accettori finali di elettroni diversi dall’O2 . Questo tipo di respirazione in assenza di ossigeno è tipica degli anaerobi facoltativi (come Escherichia coli), di batteri del suolo (batteri denitrificanti) e degli archea. Nel caso di E.coli l’accettore finale di elettroni può essere il nitrato o un composto organico come il fumarato che viene ridotto a succinato (da notare che a differenza del processo fermentativo, la molecola organica che funge da accettori di elettroni è esterna alla via metabolica). I batteri denitrificanti appartenenti al genere Bacillus o Pseudomonas, presentano come accettare alternativo di elettroni il nitrato (NO3-), gli enzimi implicati in tale processo sono delle reduttasi: a secondo del numero di elettroni accettati si possono formare NO2-, NH3 o N2 come prodotti finali. I metanobatteri (archea) utilizzano la CO2 come accettore finale di elettroni: questo processo è la fonte principale di produzione di CH4 (metano) del pianeta. In questo caso però si tratta di un processo di produzione di energia particolare-la metanogenesi- piuttosto che di respirazione vera e propria. Altri microrganismi ( Desulfovibrio) utilizzano composti ossidati, ad esempio i solfati (SO4--), come accettori finali di elettroni, dando origine a H2S e ad altri composti ridotti dello zolfo: sia la metanogenesi, sia la riduzione dei solfati sono tipici di microrganismi che vivono in ambienti fortemente anaerobici come i sedimenti del fondo di laghi ecc. Tabella 2. Accettori di elettroni nella respirazione e metanogenesi nei procarioti Elettroni accettori Prodotto ridotto finale O2

H2O

NO3 SO4

Tipo di processo

Microrganismo

respirazione aerobica

Escherichia, Streptomyces

NO2, NH3 or N2

denitrificazione

Bacillus, Pseudomonas

S or H2S

riduzione solfati

Desulfovibrio

respirazione anaerobica fumarato

succinato

CO2

CH4

Escherichia metanogenesi

Methanococcus

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2. I chemioautotrofi o chemiolitotrofi Ai microrganismi chemioautotrofi o chemiolitotrofi appartengono batteri che utilizzano l’ossidazione di composti inorganici come fonte di energia e la CO2 come fonte di carbonio. L’energia necessaria alla riduzione della CO2 in glucosio (reazione endoergonica) non deriva dalla energia radiante (come vedremo nella fotosintesi), ma dall’ossidazione di piccoli composti inorganici. A questo gruppo di microrganismi appartengono i batteri nitrificanti che sono i principali protagonisti del ciclo dell’azoto nella biosfera. Le forme ridotte dell’azoto, NH3 o NO2, vengono convertite in una forma ossidata come NO2- o NO3- rispettivamente da batteri come Nitrosomonas o Nitrobacter . Thiobacillus denitrificans (tipico di fumarole e sorgenti calde vulcaniche) è in grado di ossidare i composti ridotti dello zolfo (H2S) e di utilizzare come accettore finale di elettroni NO 3- che viene convertito in N2: in questo caso assistiamo a un processo di denitrificazione associato all’ossidazione di un composto inorganico. Alcune specie appartenenti al genere Pseudomonas potrebbero essere classificate come “chemioautotrofe facoltative”. Infatti di solito queste specie sono chemiorganotrofe e quindi eterotrofe, ma la presenza di enzimi particolari li rende capaci di utilizzare composti inorganici come fonte di energia. Queste specie possono utilizzare H2 (idrogeno) come fonte di energia ossidandolo ad acqua: tale processo avviene grazie ad una idrogenasi che trasferisce gli elettroni al NAD+ che a sua volta li immette nel sistema di trasporto degli elettroni. Anche il Metanobacterium (Archea) può utilizzare l’idrogeno come fonte di energia e ossidarlo ad H2O.

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Tabella 3. Vari gruppi fisiologici di chemioautotrofi o chemiolitotrofi physiological group energy source oxidized end product

organism

hydrogen bacteria

H2

H2O

Alcaligenes, Pseudomonas

methanogens

H2

H2O

Methanobacterium

carboxydobacteria CO

CO2

Rhodospirillum, Azotobacter

nitrifying bacteria* NH3

NO2

Nitrosomonas

nitrifying bacteria* NO2

NO3

Nitrobacter

sulfur oxidizers

H2S or S

SO4

Thiobacillus, Sulfolobus

iron bacteria

Fe ++

Fe+++

Gallionella, Thiobacillus

Figura 6. Processi ossidativi nei chemioautotrofi

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3. I fotosintetici In realtà anche in questo gruppo sono presenti vari modelli metabolici: fotosintetici autotrofi ossigenici; fotosintetici autotrofi non ossigenici; fotosintetici eterotrofi o fototrofi facoltativi. Ai fotosintetici autotrofi ossigenici (o fotoautotrofi) appartengono i cianobatteri che hanno molti aspetti in comune, per quanto riguarda il processo fotosintetico, con le alghe e le piante. Questi microrganismi utilizzano l’energia radiante come fonte di energia e la CO2 come fonte di carbonio. L’energia luminosa viene catturata da pigmenti speciali (la clorofilla a e b, nelle piante e alghe, la clorofilla a nei cianobatteri) localizzati nella membrana interna dei cloroplasti (piante e alghe) o nella faccia interna di un sistema di membrane organizzato, nei cianobatteri. Accanto alla clorofilla che assorbe nello spettro 650-750 nm, sono tipici dei cianobatteri pigmenti accessori come i carotenoidi o le ficobiliproteine. I pigmenti sono organizzati in forma di aggregati in due fotosistemi (altro aspetto in comune tra cianobatteri, alghe e piante); l’assorbimento di un quanto di luce (fotone) passa da pigmento a pigmento fino ad arrivare al centro di reazione del fotosistema. L’assorbimento del fotone da parte del centro di reazione del fotosistema determina un salto di un elettrone a un livello energetico superiore: questo stato intermedio ad alta energia deve essere convertito in un forma utilizzabile per la cellula (energia chimica, ovvero ATP). Vediamo in che modo: l’elettrone ad alta energia viene trasportato attraverso un sistema di trasporto di membrana costituito da ferro-sulfo proteina (P430), ferrodoxine, chinone e citocromi. I due fotosistemi lavorano in modo coordinato: il fotosistema I assorbe fotoni di lunghezza d’onda superiore a 700nm, l’elettrone che viene liberato dal suo centro di reazione passa attraverso la catena dei trasportatori e raggiunge il NADP che viene ridotto a NADPH. Il buco elettronico che si determina nel fotosistema I viene colmato da un elettrone che si genera nel fotosistema II e che giunge al fotosistema I grazie al sistema dei trasportatori. L’energia che viene rilasciata durante il trasferimento dell’elettrone da un citocromo all’altro è accoppiata alla fosforilazione di ADP con sintesi di ATP (fotofosforilazione). Il buco elettronico del fotosistema II viene colmato dalla fotolisi dell’acqua, con un processo ancora poco chiaro.

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Il processo fotosintetico può essere schematizzato in questo modo:

Fase luminosa e fase oscura della fotosintesi pmf: forza protono-motrice Tratto da: The Diversity of Metabolism in Procaryotes, Department of Bacteriology University Wisconsin, USA

Per concludere, i cianobatteri utilizzano l’H2O come donatore di elettroni (in realtà la molecola riducente è il NADPH) e l’ATP generato nel processo di fotofosforilazione come fonte di energia per sintetizzare a partire dalla CO2 il glucosio (fase oscura della fotosintesi o ciclo di Calvin). La reazione generale del processo fotosintetico è:

6 CO2 + 6 H2O + energia (ATP) ----------> Glucosio + 6 O2

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Ai fotoautotrofi non ossigenici appartengono i batteri sulfurei verdi e i batteri sulfurei purpurei. Questi microrganismi utilizzano l’energia luminosa come fonte di energia e la CO2 come fonte di carbonio, ma utilizzano composti ridotti dello zolfo come donatori di idrogeno, anziché acqua e quindi il processo si svolge senza produzione di O2. Questi batteri presentano un solo fotosistema e hanno un pigmento particolare chiamato batterioclorofilla che assorbe nel range 8001100nm. I batteri verdi e i batteri purpurei non sulfurei sono dei fototrofi facoltativi, infatti possono anche utilizzare composti organici come fonte di energia ed effettuano un’efficiente respirazione in presenza di O2. Le specie più studiate appartenenti al genere Rhodospirillum e Rhodobacter utilizzano la luce come fonte di energia, ma utilizzano acidi organici come fonte di carbonio. Il processo fotosintetico è anossigenico, infatti questi batteri usano una grande quantità di composti donatori di elettroni ( ad eccezione dell’acqua e dei composti ridotti dello zolfo). Il tipico habitat di queste specie è caratterizzato da grande irradiazione solare, bassa tensione di O2 ed alta concentrazione salina (si tratta di batteri alofili). Alcune specie come Halobacterium halobium, appartenenti agli Archea, presentano un particolare pigmento proteico, chiamato batteriorodopsina, coniugato ad un retinoide che cattura la luce dando origine direttamente a un gradiente di protoni H+ attraverso la membrana, flusso che si associa alla sintesi di ATP. Questo è l’unico esempio in natura di fotofosforilazione non fotosintetica. Questi microrganismi sono normalmente eterotrofi, vivono in ambienti estremamente iperosmotici e l’alta concentrazione salina limita la disponibilità di O2 per la respirazione, così hanno sviluppato un meccanismo di produzione alternativo di ATP utilizzando la batteriorodopsina che modifica la propria conformazione, per favorire il flusso di protoni H+ espulsi in seguito alla fotoattivazione. La forza protono motrice generata dalla batteriorodopsina fotoattivata viene utilizzata anche per effettuare scambi ionici tra sodio e potassio, ciò permette la sopravvivenza di questi microrganismi in ambienti dove le concentrazioni saline sono molto alte.

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Tabella 4. Differenze nel processo fotosintetico tra cianobatteri e batteri fotoautotrofi non ossigenici cyanobacteria photosynthesis

bacterial photosynthesis

Cyanobacteria, plants, algae

purple and green bacteria

chlorophyll a

bacteriochlorophyll

absorbs 650-750nm

absorbs 800-1000nm

present

present

(noncyclic photophosphorylation)

present

absent

Produces O2

yes

no

Photosynthetic electron donor

H2O

organisms type of chlorophyll Photosystem I

(cyclic photophosphorylation) Photosystem I

H2S, other sulfur compounds or

certain organic compounds

Fase oscura della fotosintesi (Ciclo di Calvin)

Figura 8. Il ciclo di Calvin e le relazioni con la sintesi di biomolecole e materiale cellulare La riduzione di CO2 a glucosio richiede 18 ATP e 12 NADPH2

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Bibliografia

1) The Diversity of Metabolism in Procaryotes: http://www.bact.wisc.edu/Bact303/bact303metabolism 2) Bacterial Metabolism: http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch004.htm 3) Metabolism Introduction

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