Labo 3 - 4

Universidad Católica de la Santísima Concepción Facultad de Medicina, Escuela de Medicina Depto. De Ciencias Básicas y Morfología Laboratorio de Bioquímica /

LABORATORIO Nº 3 y 4 REACCIÓN ENZIMÁTICA Medicina Sección I

Integrantes:  Franca González Beltrán  Juan González Oyarzún  Loreto Hernández  Max Hetz Navarrete Fecha del Laboratorio:  15/04/2009  22/04/2009 Fecha de Entrega:  06/05/2009 Docentes:  Dr. Reginald del Pozo Ph.D  BQ. Javier Grandón P.  BQ. Mirna Muñoz M.Sc  QA. German Rotter M.

INTRODUCCIÓN Las infinidades de reacciones bioquímicas que ocurren en nuestro organismo y medio entorno orgánico requieren de un tiempo prudente y óptimo para realizarse, de lo contrario, si transcurrieran lentamente, no serían eficaces. Debido a esto, la velocidad a la cual se hace un trabajo adecuado, corresponde aun factor esencial para una mejor producción de un sistema, cualquiera sea éste. Si nos avocamos al sistema biológico, los procesos bioquímicos que involucra, requieren viablemente una velocidad específica para que se lleven eficazmente a cabo. Para obtener dicha velocidad necesitamos de las relevantes enzimas, catalizadores mayormente de origen proteico, que aceleran adecuadamente las reacciones, éstas se unen a un sustrato para que pueda la reacción posteriormente formar productos rápidamente. El mecanismo de acción de las enzimas es muy específico, y aumenta la velocidad de la reacción en un millón de veces y más. Las moléculas que reaccionan deben alcanzar un estado de transición (estado de mayor energía y el más inestable) un estado activado, donde es muy probable que estas reaccionen formando producto. El alcanzar el estado de transición necesita de energía, por tanto, lo que realiza la enzima es disminuir la cantidad de energía necesaria para alcanzar este estado. Las enzimas se encargan además de conferir un ambiente, favorable en condiciones para la reacción, de este modo no producen grandes diferencias de energía calórica en las células por ende en el cuerpo. Este nuevo ambiente es que cuando modulan la reacción producen cambios en los reactantes formando nuevas fuerzas en las moléculas, desestabilizándola y de esta forma la reacción ocurre más fácil y por ende más rápida. Como hemos mencionado, en los sistemas biológicos es muy importante la velocidad con que ocurren los procesos. Esta puede ser medida cuantificando la cantidad de producto generado o la cantidad de sustrato que ha desaparecido por unidad de tiempo. Pero también cabe mencionar que las velocidades de reacciones enzimáticas son influidas también por la concentración de enzima de una forma proporcionalmente directa, en condiciones saturantes para la enzima. Además la velocidad con que ocurren las reacciones catalizadas por enzimas depende de si hay suficiente sustrato como para saturar la enzima. Cuando la enzima esta saturada, ha alcanzado su velocidad máxima, esto se logra cuando la velocidad de formación de producto se hace independiente de la cantidad de sustrato (reacción de orden cero) Conforme a lo anterior, analizaremos la acción de la enzima fosfatasa alcalina, presente en intestino de ternera, catalizando la reacción de hidrólisis del 2fosfopropanodiol en glicerol y fosfato de sodio. Donde el comportamiento de dicha reacción de acuerdo a sus factores influyentes (concentración de sustrato, velocidad de reacción, concentración enzimática, etc.) se verá elucidada a forma de gráficas, tales como ecuación de Lineweaver-Burk y Michaelis y Menten por ejemplo, que describe el comportamiento de la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad inicial. Así como también se puede detectar la constante Michaelis-Menten (Km) indicando la

afinidad que tiene una enzima por su sustrato, esta constante en el grafico nos sirve para encontrar el valor de la concentración de sustrato cuando la velocidad inicial de reacción es la mitad. OBJETIVOS Aplicar conocimientos sobre ecuación Michaelis Menten, analizando la reacción enzimática especifica de la fosfatasa alcalina, involucrando sus factores tales como velocidad de reacción, concentración de sustratos, concentración de enzima e ir comparando datos de acuerdo a dicha ecuación o a la gráfica de dobles recíprocos. Manejar conceptos de métodos químicos tales como los especofotométricos, la absorbancia detectada por la muestra y lo que nos permite deducir de aquella de acuerdo a su concentración, en este caso la aplicación de una solución reductora a la muestra enzimática producida. Aplicar conocimientos matemáticos, para calcular valores como la velocidad inicial, máxima, a partir de gráficos y ecuación de michaelis-menten o de dobles recíprocos, cáculo de la Km y pendiente (Km/Vmáx). MATERIALES Y METODOS • • • • • • • • • • • • • • •

Materiales: Tubos de ensayo Matraz Erlenmeyer de 100mL Pipetas de 2mL, 5mL y 10mL propipetas Gradilla para tubos de ensayo Espectrofotómetro micropipeta 200-1000µL puntas para micropipeta Vórtex Vaso de precipitado de 50 mL Soporte universal Nuez y pinza Baño a 37ºC Cubetas para medición en espectrofotómetro Cronómetro

• • • • • •

Reactivos: Glicina/NaOH 0.1M (pH 9.4), NaCl 0.1% p/v β-glicerofosfato de sodio 0.003M Fosfatasa alcalina de intestino de ternera Molibdato de amonio 2.5% en H2SO4 5N Ácido 1,2,4-aminonaftolsulfónico Fosfato de sodio 1µmol/mL

Flujogramas 1

Preincubar a 37° C en baño termorregulador por 6 a 7 minutos (recordar que tiene solución tampón pH= 9,4)

Enzima 5 ml

(Luego de 6 a 7 minutos)

Definición de alícuota: volumen o cantidad de masa que se va a emplear en una prueba de plataforma o de laboratorio. CADA ALÍCUOTA QUE SE SAQUE DEBE SER DE 3 ml. Completar con Agua destilada y 0,4 ml de Solución reductora

Ejemplo: 3ml de solución

(a los 5 minutos exactos)

Observaciones 1. Flujograma1 • Se debe preparar un tubo blanco y estándar (2) además de los tubos para blanquear y para tener el parámetro común: Bco= Molibdato NH4 1ml H2O 8.6ml Std.(x2)= Molibdato NH4 1ml Solución Std.Fosfato 1ml H2O 7.6ml • Se deben utilizar pinzas puesta en el cuello del matraz para poderlo transportar al baño termorregulador • -En el mismo instante en que la enzima toca la solución preincubada debe cronometrarse el tiempo con un cronómetro el cual, durante el experimento, nunca se detendrá debido a que llevará registro de los tiempos para poder sacar cada alícuota. En el caso de la primera alícuota, esta debe sacarse en el instante en el que se agrega la enzima. • -El matraz erlenmeyer con la solución debe permanecer en el baño termorregulador durante toda la experiencia para mantener temperatura constante y no ser una variable. • Cada tubo de ensayo en el que se agregarán las alícuotas debe tener molibdato ácido y agua destilada (esto para poder parar la reacción y ver el avance según el tiempo). • Golpetear suavemente contra la mesa para eliminar burbujas y así no estropear la medición de Abs. Flujograma 2 500ul Enzima

500ul Buffer

1 S

2 S

mlSus. 2 H2O --

1.5 0.5

3 S

1 1

4 S

0.5 1.5

5 S

0.25 1.75

Aquí la variable es la cantidad de sustrato, por lo que se diluye con agua destilada (que tampoco será la misma cantidad en cada caso) hasta que todos los tubos queden con igual volumen y es porque es la misma cantidad de enzima que se agrega a todos los tubos.

(Todos los tubos deben pasar por este proceso)

Preincubar a 37° C en baño termorregulador por 6 a 7 minutos para alcanzar su máxima actividad según temperatura adecuada.

Aunque son experimentos que pretenden determinar diferentes resultados, para reducir el tiempo de las experiencias se ha decidido el cronometrar en seguimiento para el cronómetro y economizar la espera. Cada llenado de los tubos se debe realizar de manera conjunta por el equipo para luego cronológicamente con diferencia de 1 minuto por tubo (para eso además están con número y con letras diferenciadas de abreviación para cada experimento) agregar el volumen específico de enzima que aunque en el primer caso no varíe, es la que actúa sobre el sustrato y sirve además para poder llevar un orden y no cambiar de pipeta por el tiempo.

Se agrega la cantidad de enzima a cada tubo en un intervalo de tiempo distinto Tiempo (min) Tubo

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

S1

S2

S3

S4

S5

E1

E2

E3

E4

E5

Se agrega a cada tubo 3 ml de Solución de Molibdato para detener la acción enzimático.

Tiempo (min Tubo

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

S1

S2

S3

S4

S5

E1

E2

E3

E4

E5

Se agregan 3,6ml de agua destilada y 0,4 de solución reductora

Observaciones 2. Flujograma 2 • Cada tubo, una vez que se le agrega el volumen correspondiente de enzima debe vorterearse de 3 a 5 segundos y volver a incubar por 10 minutos cada tubo, esto para mezclar y a la vez tratar de mantener la temperatura constante y no se transforme en una variable. • Se debe preparar un tubo blanco y estándar (2) además de los tubos para blanquear y para tener el parámetro común: Bco= Buffer 0.5ml H2O 2.5ml Std.(x2)= Buffer 0.5ml Std.Fosfato 1ml H2O 1.5ml • El desarrollo del laboratorio se realiza en base a reacciones sucesivas para disminuir tiempo con intervalos de 1 min entre cada incorporación de sustancia a cada tubo. • Golpetear suavemente contra la mesa para eliminar burbujas y así no estropear la medición de Abs. RESULTADOS

Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 30 40 50 60

Absorvancia 0,006 0,066 0,078 0,118 0,132 0,143 0,162 0,180 0,216 0,223

µmoles totales de PO4H-2 0,02 0,21 0,24 0,37 0,41 0,45 0,50 0,56 0,67 0,69

µmoles de PO4H-2 menos 0 min 0,19 0,22 0,35 0,39 0,43 0,49 0,54 0,65 0,68

µmoles de PO4H-2 en 5 min 0,21 0,04 0,12 0,04 0,03 0,06 0,03 0,06 0,01

Tabla 1.- Corresponde a los Datos obtenidos en la primera fase del Laboratorio de Enzimas, donde se reflejan la Absorbancia, y la cantidad de moles de producto obtenidos a diferentes intervalos de tiempo de reacción enzimático. Estandar 1 Estandar 2

0,322 0,320

Estándar 1.- Corresponde a los estándares realizados para la Tabla 1, para determinar un promedio , y utilizar este en los procedimientos de calculo de producto.

Gráfico 1.- Corresponde al gráfico de Velocidad (abscisa), y Tiempo (ordenada), donde podemos ver reflejado el descenso de la velocidad enzimático a lo largo que avanza el tiempo de reacción. No se ha graficado el valor 0,04 µmoles/5min debido a que es un dato que desvía incorrectamente la curva, y esto se desvió lo mas probable por efectos de variaciones en el detenimiento de la reacción enzimático.

Gráfico 2.- en el gráfico se muestra el desarrollo de la curva de aumento de la concentración de producto en base al progreso de tiempo de la reacción enzimático.

Tubo Nº 1 2 3 4 5

[S] (mM) 4 3 2 1 0,5

Absorbancia 1,145 1,074 1,012 0,661 0,396

Velocidad 3,16 2,97 2,80 1,83 1,09

1/[S] 0,25 0,33 0,50 1,00 2,00

1/Vi 0,32 0,34 0,36 0,55 0,91

Tabla 2.- Corresponde a la tabla que refleja los resultados obtenidos en la segunda parte del Laboratorio, donde en iguales circunstancias reactivas se vario la concentración de Soluto, para luego obtener Absorbancia, y Velocidad. ESTANDAR 1 ESTANDAR 2

0,367 0,357

Estándar 2.- Corresponde a los Estándares calculas para obtener un promedio y utilizar en los cálculos para obtener la velocidad enzimático expuesta en la Tabla 2.

Gráfico 3.- Corresponde a la curva de Progreso en base a la Tabla 2, donde se refleja Velocidad versus Concentración de Sustrato y podemos visualizar la curva regida por la ecuación de Michaelis-Menten

Gráfico 4.- Corresponde al gráfico también llamado de los Dobles Recíprocos, en donde se utilizan los valores inversos de Velocidad y Sustratos que se encuentran en la Tabla 2. Para obtener los valores exactos debemos utilizar la ecuación de dobles recíprocos o de Lineweaver- Burk: 1

Km

1

= Vi

1

x

+

V máx

S

V máx.

Según los datos obtenidos en el práctico nos dio la siguiente ecuación de la recta: y = 0,3476x + 0,2109 Entonces la velocidad máxima será : 0,2109 = 1/ V máx. V máx. = 1/ 0.5556 V máx. = 4,7416 (µmoles) PO4H-/10 min Para calcular la Km lo haremos mediante la relación de la pendiente de la recta: Km =

0,3476

V máx Km Km

= 0,3476 x V máx. = 0,3476 x 4,7416

Km

=

1,64

Tubo Nº 1 2 3 4 5 ESTANDAR 1 ESTANDAR 2

Enzima (ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 0,367 0,357

Absorvancia 0,340 0,540 0,779 0,971 1,033

Velocidad 0,94 1,49 2,15 2,68 2,85

Tabla 3.- Corresponde alos datos obtenidos en situación reactivas idénticas pero con variaciones de la cantidad de enzima presentes. Además se adjuntan los Estándares para obtener un promedio y utilizarlo en el calculo de la Velocidad.

Grafico 5.- corresponde a la Tabla 3, visualizando el ascenso lineal de la velocidad de la reacción catalizada por enzima, al ir aumentando la cantidad de esta ultima. El gráfico no posee el dato 2,85 de velocidad debido a que era un dato que desviaba demasiado la recta debido a quizás errores en tiempo de preparación. Para obtener el promedio de la Absorbancia de los Estándares, se realiza lo siguientes:(Tabla 1) 0, 322 + 0, 320 2 A lo cual obtenemos: 0,321 de Absorbancia PROMEDIO.

Para calcular la concentración de producto en base a la Absorbancia obtenida de cada muestra, nos basamos en los promedios de los estándares:

Estándar Promedio:0,321 La absorbancia equivale a la concentración de 1 µmol de fosfato, que sería el producto de la acción enzimático de la fosfata alcalina., y por ende con dividir las concentraciones muestreadas por la del estándar promedio obtendremos la concentración final. Absorbancia 5 min: 0,066 Absorbancia Promedio: 0,321

0, 066 0, 321

Obtenemos un concentración de producto de: 0,021 µmoles En el caso del calculo de las velocidad, basta tan solo con dividir la concentración de producto ya valorizado con la cantidad de tiempo que se desea sacar la velocidad, que puede ser por minuto o por 5 minutos. Cabe destacar que las tablas adjuntas de las cuales se desarrollaron los gráficos, poseen variación debido a que en el calculo por medio de Excel se utilizan todos los decimales, para así hacer las representación gráficas mas representativa. CONCLUSION Y DISCUSION Durante la última actividad práctica que realizamos tratamos el tema de Enzimas. Esta actividad se encontraba dividida en dos partes, en las que pudimos observar el comportamiento de la velocidad de la reacción enzimática en función del tiempo y la influencia que tienen la concentración de sustrato y la concentración de enzima en la velocidad de la reacción. Para realizar ambas partes de este práctico utilizamos como enzima la fosfatasa alcalina (FA) de intestino de ternera. El sustrato de esta enzima es el β-glicerofosfato de sodio, el cual en presencia de agua y FA es hidrolizado a glicerol y fosfato de sodio. Al utilizar FA hay que tener en consideración que toda enzima trabaja a una temperatura y a un pH óptimo, los cuales en este caso son 37° C y 9,4 respectivamente. Para detener la reacción se agregó solución stop (molibdato de amonio 2,5% en H2SO4 5N), el H2SO4 acidifica el medio y desnaturaliza a la enzima, haciendo que esta deje de formar producto. Por otra parte, el molibdato se une al fosfato generado por la reacción enzimática, formando un complejo que puede detectarse al agregar solución reductora (ácido 1,2,4-aminonaftosulfónico), la cual hace que la solución tome un color azulvioláceo, que es usado para medir la concentración de fosfato mediante espectrofotometría. En la primera parte del práctico estudiamos el progreso de la reacción enzimática en función del tiempo de incubación, lo que puede observarse en el Gráfico 2. El progreso de una reacción enzimática puede medirse utilizando como referencia la cantidad de sustrato consumido o el producto formando, en este caso utilizamos el producto, que según la curva del Gráfico 2 aumenta de forma hiperbólica. La curva toma una forma hiperbólica ya que la FA, al encontrarse un medio rico en sustrato y con condiciones óptimas para reaccionar, comienza su actividad catalítica de forma eficiente. El sustrato es saturante ya que se encuentra en gran cantidad en relación a la cantidad de enzima presente, la formación de producto es rápida y eficiente

ya que todos los sitios activos de la enzima están siendo ocupados por sustrato. A medida que aumenta la concentración de producto, disminuye la concentración de sustrato, los sitios activos de la enzima no serán ocupados en su totalidad, por lo que la formación de fosfato se hace cada vez más lenta. La velocidad aumenta de forma repentina de 0 a un valor de 0,22 de forma tan rápida que no se puede observar en la Gráfico 1 (se trata del tiempo que demoran encontrarse la enzima con el sustrato). Teóricamente, la velocidad debería permanecer constante por un breve periodo de tiempo, pero al mirar la curva del Gráfico 1 esto no resulta así. Esto pudo ocurrir debido a una descoordinación del trabajo en grupo, ya que si se deja pasar mucho tiempo entre retirar una alícuota y vaciarla en el tubo con solución stop, sigue llevándose a cabo la reacción y sigue consumiéndose sustrato, disminuyendo la liberación de fosfato y, por consiguiente, disminuyendo la velocidad de reacción. Según el Gráfico 1 la velocidad de reacción disminuye a medida que pasa el tiempo. Teóricamente la velocidad puede llegar a ser 0 cuando se alcanza el equilibrio de la reacción. En la segunda parte del práctico estudiamos los parámetros que cambian la velocidad de reacción al ser modificados. El primer parámetro que modificamos fue la concentración de sustrato. Se puede observar la variación de la velocidad en función de la concentración de sustrato en la curva de saturación Gráfico 3. La fosfatasa alcalina, al no ser regulada alostéricamente, sigue la cinética de Michaelis-Menten, por lo que se pueden obtener del gráfico los valores de Vmáx y Km. La importancia de estos valores se debe a su significado, mientras la velocidad máxima es la velocidad inicial más alta que se alcanza, en la que la enzima está saturada; Km es la relación entre k1, k2 y k3 (constantes de velocidad de la reacción enzimática) y es bastante útil a la hora de comparar la eficiencia de diferentes enzimas o bien, de una misma frente a distintos sustratos; enzimas con menor valor de Km muestran ser más eficientes y afines a su sustrato, ya que a menor [S] se alcanza la mitad de Vmáx, la catálisis es más rápida pues toma menos tiempo para que se forme el complejo enzima sustrato. Puede observarse que a bajas concentraciones de sustrato, la Vi aumenta casi linealmente con el incremento de la concentración de sustrato, esto ocurre porque a bajas [S] no han sido ocupados todos los sitios activos de las enzimas. Cuando la concentración de sustrato llega a ser saturante, es decir, todos los sitios activos se encuentran ocupados, se llega a un estado estacionario, que en el gráfico se observa como una meseta, la velocidad de reacción deja de ser dependiente de la concentración de sustrato y pasa a depender solamente de la velocidad en que ocurre la catálisis en el sitio activo, y se alcanza la Vmáx. Como se mencionó anteriormente se pueden obtener los valores de Vmáx y Km a partir del gráfico, pero de forma aproximada, los cuales serían 3,16 µmoles/5 minutos y 1,4 mM respectivamente. El valor de velocidad máxima que se calcula a partir del gráfico es aproximado, ya que se acerca a él pero nunca lo alcanza. Para calcular estos valores con certeza se utiliza la ecuación de los dobles recíprocos (Gráfico 4) obteniéndose valores más reales y confiables, 4,7619 µmoles/5 minutos para la Vmáx y 1,6554 mM para Km. El segundo parámetro modificado fue la concentración de enzima. Se agregan distintas cantidades de enzima a distintas soluciones con igual concentración de sustrato. La concentración de sustrato utilizada es saturante (6 mM), por lo que sin importar la cantidad de enzima que se agregue, sus sitios activos siempre estarán ocupados, por lo que al hablar de velocidad, se habla específicamente de Vmáx. Entonces, la velocidad de la reacción será directamente proporcional a la concentración de enzima, si se

mantienen constantes todos los otros factores, tales como el pH, la temperatura, la concentración de sustrato, etc. Esto puede observarse en el Gráfico 5. Para finalizar, podemos decir que los errores que pudieron cometerse realizando este práctico fueron debidos al factor humano. El práctico requería de gran minuciosidad y de coordinación entre los integrantes del grupo de trabajo. Las soluciones que se ocuparon en el práctico debían realizarse con exactitud y siguiendo un cierto orden, especialmente al agregar la solución reductora; también debía medirse al espectrofotómetro en el mismo orden (blanco, estándar 1, estándar 2, otros) ya que el color se intensifica a medida que pasa el tiempo, ya que la formación de compuesto coloreado continúa. También hay que tener en consideración la coordinación del grupo de trabajo, especialmente entre la persona que manejaba el cronómetro y la persona que debía detener la reacción con solución stop, ya que un par de segundos de error podían cambiar drásticamente los resultados. BIBLIOGRAFÍA •

Del Pozo. R, Texto guía de Bioquímica Medicina, volumen I, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Facultad de Medicina

•

Nelson. D, Cox. M, Lehninger Principios de Bioquímica, Tercera Edición, Ediciones Omega, 2000, Barcelona, España.

•

Del Pozo R., Muñoz Mirna, Grandón Javier, Rotter German; “Guía de trabajos prácticos” (2009), Universidad Católica de la Santísima Concepción.