Materi Kromatografi Lapis Tipis.docx

A.

Pengertian Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan zat terlarut oleh suatu proses

migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya pembedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion. Atau secara sederhana kromatografi biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Kromatografi di gunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponen. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip ini. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin di deteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan

perbedaan kepolaran. Kromatografi lapis tipis adalah metode

pemisahan fisika-kimia dengan fase gerak (larutan pengembang yang cocok), dan fase diam (bahan berbutir) yang diletakkan pada penyangga berupa plat gelas atau lapisan yang cocok. Pemisahan terjadi selama

perambatan kapiler

(pengembangan) lalu hasil pengembangan di deteksi. Zat yang memiliki kepolaran yang sama dengan fase diam akan cenderung tertahan dan nilai Rf -nya paling kecil. Kromatografi Lapis Tipis atau TLC (Thin-Layer Chromatography) adalah metode pemisahan campuran analit dengan mengelusi analit

melalui suatu

lempeng kromatografi lalu melihat komponen atau analit yang terpisah dengan penyemprotan atau pengecatan (Gandjar dan Rohman, 2007). Metode pemisahan didasarkan pada perbedaan distribusi molekul komponen dalam dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak dengan tingkat kepolaran yang berbeda. Apabila molekul komponen berinteraksi secara lemah dengan fasa diam, maka komponen tersebut akan bergerak lebih cepat meninggalkan fasa diam. Keberhasilan pemisahan

tergantung daya interaksi komponen campuran dengan fasa diam dan fasa gerak (Hendayana, 2006). Prinsip pemisahan senyawa dengan kromatografi yaitu, adanya distribusi komponen dalam fase diam (stationer)dan fase gerak (mobile)berdasarkan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan. Persyaratan utama kromatografi antara lain: 1. Ada fase diam tidak boleh bereaksi dengan fase gerak. 2. Komponen sampel harus larut dalam fase gerak dan berinteraksi dengan fase diam. 3. Fase gerak harus bisa mengalir melewati fase diam, sedangkan fase diam harus terikat kuat di posisinya (Ardianingsih, 2009). Media pemisahan merupakan lapisan dengan ketebalan sekitar 0,1 sampai 0,3 mm pada lempeng kaca, plastik atau aluminium. Lempeng yang paling umum digunakan berukuran 8 x 2 inci. Zat padat (Fase diam) yang sering digunakan adalah alumina, gel silika dan selulosa. Fase diam yang digunakan dalam KLT adalah penjerap yang berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 μm.S emakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiennya dan resonansinya (Gandjar dan Rohman, 2007). Sampel yang digunakan berupa campuran senyawa organik yang diteteskan pada salah satu sisi lempengan dalam bentuk larutan dengan jumlah kecil, biasanya berupa mikroliter yang berisi sejumlah mikrogram senyawa.Noda sampel selanjutnya dikeringkan dan sisi lempeng (bagian bawah) dicelupkan kedalam fasa gerak yang sesuai. Pelarut akan bergerak naik disepanjang fase diam dan bersamaan dengan pergerakan pelarut, sampel dibawa dengan laju yang tergantung pada kelarutan zat terlarut dalam fasa gerak dan interaksi dengan zat padat. Setelah terbentuk noda sekitar 10 cm, lempeng dikeringkan dan noda zat terlarutnya di periksa dengan sinar UV 254 nm dan 366 nm (Underwood, 2002).

Pemilihan eluen yang tepat dapat mempengaruhi bercak noda yang dihasilkan.Eluen yang baik dapat menghasilkan bercak noda yang tidak berekor dan jarak antara noda yang muncul sangat jelas. Kromatogram yang dihasilkan dapat diuraikan dan zona-zona dicirikan oleh nilai Rf. Nilai Rf dapat dihitung dengan cara : jarak (cm)dari garis awal ke pusat zona

Rf = jarak (cm)dari garis awal ke garis depan pelarut Nilai Rf senyawa dapat dibandingkan dengan harga standar. Nilai Rf dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yang mempengaruhi gerak noda dalam KLT diantaranya adalah struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan, sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya, jenis eluennya, serta jumlah cuplikan yang digunakan tidak terlalu berlebihan (Sastrohamidjojo, 2007). Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya ditentukan dua desimal. Nilai maksimum adalah 1, artinya solut bermigrasi dengan kecepatan sama dengan fase gerak. Nilai minimum adalah 0, teramati jika solut tertahan pada posisi titik awal dipermukaan fase diam. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan komponenkomponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang. Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat langsung diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilai dari Jarak relative pada pelarut. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak tempuh oleh eluen (fase gerak) untuk setiap senyawa. Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam. Karena itu Rf juga disebut factor referensi. Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga Rf adalah : 

Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.



Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.

Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama, jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen. 

Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap. Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.



Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak. Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan

maka

perbandingan

yang

dipakai

harus

betul-betul

diperhatikan. 

Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.



Teknik percobaan. Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).



Jumlah cuplikan yang digunakan. Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahankesalahan pada harga-harga Rf.



Suhu. Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase.



Kesetimbangan. Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau

kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Sedangkan fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Pendaran ini ditutupi

pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada,

meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Namun, apabila di sinarkan dengan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap. Sementara UV tetap di sinarkan pada lempengan, harus dilakukan penandaan posisi- posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Ketika sinar UV dimatikan, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.

B. Prinsip Kerja Klt Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul. Pada kromatografi lapis tipis, Eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan ( feed ) untuk melewati fase diam (adsorbent ). Interaksi antara Adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu

pemisahan

komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “like dissolved like”. C. Fase Diam dan Fase Gerak KLT Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairanpadatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.

1. Fase Diam Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika gel atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. 2. Fase Gerak Dalam kromatografi, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan ( feed ) untuk melewati fase diam (adsorbent ). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada: Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.

D. Kelebihan Metode Kromatografi Lapis Tipis Beberapa keuntungan dari kromatografi lapis tipis ini adalah sebagai berikut : 

Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.



Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.



Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending ), menurun (descending ), atau dengan cara elusi 2 dimensi.



Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa



Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.



Hanya membutuhkan sedikit pelarut.



Waktu analisis yang singkat (15-60 menit)



Investasi yang kecil untuk perlengkapan (Biaya yang dibutuhkan ringan).



Preparasi sample yang mudah



Kemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak mungkin



Kebutuhan ruangan minimum Analisis KLT banyak digunakan karena :



Waktu yang diperlukan untuk analisis senyawa relatif pendek



Dalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif tentang konstituen utama dalam sampel



Cocok untuk memonitor identitas dan kemurnian sampel



Dengan bantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk analisis kombinasi sampel terutama dari sediaan herbal.

Aplikasi Metode KLT Dalam Bidang Farmasi Contoh penggunaan metode pemisahan secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat

paten seperti poldanmig yang beredar di pasaran

apakah memenuhi persyaratan mutu obat atau tidak. Sehingga dengan kadar yang tepat obat dapat memberikan efek terapi yang dikehendaki. Setiap komponen memiliki harga Rf sendiri-sendiri, dengan bantuan dari sinar ultraviolet maka dapat ditentukan noda yang tidak tampak oleh kasat mata. Cara yang biasa dilakukan dengan menyemprotkan KMNO4 dalam H2SO4 yang kemudian akan berinteraksi dengan komponen-komponen sampel baik secara kimia maupun berdasarkan kelarutan membentuk warna-warna tertentu. Noda kemudian dihitung harga Rf -nya. Harga Rf dihitung dengan menggunakan

perbandingan jarak yang ditempuh solut

dengan jarak yang ditempuh fase gerak. Nilai maksimum Rf adalah 1 dan nilai minimumnya 0. Dengan menggunakan silika gel sebagai fase diam, harga Rf 1 menunjukkan jika senyawa tersebut sangat nonpolar sedangkan harga Rf 0 menunjukkan bahwa senyawa tersebut sangat polar. Analisis dengan KLT juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi simplisia yang kelompok kandungan kimianya telah diketahui. Kelompok kandungan kimia tersebut antara lain : 1. Alkaloid 2. Antraglikosida 3. Arbutin 4. Glikosida Jantung 5. Zat pahit

6. Flavonoid 7. Saponin 8. Minyak atsiri 9. Kumarin dan asam fenol karboksilat 10. Valepotriat