Lecture 9 2006

Можно выделить два типа функциональных доменов, связанных с репликацией ДНК. Это: РЕПЛИКОНЫ и ВРЕМЕННЫЕ ЗОНЫ РЕПЛИКАЦИИ

Репликоны впервые были обнаружены при изучении реплицирующейся ДНК высших эукариот с использованием метода “fiber autoradiography”

Существует ряд методических подходов, позволяющих изучать организацию в репликоны протяженных областей генома. Наиболее простой метод основан на анализе полярности синтеза ведущих цепей ДНК

В геноме человека существуют очень длинные (700 kb) и крайне ассиметричные репликоны. Последнее указывает на возможность генетической детерминации концов репликонов

Эритроидные и неэритроидные клетки Хромосомы с “Испанской” делецией Хромосомы с делецией ori β LCR

HOR HOR 5’β3 5’β2

ori

5’ HS sites 7 6 5 4 3 2 1

3’HS1 ε

Gγ Aγ

δ β

HOR 5’β1

HOR 3’β1 Embryonic

Hispanic deletion

Fetal

Adult ~10 kb

В домене β - глобиновых генов кур участок начала репликации ДНК расположен между генами δ и β. Этот участок начало репликации работает в эритроидных клетках, где домен реплицируется в начале S фазы, и в неэритроидных клетках, где домен реплицируется в конце S фазы. Делеция участка начала репликации приводит к тому, что весь домен реплицируется пассивно с участка начала репликации, находящегося за пределами домена. Та же ситуация наблюдается и при «Испанской» делеции, удаляющей 5’-концевую область домена (т.е. использование участка начала репликации контролируется теми же регуляторными системами, которые контролируют транскрипционный статус домена)

Индивидуальные гены реплицируются в разное время по ходу S фазы. Предложено несколько методических подходов, позволяющих определить предпочтительное время репликации гена (replication timing) Определение относительной представленности пробы в препаратах реплицирующейся ДНК, изолированных на различных стадиях S фазы

Подсчет относительного количества клеток (в асинхронной культуре), содержащих две копии представляющего интерес фрагмента ДНК

Существует определенная корреляция между активностью гена и временем его репликации. Активные и потенциально активные гены как правило реплицируются в первой половине S фазы. Конститутивный гетерохроматин реплицируется в конце S фазы. Многие тканеспецифичные гены реплицируются в начале S фазы в тех клетках, где эти гены активны, и в конце S фазы в тех клетках, где они не активны.

late

late

early β - globin gene domain

В эктопических позициях LCR домена β - глобиновых генов направляет создание таких же областей ранней и поздней репликации

HS4 не важен для установления домена ранней репликации, но важен для установления домена поздней репликации. Делеция HS2 приводит к утрате как ранне-реплицирующегося, так и поздне-реплицирующегося доменов

liver fibroblasts

В S. pombe подавляющее большинство ori инициируется в начале S фазы. Существует лишь несколько поздних ori. Рядом с каждым из них находится несколько блоков AG-богатых последовательностей

RKKGGGGGAW R = A или G W = A или Т K = G или T

В активной и неактивной копиях X хромосомы используются одни и те же участки Начала репликации, но время репликации по ходу S фазы существенно различается

Использование техники гибридизации с олигонуклеотидными чипами позволяет анализировать время репликации протяженных участков ДНК в рамках всего генома, либо индивидуальных хромосом

Figure 1. Experimental strategy for assessing genome wide replication timing using genomic microarrays. (A) Cell cycle profile of cycling human lymphoblastoid cell line after staining with Hoechst 33259. Cells in G1 and S phase of the cell cycle are sorted. (B) The sorted S and G1 phase fractions are checked for purity by re-analysis on the flow sorter and DNA extracted from the fractions. (C) The extracted DNA is differentially labeled with dCTP-Cy3 or dCTP-Cy5 using random primed labeling. (D) The labeled DNA is cohybridized to the array after preannealing with Cot1 DNA to suppress repeats. Early replicating sequences correspond to the spots with an increased S : G1 ratio.

Replication timing profiles of two example chromosomes at a 1 Mb resolution. (A) The replication timing of chromosome 6 at a 1 Mb resolution. (B) The replication timing of chromosome 13 at a 1 Mb resolution. The black arrows indicate the gene deserts on chromosome 13.

Одни и те же участки начала репликации как правило используются в клетках, где данный репликон работает в начале S фазы и в клетках, где данный репликон работает в конце S фазы Время активации участка начала репликации контролируется теми же регуляторными элементами, которые контролируют транскрипционный статус домена

желаю успешной сдачи экзаменов