Lecture 3 2006

Кодирующие последовательности составляют не более 10% генома высших эукариот. В дифференцированных клетках многоклеточных организмов работает лишь незначительная часть от общего числа генов. Инактивация «ненужных генов» составляет не менее важную задачу, чем активация «нужных» генов

У большинства высших эукариот важную роль в инактивации генов играет метилирование остатков цитозина в составе CpG динуклеотидов

me

CpG GpC me

CpG островки CpG

CpG island

met

CpG/GpC ~ 1

CpG

CpG/GpC ~ 0,2

house-keeping gene

CpG островки как правило содержат сайты связывания транскрипционного фактора SP1 CCGCCC Для грубого анализа распределения метилированных CpG динуклеотидов можно использовать параллельное расщепление геномной ДНК чувствительными и не чувствительными к метилированию рестриктазами

ССGG GGCC

Hpa II, MspI

met

ССGG GGCC met

MspI

В CpG островках расположено около 60% всех промоторов, в том числе абсолютное большинство промоторов генов «домашнего хозяйства»

В тех промоторах, которые располагаются в CpG островках, все сайты связывания транскрипционных факторов расположены в пределах CpG островка.

На ранних стадиях дробления происходит полное деметилирование генома, после чего специфический статус метилирования устанавливается de novo метилирование de novo и поддерживающее метилирование осуществляются разными метилазами

Dnmt1

Импринтинг – один из случаев создания неактивного домена при посредстве метилирования ДНК

В установлении и поддержании импринтинга важную роль играют Imprinting Choice Regions (ICR). Это небольшие фрагменты ДНК, которые по разному метилируются в материнских и отцовских хромосомах (DMR)

Метилированный фрагмент ДНК подавляет активность расположенного рядом промотора даже если сам промотор не метилирован (по видимому путем создания локального неактивного хроматинового домена)

Перед кластером альфа глобиновых генов кур находится CpG островок, часть которого избирательно метилирована в неэритроидных клетках Acc I 290

H a e II 9 0 3

0

200

400

600

800

1000

Fok I 1553

1200

1400

M s p I/H p a II s i te s

1600

1800

2000

* Sm a I

Sm a I

Sm a ISm a I Sm a I P robe 1

P robe 2 P r o te c te d D N A fr a g m e n t u C p G fra g m e n t

Селективное метилирование CpG динуклеотидов в границах uCpG фрагмента подавляет активность промотора альфа D гена

Results of the CAT assay C A T g e n e a c t iv it y % Pα D C A T gene

uCpG

Pα D C A T gene

uCpG

Pα D C A T ge ne

m e th yl- C p G

uCpG

Pα D C A T ge ne

m e th yl- C p G

0

20

40

60

80

100

%

Что еще инактивируется метилированием ДНК

сателлиты и другие повторяющиеся последовательности транспозоны многие тканеспецифичные гены, не работающие в данном типе клеток

Нарушение системы метилирования ДНК в том числе и утрата функциональной активности белков, связывающихся с метилированной ДНК приводят к тяжелым наследственным заболеваниям RAT синдром

МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК И МОДИФИКАЦИЯ ГИСТОНОВ ТЕСНО ВЗАИМОСВЯЗАНЫ DNMT-I

HDAC-I

Долгое время считалось, что активные домены в хроматине создаются в результате действия определенных регуляторных систем, тогда как пассивное (т.е. препятствующее транскриции) состояние “задано по умолчанию” В последние годы стало очевидным, что репрессивные домены дакже создаются под действием определенных регуляторных механизмов. Большую роль в осознании этого факта сыграло изучение феномена мозаичной экспрессии генов (“variegated expression”, PEV)

PEV связан с упаковкой домена в конститутивный гетерохроматин. Существует целый ряд мутаций, подавляющих PEV (Suvars). Изучение соответствующих генов позволило идентифицировать ключевые белковые продукты, необходимые для поддержания компактной упаковки неактивных доменов. Важнейшими из них являются гистонметилазы и структурные белки гетерохроматина (HP1 у человека, Sir белки у дрожжей)

SUV39H1 непосредственно участвует в привлечении HP1 Метилирование H3/K9 гистонметилазой G9a подавляет транскрипцию, но без участия HP1, а посредством стимуляции деацетилирования гистонов

НР1 привлекает гистон-метилазу SUV39H1, которая метилирует по позиции К9 соседние молекулы Н3 и привлекает HP1. Таким образом осуществляется распространение гетерохроматинового домена

Для того, чтобы запустить каскад образования гетерохроматина достаточно тем или иным образом привлечь в определенную область хромосомы белок НР1

метилирование К4 у высших эукариот и К79 у дрожжей препятствует образованию гетерохроматина (в частности, препятствуя метилированию К9 у высших эукариот)

В дрожжевых клетках неактивные домены, обладающие некоторыми признаками гетерохроматина высших эукариот, образуются при участии SIR (silence information regulators) белков. Эти белки не взаимодействуют непосредственно с ДНК. Их посадка на хроматин обеспечивается рядом других белков (RAP, ORC-белки, ABF1). SIR2 является NAD-зависимой лизин деацетилазой.

Долговременная репрессия геномных доменов осуществляется при посредстве метилирования ДНК. Метилирование гистона H3 по позиции 9 по-видимому способствует привлечению ДНК-метилаз. Мутация, нарушающая функцию Н3 lys9-метилтрансферазы (у дрожжей и Neurospora Crassa) препятствует нормальному метилированию ДНК.

Долгое время считалось, что в отличие от ацетилирования метилирование гистонов является необратимым так как в клетке не обнаружено гистон деметилаз Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Shi et al., Cell. 2004 Dec 29;119(7):941-53. (специфическое деметилирование лизина 4 гистона Н3) Фермент присутствует у всех высших и низших эуариот

Метилированные гистоны могут быть удалены также путем разборки нуклеосом и их сборки de novo из неметилированных гистонов. Хотя в большинстве случаев сборка нуклеосом осуществляется одновременно с репликацией ДНК, существует и независящий от репликации путь сборки нуклеосом. Это позволяет вносить локальные изменения в структуру хроматина, например посредством замены стандартных нуклеосом на нуклеосомы, содержащие вариантные формы гистонов

В белковых молекулах, регулирующих динамику хроматиновой фибриллы идентифицированы различные типы доменов, обеспечивающих их связывание с ацетилированными и метилированными гистонами BROMODOMAIN – связывание с ацетилирванными лизинами (активный хроматин) гистон-ацетилазы RSC комплекс ремоделирования хроматина TAF(II)250/CCG1 (белок, ассоциированный с TFIID) коактиваторы транскрипции полимеразой II (p300) некоторые транскрипционные факторы

CHROMODOMAIN – связывание с гистоном Н3, метилированным по лизину 9 (неактивный хроматин) HP1 Mi2 (AТФазная субъединица комплекса NURF сочетающего ремоделирующую хроматин и гистондеацетилазную активности)

MBD domain – связывание с метилированными CpG динуклеотидами

не связывается с метCpG

Наиболее хорошо изучен белок MeCp2, способный связываться с одним метилированным CpG. Этот белок обладает доменом, подавляющим транскрипцию (transcription repression domain). Кроме того, он способен привлекать Sin3 комплекс, содержащий гистондезацетилазы HDAC1 и HDAC2.

Мутации MeCp2 вызывают тяжелое заболевание – Rett синдром

У мышей с нокаутом MeCp2 развивается заболевание сходное с Rett синдромом Для развития заболевания достаточно удалить ген MeCp2 только в мозговых тканях (Nestin-creMeCp2 deletion)

нокаут MBD3 летален в силу того, что этот белок является структурным компонентом комплекса ремоделирования хроматина NURD (у млекопитающих этот белок не связывается с метилированной ДНК)

Одиночные и комплексные нокауты всех остальных MBD белков летальными не являются Нокаут ДНК метилтрансфераз, осуществляющих de novo метилирование в эмбриональных клетках, является летальным !!!

Распределение модифицированных форм гистонов в рамках всего генома можно изучать посредством гибридизации продуктов иммунопреципитации с олигонуклеоитидными матрицами

Существут положительная корреляция между присутствием в транскрибирующихся генах различных метилированных форм гистонов, типичных для активного хроматина. Существут также положительная корреляция корреляция между присутствием в нетранскрибирующихся генах различных метилированных форм гистонов, типичных для неактивного хроматина

H3-K9-me2

Существует четкая корреляция между транскрипцией, ацетилированием H3 по позициям 9/14 и присутствием характерных для активного хроматина метилированных форм гистона Н3, равно как и корреляция между отсутствием транскрипции, отсутствием ацетилирования H3 по позициям 9/14 и метилированием H3 и H4 по позициям, характерным для неактивного хроматина

Особую группу белков, обеспечивающих долговременную инактивацию генов составляют белки Polycomb

Два механизма подавления транскрипции: препятствие работе комплексов ремоделирования хроматина Прямое взаимодействие с TFIID И подаdление инициации транскрипции