Lecture10 2006

А.С. Спирин 2006 г.

Лекция 10 Терминация трансляции, котрансляционное сворачивание белка и трансмембранная транслокация

ЭЛО Н ГАЦ И Я мРН К

мРН К

3'

5'

С В О БОД Н Ы Е РИ БО С О М Ы

ТЕРМ И Н А ЦИ Я

П ОЛ И РИ БО С О М А

ЗА В Е РШ Ё Н Н Ы Й БЕЛО К

ТРАНСЛЯЦИОННЫЕ ПАУЗЫ

НЕРАВНОМЕРНОСТЬ ЭЛОНГАЦИИ – ТРАНСЛЯЦИОННЫЕ ПАУЗЫ (1) Модулирующие кодоны: кодоны редких синонимных тРНК, особенно их тандемы. (2) Структурные барьеры на мРНК (стабильные шпильки, псевдоузлы, третичная структура). (3) Ингибиторные аминокислотные последовательности растущих пептидов.

РЕДКИЕ («МИНОРНЫЕ») тРНК И РЕДКО ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ («МОДУЛИРУЮШИЕ») КОДОНЫ Escherichia coli: Антикодон:

Кодоны:

tRNAArg

U*CG

CGA, CGG

tRNAArg

U*CU

AGA, AGG

tRNAIle

C*AU

AUA

tRNALeu

U*AA

UUA, UUG

tRNAPro

GGG

CCC, CCU

РАБОЧИЙ (ЭЛОНГАЦИОННЫЙ) ЦИКЛ РИБОСОМЫ ОСТАНОВКА НА ТАНДЕМЕ КОДОНОВ CGA-CGG ВСЛЕДСТВИЕ ДEФИЦИТА РЕДКОЙ тРНК

tRNAUCGArg Arg-tRNAUCG ?

РАБОЧИЙ (ЭЛОНГАЦИОННЫЙ) ЦИКЛ РИБОСОМЫ ОСТАНОВКА НА ПЕПТИДЕ, ИНГИБИРУЮЩЕМ ПЕПТИДИЛ-ТРАНСФЕРАЗНЫЙ ЦЕНТР

LysLysLysLysLysLys MetValLysThrAsp MetSerThrSerLysAsnAlaAsp

РАБОЧИЙ (ЭЛОНГАЦИОННЫЙ) ЦИКЛ РИБОСОМЫ СТРУКТУРНЫЙ БАРЬЕР НА мРНК

Очень стабильная шпилька, псевдоузел или третичеая структура

ТЕРМИНАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ

ЭЛО Н ГАЦ И Я мРН К

мРН К

3'

5'

С В О БОД Н Ы Е РИ БО С О М Ы

ТЕРМ И Н А ЦИ Я

П ОЛ И РИ БО С О М А

ЗА В Е РШ Ё Н Н Ы Й БЕЛО К

ТЕРМИНАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ: ТРИ ЭТАПА

(3) Узнавание терминирующего кодона в А-участке рибосомы: связывание терминирующих факторов. (4) Освобождение полипептида: гидролиз сложно-эфирной связи между тРНК и С-концом пептида. (5) Эвакуация деацилированной тРНК из Р-участка рибосомы и терминирующих факторов из А-участка.

БЕЛКОВЫЕ ФАКТОРЫ ТЕРМИНАЦИИ И ИХ «КОДОНЫ» Прокариоты

Эукариоты и археи Class 1:

RF1

RF2

UAA

eRF1

UAG

UAG

UAA

UGA

UGA

Class 2: RF3

UAA

eRF3

Схема третичной структуры фактора терминации 1-го класса (eRF1)

Взаимодействие с А-участком на 40S

Взаимодействие с ПТЦ на 60S

Взаимодействие с eRF3

Схема третичной структуры фактора терминации 2-го класса (eRF3)

eRF3

EF1

СХЕМА ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

СХЕМА ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ (ЭУКАРИОТЫ)

(1) Связывание ГТФ Конформационная перестройка (2) Гидролиз ГТФ Освобождение eRF3 (3) Гидролиз сложноэфирной связи Освобождение полипептида (4) Освобождение eRF1 Диссоциация рибосомы Уход (вытеснение) тРНК из 40S

СХЕМА ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ (ПРОКАРИОТЫ)

СХЕМА ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ (ПРОКАРИОТЫ)

+

RF3

СХЕМА ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ (ПРОКАРИОТЫ)

ПУТИ РАСТУЩЕГО ПОЛИПЕПТИДА

ЭЛО Н ГАЦ И Я мРН К

мРН К

3'

5'

С В О БОД Н Ы Е РИ БО С О М Ы

ТЕРМ И Н А ЦИ Я

П ОЛ И РИ БО С О М А

ЗА В Е РШ Ё Н Н Ы Й БЕЛО К

ТРИ ПУТИ РАСТУЩЕГО ПОЛИПЕПТИДА: •

Ко-трансляционное сворачивание в компактную глобулу.

•

Взаимодействие недосвернутого или неправильно свернутого полипептида с шаперонами.

•

Ко-трансляционная трансмембранная транслокация.

ЭЛО Н ГАЦ И Я мРН К

мРН К

3'

5'

С В О БОД Н Ы Е РИ БО С О М Ы

ТЕРМ И Н А ЦИ Я

П О Л И РИ БО С О М А

ЗА В Е РШ Ё Н Н Ы Й БЕЛО К

Котрансляционное сворачивание глобина и связывание гема А

Р И БО С О М А

N -ко н е ц

Б

Р И БО С О М А

F E

В

Р И БО С О М А

ШАПЕРОНЫ И ШАПЕРОНИНЫ

Прокариоты

Эукариоты

Система Hsp70/DnaK шаперонов: Dna K

Hsp70

Dna J

Hsp40

GrpE

Шаперониновая система: Gro EL: (60 kDa)14 Gro ES: (10 kDa)7

TRiC: (55 kDa)16

Связывание растущего пептида с шаперонами

ТРАНСМЕМБРАННАЯ ТРАНСЛОКАЦИЯ РАСТУЩЕГО ПОЛИПЕПТИДА

СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД Отщепляемая сигнальная последовательность (n – h – c): N-конец растущего полипептида, 15 – 30 аминокислотных остатков. Короткий «+»-участок (группа Lys, Arg, His) – – гидрофобный участок (7 - 13 остатков, Leu, Ile, Phe, Trp, Ala) – – консервативный участок (5 - 7остатков, место расщепления).

СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД Отщепляемая сигнальная последовательность (n – h – c): N-конец растущего полипептида, 15 – 30 аминокислотных остатков. Короткий «+»-участок (группа Lys, Arg, His) – – гидрофобный участок (7 - 13 остатков, Leu, Ile, Phe, Trp, Ala) – – консервативный участок (5 - 7остатков, место расщепления).

Не отщепляемая сигнальная последовательность: Внутренняя часть растущего полипептида. Группа «+»-аминокислот (Lys, Arg, His) – – гидрофобный участок (20 - 25 остатков).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ СОБЫТИЙ В ПРОЦЕССЕ КОТРАНСЛЯЦИОННОГО ПРИКРЕПЛЕНИЯ РАСТУЩЕГО ПОЛИПЕПТИДА К МЕМБРАНЕ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

Arrest of elongation!

СХЕМА СУБЪЕДИНИЧНОЙ СТРУКТУРЫ СИГНАЛ-УЗНАЮЩЕЙ РНП-ЧАСТИЦЫ

SRP =

+ SIX PROTEIN SUBUNITS

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ СОБЫТИЙ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСМЕМБРАННОЙ ТРАНСЛОКАЦИИ

Место выхода N-конца растущего полипептида из рибосомы по данным иммуно-электронной микроскопии L.A. Ryabova, O.M. Selivanova, V.I. Baranov, V.D. Vasiliev and A.S. Spirin (1988) FEBS Letters 226: 255-260.

Трансмембранный пептид-проводящий канал (вид с торца, со стороны цитоплазмы)

Латеральные ворота

Пробка

B. van den Berg, W.M. Clemons, I. Collinson, Y. Modls, E. Hartmann, S.C. Harrison and T.A. Rapoport (2004) Nature 427: 36-44.

Трансмембранный пептид-проводящий канал (вид боку, со стороны, противоположной латеральным воротам)

B. van den Berg, W.M. Clemons, I. Collinson, Y. Modls, E. Hartmann, S.C. Harrison and T.A. Rapoport (2004) Nature 427: 36-44.

Стадии котрансляционной трансмембранной транслокации секреторного белка

B. van den Berg, W.M. Clemons, I. Collinson, Y. Modls, E. Hartmann, S.C. Harrison and T.A. Rapoport (2004) Nature 427: 36-44.

Котрансляционная и посттрансляционная трансмембранная транслокация новосинтезированного белка у грам-отрицательных бактерий

КОНЕЦ.

ДО СВИДАНИЯ!

Терминация трансляции A 5’

C G UUAA G C A*

P

3’

A Г 5’

C G UU AA

3’

R F1

G C A* R F3

Б 5’

C G UU AA G C A*

3’

R F1

P

R F3 H 20

Д 5’

C G UUAA

R F1

В 5’

R F3

C G UUAA G C A*

P

R F1

R F3

3’

3’

СТРУКТУРНЫЙ БАРЬЕР НА мРНК

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ eEF2 Something bad!

Mitogenic stimulation

2+

Elevation of cytoplasmic Ca

Activation of eEF-2 kinase

Phosphorylation of eEF-2

Arrest of translation

Disappearance of short-lived proteins

Death!

Induction of immediate-early genes

Transition to proliferative state

concentration

EF-Tu (EF1A) GDP Form

GTP Form

СХЕМА ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ У ПРОКАРИОТ

СХЕМА ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ У ЭУКАРИОТ

ШАПЕРОНЫ И ШАПЕРОНИНЫ Прокариоты

Эукариоты

[Trigger factor = TF]

[NAC]

DnaK DnaJ GrpE (20 kDa)

Hsp70 Hsp40

GroEL (60 kDa)14 GroES (10 kDa)7

TRiC = CCT

[Hsp90]