Labo 2

Universidad Católica de la Santísima Concepción Facultad de Medicina, Escuela de Medicina Depto. De Ciencias Básicas y Morfología Laboratorio de Bioquímica

PRÁCTICO Nº 2 BIOQUÍMICA:

PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS

Nombre de Integrantes:

Felipe Navarro Ricardo Olave Plinio Ramírez Belén Rodríguez Fecha de Realización: 02 de Abril de 2009 Fecha de Entrega de informe: 16 de Abril de 2009 Docentes Encargados: Dr. Reginaldo del Pozo Bq. Mirna Muñoz M.Sc. Bq. Javier Grandón QA. Germán Rotter

INTRODUCCIÓN

Una proteína es una macromolécula compuesta por una o varias cadenas polipeptídicas cada una de las cuales tiene una secuencia característica de aminoácidos unidos por enlace peptídico. Existe una técnica que permite diferenciar proteínas de aminoácidos, por medio de una reacción con ninhidrina. Esta reacción tiene como objetivo detectar y cuantificar cantidades de aminoácidos libres, estos en general reaccionan con la ninhidrina cuando son calentados con un exceso de la misma. Todos los aminoácidos que poseen un grupo amino libre reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco, un aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto original y ninhidrina reducida. El amoniaco reacciona con otra molécula de ninhidrina y con la ninhidrina reducida formando un producto de color azul o púrpura (que posteriormente puede ser utilizado para cuantificar el aminoácido). Las proteínas a diferencia de los aminoácidos reaccionan de forma muy débil, debido a la baja concentración de grupos amino libres, por lo cuál, en términos prácticos se considera negativa. Las propiedades biológicas de las proteínas, así como muchas de sus propiedades físico-químicas, dependen de la integridad de sus estructuras. La pérdida de la estructura tridimensional que es suficiente para originar la pérdida de la función se denomina desnaturalización. La mayoría de las proteínas se pueden desnaturalizar mediante calor, sobre 50ºC, el cual afecta de manera compleja a las interacciones débiles de una proteína (los enlaces de hidrógeno principalmente). Este proceso puede llevarse a cabo también por acción de extremos de pH, (ácidos fuertes como ácido tricloroacético o álcalis fuertes como NaOH) ciertos disolventes orgánicos miscibles en agua como el alcohol o la acetona, ciertos solutos tales como la urea o el cloruro de guanidino o mediante detergentes. El tratamiento con cada unos de estos agentes desnaturalizantes rompe enlaces no covalentes. La proteína desnaturalizada presenta una solubilidad disminuida y habitualmente precipita. Las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI), la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad, debido a que hay menos repulsiones intermoleculares y facilita su agregación. La insolubilidad de la caseína (una fosfoproteína) en su punto isoeléctrico puede ser utilizada para detectar su punto isoeléctrico. El precipitado de caseína es de color blanco parecido a queso cottage. OBJETIVOS

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-

Diferenciar aminoácidos de proteínas, según su reacción con ninhidrina, comprendiendo que esto sólo ocurre en aminoácidos y no en proteínas. Reconocer los agentes físico-químicos que provocan la desnaturalización de las proteínas y el efecto que eso conlleva en la función de estas. Descubrir si la temperatura es un agente lo suficientemente potente como para desnaturar una proteína. Conocer y entender mecanismos de acción junto con bases físico-químicas de técnicas de laboratorio usadas en bioquímica para la determinación del punto isoeléctrico de la caseína. Comprender por qué la caseína en su punto isoeléctrico se hace menos soluble, además de la incidencia que tiene el pH sobre ésta. En la preparación de las distintas muestras a analizar aprender la correcta utilización de las pipetas conociendo la forma correcta de manipularlas.

MATERIALES 1. Trípode

11. Rejilla

2. Gradilla

12. 16 Tubos de Ensayo

3. Mechero de Bunsen

13. 5 microtubos de polipropileno (KHAN)

4. Vaso Precipitado Kimax 500 ml. 5. Tres Pipetas de 5 ml.

14. Vortex 15. Fósforos

6. Pipeta de 10 ml.

16. Marcador Permanente

7. Pipeta de 1 ml.

17. Cronometro

8. Pinza Metálica

18. Agua Potable

9. Propipetas (verde-azul)

19. Agua Destilada

10. Vaso Precipitado 50 ml.

REACTIVOS Experimento N°1: 1. Solución alcohólica de ninhidrina al 0,1% 2.

Solución Neutra de Aminoácidos 0,1 M (Glicina) 3. Solución Neutra de Caseína: 0,5 g de caseína en 100 ml. de buffer fosfato 0,1 M, ph 7.0. Experimento N°2: 1. Muestra Proteica Albúmina (BCA) 2. Acido Tricloroacético (TCA) al 10% p/v Experimento N°3: 1. Caseína al 0,5% en Acetato de Sodio 0,1 M 2. Acido Acético 1 M.

MÉTODO Método Experimental N°1: Identificación de aminoácidos por la reacción de Ninhidrina y su diferenciación con las proteínas:

2,5 ml. de Sol. Neutra de glicina

Mezclar Vortex todos los tubos

Agregar 0,5 ml. Ninhidrina

2,5 ml. de Sol. Neutra de Caseína

Se someten a baño maría por 2 minutos aprox. 2,5 ml. de Agua Destilada Observar y anotar resultados

Método Experimental N ° 2: Reconocimiento de proteínas por reacciones de precipitación por desnaturalización por calor y ácido tricloroacético:

Baño María por 3 minutos

0,5 ml de Muestra Proteica (BSA)

Agitar tubos en Vortex

0,5 ml de Agua Destilada

0,5 ml de Muestra Proteica (BSA)

0.5 mL de ácido tricloroacético al 10%.

0,5 ml de Agua Destilada

Observar y Anotar resultados

Método Experimental N°3: Determinación del punto isoeléctrico de la caseína:

3.2 ml de Acido Acético

6.8ml de H2O destilada Sacar 5ml del Tubo 1 y Traspasar al Tubo 2

1

2

Mezclar en Vortex Agregar 5ml de Agua destilada

Repetir el procedimiento de dilución seriada hasta el tubo 9

3

9 Eliminar 5 ml del Tubo 9 1ml de caseína en acetato 0.1M

Sacar 5ml del Tubo 2 y Traspasar al Tubo 3 Mezclar en vortex

Agregar finalmente 1 ml de solución de caseína en acetato de sodio 0.1 M. a todos los tubos (del 1 al 9)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Observar y Anotar resultados inmediatos y luego de 15 minutos

Mezclar inmediatamente en vortex todos los tubos

RESULTADOS Resultados experimento N°1 Componentes

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Solución Neutra De Aminoácidos Solución Neutra De Caseína Agua Destilada Solución Alcohólica De Ninhidrina Resultados

2.5 ml

-

-

-

2.5 ml

-

0.5 ml

0.5 ml

2.5 ml 0.5 ml

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-

+

Resultados experimento N°2 Componentes Muestra Proteica Agua Destilada Ácido Tricloroacétic o 10 % Resultados

Tubo 1 0.5 ml

Tubo 2 -

Tubo 3 0.5 ml

Tubo 4 -

-

0.5 ml

-

0.5 ml

-

-

0.5 ml

0.5 ml

precipitado

Negativo

negativo

negativo

Resultados experimento Nº3 0 = NO CAMBIA Tub o1 Ph 3.5

+ = OPALESCENCIA Tub Tub Tub Tub o2 o3 o4 o5 3.8 4.1 4.4 4.7

X = PRECIPITADO Tub Tub Tub Tub o6 o7 o8 o9 5.0 5.3 5.6 5.9

Resultad o Inmediato

+

+

+

×

×

×

+

0

0

Resultad o A Los 15 Min.

+

+

+

×x

×x

×

+

0

0

En la tabla anterior se presentan los resultados de la interacción de la Caseína,, la cual se torna insoluble en su punto isoeléctrico precipitando. El punto isoeléctrico corresponde al promedio de lo pH donde se produce la precipitación de la proteína. Punto isoeléctrico = (4.4+4.7)/2 = 4.55

CONCLUSIÓN Los aminoácidos y las proteínas poseen distintas características algunas de las cuales logramos observar en este práctico, algunas reacciones de detección, pruebas de denaturalización y determinación de puntos isoeléctricos de aminoácidos y proteínas son de gran valor al momento de analizar y comprender este tipo de moléculas tan importantes para la vida. El primer experimento realizado, reacciones de aminoácidos y proteínas con ninhidrina pretendía demostrar la especificidad de esta prueba para determinar la presencia de aminoácidos libres, que dio positivo, en contraste con la reacción con proteínas, que dio negativo, se realizó también una muestra control de agua destilada con ninhidrina, cuyo resultado fue lógicamente negativo. Se obtuvieron los resultados esperados ya descritos anteriormente. Los aminoácidos al tener todos por lo menos un grupo amino libre, toda la masa de aminoácidos presente en la solución reacciona resultando un producto de color violeta intenso y por lo tanto visible al ojo humano, esta sería la información cualitativa que podemos obtener de la reacción; que a diferencia de las proteínas, en las cuales gran parte de los grupos amino de sus aminoácidos constituyentes se encuentra bloqueada por los enlaces covalentes que unen cada uno de éstos con el anterior por lo cual sólo el NH3 del amino terminal y algunos de los aminoácidos básicos reaccionan dando un tono violeta muy débil o como fue en nuestro caso no hubo coloración. Dudando del resultado dejamos aún cinco minutos más incubando el tubo de ninhidrina + proteínas para ver si había algún cambio pero no se evidenció mayor diferencia que una opacidad casi imperceptible. En la desnaturalización de proteínas trabajamos con Albúmina de Suero Bovino (BSA). Este proceso con el cual podemos afectar la función de una proteína (la BSA funciona como molécula transportadora de lípidos a través de la sangre) por el rompimiento de los enlaces, no covalentes principalmente, que estabilizan la estructura secundaria o terciaria de una proteína ya sea por medios físicos o químicos. En este caso la desnaturalización se desarrolló probando con dos agentes desnaturalizantes, calor y por otra parte desnaturalización con ácidos fuertes, ácido tricloro acético (TCA) específicamente. Al alterarse la estructura secundaria y terciaria

las interacciones hidrofóbicas, que en la forma nativa se encuentran “protegidas” por las interacciones hidrofílicas que están hacia el exterior en la proteína plegada para que ésta pueda ser soluble en agua, se desestabilizan quedando expuestas al exterior disminuyendo la solubilidad y precipitando finalmente cuando se logra desnaturalizar la proteína. Sólo se consiguió observar la desnaturalización en presencia de TCA ya que éste es un fuerte agente desnaturalizante que actúa rápidamente insolubilizando la proteína; al someter BSA sólo a calor no se apreció ningún resultado producto de que para desnaturalizar con este agente es necesario en algunos casos mantenerlo por un tiempo considerable hasta poder visualizar una cantidad razonable de proteína insoluble (desnaturalizada), este comportamiento es de gran importancia ya que ofrece resistencia a la desnaturalización en un proceso febril. El conocer estos tipos de mecanismos que afectan la actividad de proteica, que en el caso de una enzima afectarán su capacidad catalítica, permiten conocer la función de una proteína por medio de la pérdida de su función, en el cuerpo humano estados de acidosis y fiebre pueden producir daño a proteínas que cumplen funciones importantes. El último experimento correspondía a la determinación del punto isoeléctrico de la caseína, como ya sabemos este punto corresponde al cual la carga neta de un aminoácido o proteína es igual a cero, lo que quiere decir que las cargas positivas y negativas están igualadas. La caseína posee un punto isoeléctrico que es a pH 4,6, sabiendo que este valor depende de la concentración de H+ se prepararon 9 soluciones de distinto valor de pH; de 3,5 el primer tubo hasta 5,9 con diferencias de 0,3 en el valor de pH de cada uno de los tubos intermedios. Sabiendo que la caseína (una fosfoproteína) es insoluble en su punto isoeléctrico podemos determinarlo en base a este dato. Aplicando una cantidad determinada de esta proteína a cada tubo podemos observar el comportamiento de ella a los distintos pH. Los resultados los podemos agrupar en tres grupos distintos la primera serie de tubos del 1 al 3 (pH desde 3,5 a 4,1) y el tubo 7 (pH 5,3) se obtuvieron como resultado cierta opalescencia la cual puede ser explicada en base a una desnaturalización de la proteína ya que como sabemos los medios ácidos favorecen esta situación debido a que la forma nativa donde es soluble en agua se ve alterada. La forma nativa tiene lugar a pH 6,6 que es el pH de la leche por lo cual cualquier pH muy ácido desnaturalizará y afectará por ende la solubilidad de la proteína. Otro grupo de resultados muy importante es el que se obtuvo en los tubos 8 y 9 (pH 5,6 y 5,9) donde se no se observó ningún cambio en la transparencia de la muestra, probablemente debido a que son los pH más cercanos al valor del pH de la leche, por lo cual la estructura secundaria y terciaria aún no han sido alteradas o se han alterado muy poco; debemos tener en cuenta que entre los tubos 8 y 9 en comparación con la leche la mayor diferencia de pH es de un punto (pH 5,6 en tubo 9 v/s pH 6,6 en leche), lo que en términos de concentración molar de H+ equivale a una diferencia de 2,25 * 10-6 M (2,5 * 10-6 M en tubo 9 v/s 2,5 * 10-7 M en leche de concentración de H+), a pesar entonces de la diferencia en un orden de magnitud de las concentraciones molares son concentraciones muy pequeñas a las que nos referimos en este caso. Finalmente tenemos el último grupo de resultados (tubos 4, 5 y 6 a pH 4,4; 4,7 y 5,0 respectivamente) los cuales todos dieron un precipitado de color blanquecino, como ya mencionamos anteriormente la caseína precipita al pH de su punto isoeléctrico, debido a que las nuevas cargas que adquieren los grupos ionizables de ella desestabilizan la solubilidad de la proteína y decanta, produciéndose este resultado. Se requerían hacer dos observaciones, una inmediata y otra a los 15 minutos, en los dos primeros grupos no fueron observables cambios notorios pero sí en los tubos 4, 5 y 6 se observó que en los que se había producido mayor cantidad de proteína decantada eran los tubos 4 y 5 (pH 4,4 y 4,7 respectivamente) por lo tanto podemos deducir que su PI se encuentra entre ambos valores, coincidiendo con el resultado teórico que correspondía a pH 4,6.

BIBLIOGRAFÍA Nelson y otros, Lehninger. “Principios Básicos de Bioquímica”. Tercera edición, 2001. Ediciones Omega. Barcelona, España. R. del Pozo, M. Muñoz, J. Grandón, G. Rotter. “Guía de trabajos prácticos Bioquímica 2009.” UCSC, Facultad de Medicina, Escuela de Medicina. http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf http://es.wikipedia.org/wiki/Desnaturalizaci%C3%B3n http://www.ehu.es/biomoleculas/proteinas/desnaturalizacion.htm