Mayrani Sholihania 152210101143.docx

TUGAS UJI BIOAKTIVITAS KANDIDAT OBAT Review Jurnal “Uji Bioaktivitas Antikanker metode In Vivo dan Uji Bioaktivitas secara In Vitro metode MTT ”

Disusun Oleh: Mayrani Sholihania

152210101143

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER 2018

Jurnal 1 : Uji Senyawa Taurin Sebagai Antikanker Terhadap Jumlah Sel – Sel Leukosit

Judul

dan Sel – Sel Eritrosit Mencit (Mus Musculus L.) yang di Induksi Benzo (A) Pyren Secara In Vivo Tahun

: 2016

Penulis

: Agra Maysa, E. L. Widiastuti, N. Nurcahyani, H. Busman

Jurnal 2 Judul

: Uji Aktivitas Ekstrak Biji Sirsak (Annona muricata L.) Terhadap Sel Kanker Mamalia Secara In Vitro

Tahun

: 2014

Penulis

: Lusiana Arifianti, Sukardiman, Herra Studiawan, Rakhmawati, Lulus Megawati

Reviewer

: Mayrani Sholihania

Tanggal

: 30 Oktober 2018

Paper ini bertujuan untuk mereview 2 jurnal tentang uji bioaktifitas senyawa yang dapat berperan sebagai antikanker serta membandingkan metode yang digunakan dari kedua penelitian tersebut. Penelitian pertama bertujuan untuk mengetahui aktifitas senyawa Taurin sebagai antikanker dengan metode in Vivo. Sementara jurnal kedua bertujuan untuk uji aktivitas ekstrak Biji Sirsak (Annona muricata L.) terhadap sel kanker mamalia cecara In Vitro dengan metode MMT. Metode yang digunakan pada jurnal pertama adalah metode in vivo dimana menggunakan hewan uji mencit (Mus Musculus) jantan yang di induksi dengan senyawa Benzo (A) Pyren. Digunakan mencit karena umumnya mencit memiliki pertumbuhan yang relative cepat dan memliki komponen darah dan organ yang mirip manusia, mencit dipilih yang jantan karena pada mencit jantan tidak terlalu banyak dipengaruhi oleh hormone reproduksi. Benzo (α) pyren merupakan senyawa hidrokarbon polisiklik aromatik yang digolongkan sebaga senyawa pro karsinogen kuat yang mampu merusak DNA dan menimbulkan mutasi gengen pengatur pertumbuhan. Taurin (2-aminoethane sulphonic acid) merupakan asam amino esensial bebas yang ditemukan melimpah pada jaringan hewan. Taurin telah digunakan secara klinis dalam pengobatan berbagai penyakit seperti penyakit kardiovaskuler, hiperkolesterolemia, epilepsi, alzheimer, gangguan hati, alkoholisme, dan fibrosis, dengan tingkat keberhasilan yang beragam . Dari latar belakang tersebut, taurin diharapkan mampu bekerja dalam mereduksi sel-sel kanker

atau setidaknya bereaksi secara antagonis terhadap sel-sel kanker pada jaringan darah dengan mengujicobakannya pada hewan percobaan yang telah terinduksi zat kanker. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari: bak berbahan plastik berukuran 20 x 30 cm sebanyak 30 buah sebagai wadah pemeliharaan mencit, tempat minuman dan tempat pakan serta tutup dari kawat, neraca analitik, kertas label, tissue, jarum suntik, sonde,pemanas air dan panci untuk sterilisasi jarum suntik, gelas objek, pipet Thoma, kamar hitung, mikroskop, blood counter tabulator, tutup glass counter, gunting, pipet tetes, plat tetes, pisau, haemositometer, dan kamera digital. Sementara untuk bahan yang digunakan adalah 30 ekor mencit (Mus musculus), pakan mencit Par G, air mineral untuk minum mencit, oleum olivarum, benzo (α) pyren, aquadest, larutan Hayem (NaCl 1 g + Na2SO4 5 g + HgCl 20,5 g + aquadest 200 mL), larutan Turk (asam asetat 13 mL + gentiana violet 21 mL + aquadest 100 mL), taurin, ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) sebagai antikoagulan untuk mencegah pembekuan darah, dan giemsa. Fungsi dari larutan hayem adalah untuk mengencerkan darah, menghindari pembekuan, memperjelas bentuk eritrosit karena bayangan leukosit dan trombosit lenyap. Sedangkan fungsi dari larutan Turk adalah untuk pengenceran, melisiskan eritrosit, mencegah koagulasi darah, serta dapat berfungsi sebagai pewarna leukosit karena adanya gentian violet yang terkandung dalam larutan tersebut. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan enam jenis perlakuan. Masing-masing perlakuan menggunakan lima pengulangan. Perlakuan yang diberikan yaitu: 

Perlakuan 1 : Tidak diberi perlakuan (kontrol)



Perlakuan 2 : Diberi 0,2 mL Oleum olivarum dan aquadest sampai akhir masa penelitian (kontrol negatif)



Perlakuan 3 : Diinduksi 0,5 mL larutan benzo (α) pyren tanpa pemberian taurin (kontrol positif)



Perlakuan 4 : Diberi taurin 7,8 mg/bb mencit setiap hari selama dua minggu, kemudian diinduksi 0,5 mL larutan benzo (α) pyren selama 10 hari (preventif)



Perlakuan 5 : Setelah diinduksi 0,5 mL larutan benzo (α) pyren, diberi taurin 7,8 mg/bb mencit selama 15 hari (dosis I); Perlakuan 6 : Setelah diinduksi 0,5 mL larutan benzo (α) pyren, diberi taurin 15,6 mg/bb mencit selama 15 hari (dosis 2).

Untuk prosedur kerja yang dikerjakan dalam penelitian ini ada beberapa langkah diantaranya adalah : 1. Langkah pertama Persiapan hewan uji : Mencit yang digunakan pada penelitian ini adalah mencit jantan dari galur khusus berumur 5-7 minggu sebanyak 30 ekor dan ditempatkan di wadah yang terpisah, dengan masing-masing wadah berisi satu ekor mencit. Mencit diadaptasikan selama 15 hari dengan kondisi kandang, dengan diberi pakan Par G dan minuman air mineral secara ad libitum (sampai kenyang). 2. Lagkah kedua Persiapan senyawa taurin: Taurin yang digunakan sesuai dengan dosis yang biasa digunakan oleh manusia yaitu 3 gr/70 kgBB manusia, kemudian dikonversi ke mencit dengan nilai 0,0026 menurut tabel konversi Suhardjono (1995). Hasil konversi yang diperoleh dari perhitungan 3000 mg dikali dengan 0,0026 adalah 7,8 mg/bb/hari. Dosis yang digunakan untuk pengujian adalah 7,8 dan 15,6 mg/bb/hari. 3. Langkah ketiga Induksi zat karsinogen dilakukan dengan menyuntikkan larutan benzo (α) pyren pada jaringan subkutan mencit di bagian tengkuk. Larutan karsinogenik diperoleh dengan melarutkan 0,3 g benzo (α) pyren dengan 0,2 mL Oleum olivarum. Injeksi larutan karsinogenik dilakukan setiap hari selama 10 hari. Setelah itu, mencit diberi larutan taurin dengan cara dicekok selama 15 hari. 4. Langkah Langkah keempat Analisis data : perhitungan sel Eritrosit dan Leukosit dengan metode kamar hitung Dari metode yang dilakukan di atas di peroleh hasil bahwa jumlah rata-rata leukosit kelompok dosis 1, yaitu yang diberi taurin sebanyak 7,8 mg/bb/hari, memiliki jumlah leukosit yang lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah rata-rata leukosit kelompok kontrol, kontrol negatif, preventif, dan dosis 2. Mencit yang diberi taurin dengan dosis 15,6 mg/bb/hari (dosis 2) mengalami penurunan jumlah rata-rata leukosit yang cukup banyak hingga mendekati jumlah rata-rata leukosit kelompok kontrol negatif, yaitu kelompok mencit yang tidak diinduksi benzo (α) pyren. Adapun jumlah rata-rata eritrosit tertinggi ditemukan pada kelompok dosis 2 (diberi taurin dengan dosis 15,6 mg/bb/hari). Jumlah rata-rata eritrosit pada kelompok ini mengalami peningkatan sebesar 254 % dibanding jumlah rata-rata eritrosit pada kelompok kontrol positif.

Jumlah ini juga berada di atas jumlah normal eritrosit mencit. Hal ini diduga merupakan pengaruh dari pemberian taurin dengan dosis tersebut, di mana taurin diduga bereaksi secara antagonis dalam melawan sel kanker dengan hasil yang cukup baik, Dengan demikian senyawa taurin efektif dalam mereduksi jumlah sel-sel leukosit hingga kembali ke jumlah normal, taurin mampu meningkatkan jumlah sel-sel eritrosit pada mencit yang terkena leukemia hingga kembali ke jumlah normal. Untuk jurnal kedua penelitian menggunakan teknik in vitro dengan metode MTT. Metode ini didasarkan pada reaksi reduksi reagen MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolium bromide) yang dikatalis oleh enzim suksinat dehidrogenase yang terkandung dalam selm hidup. Prinsip pengujian ini adalah reduksi garam kuning tetrazolium MTT oleh enzim reduktase, suksinat tetrazolium yang masuk ke dalam rantai respirasi pada mitokondria sel-sel yang hidup dan membentuk kristal formazan berwarna ungu dan tidak larut air. Penambahan reagen stopper (bersifat detergenik) dapat melarutkan kristal berwarna ini yang kemudian diukur absorbansinya menggunakan elisa reader pada panjang gelombang 595 nm. Semakin besar absorbansi menunjukkan semakin banyak jumlah sel yang hidup. Sirsak telah lama diteliti sejak tahun 1940-an, semua bagian tanaman sirsak ini dapat digunakan untuk pengobatan. Kandungan fitokimia tanaman ini adalah asetogenin, alkaloid, kuinolina, isokuinolina, tanin, kumarin, prosianidin, flavonoid, amil kaproat . Senyawa bioaktif yang berasal dari tanaman sirsak Annonaceous acetogenin, telah lama diteliti dan terbukti bersifat antikanker, selain itu juga bersifat antiparasit, insektisida, anticacing, antibakteri, dan antivirus. Bahan Tanman yang digunakan adalah biji dari buah sirsak (Annona muricata Linn.), yang didapat dari Kecamatan Kepohbaru, Kabupaten Bojonegoro. Biji sirsak tersebut diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Untuk sel kanker manusia yang digunakan adalah beberapa jenis continous cell line, diantaranya yaitu sel kanker payudara (T47D), sel kanker kolon (WiDr), sel kanker serviks (HeLa) dan sel kanker nasofaring (Raji) yang diperoleh dari CCRC (Cancer Chemoprevention Research Center) Univeristas Gajah Mada, Yogyakarta Bahan Kimia yang digunakan ada Etanol 96%, Media Rosewell Park Memorial Institute (RPMI 1640) (Gibco), Fetal Bovine Serum (FBS) (Sigma), Penisilin – streptomisin (Sigma), Amfoterizin B (Sigma), Dimethyl sulfoxide (DMSO), tripsin-EDTA (Sigma) (tripsin 0,25%), Tripan Blue (Sigma), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) difenil tetrazolium bromida (MTT)

(Sigma), Sodium Duodecyl Suphate (SDS) dan Phosphat Buffer Saline (PBS) (Invitrogen). Untuk Langkah langkah melakukan pengujian pada penelitian ini antara lain adalah : 1. Sejumlah sel uji ditransfer sebanyak 1x104 sel/sumuran dalam media kultur lengkap yang terdiri dari FBS sebagai nutrisi utama sel, penisilin-sterptomisin sebagai pencegah kontaminan bakteri, amfoterizin-B sebagai pencegah kontaminan jamur dan RPMI 1640 sebagai media pembawa (volume masing-masing sumuran 100 μl) kedalam 96-well plate dan diinkubasi dalam inkubator CO2 5% semalam. 2. Selanjutnya dilakukan pemberian sampel uji dengan seri kadar dan dibuat replikasi tiga kali (triplo), kemudian diinkubasikan kembali semalam. 3. Pengujian hari ke tiga, penambahan reagen MTT, dan setelah 4 jam akan terbentuk kristal formazan pada sel yang masih hidup. Selanjutnya ditambahkan SDS stoper untuk menghentikan reaksi MTT. Kemudian dilakukan pembacaan absorbansi menggunakan elisa reader pada panjang gelombang 595nm. 4. Berdasarkan nilai absorbansi yang diperoleh dilakukan penentuan persen viabilitas sel dengan menggunakan rumus:

5. Selanjutnya bersama dengan data kadar sampel yang digunakan dilakukan penentuan nilai IC50. Nilai IC50 menunjukkan nilai konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel 50% dan menunjukkan potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap sel. Nilai ini merupakan patokan untuk melakukanuji pengamatan kinetika sel. Semakin besar harga IC50 maka senyawa tersebut semakin tidak toksik. Dari hasil penelitian diketahui bahwa ekstrak biji sirsak memiliki potensi sitotoksik terhadap semua sel uji. Kemampuan ekstrak biji sirsak menghambat pertumbuhan paling kuat terhadap sel kanker servik dengan IC50 sebesar (8,906 ± 4,497 μg/ml). Dengan demikian, ekstrak ini dapat dikembangkan sebagai pengobatan antikanker, utamanya untuk kanker servik akan tetapi perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui mekanisme ekstrak etanol daun sirsak dalam menghambat pertumbuhan sel, sehingga penggunaannya dapat tepat pada siklus proliferasi yang sesuai pada sel kanker tersebut. Dari kedua metode pada jurnal diatas ada beberapa keuntungan dan kerugian menggunakan 2 metode tersebut, antara lain adalah :

Keuntungan Metode In Vivo

-

Kerugian

Hewan uji memiliki

-

organ atau komponen darah

yang

dengan

sama

dapat

membantu yang

-

dijalankan

di

manusia

bisa

Memerlukan penanganan lebih

-

penelitian

tidak

pengerjaan

lama

manusia

sehingga

Waktu

Adanya

pengorbanan

hewan uji -

tubuh

Hasil

dapat

dipengaruhi

yang

oleh

kondisi hewan uji

sebenarnya In vitro Metode MTT

-

Waktu

pengerjaan

-

Jika

senyawa

yang

cepat

diteliti berwarna dpat

-

Lebih akurat

menyebabkan

-

Lebih sensitive

absorbansi

-

Dapat digunakan untuk

diberikan oleh sampel,

sampel dalam jumlah

sehingga

besar

menggunakan control sampel

adanya yang

harus

pada

pembacaan

saat agar

diperoleh nilai yang valid.

DAFTAR PUSTAKA Arifianti, lusiana, dkk. 2014. Uji Aktivitas Ekstrak Biji Sirsak (Annona muricata L.) Terhadap Sel Kanker Mamalia Secara In Vitro. Vol.1 No.2 Birdsall, T.C.1998.Therapeutic Applications of Taurine. Alternative Medicine Review,3(2):128136.

Doyle, A., Griffith, S .J . B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research ,49, John Willey and Sons, Ltd., New York.

Lim, T.K,. 2012. Edible Medical and Non- Medical Plant. London New York : Springer Dordrecht Heidelberg. Hal : 879-880 Maysya, Agra, dkk. 2016. Uji Senyawa Taurin Sebagai Antikanker Terhadap Jumlah Sel – Sel Leukosit dan Sel – Sel Eritrosit Mencit (Mus Musculus L.) yang di Induksi Benzo (A) Pyren Secara In Vivo.Vol. 16(2) : 68 -75. Suhardjono D. 1995. Percobaan Hewan Laboratorium. Gajah Mada University Press, Yogyakarta.