Legge Di Ghk, Comparazione Membrana - Condensatore, Reobase E Cronassia, Canali, Canali Pre Il Sodio

LEZIONE 3: La legge, che descrive il modello fisico, che sostiene il potenziale di riposo della cellula, è l’equazione di GOLDMAN-HODGKIN-KATS (GHK). In tale legge abbiamo le permeabilità degli ioni che possono attraversare la membrana e i rapporti fra le concentrazioni degli ioni medesimi. Però l’equazione di Goldman non è l’unica equazione che descrive l’andamento di un potenziale di membrana in funzione delle concentrazioni degli ioni. Abbiamo visto che esiste anche l’equazione di Nerst, che allo stesso modo dà un valore di potenziale in funzione del logaritmo del rapporto tra le concentrazioni degli ioni. Allora facendo qualche calcolo matematico possiamo capire, innanzi tutto perché è l’equazione di Goldman quella che descrive in maniera corretta il potenziale di riposo, e poi vedere invece che informazioni ci dà l’equazione di Nerst. Sappiamo che l’equazione di Nerst dà un valore di potenziale che si chiama potenziale d’equilibrio (quindi il sistema è all’equilibrio) e dato questo potenziale d’equilibrio sappiamo che le concentrazioni ioniche dello stesso ione tra l’interno e l’esterno della cellula sono disposte in un certo modo. Quali sono gli ioni interessanti dal punto di vista dell’elettrofisiologia cellulare? Di fondamentale interesse per tali studi sono: • Sodio, • Potassio, • Cloro. Il Cloro crea qualche problema in più rispetto a Sodio e Potassio, perché il Cloro a seconda del tipo cellulare viene trattato in maniera diversa. Sostanzialmente a noi interessano Sodio e Potassio. Andiamo a vedere qual è il potenziale d’equilibrio per il Sodio e per il Potassio usando la legge di Nerst. I due valori che otterremo ci torneranno molto utili in tutta la trattazione successiva per capire come le cellule possono far variare il proprio potenziale di membrana. L’aumento della variazione del potenziale di membrana è un fenomeno elettrico che genera e poi trasferisce l’informazione da un neurone all’altro, su questo si basa tutto il funzionamento del sistema nervoso. La legge di Nerst dice che: [i]est

R*T E

=

* ln

z*F [i]int dove: E = potenziale d’equilibrio [i]est = concentrazione dello ione all’esterno della cellula [i]int = concentrazione dello ione all’interno della cellula z = valenza dello ione F = costante di Faraday R = costante dei gas T = temperatura Ora sostituiamo dentro tale espressione i valori opportuni per il Sodio e per il Potassio e calcoliamo il valore del loro potenziale d’equilibrio. Per quanto riguarda il Sodio, ad una temperatura di 37°C, che è la temperatura interna dell’uomo, abbiamo: R*T [Na]est 145 E = * ln = 61 * ln = + 66 mV z*F [Na]int 12 La concentrazione del Sodio all’esterno della cellula è 145 milliequivalenti su litro (mEq/l), che per il sodio equivale a dire millimoli litro (mmoli/l). 1

Quindi queste concentrazioni sono mmoli/l, non in mEq/l. Il potenziale d’equilibrio per il Sodio è quindi un valore intorno ai + 66 mV. Il potenziale di riposo della membrana però non può essere dovuto al potenziale d’equilibrio per il Sodio, perché se così fosse il potenziale di riposo della membrana dovrebbe essere a + 66 mV, visto che noi nella cellula e fuori abbiamo questa distribuzione di Sodio. Dal momento che noi abbiamo un potenziale di riposo della cellula pari a –90 mV, tale valore non può essere dovuto ad un equilibrio per il Sodio. Allora la seconda ipotesi è: il potenziale di riposo della cellula è dovuto al potenziale d’equilibrio per il Potassio. Di nuovo stessa legge vista in precedenza, utilizzando questa volta i valori del Potassio: [K]est

R*T E

=

* ln

= 61 * ln [K]int

z*F

4 = - 97 mV 155

(i numeri sono diversi a seconda dei testi) Svolgendo i conti risulta che il potenziale d’equilibrio del Potassio è attorno ai –97 mV in condizioni normali. Il risultato è negativo perché il rapporto è frazionario: 4 = 0.0258 155 e quindi il logaritmo di questo rapporto è negativo. Essendo il potenziale di riposo della cellula –90 milliVolt, questo risultato non può essere dovuto al potenziale d’equilibrio del Potassio. Ecco perché la soluzione è, infatti, che il potenziale di riposo della cellula non è un potenziale d’equilibrio, perché non è né l’equilibrio del sodio né l’equilibrio del potassio, ma è un potenziale d’equilibrio diffusionale dove gli ioni continuamente diffondono dentro e fuori dalla cellula. La somma totale di tutti questi flussi dal punto di vista delle cariche è uguale a zero, quindi il potenziale non varia, rimane costante, ma non è una situazione d’equilibrio. È molto più vicina al potenziale d’equilibrio del Potassio, perché il Potassio è quello che permea di più nelle membrane; molto più lontano dal potenziale d’equilibrio del Sodio, ma non è uguale né all’uno né all’altro perché il potenziale di riposo è un potenziale diffusionale e non d’equilibrio. A questo punto può sorgere una domanda. L’equazione di Goldman, che è un’equazione che dà un potenziale diffusionale spiega e descrive molto bene il potenziale di riposo, ma come fanno le concentrazioni ioniche a mantenersi costanti, se gli ioni continuamente diffondono dentro e fuori dalla cellula? Se fosse un potenziale d’equilibrio sarebbe molto più semplice; questi ioni sono distribuiti con queste concentrazioni perché l’equilibrio di Donnan ci spiega come mai esistono queste concentrazioni, e il potenziale elettrico che noi troviamo è dovuto all’equilibrio di Donnan. Questo potenziale è il potenziale che noi troviamo a cavallo di una membrana se lo ione che stiamo considerando è in equilibrio secondo quello che dice Donnan.Quindi è molto più facile capire perché in questo caso le concentrazioni rimangono costanti: siamo in equilibrio, non c’è flusso netto di quello ione, quindi la concentrazione rimane costante. È un po’ più difficile capire come fanno a rimanere costanti le concentrazioni ioniche, cioè, il Potassio o altro all’interno della cellula, e il Sodio o altro fuori, se continuamente il Potassio esce dalla cellula e il Sodio entra. Oltre a tutti questi movimenti ionici che sono passivi esiste una proteina di membrana che invece utilizza energia per compiere il suo lavoro ed è la pompa Sodio-Potassio o ATPasi Sodio Potassio. 2

Tale pompa, trovasi quasi dappertutto, è quella che fornisce energia per tanti fenomeni cellulari: trasporto di sostanze, trasporto d’amminoacidi, riassorbimenti.

Nel caso dei neuroni, delle cellule eccitabili, la pompa Sodio- Potassio per ogni molecola di ATP che viene idrolizzata per ciclo, espelle tre ioni Sodio dalla cellula verso l’esterno ed importa simultaneamente due ioni Potassio dall’esterno all’interno della cellula.

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Perché deve fare questo? Noi abbiamo alto Potassio all’interno della cellula, alto Sodio all’esterno della cellula. Il potenziale di riposo della cellula è di – 90 milliVolt, allora vuol dire che se fosse – 97 mV la cellula non perderebbe né acquisterebbe Potassio, perché sarebbe il potenziale d’equilibrio del Potassio. Dal momento che il potenziale all’interno della cellula è più positivo, è – 90 e non – 97 milliVolt, il Potassio tende ad uscire dalla cellula. È chiaro che se io nella cellula ho un potenziale più positivo, il Potassio, che è uno ione positivo, cerca di uscire da questo ambiente. Quindi a riposo la cellula costantemente perde Potassio. Cosa succede al Sodio? Il potenziale d’equilibrio del Sodio è +66 milliVolt, se il potenziale di riposo della cellula nervosa fosse + 66 milliVolt, la cellula non perderebbe né acquisterebbe Sodio, perché si troverebbe al potenziale d’equilibrio per il Sodio. Dal momento che il potenziale di riposo della cellula è – 90 milliVolt, quindi molto più negativo, il Sodio (che è caricato positivamente) per gradiente elettrochimico tende a penetrare nella cellula. Quindi a riposo, il Potassio esce continuamente e il Sodio entra continuamente nella cellula. È per questo che non è una situazione d’equilibrio, ma è un potenziale di tipo diffusionale: perché continuamente il Potassio esce e il Sodio entra all’interno della cellula. Se non c’è nessun meccanismo che mantiene costanti le concentrazioni ioniche dopo un po’ il Potassio finirà di uscire dalla cellula, perché si raggiungerà una nuova situazione d’equilibrio, e il Sodio non entrerà più nella cellula per lo stesso motivo. Allora la pompa Sodio- Potassio serve a mantenere le concentrazioni di Sodio e di Potassio al loro valore perché porta fuori dalla cellula tre ioni Sodio che sono entrati e riporta in cellula due ioni Potassio che sono usciti, per ogni ciclo di idrolisi di ATP. Quindi vedendo la situazione con gli occhi di Donnan e del suo equilibrio, l’ATPasi Sodio-Potassio impedisce che il Sodio e il Potassio raggiungano le concentrazioni d’equilibrio, perché se lo facessero il potenziale di membrana avrebbe un valore o del potenziale d’equilibrio del Potassio o del potenziale d’equilibrio del Sodio (oppure 0). Di fatto la ATPasi Sodio-Potassio continua a mantenere le concentrazioni di Sodio e di Potassio, a cavallo della membrana, lontane da quelle che sarebbero le concentrazioni d’equilibrio. In questo modo fa sì che i flussi di Sodio e di Potassio rimangano costanti nel tempo e non si esauriscano. Dal momento che deve pompare ioni Sodio contro gradiente elettrochimico e ioni Potassio contro gradiente elettrochimico l’energia necessaria per questo tipo di trasporto arriva dall’idrolisi dell’ATP; deve fare un lavoro contro il gradiente elettrochimico. Tutti questi processi sono passivi, tutte le diffusioni degli ioni sono passive, però la pompa dal momento che fa fluire degli ioni contro gradiente elettrochimico necessariamente deve utilizzare dell’altra energia per vincere il gradiente elettrochimico, quindi idrolizza l’ATP. Guardando la stechiometria si può notare come siano 3 le cariche positive che escono contro 2 cariche positive che entrano. Quindi, di fatto, il funzionamento della pompa Sodio-Potassio non è neutro; dal punto di vista elettrico il funzionamento della pompa produce una corrente di ioni positivi che escono dalla cellula. Di conseguenza in minima parte ance la ATPasi Sodio- Potassio contribuisce al valore di potenziale di riposo della cellula. Infatti oltre ad avere questo flusso continuo di Potassio in uscita, questo flusso continuo di Sodio in entrata, abbiamo anche una carica positiva per ciclo di idrolisi di ATP che esce dalla cellula. E quindi si dice che tale pompa è elletrogenica perché trasporta ioni con stechiometria diversa e ad ogni ciclo porta fuori una carica positiva, contribuisce quindi a rendere un po’ più negativo il potenziale di riposo. Di conseguenza questo valore di –90 mV è dato sì dall’equazione di Goldman a cui però bisogna sommare il modesto effetto elettrogenico da parte della pompa Sodio-Potassio. CARATTERISTICHE PASSIVE DELLE MEMBRANE CELLULARI Trattiamo ora questo discorso, perché capire qual è il comportamento elettrico passivo di una membrana cellulare ci aiuterà poi a capire due fenomeni molto importanti della fisiologia dei neuroni: 4

1)l’integrazione a livello della sinapsi 2)la propagazione del potenziale d’azione, l’impulso che poi viene propagato lungo la fibra. Questi due aspetti sono fondamentali perché l’integrazione sinaptica permette , ad esempio, ad un motoneurone di decidere se far contrarre un muscolo o meno, il motoneurone alla fine somma tutto quello che gli arriva e tramite un meccanismo che si chiama integrazione sinaptica decide se far contrarre o no il muscolo. Per far contrarre il muscolo deve far partire un impulso che è il potenziale d’azione e questo si deve propagare. Quindi le caratteristiche passive della membrana cellulare ci spiegano come avviene l’integrazione sinaptica e come avviene la propagazione del potenziale d’azione. Due fenomeni indispensabili per capire qualsiasi processo che sta alla base della vita; senza il funzionamento del sistema nervoso centrale, difficilmente si riesce a sopravvivere.

CONDENSATORE

RESISTORE

Q C= V

I dove: C = capacità Q = carica V = d.d.p.

g = R V R =

C = 1 µF/ cm2 nelle membrane biologiche

I

dove: V = d.d.p. I = corrente (Ampere) 5

I = dQ/ dt quindi: I=g*V Membrana cellulare, un doppio strato lipidico il cui spessore è fra i 3-4 e i 10 nanometri. Dal punto di vista elettrico una membrana cellulare è simile a due sistemi. La prima similitudine elettrica che si può fare è data dalla composizione stessa della membrana. I fosfolipidi delimitano uno spazio all’interno della membrana, dove ci sono le code degli stessi, in cui non ci sono cariche elettriche. Le cariche elettriche rimangono invece confinate sulle due superfici. L’equivalente elettrico di una struttura fatta in questo modo è il condensatore. Quindi dal punto di vista elettrico la membrana cellulare si comporta esattamente come un condensatore: una struttura che separa delle cariche , cariche che rimangono confinate alla superficie intracellulare ed extracellulare della membrana. La membrana cellulare ospita anche diverse strutture che sono delle proteine integrali di membrana. Alcune di queste proteine sono dei canali che lasciano passare gli ioni, ad esempio Sodio e Potassio che fluiscono continuamente a riposo. Sodio e potassio non possono attraversare la membrana ovunque, perché non possono passare nel condensatore idrofobico, quindi per attraversare la membrana utilizzano delle strutture proteiche che si chiamano canali ionici. Quindi queste vie di passaggio degli ioni, come equivalente elettrico, hanno quello di essere delle resistenze. Quindi lasciano passare gli ioni, ma ne limitano la diffusione, perché gli ioni devono attraversare questi canale in fila singola. Di fatto, la membrana non è un puro condensatore, ma un condensatore con delle resistenze che sono inserite in parallelo nel circuito. CIRCUITO EQUIVALENTE DI MEMBRANA Disegniamo con simboli elettrici il comportamento elettrico della membrana:

Questa disposizione di resistenze e capacità è detta in parallelo, perché uno ione che deve passare da una parte all’altra, o passa per la resistenza o con un meccanismo diverso di passaggio salta da una parte all’altra della membrana attraverso un condensatore. 6

Sono in parallelo perché lo ione arrivato a questo punto può scegliere se passare attraverso la resistenza o attraverso il condensatore. Questa disposizione prende il nome di circuito RC (resistenza-capacità) in parallelo. Questa similitudine elettrica aiuta moltissimo l’analisi dei fenomeni passivi della membrana. Questo tipo di circuito è infatti molto caratterizzato in elettronica perché è alla base di qualsiasi tipo di filtro di segnali (telefonini, strumenti musicali, hanno al loro interno migliaia di questi piccoli circuiti.) Di fatto, le proprietà elettriche di questo circuito sono molto ben definite, sia da un punto di vista fisico che elettrico. Risulterà in questo modo molto facile spiegare le proprietà elettriche delle membrane cellulari, che invece sono qualcosa di molto più complesso, andando ad utilizzare la terminologia più semplice del linguaggio dell’elettronica. Fino adesso noi parlando di ioni abbiamo parlato di flussi con quelle leggi complicate che legavano i flussi ai gradienti elettrochimici e alle concentrazioni di ioni. Però se noi pensiamo che abbiamo a che fare con degli ioni, di fatto quello che interessa dal punto di vista dell’attività elettrica della cellula non è tanto il flusso di ione, quanto il flusso di carica, quindi la corrente. Passando dalle leggi che descrivono i flussi di materia e quindi di ioni a quelli che descrivono i flussi di corrente si semplifica di molto il discorso. Una legge fondamentale che governa i flussi di corrente all’interno di circuiti come questi è una legge che viene derivata a partire dalla legge generale dei flussi. La legge generale dei flussi diceva che: J=L*X dove: J = flusso X = forza coniugata In questo caso la legge che ci descrive come varia il flusso di corrente in funzione di X, che è la forza coniugata, prende il nome di Legge di Ohm. Tale legge ci dice che I, flusso di corrente, è uguale a X, che è la forza coniugata. La forza coniugata che spinge uno ione da una parte all’altra è una differenza di potenziale elettrico. Non abbiamo più a che fare con i gradienti elettrochimici, sono sottointesi, a noi interessa adesso fare i conti con differenza di potenziale elettrico. Quindi è uguale a: V I= R dove: R = resistenze nel circuito Quindi una trattazione dei fenomeni passivi di membrana, che poteva essere molto difficile dal punto di vista matematico utilizzando le equazioni dei flussi, perché sono complicate di per sé, viene resa molto più facile da questo analogo elettrico. Dal momento che elettricamente la membrana si comporta come un circuito RC in parallelo, allora noi invece di parlare di flussi di Sodio, Potassio, Cloro e quant’altro, quindi di ioni, parliamo di flussi di cariche elettriche. Tutto il discorso si semplifica e alla fine la legge che descrive come varia la corrente in un circuito di questo tipo è la legge di Ohm , che è molto più semplice da trattare matematicamente che non la legge di NerstPlanck , che descrive la stessa cosa ma in termini di potenziale elettrochimico. È vero che questa V, che è la differenza di potenziale, è data dalla equazione , ad esempio, di Goldman, che ha a che fare con le concentrazioni ioniche, però quando andiamo a vedere cosa succede all’andamento del potenziale di membrana possiamo utilizzare tranquillamente la legge di Ohm che è molto più

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semplice perché, di fatto, la membrana si comporta esattamente come un circuito RC. Quali sono le caratteristiche che ci interessano? Dalla legge di Ohm risulta che noi abbiamo una corrente di ioni, una corrente elettrica, (un passaggio di ioni) se abbiamo una differenzia di potenziale a cavallo della membrana. Se non esiste differenza di potenziale non c’è passaggio di carica. Quindi: V=R*I V, che è la differenza di potenziale ai capi del nostro circuito esiste ed ha un certo valore in funzione di quanta è la corrente che sta passando e di quanto è la resistenza attraverso cui questa corrente sta passando. È questa la legge di Ohm , prima esplicitata per fare vedere I, e ora per far vedere V. Questa però è la parte di proprietà che riguarda il ramo resistivo. Il fatto di avere una capacità, quindi di essere un condensatore, introduce una piccola complessità. Nel senso che secondo la legge di Ohm se io faccio passare della corrente, istantaneamente varia un potenziale. Qui però non c’è nessun termine che lega la variazione del potenziale in funzione del tempo. Quando la corrente è zero, la differenza di potenziale è zero. I=0

V=R*0=0

Quando la corrente ha un valore x, il potenziale si modifica di conseguenza. I=x

V=R*x

Questo è vero solo se noi stiamo parlando della resistenza. Non è più vero se noi andiamo a parlare delle capacità. Perché il fatto di avere una capacità in parallelo, implica un ritardo temporale del potenziale elettrico rispetto alla corrente. La nostra capacità è data da questa formula: Q C= V dove: C = capacità misurata in Farad Q = carica presente sulle armature del condensatore, all’esterno e all’interno della cellula V = differenza di potenziale a cavallo della membrana andiamo ad esplicitare i termini per tirare fuori la quantità di carica: Q=C*V La quantità di carica si misura in Coulomb ed è uguale alla capacità per la differenza di potenziale. Più aumenta la differenza di potenziale maggiore è la carica che può essere ospitata sulle facce della membrana cellulare. A noi però non interessa tanto la carica ,quanto la corrente (derivata della carica sul tempo). dQ I= dt

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dQ =C*V dt dQ

dV =

dt

C* dt

La corrente che passa attraverso il condensatore non è costante, ma dipende da quanto velocemente varia il potenziale . Quindi la legge di Ohm ci dice che passa una corrente attraverso la resistenza, se la differenza di potenziale è diversa da zero. Quindi se io ho costantemente –90 mV come differenza di potenziale, perché è potenziale di riposo, io ho una corrente costante che passa attraverso la resistenza. Attraverso la capacità, quando il potenziale rimane costante a –90 mV, non passa nessuna corrente perché: dQ I=

è diversa da 0 dt solo quando la variazione del potenziale di membrana è diversa da zero, cioè solo quando: dV è diversa da zero dt Se il potenziale di membrana non varia, la corrente è uguale a zero. Quindi quando il potenziale di membrana rimane costante, indipendentemente dal suo valore, non passa nessuna corrente attraverso la capacità, ma passa tutto attraverso la resistenza. Se poi la differenza di potenziale ai capi della membrana è zero, non passa più corrente. Quindi mentre la corrente passa attraverso la resistenza in funzione di quanto è la sua differenza di potenziale; la corrente passa attraverso la capacità solo se la differenza ai capi della membrana sta variando, altrimenti no. Questo è importante per capire come varia nel tempo il potenziale di membrana di una cellula nervosa. E ( idem) il potenziale di membrana varia se c'è una corrente che sta portando delle cariche sulle armature del condensatore. Vale anche l'opposto, ovviamente. Abbiamo una variazione del potenziale di membrana se abbiamo una corrente che sta portando delle cariche sulle armature del condensatore, se questa corrente non c'è il potenziale di membrana non varia. Mentre la resistenza di membrana varia, la capacità di membrana delle membrane biologiche per unità di area è pressoché costante, ed ha questo valore qui: C = 1 µF/ cm2 Tale valore rimane costante perché la capacità di una membrana, come la capacità di una condensatore, è una proprietà di come è costruito un condensatore, di quali materiale è fatto. Tutte le membrane plasmatiche hanno la stessa composizione biochimica: sono tutti fatti di fosfolipidi più o meno diversi, alcune sono più ricche di colesterolo, altre meno, ma mediamente tutte hanno lo stesso spessore e la stessa composizione. Quindi la capacità di membrana per unità di area non varia a seconda della cellula, è costante per tutte, comprese quelle eccitabili. La resistenza di membrana per unità di area invece non è un valore costante. Perché dipende da quante 9

vie, da quante proteine di membrana sono inserite nella membrana stessa.

Cellule diverse, tessuti diversi, possono esprimere e portare in membrana un numero variabile di queste proteine e di conseguenza non c'è un valore univoco che le esprime. Contrariamente tutte le cellule costruiscono la propria membrana con gli stessi mattoni, la capacità è dunque valore costante.

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Dalle proprietà che abbiamo visto ne deriva un aspetto molto importante della fisiologia delle cellule nervose.

Qui avete due tracciati in funzione del tempo. Nel tracciato in alto è raffigurata la variazione del potenziale di membrana, la traccia più spessa. Noi andiamo a far passare della corrente attraverso la membrana della cellula con due elettrodi. Questo esperimento viene così condotto: noi abbiamo una cellula nervosa, una pipetta collegata con un elettrodo, un generatore di corrente, tutto questo immerso in un bicchiere con del liquido, ed un secondo elettrodo. Quello che noi troviamo non è una variazione a gradino con la stessa cinetica, con la stessa forma della corrente che abbiamo iniettato.Il risultato che noi invece troviamo è che il potenziale di membrana della cellula varia molto più lentamente della variazione della corrente che noi stiamo iniettando. Iniziamo ad iniettare della corrente, il potenziale di membrana sale nel tempo; smettiamo di iniettare la corrente e il potenziale di membrana scende nel tempo con una certa cinetica. Questo perché l'equivalente elettrico di una membrana cellulare è un circuito con una resistenza e una capacità in parallelo. Se la membrana cellulare fosse solo una pura resistenza, l'andamento 11

del potenziale di membrana seguirebbe la linea tratteggiata anch'essa a gradino. In quanto la legge di Ohm ci dice che non appena varia la corrente, varia il potenziale di membrana. Non c'è nessun parametro che definisce i tempi con cui questo avviene, per cui se fosse una pura resistenza noi da zero corrente che era la facciamo passare ad una certa quantità di corrente, il potenziale salta da un valore all’altro in funzione di quanto è la resistenza di membrana. Se viceversa la membrana cellulare fosse una pura capacità, la legge allora ci dice che non appena varia la corrente, varia il potenziale di membrana e dal momento che poi la corrente si mantiene costante, quindi dQ/dt è costante, anche dV/dt rimane costante; il potenziale di membrana varia con quella pendenza indicata dalla lettera b se la membrana cellulare fosse una pura capacità. Dal momento che il circuito è un RC parallelo, quindi non è né una pura resistenza né una pura capacità, di fatto il potenziale di membrana varia con una cinetica che si chiama andamento esponenziale. Quindi in funzione di una corrente che viene a trovarsi a cavallo della membrana, noi abbiamo la variazione del potenziale di membrana che non è istantanea, ma segue una certa cinetica e questa cinetica è di tipo esponenziale. Vediamo cosa vuol dire che una quantità si altera nel tempo in modo esponenziale. Questo è un concetto molto più generale, l'andamento esponenziale, che si trova in tanti fenomeni fisiologici e non solo. ANDAMENTO ESPONENZIALE Prendiamo una grandezza H qualsiasi, si dice che questa grandezza segue un andamento esponenziale se AUMENTA oppure DECRESCE della STESSA FRAZIONE nell'unità di tempo.

In questo esempio, questa grandezza H decade ogni secondo del 20% del suo valore, questo decadimento è un decadimento esponenziale. Vediamo nel tempo quali sono i valori che assume H: se t = 0

H0=1

un secondo dopo il valore di H è decaduto del 20%, quindi H1= H0 * 0,8 Se decade del 20%, vuol dire che un secondo dopo è all'80% del suo valore iniziale, e quindi vale: 12

(100-20) H1 = 1 *

= 0.8 100

Un secondo più tardi (100-20) H2 = H1 *

= 0.8 * 0.8 = 0.64 100 H2 è l’80% non di H0, cioè del suo valore iniziale, ma del valore che aveva un secondo prima, H1, perché ogni secondo decade del 20% quindi 0,8*0,8=0,64 e così via… Alla fine è come scrivere che il valore H all'istante T è uguale al valore iniziale moltiplicato la frazione che rimane elevato al tempo. Noi in pratica abbiamo moltiplicato sempre il valore H0 per 0,8 elevato ai secondi che sono trascorsi. Ht = H0 * 0.8t Questa è la scrittura più generale che indica l’andamento che abbiamo visto secondo per secondo. Quindi se noi vogliamo calcolare H al T=30 secondi sostituiamo 30 dentro l'espressione e troviamo quanto vale H. Storicamente il tempo all'esponente non è positivo, ma viene indicato come negativo. Allora si scrive: Ht = H0 * 0.8t = H0 * 1.25-t Perché

1 H0 *

1 = H0 *

(1/0.8)t

1.25t

H0 *0,8^T o scrivere H0 *1,25 ^ (-T) è la stessa cosa, perché 1,25 è il reciproco di 0,8, questo che abbiamo elevato alla -1. 0,8 alla -1 è uguale a 1,25; T alla -1 fa –T. Quindi la forma che assume l'andamento esponenziale quando andiamo a trattare i fenomeni di membrana è di questo tipo, con il tempo all'esponente, ma negativo. Applichiamo adesso questo ragionamento al nostro circuito; se il potenziale di membrana varia in maniera esponenziale significa che ogni secondo aumenta o diminuisce della stessa frazione. Abbiamo il nostro equivalente elettrico di membrana, capacità e resistenza in parallelo, capacità di 1 Farad (per semplificare i conti), una differenza di potenziale ai capi del nostro circuito, quindi ai capi della membrana, di 100 volt, 100 coulomb di carica e una resistenza di 5 Ohm. C=1F ∆V = 100 V 13

Q = 100 C R=5Ω

Fase di scarica: noi abbiamo una certa differenza di potenziale ai capi della membrana, togliamo questa differenza di potenziale, le cariche che si sono accumulate ai capi della membrana si scaricano, cioè si ridistribuiscono passando attraverso la resistenza. Quando noi poniamo la differenza di potenziale, sul lato e sull'altro del condensatore, sulle due armature, e quindi sul lato extracellulare e sul lato intracellulare si accumulano delle cariche, in modo tale da seguire il potenziale di membrana che abbiamo imposto; nel momento in cui noi rimuoviamo questa differenza di potenziale dall'esterno, sperimentalmente, queste cariche devono ridistribuirsi perché adesso la loro distribuzione non combacia più con il potenziale che abbiamo imposto. E tali cariche non saltano da un’armatura all'altra attraverso il dielettrico, ma passano attraverso i fili del circuito, quindi per ridistribuirsi devono passare attraverso la resistenza. La corrente che passa attraverso la resistenza ce la dà la legge di Ohm, ed è uguale alla differenza di potenziale diviso la resistenza. V I= R Q V= C All'istante T=0, quando noi facciamo sì che il condensatore si scarichi attraverso la resistenza, abbiamo 100 volt di differenza di potenziale su 5 ohm di resistenza, quindi abbiamo una corrente di 20 ampere. 20 ampere significa 20 coulomb al secondo, 20 coulomb di carica al secondo. 100 V t =0

I = 20 A =

Q = 100 C 5

Dopo un secondo, sulle armature del condensatore non ci sono più 100 coulomb di carica, perché 20 coulomb se ne sono andati, si sono ridistribuiti, quindi saranno 80 coulomb quelli che sono rimasti. 14

80 V t =1

I = 16 A =

Q = 80 C = ( 100 – 20 A * 1 s)

5Ω ( A = dQ/d t) Al tempo =1 noi avremo il nuovo potenziale, che non è più 100, ma ci viene dato dalla legge di Ohm ed è di 80 V, diviso 5 ohm, la resistenza è sempre quella. Quindi adesso la nostra corrente non sarà più 20 ampere, ma sarà 16 ampere e così via. Dal momento che è la corrente che detta il potenziale di membrana, anche il potenziale di membrana varia in maniera esponenziale, ecco perché c'è quella variazione. Il potenziale di membrana varia, perché varia la corrente che passa attraverso la resistenza; la corrente che passa attraverso la resistenza di membrana varia, perché varia la carica che è presente sulle due armature del condensatore. Siccome questa variazione è una variazione costante nel tempo, secondo dopo secondo il condensatore perde la stessa quantità di carica, in ultima analisi la variazione del potenziale di membrana è il fenomeno che ha un andamento esponenziale perché è l'esponenziale d'origine della variazione della corrente, che è la variazione delle cariche sulle armature del condensatore. Che cosa comporta quindi dal punto di vista fisiologico questo andamento? Lo anticipiamo adesso per poi vederlo meglio quando si parlerà di integrazione sinaptica e di propagazione del potenziale d'azione. Se al posto di iniettare noi dall'esterno(tramite quel sistema) una corrente, ad un certo punto nella cellula si aprono dei canali ionici che fanno entrare degli ioni, la situazione è la stessa. Ad un certo punto si aprono dei canali ionici istantaneamente e la corrente aumenta. La variazione del potenziale di membrana non sarà così istantanea, ma varierà nel tempo con una certa velocità maggiore o minore. Questo influisce notevolmente su come una cellula possa, ad esempio, sommare tante aperture di canali ionici in modo da dare un risultato finale di variazione di potenziale di membrana. Normalmente nella fisiologia del neurone non c'è nessuno che dall'esterno con una pipetta inietta della corrente, però ci sono dei canali ionici che vengono aperti, in seguito, ad esempio, al legame del neurotrasmettitore. Quindi questa corrente che noi qui stiamo inserendo con una pipetta nella realtà proviene da un rilascio di neurotrasmettitore, quindi il potenziale della cellula che si trova dall'altra parte, postsinaptica, varierà in questa maniera e non seguendo invece la cinetica della corrente che sta entrando. Questa velocità di cambiamento non è casuale, è legata alle caratteristiche passive della membrana. In particolare si definisce una costante di tempo, che viene indicato come, il prodotto della resistenza di membrana per la capacità di membrana. Tale valore ci dice quanto velocemente può variare il potenziale di membrana. τ=R*C

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Qui in alto abbiamo ripreso il grafico già visto prima per capire il significato di, della costante di tempo. In alto abbiamo l'andamento del potenziale di membrana, in basso la corrente totale che passa attraverso questo circuito, che è il nostro circuito equivalente di membrana. τ è la nostra costante di tempo ed è uguale al prodotto della resistenza di membrana per la capacità di membrana. La corrente totale, I, che passa attraverso il circuito, può scegliere due vie in parallele, o passa attraverso la capacità o passa attraverso la resistenza. Quindi la corrente totale, I, che entra ed esce dalla membrana è uguale alla componente capacitiva di questa corrente, cioè quella che attraversa la membrana attraverso il condensatore più quella resistiva. I = Ic +IR La corrente capacitiva è uguale ad un andamento esponenziale, ha una cinetica esponenziale nel tempo ed è uguale a:

Ic = I * e –t/τ Quel: e –t/τ 16

vuol dire che ha un andamento esponenziale con una costante di tempo τ che ci dice quanta corrente decade e in quanto tempo. Che cosa succede quando noi andiamo a far passare della corrente nel circuito? Al tempo T=0 noi facciamo passare una corrente attraverso questo circuito e il potenziale di membrana sale, cambia valore, passa da 0 ad un valore V infinito dopo un numero di secondi molto grande rispetto a. Come facciamo a descrivere questo andamento esponenziale del potenziale? Ci serve di nuovo la legge di Ohm, noi sappiamo che V, il potenziale di membrana è uguale alla resistenza di membrana per la corrente che passa attraverso la resistenza, non la corrente totale. V = R * IR Questo lo dice la legge di Ohm. Quale è la corrente che passa attraverso la resistenza? IR è: la corrente totale (I) meno la corrente che passa attraverso la capacità, Ic, che è la corrente capacitiva. Quindi: IR = I – IC = I - I * e –t/τ Raccogliendo e sostituendo IR = I (1 - e –t/τ) V = R * IR = R * I (1 - e –t/τ) questa R*I è il nostro V infinito (V) cioè è il potenziale di membrana che noi abbiamo e che rimane stabile quando il tempo per cui noi manteniamo l'influsso di corrente è molto maggiore di. V∞=R*I

se t > > τ

Poniamo τ uguale ad 1 secondo, costante di tempo è 1 secondo. Se τ è un secondo, noi manteniamo l'influsso di corrente per 10 secondi, il nostro V ∞ è quello che andiamo a misurare dopo 10 secondi, un tempo ragionevolmente molto maggiore di. Questo è uguale alla corrente, che a questo punto passa solo attraverso la resistenza, per la resistenza di membrana. Vediamo che valore assume, in tre punti temporali ben definiti, il potenziale di membrana. Se t =0

e –t/τ = e0 = 1

quindi V = 0

Se t = ∞ e –t/τ = e-∞ = 0

quindi V = V ∞

quindi quando siamo molto in là con il tempo di applicazione della corrente V=V∞ un valore costante che non cambia. Quando T è uguale a, ecco quello che ci dice la costante di tempo su cui ragionare nei processi cellulari Se t = τ e –t/τ = e-1 = 0.36

quindi V = 64 % V ∞ 17

Quindi quando il tempo è uguale a, alla costante di tempo, noi sappiamo che il nostro potenziale di membrana è arrivato al 64% del suo valore finale. Ecco perché la costante di tempo ci dice quanto velocemente o quanto lentamente varia il potenziale di membrana, perché ci dice dopo quanto tempo il potenziale di membrana arriva al 64% del suo valore finale. Quindi confrontando la costante di tempo di cellule diverse, noi possiamo dire quanto velocemente o quanto lentamente le cellule fanno variare il proprio potenziale di membrana e questo ci è utile per capire i fenomeni di integrazione sinaptica. Sarà fondamentale questo discorso perché i fenomeni di integrazione sinaptica prevedono che il potenziale di membrana vari a seconda di quanta corrente sta passando in quel momento attraverso la membrana. Quindi a seconda che la cellula abbia una costante di tempo lenta o veloce, questa variazione del potenziale di membrana sarà più veloce o più lenta. Quindi quello che ci dice la costante di tempo, che è uguale alla resistenza di membrana per la capacità di membrana, è dopo quanto tempo il potenziale di membrana arriva al 64% del suo valore finale.

Il processo di scarica invece, quando noi ad un certo punto cessiamo di far passare della corrente, ha lo stesso andamento temporale del processo di carica che abbiamo visto, la costante di tempo è sempre la stessa, cambia solo l'espressione matematica che descrive l'andamento temporale del potenziale. Per gli stessi ragionamenti fatti prima, il potenziale al tempo t è uguale a Vt = V0 * e –t/τ è l'andamento esponenziale che abbiamo visto all'inizio, il valore iniziale della variabile per l'andamento esponenziale e –t/τ e –t/τ = e0 = 1

quindi V = V0

Se t = ∞ e –t/τ = e-∞ = 0

quindi V = 0

Se t =0

Se t = τ e –t/τ = e-1 = 0.36

quindi V = 36 % V0

Quindi quando noi consideriamo la scarica del condensatore, dopo che è trascorsa una costante di tempo il potenziale di membrana è al 36% del suo valore iniziale. C'è una piccola differenza nella definizione, quando si carica è il 64% del valore finale, quando si 18

scarica il 36% del valore iniziale. Perché l'espressione matematica che descrive l'andamento del potenziale di membrana in funzione del tempo è diversa nei due casi? La costante di tempo è identica, la formula matematica che ne descrive la variazione del potenziale è leggermente diversa, ecco perché sussiste questa variazione. Quindi dal punto di vista delle cellule: se τ è grande, quindi se una cellula ha una grande resistenza di membrana e una grande capacità di membrana, tutte queste variazioni transienti del potenziale sono lente. Se una cellula ha una τ piccola, cioè una piccola resistenza di membrana e una piccola capacità di membrana, tutte queste variazioni del potenziale sono veloci. Questo può essere sfruttato nelle cellule nervose. Nelle fibre mieliniche, la mielina che avvolge gli assoni delle fibre 1°, diminuisce la capacità di membrana, perché la capacità di membrana dipende anche dalla distanza fra le armature; se diminuisce la capacità di membrana, diminuisce la costante di tempo, perché τ è uguale a R*C, il momento della costante di tempo velocizza la variazione del potenziale di membrana e questo fa aumentare la velocità di propagazione del potenziale d'azione. Lo studio di queste proprietà delle membrane ci spiega perché da parte delle cellule sono stati adottati certi sistemi che consentono il normale funzionamento del sistema nervoso, come ad esempio l'adozione della guaina mielinica. Perché inventarsi la guaina mielinica? Utilizzando la guaina mielinica si diminuisce la capacità di membrana, quindi i transienti sono più veloci. Vedremo parlando della propagazione del potenziale di membrana come questo davvero velocizza la conduzione del potenziale d'azione. Il motivo fisico che sta alla base è questo.

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Qui avete un grafico, una serie di tracce, in cui in funzione del tempo si ha il potenziale di membrana.

Questa serie di tracce è stata ottenuta stimolando la cellula sperimentalmente con diverse correnti, alcune che tendono a portare il potenziale di membrana a valori più negativi, altre che tendono a portare il potenziale di membrana di riposo a valori più positivi. Quello che si vede è che la cellula non risponde sempre in maniera passiva, ad un certo punto la risposta diventa diversa da quello che uno si aspetta da una pura risposta passiva da circuito RC, e diventa quella che è chiamata risposta attiva che ha tutta una sua base fisiologica completamente diversa rispetto a quello che abbiamo visto fino adesso. La cellula risponde in maniera passiva sempre quando l'iniezione di corrente fa sì che un potenziale di membrana diminuisca, quindi che si vada da -80 mV, in questo caso di potenziale di riposo, verso valori più negativi. Questo non è sempre vero invece se la cellula fa sì che il potenziale di membrana aumenti di valore partendo dal suo valore di riposo. Le risposte saranno passive intanto che il potenziale di membrana rimane al di sotto di un certo valore, 20

che viene chiamato valore soglia (valore tratteggiato), che è intorno al valore di -40 mV. Oltre questo valore soglia la risposta non è più passiva, ma si instaura una risposta di tipo attivo. Quindi le risposte passive sono vere e sono proprie di tutte le cellule eccitabile se il potenziale di membrana diventa più negativo del potenziale di riposo in seguito ad una corrente che sta passando attraverso la membrana plasmatica o se il potenziale di membrana diventa più positivo, ma non più positivo di un certo valore chiamato valore soglia, che è all'incirca per tutte le cellule eccitabili intorno ai -40 mV. La forma delle risposte passive è un andamento esponenziale, sia che il potenziale diventi più negativo del valore di riposo, sia che diventi più positivo. La forma delle risposte attive (in alto) è completamente diversa da una risposta passiva, quello che ci sta dietro è molto più complesso di quello che abbiamo visto; lo tratteremo successivamente. Adesso vediamo una nota tecnica: come fare a stimolare una fibra nervosa? Come un neurologo può evocare risposte attive o passive nei tronchi nervosi periferici? Ci sono due metodi:

1. Il primo è quello che male si adatta al paziente cosciente perché si tratta di inserire un elettrodo all'interno di una fibra nervosa. E' un modo un po' invasivo. Viene sì usato, ma solo in anestesia, e non è una pratica di routine. Un elettrodo viene introdotto all'interno della cellula, un elettrodo si trova all'esterno, e si fa passare della corrente attraverso questi due elettrodi. 2. Il metodo che invece viene utilizzato di routine per valutare la funzionalità dei tronchi nervosi è quella della stimolazione extracellulare. Qui abbiamo una fibra nervosa, l'assone di un nervo, e due elettrodi extracellulari, che vengono cioè applicati alla cute. Un elettrodo positivo, un elettrodo negativo, viene fatta passare della corrente attraverso questi elettrodi. 21

Gran parte di questa corrente va da un elettrodo all'altro attraverso il liquido extracellulare, una piccola parte di questa corrente passa attraverso la membrana cellulare ed esce attraverso la membrana cellulare sotto l'altro elettrodo. Questo è il sistema di stimolazione extracellulare usato abitualmente per la diagnostica a livello neurologico. La corrente va dal polo positivo al polo negativo per definizione, corrente è il verso delle cariche positive. Per attraversare la membrana cellulare la corrente deve passare attraverso le resistenze di membrana. La resistenza di membrana si oppone al passaggio delle cariche, dato che la corrente è definita come il senso delle cariche positive. Sotto l'elettrodo positivo avremo un accumulo di cariche positive al di fuori della cellula; sono tutte le cariche positive che stanno permeando per passare attraverso la resistenza di membrana. Sotto l’elettrodo negativo avremo il fenomeno opposto: un accumulo di cariche positive sotto l'elettrodo negativo all'interno della cellula; sono tutte le cariche che stanno uscendo dalla cellula per tornare all'elettrodo negativo. Sotto l’elettrodo positivo il potenziale di membrana diventerà più negativo del suo valore di riposo perché abbiamo un accumulo di cariche positive fuori e quindi ci sarà un eguale accumulo di cariche negative all'interno, sulle armature del condensatore. Sotto l'elettrodo negativo invece avremo una depolarizzazione del potenziale di membrana perché avremo un accumulo di cariche positive che stanno cercando di uscire dalla cellula, però attraverso la resistenza di membrana ne passano poche per volta e quindi c'è un accumulo di cariche positive e si creerà una parziale carica più positiva. Di conseguenza il potenziale dai -90 mV ai -80 mV che è, diventerà più positivo Di fatto, una parte di cellula viene eccitata, portata a potenziale di membrana più positivo, una parte invece di fibra viene inibita, portata ad un potenziale di membrana più negativo. Questo è il meccanismo fisico che sta sotto alla tecnica utilizzata del doppio elettrodo per andare a stimolare le fibre nervose attraverso questo circuito. Se sotto l'elettrodo negativo si riesce a portare il potenziale di membrana ad un valore sopra a quel valore che abbiamo definito valore soglia, allora si instaura una risposta di tipo attivo. Però questo valore soglia non è costante, è circa -40 mV in tutte le cellule, ma, di fatto, questo valore soglia dipende da quanto velocemente sta variando il potenziale. Se il potenziale varia troppo lentamente questo valore soglia di fatto sfugge, diventa sempre più alto e non si riesce mai a raggiungere.

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Questo fenomeno prende il nome di ACCOMODAZIONE della SOGLIA ed è una delle proprietà fondamentale dei neuroni per quello che riguarda il loro normale funzionamento.

In questo grafico vi è: una linea continua, una variazione passiva del potenziale di membrana nel tempo, indicato come p.m ed una linea tratteggiata, la variazione del valore soglia in funzione a quello che sta succedendo al potenziale di membrana. Per un tratto il potenziale di membrana rimane sempre sotto al valore soglia, però si può vedere che il valore soglia quando la membrana si depolarizza diventa un po' più positivo, quindi cerca di scappare. Quando la membrana si iperpolarizza, quindi va ad un potenziale più negativo, il valore soglia diventa un po' più negativo. Se questa variazione del potenziale di membrana non è abbastanza veloce da incrociare la variazione del potenziale soglia, questo non lo si raggiunge mai e, di fatto, non si può evocare una risposta attiva nella fibra. Quindi bisogna portare il potenziale di membrana oltre il valore soglia, ma questo valore soglia diventa tanto più positivo quanto più lentamente il potenziale di membrana sta variando. Cellule che hanno una costante di tempo molto lunga avranno delle soglie per dare origine alla risposta attiva un po' più alte per questo fenomeno, perché oltre al fatto che ci mettono più tempo ad arrivare ad un potenziale oltre soglia, questo potenziale soglia diventa un po' più positivo, perché il potenziale di membrana sta variando lentamente nel tempo. Questo fenomeno abbiamo detto chiamarsi accomodazione della soglia. L'esistenza di un valore soglia di potenziale fa sì che non tutti gli stimoli siano in grado di dare origine ad una risposta attiva. Sempre coma parametri per valutare lo stato di salute di un tronco nervoso oltre a stimolare la fibra 23

nervosa con i due elettrodi extracellulari, quello che si va a valutare sono due parametri che vengono detti REOBASE e CRONASSIA. Questi parametri sono importanti per stabilire lo stato di funzionamento e di salute della fibra nervosa. Sono dunque un utile strumento diagnostico per riuscire a capire che cosa c'è che non va a livello neurologico da qualche parte del sistema nervoso periferico. Cosa sono reobase e cronassia?

La REOBASE è una intensità di stimolazione minima, che equivale a dire corrente applicata agli elettrodi, affinché io possa avere una risposta attiva. E' l'intensità di stimolazione minima applicata per un tempo molto lungo che dà origine ad una singola risposta attiva. Si prova a stimolare la fibra ad intensità di corrente sempre crescenti per un tempo lungo, dove per tempo lungo si intendono centinaia di millisecondi, fintanto che riesco ad evocare una singola risposta attiva nella fibra che sto studiando. La CRONASSIA è invece il minimo tempo di applicazione di uno stimolo, che ha una intensità doppia rispetto alla reobase, che dà origine ad una singola risposta attiva. Per una fibra normale i valori di reobase e cronassia sono fissati. Andare a valutare qual è la reobase e qual è la cronassia di una fibra nervosa, di un nervo periferico, e confrontarli con i valori di riferimento è un utile strumento per capire se quel tronco periferico sta funzionando in maniera corretta oppure se c'è una qualche patologia in atto. Su cosa si basa questa analisi, relativamente semplice dal punto di vista operativo, ma con un grosso significato funzionale, per quello che riguarda il sistema nervoso? Nel grafico soprastante, con la linea rossa si ha la legge che ha la forma di un'iperbole, definizione matematica di un'iperbole, che lega l'intensità della corrente di stimolazione, in ordinata, e il tempo di applicazione di questa stimolazione, in ascissa, in millisecondi. La legge dice che: l'intensità di corrente è uguale ad una costante K diviso il tempo più R, dove R la reobase. i =

K t

+ R

L'intensità di stimolazione deve avere un certo valore finito, ad un certo punto non si può più evocare una risposta attiva se l'intensità della corrente di stimolazione scende sotto un certo 24

valore. Perché? Perché esiste una soglia; se l'intensità di corrente di stimolazione non è sufficiente a portare la membrana a soglia, noi non avremo una risposta attiva. Quindi ci sarà un valore minimo al di sotto del quale noi non riusciremo a portare a soglia la membrana e quindi non avremo risposte attive. La cronassia τ per come è fatta l'equazione che lega il tempo e l'intensità di stimolazione è uguale a τ =

K t

τ ≅

1 ms

Da dove deriva questa legge? Questa legge deriva dal fatto che la membrana cellulare è un condensatore. Allora dalle equazioni viste prima, se noi vogliamo avere una variazione di potenziale di membrana, un ∆v, dobbiamo far variare la quantità di carica presente sulle armature del condensatore. Se io voglio portare il potenziale di membrana di una cellula nervosa dal suo valore di riposo ad un valore sopra soglia, in modo da dare origine ad una risposta attiva, io devo fargli fare un salto di almeno 50 mV, se partiamo da -90 mV e arriviamo a -40 mV. Per far saltare la cellula di 50 mV devo portare sulle armature del condensatore (che è la membrana cellulare) una certa quantità di carica. Che cosa mi dicono allora reobase e cronassia? Esse mi definiscono le coordinate di tutti i punti che giacciono su questa curva. Quest’area (tratteggiata in verde) è una corrente di intensità per un tempo. La corrente è una carica diviso un tempo (T). q=C*V ∆q ⇒ ∆V dq i = dt se io voglio un ∆v di 50 mV devo dare un ∆q sulle membrane del condensatore, devo aggiungere o togliere una certa quantità di carica. Cosa ha a che fare questo con reobase e cronassia? Questa linea rossa mi dà le coordinate di tutti i punti che soddisfano un cero criterio, qual è questo criterio? L’area verde ha le dimensioni di una corrente i (= q/t) per un tempo t, è un rettangolo la cui dimensione dell'area è data dal prodotto dell'ordinata per l'ascissa, o viceversa, del prodotto dell'ascissa per l'ordinata, cioè corrente per un tempo che è q, cioè una quantità di carica. Quell'area mi dice qual è la quantità di carica che devo mettere sulle armature del condensatore per avere un salto di potenziale tale per cui ho una risposta attiva. Cosa vuol dire? Vuol dire che se ho una risposta attiva sono arrivata a soglia. Misurando reobase e cronassia io, di fatto, ho un valore di quanto è questa quantità di carica che io devo portare sul mio condensatore, che è la membrana cellulare, per far sì che il potenziale 25

della membrana cellulare salti di (poniamo) 50 mV, e da – 90 mV arrivi a soglia. Perché sono sicuro che arrivo a soglia? Perché per come sono definite reobase e cronassia entrambe devono dare origine ad una risposta attiva. E la risposta attiva io l’ ho solo se il potenziale di membrana è arrivato a soglia, altrimenti non ce l’ ho. Perché questo è un indice importante della funzionalità della cellula? Perché questo ∆q a parità di ∆ V, che è il salto di potenziale che mi porta a soglia, dipende dalla capacità di membrana. Se io voglio 50 mV di salto di potenziale devo dare una certa quantità di carica, questa quantità di carica che io devo fornire dipende dalla capacità del condensatore. Questo ci dice la legge. Abbiamo visto che la capacità per unità di superficie in tutte le cellule è costante, è fissa, è uguale. Per una cellula che sta bene la sua capacità di membra è di 1 microFarad per cm2. Se io trovo che per un salto i 50 mV ho bisogno di fornire una quantità di carica diversa da quella normale, vuol dire che la capacità di membrana di quella cellula è diversa da quella di una cellula normale. Dal momento che la capacità di membrana è legata a come è fatta la membrana cellulare, questo mi dà molte informazioni su cosa sta succedendo in quella fibra nervosa. Visto che normalmente questa analisi si fa su fibre mieliniche e visto che la mielina fa variare di molto la capacità di membrana, io ho una tabella di riferimento dei valori di reobase e cronassia giusti, fisiologici, per una fibra mielinica che sta bene, se la fibra mielinica comincia a perdere la guaina mielinica, la capacità di membrana varia, perché la guaina mielinica fa variare la capacità di membrana. Allora se io vado a misurare dei valori di reobase e di cronassia che sono diversi da quelli normali vuol dire che la capacità di membrana è diversa da quella normale, ma siccome la capacità di membrana della cellula mielinica dipende dalla mielina allora vuol dire che c’è qualcosa che sta andando ad alterare la guaina mielinica di questa fibra.E’ un primo approccio molto semplice per capire se una fibra nervosa sta bene oppure no ed in particolare che cosa c’è che non va. Basata su un principio fisico, forse complesso, però molto utile. Adesso cominciamo a dare una faccia a questi elementi capacitivi e resistivi che abbiamo visto fino adesso. Cominciamo a trattare le strutture attraverso cui passano gli ioni. Abbiamo detto che gli ioni non possono passare attraverso la membrana, quindi essi materialmente si spostano attraverso delle strutture all’interno della membrana chiamate CANALI IONICI, proteine integrali di membrana. “Integrali” perché devono far passare lo ione per tutto lo spessore della membrana, devono essere perciò dei tubi che presentano una faccia aperta verso l’esterno e una faccia aperta verso l’interno della cellula. Gli ioni non possono attraversare il doppio strato lipidico direttamente, passano solo attraverso canali ionici propriamente detti. Vi è poi la pompa Sodio-Potassio, che non è un canale ionico, ma è come se lo fosse; di fatto, è una proteina molto più complessa. Possiamo avere canali ionici che lasciano passare un solo tipo di ione, oppure canali ionici che lasciano passare più ioni. Vediamo come si possono classificare i canali ionici. CLASSIFICAZIONE CANALI IONICI IONE PERMANENTE MODALITA’ DI GATE Na+ NON-gated (leak) K+ Ligand-gated * Ca2+ Voltage gated (Hyperpol.act/ Dep.act) Cl Stretch- Activated Aspecifici (Na, Ca, K/ Na, K/ altri ioni) Heat- Activated * = Composti extracellulari, ATP, cAMP, cGMP, GTP, Ca2+ Questo è uno schema utile per ricordarsi le proprietà del canale in base alla sua classificazione. 26

Una canale ionico, essendo una proteina che lascia passare degli ioni, può essere classificata con due classificazioni parallele, entrambe dicono qualcosa di questo canale ionico, la somma delle due ci dà tutte le informazioni necessarie per capire di cosa si tratta. Il canale ionico è classificato in base allo ione permeante, cioè allo ione o agli ioni che lascia passare, e alla modalità di gate, cioè di apertura del canale. Il sodio e il potassio, che normalmente a riposo attraversano la membrana cellulare, passano attraverso dei canali ionici per il sodio e per il potassio che sono aperti. Quindi appartengono alla prima categoria, ai canali non-gated o canali di leak (aperti), perché sono canali sempre aperti, vie di fuga, vie resistive sempre aperte che lasciano passare gli ioni sempre. Però non tutti i canali ionici sono così, anzi la maggior parte non lo sono. Quindi vi è un tipo di canale, chiamato di leak, che svolge questo ruolo, a riposo fa sì che ci sia una diffusione di ioni e quindi si abbia un potenziale di membrana di riposo di tipo diffusivo. Per quanto riguarda lo ione permeante, possiamo avere canali che lasciano passare solo il sodio, solo il potassio, solo il calcio, solo il cloro (gli ioni negativi) e poi quelli che vengono chiamati canali aspecifici e quindi che lasciano passare sodio e potassio, oppure sodio, calcio e potassio, oppure ancora altri ioni. Abbiamo canali di tutti questi diversi tipi. E poi ciascuno di questi tipi può avere una modalità di apertura, modalità di gate diversa. Allora possiamo avere oltre ai canali di leak che lasciano passare sodio, potassio e cloro (ioni che diffondono a riposo) anche canali così detti ligand-gated che vengono aperti se legano un certo composto, che possono essere composti extracellulari come i neurotrasmettitori, oppure composti intracellulari come ad esempio ATP, cAMP, cGMP, GTP, calcio… Ci sono tante sostanze all’interno della cellula che possono indurre l’apertura di un canale ionico. Quindi mettendo insieme lo ione che permea e la modalità di gate noi otteniamo l’identificazione del canale. Abbiamo ancora dei canali detti voltage-gated che vengono aperti solo se il potenziale di membrana raggiunge e supera un certo valore e questi voltage-gated sono distinti a loro volta in due categorie:  Se si aprono quando il potenziale di membrana diventa più positivo del valore di riposo, sono quelli che si attivano in depolarizzazione  Oppure se si aprono quando il potenziale di membrana diventa più negativo del valore di riposo, sono quelli che si dicono attivati in iperpolarizzazione, quando il potenziale di membrana diventa più negativo di un certo valore. Poi abbiamo i canali detti stretch-activated che vengono aperti da una tensione che aumenta a livello della membrana cellulare, quindi la membrana cellulare tira sull’esterno del canale e il canale ionico si apre. Poi abbiamo un’ultima classe di attivazione per i canali che sono gli heat-activated e sono quelli invece attivati dalla temperatura, in special modo quelli attivati da temperature nel range di quelle nocive, sopra i 45°. Tali canali vengono attivati da temperature al di sopra dei 45°, ma non solo, possono essere attivati anche da temperature sotto i 10- 15 ° (vedremo parlando del dolore). Mettendo assieme tutte e due le classificazioni arriviamo alla descrizione del canale. Un canale viene quindi descritto dal tipo di ione che lascia passare e dalla modalità di apertura del canale Un paio di esempi di classificazione dei canali. Nel cuore c’è una corrente particolare che si chiama If e che dà il pace del cuore, il tempo di battito del cuore. Questa corrente If è un canale cationico aspecifico, cioè lascia passare sodio e potassio, ed è un canale voltage-gated di quelli che si aprono in iperpolarizzazione, quindi si apre quando il potenziale di membrana scende al di sotto di un certo valore. Quindi il canale If è un canale cationico aspecifico attivato in iperpolarizzazione, questa è la sua descrizione. If pacemaker cardiaco è 27

- cationico aspecifico (Na, K) - Voltage-gated in iperpolarizzazione Il recettore per l’acetilcolina (AchR) è anche questo cationico aspecifico, perché lascia passare sodio e potassio, ma appartiene ai ligand-gated perché viene aperto dal legame con l’acetilcolina. AchR è - Ligand-gated (Ach) - Cationico aspecifico (Na, K) Un esempio di canale stretch-activated è quello delle fibre sensoriali primarie del fuso neuromuscolare che vengono attivati quando la fibra viene stimolata. Quindi ciascuno di questi canali è importante in molti sistemi, sensoriali e non, e possono far passare o un singolo tipo di ione o più tipi di ioni a seconda della loro funzione. Vedremo poi quando è il caso di lasciar passare un solo tipo di ione o quando è invece il caso di lasciar passare più tipi di ioni. Quali sono però le caratteristiche strutturali comuni di un canale ionico?

Indipendentemente dal tipo di canale, che lasci passare sodio, potassio, cloro, cha sia un voltage, che sia uno stretch, ci sono alcune caratteristiche del canale che sono comuni a tutti perché la loro funzione è la medesima, lasciar passare gli ioni. La prima caratteristica, già menzionata prima, è che il canale ionico è una proteina integrale di membrana, quindi necessariamente deve avere un lato extracellulare ed un lato intracellulare. La seconda è che al suo interno deve esserci un poro acquoso, via attraverso cui permeano gli ioni con il loro mantello di idratazione o parte di esso. Non è ancora chiaro come permeano gli ioni attraverso il canale ionico, di fatto, o ci transitano portandosi dietro tutte le molecole d’acqua che costituiscono il mantello di idratazione oppure solo alcune di tali molecole vi transitano. Dopodiché all’esterno della cellula, su un lato dove passano gli ioni, si deve avere quello che si chiama filtro di selettività ionica, in quanto il canale deve decidere quali ioni possono passare e quali no. Il canale sopra riportato, ad esempio, possiede delle cariche negative che fanno parte del filtro di selettività, quindi respingerà gli ioni negativi e attrarrà gli ioni positivi. 28

A seconda dello ione che deve passare attraverso il canale esisterà un filtro di selettività, con delle caratteristiche elettriche particolari, in modo tale da favorire quale tipo di ione deve passare rispetto ad altri. Ci sono dei canali ionici (per far capire come è potente questa selezione) che devono lasciar passare il Potassio anziché il Sodio, lavorare al contrario. Noi, infatti, sappiamo che fuori ci sono 4 millimoli su litro di potassio e 145 millimoli su litro di sodio, quindi ogni volumetto contiene 145 parti di sodio e 4-5 parti di potassio e nonostante tutto tale canale non deve far passare Sodio, ma far passare solo Potassio. Il canale non sbaglia: va a pescare quei 4-5 millimoli su litro di potassio in mezzo a 145 millimoli su litro di sodio, è selettività specifica. Se è un canale voltage-activated vi è una ulteriore caratteristica: l’esistenza di una regione detta sensore di voltaggio che è quella che sente qual è la differenza di potenziale a livello della membrana e induce l’apertura del canale ionico modificando la struttura terziaria o quaternaria del canale, della proteina stessa. Nel caso invece che sia un canale di ligand-gated, invece del sensore di voltaggio, ci sarà una regione della proteina che si occupa di legare la sostanza che poi induce l’apertura del canale, legame sia di composti extracellulari, di ATP, cAMP, GTP, cGMP, calcio sia di quanto altro può attivare un canale ionico. Poi ovviamente, essendo un canale che si apre e che si chiude, deve possedere una porta che chiude oppure che apre il canale. Tale porta è l’effettore finale dell’azione o del voltaggio o dei vari ligandi o di quanto altro per aprire il canale. Quindi riassumendo queste sono le caratteristiche comuni ai diversi canali: -Poro acquoso per far passare degli ioni -Filtro di selettività per decidere qual è lo ione che deve passare attraverso questo canale -Una regione deputata a ricevere lo stimolo per l’apertura del canale che sia • Il sensore di voltaggio nei canali voltage-gated • Una regione particolare che lega il neurotrasmettitore o il composto intracellulare se sono dei canali ligand-gated. Andiamo a vedere più nel dettaglio le proprietà dei 3 canali più importanti per la fisiologia del sistema nervoso: 1) canale sodio voltaggio dipendente 2) canale potassio voltaggio dipendente 3) canale calcio voltaggio dipendente Li vediamo adesso in sequenza e poi alla fine li inseriamo nello schema di funzionamento complessivo. CANALE Na voltaggio dipendente Neuroni centrali Na v1.1 Neuroni Periferici Na v1.8 Muscolo scheletrico Na v1.4 Muscolo cardiaco Na v1.5 Composto da ≅ 2000 a.a Eterodimero: α poro- canale β1 subunità accessoria, non sempre presente β2 subunità accessoria, non sempre presente BLOCCATO DA: TTX = Tetrodotossina 29

STX = Saxitossina Anestetici locali = Lidocaina, Procaina, Tetracaina Dato che ENa = + 63 mV, tale canale tende a depolarizzare la cellula. Tale canale è presente: in tutti i neuroni, sia centrali che periferici, nel muscolo scheletrico e nel muscolo cardiaco. Diversi sono i tipi, diverse le famiglie di canali Na voltaggio dipendenti, (la cui classificazione è segnata in rosso) ma hanno la stessa funzione con piccole varianti a seconda del tipo di tessuto in cui si trovano. È composto da diverse subunità, 3 proteine (1 β2) che si legano insieme. Il canale è bersaglio di numerose neurotossine potentissime. La TTX (tetrodotossina) si trova nei tessuti del pesce palla e bastano pochissime micromoli di TTX per bloccare i canali Na voltaggio dipendenti, che abbiamo visto trovarsi anche nel muscolo cardiaco; ci vuole poco per arrestare il funzionamento del cuore. Questo canale Na voltaggio dipendente è molto importante, fondamentale, per la funzione del neurone, ed è bersaglio di numerose tossine, come anche la saxitossina che proviene dallo scorpione Sono però dal punto di vista farmacologico degli agenti che vengono impiegati per certi tipi di manipolazioni. E’ inoltre, tale canale, un bersaglio per gli anestetici locali; lidocaina, procaina, tetracaina e derivati agiscono andando a bloccare i canali del Na voltaggio dipendenti. Quindi mettendo assieme queste due informazioni ne traiamo la conseguenza che se si va ad utilizzare un anestetico locale per via sistemica e come se si va ad infondere la tetradotossina o la saxitossina in un paziente e quindi c’è il rischio di ammazzarlo. Gli anestetici locali agiscono si canali del sodio voltaggio dipendenti che bisogna stare attenti a toccare, hanno un uso strettamente locale, non sistemico perché altrimenti avrebbero lo stesso effetto delle tossine, quindi un effetto letale. Dato che il potenziale d’equilibrio del Sodio dipende dalle concentrazioni del sodio all’interno e all’esterno della cellula ed è circa +63- +66 mV, allora l’apertura del canale del Na voltaggio dipendente tende a portare il potenziale della cellula a questo valore, quindi tende a depolarizzare la cellula. Ogni volta che si apre il canale del Na voltaggio dipendente e quindi ogni volta che il Na entra all’interno della cellula, dato che il suo potenziale d’equilibrio è +63 mV, l’apertura dei canali del Na voltaggio dipendente tende a depolarizzare il potenziale di membrana perché cerca di portarlo verso il proprio potenziale d’equilibrio. Come funzionano i canali del Na voltaggio dipendente? Hanno un meccanismo particolare. Parlando in seguito delle risposte attive, cioè del potenziale d’azione, vedremo che questo meccanismo è fondamentale perché il potenziale d’azione possa aver luogo. Questo è uno schema dei componenti del canale del Na voltaggio dipendente. Prima abbiamo detto che un canale ionico deve possedere una porta che lo apra o che lo chiuda. Il canale del Na voltaggio dipendente di fatto possiede due porte: - una porta che si chiama “porta di attivazione” - una porta detta “porta di in attivazione”.

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A .Noi siamo al potenziale di riposo, la cellula è al suo potenziale di riposo. Entrambe le porte, sia quella di attivazione che di inattivazione, possiedono delle cariche positive. Siccome l’interno della cellula è negativo, siamo a –90 mV all’interno, la porta di inattivazione è aperta, perché le cariche positive fanno sì che ci sia una forza elettrica che tiene la porta di inattivazione aperta. La porta di attivazione del canale del Na voltaggio dipendente anch’essa ruoterebbe verso il basso, ma di fatto è mantenuta orizzontale dalla struttura della proteina e mantiene il canale chiuso. Entrambe hanno cariche positive sulla porta, sulla parte mobile, però per come sono messe all’interno della proteina di fatto una è aperta, la porta di inattivazione, l’altra è chiusa, la porta di attivazione. Siamo a potenziale di riposo.

B Il potenziale di membrana salta dai -60 di riposo ai +40 , siamo abbondantemente oltre il potenziale soglia, che abbiamo detto essere di -40 mV circa. L'interno della cellula adesso diventa positivo, siamo a +40 mV; il riferimento è sempre l'esterno che è 0,quindi il +40 significa che all'interno ci sono + 40 mV rispetto all'esterno. Queste cariche positive all'interno fanno sì che la porta di attivazione si apra, perché le cariche positive che possiede vengono respinte dall'aumento di cariche positive all'interno della cellula, e la porta di inattivazione comincia a chiudersi. La differenza è che la velocità con cui queste due porte si muovono è diversa, la porta di attivazione è molto veloce ad aprirsi e sarà molto veloce a chiudersi, la porta di inattivazione invece è molto lenta a muoversi, sia in chiusura che in apertura. Quando il potenziale salta a m +40 mV la porta di attivazione si apre istantaneamente, la porta di inattivazione incomincia a chiudersi più lentamente.

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C. Ci sarà un breve lasso di tempo in cui il canale rimane aperto, quando il potenziale rimane a valori positivi, perché la porta di attivazione rimane aperta e la porta di inattivazione si sta chiudendo lentamente. Quindi per quei 0,5-0,6 millisecondi (la scala temporale di questi eventi è questa) il canale rimane aperto e quindi Sodio ha modo di entrare all'interno della cellula.

D. Se la depolarizzazione continua ancora lasciamo il tempo alla porta d’inattivazione di chiudersi. A questo punto abbiamo che il potenziale è sempre +40 mV all'interno della cellula, la porta di attivazione è aperta, perché a +40 mV la porta sta aperta, però la porta d’inattivazione è chiusa adesso, perché le abbiamo dato il tempo di chiudersi. Quindi, di fatto, non c'è più un canale aperto e il sodio non può più entrare all'interno della cellula. Quindi anche se il potenziale è positivo, di fatto, il sodio non entra più.

E. Torniamo ad un potenziale di membrana a -60 mV. Abbiamo applicato la depolarizzazione, ora la togliamo. Il potenziale negativo che c'è adesso all'interno della cellula fa chiudere molto velocemente la porta d’attivazione e comincia a far aprire molto lentamente la porta d’inattivazione.

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F. Se rimaniamo per un certo lasso di tempo di nuovo a -60 mV, lasciamo il tempo che la porta d’inattivazione si apra completamente e torniamo al nostro stato iniziale. Il canale del Na voltaggio dipendente funziona con questo meccanismo, con il gioco di queste due porte, in cui il trucco è che la porta d’attivazione si muove molto più velocemente della porta di inattivazione. Il significato di tutto questo è spiegato delle risposte attive della membrana, cioè dal potenziale d'azione.

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