Lecture 9 2006

А.С. Спирин 2006 г.

Лекция 9: Регуляция трансляции у эукариот

ТОТАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ

Регуляция доступности активного Met-РНКi-связывающего фактора инициации eIF2 путем его фосфорилирования eIF2P:GTP:eIF2B e IF 2 : G T P : e IF 2 B

M e t-tR N A

i

G TP

eIF2P:eIF2B e IF 2 : e IF 2 B

M e t-tR N A i : e IF 2 : G T P : e IF 2 B 4 0 S S U B U N IT

G D P e IF 2 B

eIF2P:GDP e IF 2 : G D P

4 0 S : M e t-tR N A i : e IF 2 : G T P

P

8 0 S : M e t-tR N A

i

IN IT IA T IO N C O M P L E X

6 0 S S U B U N IT

eIF2-киназы: фосфорилирование Ser51 α-субъединицы eIF2 Индукторы eIF2-киназ: •

Недостаток Fe3+ и/или гема

•

Вирусная инфекция

•

Голодание

•

Недостаток ростовых факторов

•

Тепловой шок

АКТИВАЦИЯ ГЕМ-РЕГУЛИРУЕМОЙ eIF2-КИНАЗЫ (“HCR”): ДВА АЛЬТЕРНАТИВНЫХ МЕХАНИЗМА A

Индуктор: Недостаток Fe3+ и/или гема

B

HCR

HCR S S

Inactive dimer

S S

S S

Fe

Inactive heterodimer

Fe S S hsp90

HCR

heme

heme

heme

heme HCR

HCR S S S S SH

ATP

SH

ADP

hsp90

Active monomer SH

P

SH HCR

HCR

HCR

S S S S hsp90

hsp90 P

АКТИВАЦИЯ ГЕМ-РЕГУЛИРУЕМОЙ eIF2-КИНАЗЫ (HCR): Индуктор: Недостаток Fe3+ и/или гема

АКТИВАЦИЯ dsRNA-РЕГУЛИРУЕМОЙ eIF2-КИНАЗЫ (“PKR”) Индуктор: Вирусная инфекция

АКТИВАЦИЯ dsRNA-РЕГУЛИРУЕМОЙ eIF2-КИНАЗЫ (PKR) Индуктор: Вирусная инфекция

АКТИВАЦИЯ тРНК-РЕГУЛИРУЕМОЙ eIF2-КИНАЗЫ GCN2 Индуктор: Голодание по аминокислоте

АКТИВАЦИЯ тРНК-РЕГУЛИРУЕМОЙ eIF2-КИНАЗЫ GCN2 Индукторы: (2) Голодание (3) Недостаток ростовых факторов

АКТИВАЦИЯ МЕМБРАННОЙ eIF2-КИНАЗЫ (PERK)

Индуктор: Стресс

МЕХАНИЗМ ТОТАЛЬНОГО ПОДАВЛЕНИЯ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ eIF2-КИНАЗАМИ

РЕГУЛЯЦИЯ ДОСТУПНОСТИ ЛИМИТИРУЮЩЕГО мРНК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ (eIF4)

eIF4E + eIF4A + eIF4G + 4E-BP

eIF4F eIF4E:4E-BP (inactive)

+ATP

фосфорилирование 4Е-ВР

ТОТАЛЬНАЯ ГЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ eIF4E-СВЯЗЫВАЮЩИМ БЕЛКОМ

40S

eIF4E:4E-BP 5'-UTR

eIF4E CAP

POLY(A) 40S 60S CODING REGION 3'-UTR

60S

ЦИРКУЛЯРИЗАЦИЯ ПОЛИРИБОСОМЫ

40S

5'-UTR CAP

POLY(A) 40S 60S CODING REGION 3'-UTR

60S

мРНК-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ

ТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕПРЕССИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ мРНК

Прокариоты

Эукариоты

ТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА ФЕРРИТИНА

IRE Ferritin coding sequence

Ferritin mRNA 5'

Cap

3'

-Fe

3+

+Fe

3+

IRE-BP Translation initiation blocked by IRE-BP bound to IRE

aconitase (4Fe-4S) IRE unoccupied allowing initiation and ferritin synthesis

43S preinitiation complex

60S

МАСКИРОВАНИЕ мРНК

МАСКИРОВАННАЯ мРНК (1) Запасенная в процессе оогенеза мРНК ооцитов, а также запасенная в сперматогенезе мРНК сперматоцитов. (2) Маскирование-демаскирование мРНК в процессе эмбриогенеза и клеточной дифференцировки. (3) Маскирование-демаскирование мРНК в ответ на физиологические и гормональные воздействия. (4) Транспорт маскированной мРНК внутри клетки и ее демаскирование в местах внутриклеточной локализации.

Особенности маскированных мРНК: нетранслируемость; стабильность, неатакуемость нуклеазами; неподверженность полиаденилированию-деаденилированию.

сновные физико-химические свойства цитоплазматических информационных рибонуклеопротеидов (информосом) 1) Гетерогенность размеров, линейная корреляция коэффициентов седиментации частиц с коэффициентами седиментации их изолированной РНК. 2) Плотностная гомогенность (т. е. все частицы, не зависимо от размера, имеют одинаковое соотношение белок : РНК). 3) Высокое соотношение белка к РНК (около 3 : 1) и соответственно низкая плавучая плотность (1,4 г/см3 в CsCl). (Рибосомы имеют соотношение 1 : 1 и плавучую плотность 1,55 г/см3).

4) Устойчивость к удалению ионов магния. (Рибосомы при удалении магния диссоциируют сначала на субчастицы, а затем на РНК и белок).

5) Чувствительность к рибонуклеазам. (Рибосомы относительно устойчивы к рибонуклеазной обработке).

итоплазматические информационные рибонуклеопротеиды (информосомы) в животных клетках . Свободные нетранслируемые мРНП-частицы как форма существования маскированных мРНК. Стабильны в клетке, не подвержены деградации и полиаденилированию/деаденилированию, не способны взаимодействовать с факторами инициации трансляции и рибосомами.

I. Свободные мРНП-частицы как фонд транслируемых мРНК. Подвержены как деаденилированию и деградации, так и полиаденилированию и взаимодействию с рибосомами. Могут либо находиться в равновесии с полисомами, либо быть временно выключены из трансляции репрессорами.

II. Транслируемые мРНП, входящие в состав полисом и освобождаемые при диссоциации рибосом. Белки, связанные с мРНК в полисомах, позволяют рибосомам беспрепятственно транслировать кодирующие последовательности, а возможно и способствовать трансляции.

Spisula solidissima Оогенез: Синтез и маскирование мРНК, кодирующих малую субъединицу рибонуклеотид-редуктазы, циклин А, etc., накопление мРНП (информосом) в цитоплазме. Оплодотворение: Демаскирование этих мРНК в цитоплазме, переход из информосом в полисомы. мРНП in vitro: Демаскирование путем обработки солью (диссоциация белка мРНП). Демаскирование с помощью антисмысловых РНК (“competitive unmasking assay”). Открытие «маскирующего элемента» (“masking box”) в 3’-НТО: N. Standart et al. (1990) Genes Dev. 4: 2157-2168. Открытие маскирующего белка, специфически связывающегося с 3’-НТО: N. Standart (1992) Semin. Dev. Biol. 3: 367-379.

Открытие «маскирующего элемента» в 3'-НТО и первичного «маскирующего белка» в мРНК рибонуклеотид-редуктазы ооцитов моллюска Spisula solidissima

Схема маскирования-демаскирования материнских мРНК в оогенезе и после оплодотворения Xenopus laevis

коди ру ю щ ая п о сл ед о вател ьн о сть

A U G 5'

3'

блокада ини циаци и U A A

бло када деградаци и

н екоди ру ю щ ая п о сл ед о вател ьн о сть (3 '- U T R ) с егм ен т м аски ро ван и я м аски р о ван и е

дем аск и ровани е

м аски ру ю щ и й бело к

Схема инициации маскирования эукариотической мРНК коди ру ю щ ая п о сл ед о вател ьн о сть

A U G 5' eIF4E

3'

блокада ини циаци и U A A

бло када деградаци и

4E-BP Maskin

н екоди ру ю щ ая п о сл ед о вател ьн о сть (3 '- U T R )

с егм ен т м аски ро ван и я м аски р о ван и е

дем аск и ровани е

м аски ру ю щ и й бело к

КРУГОВАЯ ТРАНСЛЯЦИЯ В СФОРМИРОВАННЫХ ПОЛИСОМАХ

40S

5'-UTR CAP

eIF3, eIF4 PABP POLY(A) 40S 60S CODING REGION 3'-UTR

60S

СХЕМА МАСКИРОВАНИЯ мРНК

СХЕМА МАСКИРОВАНИЯ мРНК

4E-BP

Эукариотические мРНК-связывающие белки

Эукариотические мРНК-связывающие белки

eIF4

Drosophila Оогенез и ранний эмбриогенез: детерминация передне-задней оси эмбриона

огенез: Синтез, импорт в яйцо и маскирование мРНК, кодирующих постериоральные и антериоральные детерминанты – белки Nos (nanos мРНК) - постериоральный детерминант, Bicoid (bicoid мРНК) - антериоральный детерминант, Hunchback (hunchback мРНК), Caudal (caudal мРНК), и др. Накопление маскированных мРНП (информосом) в яйце. плодотворение: Демаскирование nanos мРНК в заднем отделе яйца, синтез Nos в заднем отделе яйца, диффузия Nos и установление задне-переднего градиента вдоль яйца и затем вдоль передне-задней оси эмбриона. Демаскирование нелокализованной hunchback мРНК, ее маскирование белком Nos по его градиенту, установление передне-заднего градиента белка Hunchback. азвитие:

МОДЕЛЬ УСИЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИ(А)-ХВОСТА НА КЭП-ЗАВИСИМУЮ ИНИЦИАЦИЮ ТРАНСЛЯЦИИ

40S

5'-UTR CAP

POLY(A) 40S 60S CODING REGION 3'-UTR

60S

СХЕМА МАСКИРОВАНИЯ мРНК

СХЕМА МАСКИРОВАНИЯ мРНК (начальная стадия) YB

ПЕРВИЧНЫЙ