Lab Tehnike.pdf

1. Postupak pripreme histoloških preparata za optičku mikroskopiju fiksacija tkivnog uzorka • • • • • •

ispiranje dehidratacija i prosvetljavanje kalupljenje sečenje i montiranje preseka na predmetno staklo bojenje tkiva i uklapanje u medijum za uklapanje, pokrivanje predmetnim staklom i dobijanje TRAJNOG HISTOLOŠKOG PREPARATA

FIKSACIJA 1. zaustavlja metabolizam ćelija 2. sprečava autolizu, tj. autodigestiju tkiva (usled delovanja proteolitičkih enzima tipa aminopeptidaza, karboksipeptidaza, proteinaza i dr.) 3. stabilizuje strukturne proteine ćelije 4. čuva veličinu i morfologiju ćelije 5. održava lokalizaciju hemijskih supstanci u ćeliji u stanju koje je slično prirodnom 6. sprečava rast mikroorganizama (ubija patogene bakterije, gljivice i viruse) stvrdnjava tkivo zbog denaturacije proteina ili uspostavljanja unakrsnih veza sa molekulima proteina

NACINI FIKSACIJE •

fizicke metode ➢ zagrijavanjem (kuhanjem u vodi ili fizioloskom rastvoru) ➢ u mkrotalasnoj pecnici (na 55 C u fikativima na bazi glioksala) ➢ freeze-drying (potapanje u tecni azot ili u hladan etanol, metanol ili aceton)

•

hemijske metode ➢ koagulacioni fiksativi (etanol, metanol, aceton, pikrinska ili trihlorsircetna kiselina) ➢ nekoagulacioni fiksativi (formaldehid, glutaraldehid, osmijum-tetroksid)

FORMALDEHID / FORMALIN (37%)

Najjednostavniji aldehid, gasovito jedinjenje rastvorljivo u vodi,obično se čuva rastvoren u vodi pod nazivom formalin (37% formaldehid i 15% metanol u vodi), najčešće se primenjuje kao dezinfekciono sredstvo i u industriji kože, bakelita i plastike, dobro prožima tkivo, ali deluje sporo, ne reaguje sa lipidima, pa stoga loše fiksira ćelijske membrane, dobro prezerviše opštu građu ćelije i komponente ECM, mehanizam dejstva podrazumeva najčešće reakciju sa NH2-grup. proteina, tj. unakrsno vezivanje sa lizinskim reziduama

KALUPLJENJE Postupku kalupljenja tkiva za svet-losnu mikroskopiju prethode pripremni postupci (ispiranje, dehidratacija, prosvetljavanje, impregnacija tkiva), nakon čega može da se izvrši kalupljenje tkiva, najčešće u parafinski blok.

ISPIRANJE I DEHIDRATACIJA Nakon fiksacije u formalinu, tkivo se ispira u vodi, a potom dehidratiše u cilju istiskivanja vode iz tkiva. Dehidracija mora biti potpuna, jer tamo gde je u tkivu zaostala voda ne može prodreti parafin. Ispiranje se vrši u tekućoj vodi, a dehidratacija u seriji alkohola sa sve većom i većom koncentra-cijom (70%, 90%, 100%).

PROSVETLJAVANJE (NATAPANJE) TKIVA To je prožimanje tkiva posrednim sredstvom koje rastapa medijum za impregnaciju i omogućava njegovo prodiranje. Parafin i drugi medijumi za impregnaciju tkiva obi-čno nisu rastvorljivi u vodi, pa je potrebno pretho-dno dehidratisano tkivo prožeti nekim sredstvom koje rastapa medijum i omogućava njegovo prodiranje s jedne strane, a s druge strane, meša se i sa sredstvom za dehidrataciju kojeg istiskuje iz tkiva. Najčešće se upotrebljava KSILOL (ili toluol), koji ima osobinu da načini tkivo prozirnim (prosvetljavanje).

IMPREGNACIJA TKIVA (prožimanje ili infiltracija) Vrši se u medijumima za impregnaciju, koji su supstance koje daju čvrstinu tkivu. PARAFIN se redovno upotrebljava za svetlosnu mikroskopiju, a plastične smole (npr. ARALDIT, EPON) za elektronsku mikroskopiju.

BOJENJE HEMATOKSILIN-EOZINOM Odstranjivanje parafina (ksilolom), rehidratacija (u seriji alkohola sa sve nižom koncentracijom, 100%, 97%, 70%, 50%, 30%, i u vodi), bojenje sa vodenim rastvorom hematoksilina, ponovna dehidratacija (s obzirom da se eozin bolje rastvara u alkoholina nego u vodi) i bojenje alkoholnim rastvorom eozina, dehidratacija, uklapanje u medijum za uklapanje (KANADA-BALZAM) i prekrivanje pokrovnom ljuspicom (TRAJNI HISTOLOŠKI PREPARAT)

2. Histološke boje – bazne i kisele boje, mehanizam dejstva, bazofilne i acidofilne komponente u ćeliji

BAZNE BOJE

KISELE BOJE

1. 2. 3. 4. 5.

1. Kiseli fukcin (creno) 2. Anilinsko plavo (plavo) 3. Eozin (crveno) 4. Orange G (naradzasto)

Metilensko zeleno (zeleno) Metilensko plavo (plavo) Pironin G (crveno) Toluidinsko plavo (plavo) Hematoksilin (plavo)

MEHANIZAM DEJSTVA •

bazna boja nosi pozitivno naelektrisanje, boji ANJONSKE KOMPONENTE ćelije (sa negativnim naelektrisanjem) u plavo, sposobnost anjonskih grupa da reaguju sa baznim bojama naziva se BAZOFILIJA

•

kisela boja nosi pozitivno naelektrisanje i boji katjonske (bazne) sastojke citoplazme ćelije u ružičasto, ovi sastojci ćelije nazivaju se eozinofilnim, reakcija ćelije i tkivnih komponenti sa kiselim bojama naziva se ACIDOFILIJA

BAZOFILNE KOMPONENTE

ACIDOFILNE KOMPONENTE

- heterohromtin i nukleolusi

- citoplazmatski filamenti

- rinbosomi i grER

- veliki broj vlakana ECM-a

- matrks hrskavice

- intracelularne membranske komponente

3. Metahromazija i PAS bojenje METAHROMAZIJA • • • •

•

osobina nekih alkalnih anilins-kih boja, npr. TOLUIDINSKOG PLAVOG, da strukture u ćeliji boje različitom bojom u odnosu na osnovnu boju rastvora na taj način se ćelije boje prelazima osnovne boje rastvora uslovljena je međusobnom reakcijom između boje i nekih biološki aktivnih materija u tkivu koje se boji, koje se nazivaju hromatofore kada se tkivo boji koncen-trovanim baznim boja-ma, kao što je npr. tolui-dinsko plavo, obojeni mo-lekuli se toliko približavaju jedan drugom da stvaraju dimerne i polimerne agregate. npr. granule se boje drugacije u odnosu na upotrebljenu boju (umesto plavo boje se ljubičasto)

PAS bojenje (periodic acid - Schiff) • •

hiostohemijska metoda koja pokazuje i lokalizuje ugljene hidrate i makromolekule bogate u ugljenim hidratima. SLUŽI ZA DOKAZIVANJE: glikogena, mukusa, bazalne membrane, retikularnih vlakana u vezivnom tkivu.

IMUNOHISTOHEMIJA (IMUNOHISTOHEMIJSKO BOJENJE) je histološka tehnika za identifikaciju tkivnih komponenti - ANTIGENA. U toj metodi koristi se INTERAKCIJA ANTIGENA I ANTITELA, u kojoj se određuje MESTO VEZIVANJA ANTITELA, pa samim tim i lokalizacija tkivnog antigena, bilo ditrektnim obeležavanjem antitela, bilo primenom metoda sekundarnog obležavanja.

AFINITET je jačina veze između jed nog veznog mesta molekula At (X) i Ag/liganda (Y). Izražava se konstantom disocijacije. AVIDITET je ukupna snaga interakcije dva molekula, kao što su Ag i At. Zavisi od afiniteta i od valencije interakcije.

4. Vezivanje antigena i antitela i obeležavanje antitela u imunohistohemijskim reakcijama Antigen i antitelo vezuju se međusobno kombinacijom vodoničnih veza, elektrostatičkih sila i Van der Waalsovih sila.

OBILJEZAVANJE ANTITIJELA •

•

•

•

enzimatsko obiljezavanje ➢ peroksidaza rena ➢ alkalna fosfataza obiljezavanje koloidnim metalima ➢ koloidno zlato ➢ srebro ➢ koloidno zlato i metal srebra fluorescentni obiljezivaci ➢ fluorescein, FITC ➢ rodamin, TRIC ➢ teksas crveno ➢ R - fikoeritrin (PE) radioobbiljezivaci ➢ radioizotopi

5. Vrste imunohistohemijskih tehnika, opšti postupak u toku imunohistohemijskog bojenja i princip dvostepene inhirektne tehnike sa polimernim lancem a) direktna metoda b) dvostepena indirektna metoda c) dvostepena indirektna tehnika sa polimernim lancem ➢ (U ovoj teghnici koristi se neobeleženo primarno antitelo, a potom sekundarno antitelo koje je konjugovano za dekstranski polimerni lanac koji je obeležen enzimom (peroksidazom rena). Dekstranski lanac može da veže za sebe 10 mol. At i 70 mol. enzima. Tehnika je brza, jednostavna za izvođenje i visokosenzitivna.) d) PAP (peroksidaza - antiperoksidaza) e) imunohistohemijska metoda sa zlatom (i srebrom) f) AVIDIN - BIOTIN / STREPTAVIDIN - BIOTIN tehnika

OPSTI POSTUPAK IHH BOJENJA TKIVA 1. deparafinizacija preparata (na klasičan način) 2. DEMASKIRANJE ANTIGENA 3. blokiranje endogene peroksidaze i pozadinskog bojenje 4. inkubacija sa primarnim antitelom 5. inkubacija sa sekundarnim antitrelom 6. vizuelizacija reakcije Ag-At uz pomoć hromogenog supstrata 7. kontrastiranje preparata Majerovim ili Harisovim hematoksilinom 8. uklapanje u medijum 9. (pozitivne i negativne kontrole)

6. Vrste imunohistohemijskih tehnika, opšti postupak u toku imunohistohemijskog bojenja i princip avidin-biotin (streptavidin-biotin) imunohistohemijska tehnika

a) AVIDIN - BIOTIN / STREPTAVIDIN - BIOTIN tehnika Bazni glikoprotein avidin ima veliki afinitet za vezivanje malog solubilnog vitamina biotina (vitamin H). Avidin - biotin kompleks kada se konjuguje sa sekundarnim At za primenu u IHH, ima dva nedostatka: obzirom da nosi pozitivno naelektrisa-nje (ima visoku izoelektričnu tačku) može da se vezuje za negativno naelektrisane strukture, kao što su jedra ćelija, što do vodi do nespecifičnog bojenja i s obzirom da je glikoprotein, teži da se veže za lektine preko ugljenohidratnog moriva, što takođe dovodi do nespecifič-nog bojenja. Iz navedenih razloga danas se u IHH koristi streptavidin-biotin kompleks. Streptavidin je izolovan iz Streptomyces avidini, i slično avidinu ima 4 visokoafinitetna mesta za vezivanje za biotin. Ovo je danas, pored dvostepene IHH tehnike bazirane na dekstranskom polimeru, najčešće upotrebljavana tehnika u IHH. Međutim, tkiva sa visokim sadržajem endoge-nog biotina, kao što su jetra i bubreg, zahtevaju da se pre započinjanja procedure bojenja primeni blokiranje endogenog biotina.

7. Subcelularno frakcionisanje – opšti principi i diferencijalno centrifugovanje i centrifugovanje u gradijentu gustine

Razdvajanje ćelijskih odjeljaka jedan od drugog je važan korak za proučavanje specifične intracelularne strukture ili organela ili proteina, ili za procjenu mogućih veza između ovih makromolekularnih struktura. Subcelularna frakcionacija koristi jednu ili više osobina svakog odjeljka, kao što su, gustoća, veličina i oblik površinskog naboja, i uglavnom se temelji na diferencijalnom centrifugiranju u medijima visoke viskoznosti na 4 ° C. Mediji koji se koriste za diferencijalno centrifugiranje su uglavnom saharoza, manitol, glicerol.

8. Hibridizacija in situ i vrste hibridizacije in situ Proces in situ hibridizacije se zasniva na činjenici da se pod određenim uslovima jednostruki lanac DNK vezuje za homologi deo DNK u ćelijskom jedru ili na hromozomu i na taj način omogućuje određivanje pozicije na kojima se na hromozomima organizama pojavljuju određene sekvence gena. Praktično, veštački sintetizovana probna sekvenca DNK se označava ili radioaktivno ili u današnje vreme često visoko fluorescentnim hemijskim grupama. Zatim se na predmetnom staklu omogućuje hibridizacija hromozomske DNK sa obeleženim probama i nakon ispiranja nevezanih proba citološki preparat se može bojiti i ispitivati autoradiografski ili pod UV lampom u cilju lokalizacije proba vezanih za hromozome. Ova tehnika se obično koristi za lokalizaciju gena koji se u genomu pojavljuju u mnogo kopija, npr. geni za rRNK, tRNA, određene ponovljive sekvence itd. Fluorescentna in situ hibridizacija (Fluorescence In situ Hybridisation: FISH) je citogenetička tehnika razvijena u bomedicinskim istraživanjima ranih 1980-ih, kada je primijenjena za otkrivanje i lokalizaciju prisustva/odsustva specifičnih DNK sekvenci na hromosomima. FISH upotrebljava fluorescentne probe koje se vežu samo za one dijelove hromosoma sa kojima ispoljavaju visok stepen komplementarnosti sekvenci. Da bi se ustanovilo mjesto vezanja fluorescentnih proba za hromosome neophodna je fluoroscentna mikroskopija. FISH se često primjenjuje za traženje specifičnih pojava u DNK za upotrebu u genetičkom konsultiranju, medicini i identificiranju vrsta. Također je primjenjiv u otkrivanju i lokalizaciji RNK ciljeva (mRNK), dugih nekodirajućih segmenata RNK (lncRNK) i miRNK u ćelijama, cirkulirajućim tumorskim ćelijama i tkivnim uzorcima. U tom smislu, može pomoći za definiranje prostorno-vremenskih osobenosti ekspresije gena.

9. Transmisiona elektronska mikroskopija – delovi TEM, princip rada

Daje sliku KROZ objekat (uzorak u obliku tankog preseka), te oblikuje sliku pomoću elektrona koji se propuštaju (transmisija) kroz preparat a potom se raspršuju po njegovim strukturama.

OSNOVNI DIJELOVI TEM-a: •

• • • • •

•

elektronski top ➢ KATODA elektronskog topa izgrađena od: užarene VOLFRAMOVE niti ili užarenog šiljatog kristala lantan-heksaborida presvučenog slojem cirkonijumoksida (dobija se veoma uzak snop elektrona i visoka rezolucija). kondenzovano socivo ➢ sabira elektronski snop na uzorak mjesto za uzorak objektivsko socivo ➢ stvara prvu povećanu sliku predmeta za izoštravanje, promenom jač. struje projektorsko socivo ➢ za regulaciju uveličanja promenom jač. struje projektuju uvel. sliku na ekran fluorescentni ekran ➢ Ljudsko oko nije osetljivo na elektrone kao što je na svetlost. Zbog toga se konačna slika predmetaprojektujena zaslon koji je prevučen fluorescentnim hemikalijama kao što su ZnSili kadmijum (Cd, 48). Takve materije emituju svetlost proporcionalno broju elektrorona koji padne na njih. fotografska ploca

PRINCIP RADA TEM-a: Kao izvor elektronskog snopa služi ELEKTRONSKI TOP. Njega čini katoda, obično volframska nit, koja zagrevanjem emituje elektrone, Wehneltov cilindar za fokusiranje elektronskog snopa i anoda s velikom razlikom potencijala prema katodi (20.000 – 100.000 V). Zbog te razlike elektroni se snažno ubrzavaju i njihov se snop prvim elektronskim sočivom, koje ima ulogu KONDENZORA, usmerava na uzorak. Prolaskom kroz uzorak elektroni se u susretu s atomima raspršuju srazmerno debljini i gustoći područja na koje nailaze. Preostali, neraspršeni elektroni čine elektronsku sliku uzorka, koja se povećava sistemom elektronskih sočiva objekriva, međusočiva i proprojektorskog sočiva. Konačna slika nastaje na fluorescentnom zaslonu, a njeni tamni delovi odgovaraju debljim i gušćim područjima uzorka.

10. Priprema uzorka za transmisionu elektronsku mikroskopiju – fiksacija, ispiranje i bojenje, dehidratacija i prosvetljavanje, kalupljenje (prožimanje smolom), sečenje, kontrastiranje • • • • •

FIKSACIJA ISPIRANJE I BOJENJE DEHIDRATACIJA i PROSVETLJAVANJE KALUPLJENJE (PROŽIMANJE SMOLOM) SEČENJE

FIKSACIJA •

•

fiksativi ➢ 1,5% do 4% glutaraldehid (2,5% standardno) –za fiksaciju proteina (primarna fiksacija); na 40C, 2-6 h (može i kraće na sobnoj temperaturi, jer tako fiksativ bolje penetrira u tkivo i manja je autoliza tkiva; nedostatak glutar-aldehida je slaba brzina prožimanja tkiva) ➢ 1% do 2% osmijum-tetraoksid –za fiksaciju lipida (sekundarna fiksacija); na sobnoj temperaturi, 60-90 min (treba ga izbegavati kod primene imuno-gold tehnike, jer maskira Ag) faktori koji utiču na fiksaciju ➢ koncentracija fiksativa ➢ temperatura fiksacije ➢ dužina fiksacije ➢ puferi koji se koriste ▪ fosfatni pufer (0,1M pH7.4) ▪ kakodilatni pufer (otrovan, neprijatnog mirisa, sadrži u sebi arsen)

ISPIRANJE I BOJENJE Uzorke je potrebno isprati u istom puferu u kome su fiksativi rastvoreni (najčešće fosfatnom ili kakodilatnom). Posle ispiranja OsO4, uzorci se radi kontrastiranja / bojenja potapaju u 2% vodeni rastvor uranil-acetata, i ponovo isperu. Ova procedura doprinosi boljem definitivnom kontrastiranju preparata, ali može da dovede do ekstrakcije glikogena iz ćelije. Bojenje: 2% vodeni rastvior uranil acetata ILI Reynoldsovo bojenje sa olovo-citratom

DEHIDRATACIJA i PROSVETLJAVANJE Rastuće koncentracije organskih rastvarača: etanol (strogo do apsolutnog etanola) i propilen- oksid (1,2-epoksipropan) (olakšava prodiranje smola u preparat).

KALUPLJENJE (PROŽIMANJE SMOLOM) •

EPOKSIDNE SMOLE ➢ Araldit 502 (komercijalna smola) ➢ Epon 812 (komercijalna smola)

•

Postoje četiri komponente za spravljanje smole: monomerna smola, učvršćivač, akcelerator, plastifikator

•

AKRILNE SMOLE (metakrilati) ➢ Derivati metakrilne i akrilne kiseline

SEČENJE preparata za TEM na ultramikrotomu Posle neophodnog trimovanja kalupa, prvo se seku polutanki preseci (radi lokalizacije tkiva ili grupe ćelija od interesa), debljine 0,5-1 µm. Te preseke sečemo staklenim noževima, na ultramikrotomu, montiramo na staklene pločice i bojimo toluidin-plavim. Ultratanke preseke, debljine 50 nm, montiramo na mrežice. Koristi se nekoliko tipova mrežica (različita veličina pojedinačnih okaca i materijal od kojih su mrežice izrađene bakar, nikl, zlato; srebro, paladijum, molibden, titanijum itd.).

11. Matične ćelije – definicija, podela, značaj

DEFINICIJA Matične ćelije su nespecijalizovane ćelije organizma koje, pod određenim fiziološkim ili eksperimentalnim uslovima, putem transformacije u progenitorne, a potom u prekursorske ćelije, mogu da stvaraju različite ćelije tkiva i organa. One učestvuju u procesima razvoja, a tokom života u procesima regeneracije i reparacije tkiva.

KLASIFIKACIJA 1. embrionalne ➢ u unutrašnjoj ćelijskoj masi blastociste 5-8. dana razvića 2. fetalne ➢ FETALNA TKIVA (krv, jetra, koštana ▪ srž, pluća, pankreas, metanefros) ➢ PUPČANA VRPCA ▪ krv iz pupčanika ▪ tkivo Wharton-ove pihtije ili ▪ perivaskularna zona pupčane vrpce ➢ EKSTRAEMBRIONALNA TKIVA ▪ fetalni deo placente (horion) ▪ amnionska tečnost ▪ amnion 3. adultne ➢ koštana srž, jetra, masno tkivo, sinovija, periost, crevo, koža, srce, pluća, skeletni mišići, bubreg, zubna tkiva, retina, mozak i pankreas 4. dobijene novim biotehnološkim postupcima ➢ (reprogramiranje somatskih ćelija) ➢ SCNT (engl. Somatic Cell Nuclear Transver, kloniranje) ➢ indukovana pluripotentnost (iPSCs) ➢ partenogeneza 5. kancerske matične ćelije

ZNAČAJ MATIČNIH ĆELIJA • • •

•

KORISTAN MODEL U PROUČAVANJU ASPEKATA NORMALNOG RAZVOJA (hESCs) ODRŽAVANJE NORMALNE HOMEOSTAZE I TKIVNOG INTEGRITETA U TOKU FIZIOLOŠKOG OBNAVLJANJA ĆELIJA I NAKON OŠTEĆENJA Ex vivo PRIMENA ➢ standardizovani ćelijski eseji u testiranju novih lekova i toksikološkim ispitivanjima TERAPIJSKA PRIMENA ➢ ćelijska transplantaciona terapija ➢ efekat “chaperone” ➢ genska terapija bazirana na matičnim ćelijama ➢ terapijsko kloniranje

12. Humane embrionalne maticne ćelije – definicija, izolovanje, kultivacija, klinički značaj

DEFINICIJA

Humane ESĆ su najprimitivnija populacija matičnih ćelija u orga-nizmu čoveka, koja se dobija od unutrašnje ćelijske mase blasto-ciste pre implantacije.To su nediferencirane, pluripotentne ćelije sa sposobnošću samoobnavljanja i neograničenim potencijalom održavanja u nediferenciranom stanju čak i nakon dugotrajnog kultivisanja, ali mogu da se diferenciraju u uslovima in vivo i in vitro, pri čemu stvaraju derivate sva tri klicina lista (uključujući i germinativne ćelije), ali ne i sva ekstraembrionalna tkiva neophodna za razviće sisara. IZOLOVANJE

• •

•

•

Prve kulture sisarskih ESC dobijene su iz blasto-ciste miša od strane sera Martina Johna Ewansa (Martin Džon Evans) 1981. godine. Kasnije, 2007. godine, ovaj britanski naučnik je sa još dvojicom naučnika podelio Nobelovu nagradu za fiziologiju ili medicinu za otkrića „načela uvo-đenja specifičnih genetičkih modifikacija kod miše-va pomoću embrionalnih matičnih ćelija“. Prve kulture ESC iz humanih blastocisti uspeo je da izdvoji 1998. godine James Thompson (Džejms Tompson) sa svojim timom, na Viskonsin Univer-zitetu u Medisonu, SAD. ESCs rhesus majmuna (1995), marmoseta (1996), psa (2006), pacova (2008), svinje itd.

KULTIVACIJA Dugotrajno kultivisanje hESĆ u nediferenciranom stadijumu zahteva prisustvo ĆELIJSKE PODLOGE KAO HRANILAČKOG SLOJA. NAJČEŠĆE KORIŠĆENE ĆELIJSKE PODLOGE su: • • • • • • •

mitotički inaktivni mišji embrionalni fibroblasti (MEF), STO ćelije (MEF koje produkuju LIF), fetalne mišje ćelije, humane fetalne ćelije kože i pluća, humani adultni fibroblasti kože, placente i prepucijuma penisa; humane adultne epitelne ćelije jajovoda, adultne ćelije koštane srži.

•

Opisano je i kultivisanje hESĆ bez ćelijske podloge, pri čemu se kultivisanje vrši na podlogama obloženim kompo-nentama ekstracelularnog matriksa (npr. laminin) i u od-govarajućim medijumima koji obično sadrže visoke koncen-tracije bFGF.

•

Sadašnji trend u kultivaciji linija hESĆ je da se koriste podloge od humanih ćelija ili medijumi za kultivisanje bez ćelijskih podloga i seruma, sa dodatkom zamenika za serum.

•

Kolonije hESĆ se presađuju svakih 7 dana, kada obično dostižu veličinu od 1,5-2,5 mm. Broj ćelija po koloniji hESĆ u trećem danu je oko 5.000, a u 7. danu nakon presađiva-nja oko 40.000. Stopa rasta kolonija se određuje izračuna-vanjem povećanja veličine kolonija u svakom 24-časovnom intervalu u toku 2-7 dana (0 dan je dan presađivanja, a 7. dan je dan sledeće pasaže). Prosečna stopa rasta iznosi oko 60-70%. Procenat ćelija koji u linijama hESĆ podleže apoptozi iznosi oko 1020%.

KLINIČKA UPOTREBA hESC Krajem 2010. godine Barak Obama je suspendovao zabranu istraživanja na hESC na federalnom nivou, što je veoma brzo rezultiralo odobrenjem od strane FDA tri kliničke studije sa primenom ćelija dobijenih od hESC u lečenju: 1) subakutnog oštećanja kičmene moždine, 2) juvenilne forme makularne degeneracije retine (Stargardtova makularna distrofija) 3) makularne degeneracije retine uslovljene starenjem.

13. Kloniranje sisara U strogom smislu te reči, kloniranje je stvaranje kopije celog genoma jednog organizma ili kopije sekvence DNK-a. Kloniranje se dešava prirodno, prilikom rođenja identičnih (monozigotnih, jednojaj-nih) blizanaca. Uprošćeno, u konvencionalnom smislu te reči, kloniranje je stvaranje genetski identičnih jedinki. Termin se odnosi na veštački postupak, loniranje je vid aseksualne reprodukcije. U nauci danas, termin se odnosi na transplantaciju nukleusa ili prenos nukleusa somatskih ćelija odraslog organizma – scnt (engl. somatic cell nuclear transfer) u enukleisanu jajnu ćeliju i razvoj jedinke koja je genetski identična sa donorom nukleusa. Prvi klonirani sisar bila je ovca Dolly.

14. iPSCs (indukovane pluripotentne matične ćelije) Reprogramiranje somatske ćelije u pluripotentno stanje praćeno je intenzivnim remodelovanjem epigenetskih obeležja, među kojima je na prvom mestu demetilacija DNK, tj. demetilacija na DNK ključnih pluripotentnih gena – Oct4 i Nanog. Naime, u somatskim ćelijama, promotori Oct4 i Nanog su visokometilisani, što odražava njihovo stanje transkripcio-ne represije. Formiranje iPSCs uključuje aktivaciju ovih gena i njihovu demetilaciju, i baš se ta demetilacija uzima kao parametar za procenu uspešnosti reprogramiranja. U principu, demetilacija se dešava pasivnim mehanizmom, kao što je npr. inhibicija DNK-metiltransferaze 1 (Dnmt1) u toku replikacije DNK, ili aktivnim mehanizmom kojim se odstranjuju metilisane baze iz nereplicirane DNK.

15. Medijumi za kultivisanje MSCs (mezenhimalnih/adultnih matičnih ćelija) izolovanih iz zubne pulpe aMEM medijum + dodaci

MEDIJUMI ZA KULTIVACIJU ‒ SHED : iDPSC s SHED se kultivišu u tzv. bazalnom medijumu za kultivasciju, koji je sličan medijumu za kultrivaciju BMMSCs: -Iglov medijum modifikovan po Dalbekou (engl. Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM/a-MEM) sa malom količinom glukoze, kome je dodat fetalni teleći serum (engl. Fetal Bovine Serum, FBS) u finalnoj koncentraciji od 10%. IDPSCs se kultivišu u medijumu koji po sastavu sličan medijumu u kome se kultivišu humane embrionalne matične ćelije (engl. Human Embrionic Stem Cells, hESCs). -DMEM/F12 medijum kome je dodat FBS u finalnoj koncentraciji od 15-20%, kao i еsencijalne aminokiseline u finalnoj konecntraciji od 1% (F12 predstavlja specifičnu hranljivu mešavinu).

MEDIJUM ZA KULTIVACIJU ( u slučaju DPSCs) aMEM medijum + 20% FCS + 100 mM L-askorbinske kiseline-2 fosfata + 2 mM L-glutamina + 100 U/ml penicilina + 100 mg/ml streptomicina - inkubacija na 370C, u 5% CO2