Khoa Hoc Su Song

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

KHOA HỌC SỰ SỐNG

Trang 1

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

NGHIÊN CỨU CÁC VẤN ĐỀ SINH HỌC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC HIỆN ĐẠI Mã số đề tài: 642801 Chủ nghiệm đề tài: PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC Cơ quan công tác: Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM Địa chỉ liên lạc: 227 Nguyễn Văn Cừ, Q. 5, TP.HCM, Điện thoại: 08-8307079

Email:[email protected], [email protected]

Thành viên tham gia: - Nguyễn Tiến Dũng - Nguyễn Đức Hoàng - Đặng Thị Phương Thảo - Lê Văn Bình - Đỗ Anh Tuấn - Chu Thị Thu Trang - Nguyễn Thanh Thùy Nhiên - Nguyễn Thị Bạch Huệ - Nguyễn Quỳnh Anh - Huỳnh Ngọc Vi ca. 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu các vấn đề: Xây dựng các qui trình PCR (polymerase chain reaction) chẩn đoán nhanh một số vi khuẩn gây bệnh thường được kiểm soát trong thực phẩm (Salmonella spp., Vibrio cholerae, Escherichia coli, E. coli O157:H7); Phân biệt Salmonella gây bệnh và không gây bệnh trong môi trường nước và trong thực phẩm; Phát triển công nghệ gen và công nghệ bề mặt tế bào phục vụ mục đích nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng. 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đã đạt được 1) Xây dựng thành công các qui trình PCR phát hiện vi sinh vật gây bệnh thường được kiểm soát trong mẫu thực phẩm sau đây: (i) Qui trình phát hiện từng tác nhân gây bệnh như Salmonella spp., Vibrio cholerae, Escherichia coli, E. coli O157:H7; (ii) Qui trình phát hiện đồng thời tác 3 tác nhân gây bệnh Salmonella spp., Vibrio cholerae, Escherichia coli. Về mặt khoa học, nội dung này mang ý nghĩa ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử là PCR để tạo ra các qui trình chẩn đoán mới cho phép phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong mẫu thực phẩm nhanh và nhạy hơn so với phương pháp vi sinh vật truyền thống.

Trang 2

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

2) Nghiên cứu phân biệt Salmonella gây bệnh và không gây bệnh trong môi trường nước và trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Trong nội dung này, đã tiến hành kiểm chứng sự hiện diện của các gen fimA, invA, iagAB, spvC trên 114 chủng Salmonella spp. phân lập từ nước, thực phẩm; hình thành quy trình phát hiện phân biệt giống Salmonella với nhóm S. enterica I gây bệnh và ứng dụng các kết quả phát hiện phân biệt Salmonella gây bệnh và không gây bệnh trong môi trường nước nuôi tôm. Về mặt khoa học, đây là những nghiên cứu đầu tiên trên thế giới và tại Việt Nam về việc dùng PCR và các gen gây bệnh khác nhau để phát hiện phân biệt giữa Salmonella nói chung và Salmonella gây bệnh. 3) Tạo dòng và biểu hiện các gen mã hóa protein vỏ VP19, VP28 của virút gây hội chứng đốm trắng WSSV trên tôm sú. Về mặt khoa học, nội dung nghiên cứu này đã đóng góp trình tự nucleotide của hai gen quan trọng đối với tính gây bệnh của WSSV, thu nhận sản phẩm kháng nguyên tái tổ hợp. 4) Nghiên cứu phát triển các hệ thống biểu hiện định vị sản phẩm gen ngoại lai ở tế bào sử dụng mô hình nấm men Saccharomyces cerevisiae bao gồm: (i) Thiết lập hệ thống biểu hiện sản phẩm gen ngoại lai (protein phát huỳnh quang lục GFP, protein phát quang aequorin, enzyme glucoamylase, α-amylase) lên bề mặt tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae; (ii) Thiết lập hệ thống biểu hiện sản phẩm của gen ngoại lai (protein phát huỳnh quang lục GFP và các dạng đột biến EYFP, ECFP) lên màng tế bào ở S. cerevisiae. Về mặt khoa học, nội dung nghiên cứu này đã góp phần hình thành các công cụ sau đây cho khoa học: (i) Phương pháp cố định protein ngoại lai trên bề mặt tế bào nấm men S. cerevisiae; (ii) Hệ thống gen chỉ thị trong công nghệ bề mặt tế bào nấm men S. cerevisiae; (iii) Công cụ nghiên cứu vai trò các protein trên màng trong hệ thống truyền thông tin nội bào. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn 1) Tạo cơ sở để phát triển các bộ KIT để phân tích nhanh các tác nhân gây bệnh trong mẫu thực phẩm phục vụ: (i) công tác giám sát, quản lý chất lượng trong sản xuất, chế biến thực phẩm; (ii) xác định nguyên nhân gây ngộ thực phẩm hoặc dịch bệnh; (iii) giám sát sự lan truyền vi khuẩn gây bệnh trong cộng đồng. 2) Các kết quả phân biệt Salmonella gây bệnh và không gây bệnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử chứng minh có thể xây dựng một tiêu chuẩn mới để kiểm soát sự hiện diện của Salmonella trong thủy hải sản xuất khẩu dựa trên nhóm Salmonella gây bệnh thay vì Salmonella nói chung (hiện diện rất phổ biến trong môi trường nước và rất khó tránh bị nhiễm), tạo tiêu chuẩn đầu ra tốt hơn cho thủy hải sản xuất khẩu. 3) Tế bào nấm men với các protein chức năng như enzyme, kháng nguyên được bổ sung trên bề mặt có thể được sử dụng dưới dạng enzyme bất động trong sản xuất và chế biến thực phẩm hoặc làm vắc xin phòng chống bệnh cho vật nuôi. 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sĩ: 04;

số đã bảo vệ: 04;

số đang hướng dẫn: 0

Tiến sĩ: 01;

số đã bảo vệ: 0;

số đang hướng dẫn: 01

5. Các sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đã công bố trong các tạp chí khoa học Trang 3

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

[1]. Phát hiện đồng thời E. coli, Salmonella spp. và Vibrio cholerae bằng multiplex PCR, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, số 2, 29 - 35, 2002. [2]. Phát hiện E. coli O157:H7 trong mẫu thực phẩm bằng phản ứng multiplex PCR, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, số 2, 23 - 29, 2002. [3]. Thiết kế plasmid biểu hiện protein phát huỳnh quang ECFP trên mặt trong của màng tế bào nấm men S. cerevisiae, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, số 3, 52 - 58, 2002. [4]. Thiết kế plasmid biểu hiện protein EYFP trong tế bào chất nấm men S. cerevisiae nhờ sự cảm ứng bằng glucose, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ ĐH Quốc gia TP.HCM, tập 5, số 7, 51 - 58, 2002. [5]. Tạo dòng nấm men S. cerevisiae tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa glucoamylase, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ ĐH Quốc gia TP.HCM, tập 5, số 7, 36 - 43, 2002. [6]. Khảo sát sự hiện diện của plasmid spv (Salmonella virulence plasmid) trên các Samonella phân lập từ nước và thực phẩm thủy sản, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, 2, 35-41, 2003. [7]. Quan sát sự biểu hiện của protein ngoại lai trong tế bào nấm men nhờ protein phát huỳnh quang ECFP, Tạp chí Sinh học, 26, 30-34, 2004. 5.2. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo khoa học [1]. Nghiên cứu phát hiện phân biệt Salmonella spp. và S. enterica I trong thực phẩm bằng phản ứng PCR, Hội nghị toàn quốc lần II, Nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học, Huế, 865-868, 2003. [2]. Tạo các plasmid với chỉ thị protein phát huỳnh quang phục vụ nghiên cứu tương tác giừa các protein nội bào ở nấm men S. cerevisiae, Hội nghị toàn quốc lần II, Nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học - Huế, 906-909, 2003. [3]. Nghiên cứu hệ thống biểu hiện protein ngoại lai trên bề mặt tế bào nấm men S. cerevisiae, Hội nghị toàn quốc lần II, Nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học - Huế, 1016-1019, 2003. 5.3. Sách chuyên khảo đã xuất bản Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm, mỹ phẩm, NXB Giáo dục, Chi nhánh t5i TP.HCM, 8/2002) 6. Đánh giá và kiến nghị Hoàn thành mục tiêu và nộidung của đề tài: có nhiều công trình công bố (07 bài báo khoa học, 03 báo cáo khoa học toàn quốc), đào tạo 04 thạc sỹ, có 01 sách. Ngoài ra, một số kết quả của đề tài có giá trị thực tiễn lớn có thể phát triển thành đề tài khoa học công nghệ để ứng dụng vào đời sống và sản xuất.

Trang 4

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

STUDIES ON BIOLOGICAL ISSUES BY MODERN BIOLOGICAL TECHNIQUES ABSTRACT Application of molecular biological techniques in studying on the following issues: (i) Establishment of PCR (polymerase chain reaction) protocols for rapid detection of some commonly regulated bacterial pathogens (Salmonella spp., Vibrio cholerae, Escherichia coli, E. coli O157:H7) in food; (ii) Differentiation of pathogenic and non-pathogenic Salmonella in natural water, food; (iii) Development of gene technology and cell surface engineering for basic and applied studies.

Trang 5

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

NGHIÊN CỨU CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN GEN TRONG E. coli ĐỂ SẢN XUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP Mã số đề tài: 643204 Chủ nghiệm đề tài: PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC Cơ quan công tác: Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM Địa chỉ liên lạc: 227 Nguyễn Văn Cừ, Q. 5, TP.HCM, Điện thoại: 08-8307079

Email: [email protected], [email protected]

Thành viên tham gia: -

Nguyễn Đức Hoàng

-

Phan Thị Phượng Trang

-

Hoàng Văn Quốc Chương

-

Nguyễn Thanh Thùy Nhiên

-

Nguyễn Quỳnh Anh

-

Phạm Hồng Ánh

-

Chu Kỳ Nam

-

Nguyễn Văn Nhung

1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Đề tài nhằm so sánh các hệ thống biểu hiện gen khác nhau trong tế bào E. coli đã được thương mại hóa, đề xuất các quy tắc chọn lựa hệ thống để phù hợp với protein mục tiêu và các công đoạn lên men, sau lên men. Kết quả của đề tài tạo cơ sở cho việc phát triển nghiên cứu công nghệ sản xuất và tinh chế protein tái tổ hợp phục vụ chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa bệnh trên người, vật nuôi, cây trồng. 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đã đạt được 2.1. Kết quả nghiên cứu 1) Đã tạo thành công 03 dòng E. coli để biểu hiện gen mã hóa là protein vỏ VP28 của vi rút gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú (WSSV) trong ba hệ thống biểu hiện khác nhau pET, pGEX, pQE; khảo sát mức độ biểu hiện trong các chủng chủ khác nhau; biểu hiện gen và chứng minh sự biểu hiện của gen và sự hiện diện của protein tái tổ hợp bằng SDS-PAGE, Western blot; định lượng và so sánh mức biểu hiện. 2) Khảo sát ảnh hưởng của 3 hệ vector (pET, pGEX, pQE), 5 chủng chủ E. coli (BL21, BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, M15[pREP4], SG13009[pREP4], nhiệt độ, thời gian và nồng độ chất cảm ứng lên hiệu suất biểu hiện của protein tái tổ hợp (VP28 của virút gây hội chứng đốm trắng WSSV) trong E. coli. Kết quả cho thấy: - Chủng M15[pREP4] là thích hợp nhất cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp bằng vector pQE30. Chủng SG13009[pREP4] cũng có thể được sử dụng nhưng hiệu quả biểu hiện thấp hơn. Trang 6

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

- Chủng BL21 là thích hợp nhất cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp bằng vector pGEX-2TK, tiếp theo là chủng BL21(DE3). - Chủng BL21(DE3) là thích hợp nhất cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp bằng vector pET43.1a, tiếp theo là chủng BL21(DE3)pLysS. - Như vậy khi lập kế hoạch tạo dòng gen và tổng hợp protein tái tổ hợp trong E. coli bằng các hệ thống pQE, pGEX, pET nên ưu tiên sử dụng các chủng chủ tương ứng là M15[pREP4], BL21, BL21(DE3). 3) Khảo sát ảnh hưởng của các protein thioredoxin (Trx), glutathione-Stransferase (GST), protein gắn maltose (MBP) và NusA ở dạng đuôi dung hợp (tag) lên tính tan của protein tái tổ hợp được biểu hiện trong E. coli. Gen mã hóa cho protein không cấu trúc NS1 của virút viêm não Nhật Bản JEV (Japanese Encephalitis Virus) được chọn làm mô hình khảo sát. Gen mã hóa NS1 được tạo dòng vào các vector pTrx, pGST, pMBP và pNusA để NS1 được biểu hiện dưới dạng protein dung hợp (fused protein) với Trx (Trx-NS1), GST (GST-NS1), MBP (MBP-NS1) hoặc NusA (NusANS1). Hàm lượng các protein dung hợp ở pha tan và không tan sau khi đồng nhất tế bào được định lượng bằng SDS-PAGE và phần mềm Quantity One (BioRad). Kết quả cho thấy trong các protein dung hợp được tạo thành thì MBP- NS1 có khả năng tan cao nhất (44,47% trong tổng MBP-NS1 trong pha tan và không tan), tiếp theo là NusA-NS1 (20,03%) và GST-NS1 (13,05%). Trx-NS1 hầu như không tan. 4) Đã tạo dòng và biểu hiện mini-proinsulin tái tổ hợp trong E. coli và khảo sát điều kiện lên men tổng hợp mini-proinsulin tái tổ hợp ở qui mô pilot. Kết quả cho thấy đã xác định được điều kiện lên men thích hợp và có thể sử dụng môi trường chứa glucose 0,5%, cao nấm men 0,5% và NaCl 0,5% làm môi trường để lên men pilot thay cho môi trường LB đắc tiền (trypton 1%, cao nấm men 0,5%, NaCl 0,5%), sử dụng lactose để cảm ứng sự biểu hiện của gen thay cho chất cảm ứng tổng hợp đắc tiền IPTG để lên men tổng hợp mini-proinsulin tái tổ hợp ở qui mô 30 lít. Hiệu suất biểu hiện là 6,1% thấp hơn ở qui mô phòng thí nghiệm (11,7%). Tuy nhiên hiệu suất biểu hiện này có thể được tiếp tục cải thiện bằng phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men sau này. 5) Ngoài ra, đề tài còn thực hiện thành công việc tạo dòng và biểu hiện một gen mã hóa kháng nguyên khác VP281, VP19 của WSSV trong E. coli. 2.2. Ý nghĩa khoa học. Kết quả của đề tài có các đóng góp khoa học sau đây: - So sánh các hệ thống biểu hiện gen khác nhau trong tế bào E. coli đã được thương mại hóa, tạo cơ sở khoa học cho việc đề xuất các quy tắc chọn lựa hệ thống biểu hiện thích hợp để sản xuất protein tái tổ hợp. - So sánh và đề xuất việc chọn lọc các đuôi dung hợp (tag) để cải thiện tính tan của protein tái tổ hợp trong E. coli. - Bước đầu xác định các điều kiện cho phép lên men E. coli ở qui mô pilot để sản xuất protein tái tổ hợp với chi phí thấp. - Tạo các kháng nguyên tái tổ hợp khác nhau của WSSV làm cơ sở cho việc chọn lọc kháng nguyên hữu hiệu dùng trong chẩn đoán WSSV bằng phương pháp miễn dịch. - Tạo cơ sở bước đầu để xây dựng công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp tại VN

Trang 7

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn - Các protein vỏ VP28, VP281, VP19, tái tổ hợp tạo thành là nguyên liệu kháng nguyên để phát triển kháng thể trong các xét nghiêm nhanh bệnh đốm trắng trên tôm sú bằng phương pháp miễn dịch (ELISA…) - Insulin tái tổ hợp là thuốc đặc trị để điều trị bệnh tiểu đường typ 1 ở nước ta hiện đang phải nhập khẩu. Việc sản xuất thành công insulin tái tổ hợp bằng công nghệ gen góp phần tạo ra thuốc đặc trị cần thiết và thay thế thuốc ngoại nhập. 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sĩ: 05; số đã bảo vệ: 02; Tiến sĩ: 01; số đã bảo vệ: 0;

số đang hướng dẫn: 03 số đang hướng dẫn: 01

5. Các sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1 Các công trình đã công bố trên các tạp chí khoa học [1]. Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây hội chứng đốm trắng WSSV trên tôm sú trong E. coli, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1, 47-56, 2003. [2]. Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP19 của vi rút WSSV gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú trong E. coli , Tạp chí Di truyền và ứng dụng, 4, 49-55, 2003. [3]. Sử dụng vector pQE để biểu hiện và tinh chế protein vỏ VP28 của virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1, 299307, 2003. [4]. Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP281 của virus gây hội chứng đốm trắng White Spot Syndrome Virus) trên tôm sú (Penaeus monodon), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2, 49-56, 2004. [5]. Tạo dòng và biểu hiện mini-proinsulin tái tổ hợp trong E. coli, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2, 155-160, 2005. 5.2. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo khoa học [1]. Nghiên cứu thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy để tổng hợp miniproinsulin tái tổ hợp trong E. coli ở qui mô pilot, Báo cáo Khoa học Hội nghị toàn quốc Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Trường ĐH Y Hà Nội, 1157-1159, 11/2005. [2]. Ảnh hưởng của vector và chủng chủ lên sự biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli: trường hợp protein VP28 của virus gây hội chứng đốm trắng WSSV, Hội nghị toàn quốc Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Trường ĐH Y Hà Nội, 1325-1328, 2005, 11/2005. [3]. Ảnh hưởng của các protein "tag" lên tính tan của các protein dung hợp tái tổ hợp: trường hợp protein NS1 của virus viêm não Nhật Bản, Hội nghị toàn quốc Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Trường ĐH Y Hà Nội, 1343-1346, 2005, 11/2005.

Trang 8

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

6. Đánh giá và kiến nghị Đề tài được tiến hành đúng nội dung đăng ký, có kết quả tốt, có 05 bài báo khoa học ở tạp chí trong nước, 03 báo cáo tại hội nghị khoa học toàn quốc, đào tạo 02 thạc sĩ đã bảo vệ thành công và 01 nghiên cứu sinh. Đề tài tạo một số cơ sở khoa học và thực tiễn cần cho việc ứng dụng công nghệ gen để sản xuất protein tái tổ hợp ở Việt Nam, đặc biệt là các kháng nguyên tái tổ hợp để chẩn đoán virút gây bệnh đốm trắng trên tôm sú và insulin tái tổ hợp dùng để điều trị bệnh tiểu đường.

STUDY ON GENE EXPRESSION SYSTEMS IN E. coli FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEIN ABSTRACT The research is to compare different commercially available expression systems in E. coli and to suggest categories for the selection of a system which is most suitable for a targeted protein as well for fermentation and downstream step. Results of this research provide the base for the process development in production and purification of recombinant protein for diagnosis, treatment and prevention of disease in human being, animals and plants.

Trang 9

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG KHÁNG UNG THƯ, CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY THUỐC VIỆT NAM BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ Mã số : 822004 Người chủ trì : PGS.TS. HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG Cơ quan : Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên – ĐHQG Tp HCM Địa chỉ : 227, Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp HCM Điện thoại : 8 304 924 Thành viên tham gia : 09 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Mục tiêu dài hạn của đề tài là góp phần đánh giá nguồn lợi cây thuốc Việt Nam nhằm có hướng khai thác và bảo tồn hợp lý Mục tiêu ngắn hạn là xây dựng một hệ thống các phương pháp hiện đại để nghiên cứu hoạt tính kháng phân bào và kháng oxy hoá của cây thuốc Việt Nam và sử dụng các phương pháp này để sàng lọc cây thuốc có hoạt tính mong muốn. Nội dung nghiên cứu bao gồm - Xây dựng các phương pháp xác định tác động gây apoptosis của hoạt chất (khảo sát hàm lượng DNA toàn phần và DNA phân tử lượng thấp, kính hiển vi huỳnh quang) - Xây dựng các quy trình thử nghiệm dựa trên phương pháp flow cytometry để xác định hoạt tính kháng ung thư và giai đoạn tác động của hoạt chất - Áp dụng các quy trình đã xây dựng để sàng lọc thu nhận hoạt chất từ chất chiết thực vật 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đạt được 2.1. Kết quả nghiên cứu 2.1.1. Nghiên cứu các đặc điểm, cơ chế và hình thành quy trình nhận biết apoptosis bằng các phương pháp - Thử nghiệm MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) - 2,5-diphenyltetrazolium bromide) -

Thử nghiệm Trypan Blue.

- Phương pháp tách chiết DNA toàn phần và điện di (thang DNA – DNA laddering) -

Phương pháp tách chiết DNA phân tử lượng thấp và điện di.

-

Phương pháp nhuộm và quan sát tế bào dưới kính hiển vi phát huỳnh quang.

- Phương pháp Flow Cytometry (FC) với các quy trình: (1) khảo sát thể tích tế bào và độ đặc, (2) khảo sát sự nguyên vẹn của màng sinh chất, (3) xác định mức độ Trang 10

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

biến tính của bộ nhiễm sắc thể, (4) xác định hàm lượng DNA và RNA, (5) khảo sát trạng thái hoạt động của lysosome, (6) phát hiện hiện tượng sub-diploid. Các kết quả thu được - Xác định diễn tiến của quá trình apoptosis dựa trên việc khảo sát động học: tế bào chuyển sang apoptosis khởi đầu bằng sự mất nước làm cô đặc tế bào chất, nhiễm sắc thể cô đặc và bắt đầu sự phân cắt đặc hiệu tại vị trí nối của hai nucleosome. Cuối giai đoạn giữa lysosome vỡ ra, dẫn đến sự biến đổi cấu trúc khung sườn tế bào, làm tế bào mất đi khả năng bám dính, diễn tiến cuối cùng của apoptosis trong in vitro, là màng sinh chất bị vỡ. - Hình thành quy trình cho phép nhận biết và phân biệt tế bào sống, tế bào apoptosis giai đoạn sớm, giữa, muộn và tế bào hoại tử. Quy trình đơn giản gồm: thử nghiệm trypan blue, flow cytometry với FSC-SSC và nhuộm PI (propidium iodide) nhận biết sub-diploid, tách chiết DNA toàn phần nhận biết hiện tượng thang DNA. 2.1.2. Xây dựng quy trình nhận biết tác động kháng phân bào Các phương pháp sử dụng nuôi cấy

Phương pháp bỏ đói (serum starvation) để đồng bộ hoá dòng tế bào

- Phương pháp flow Cytometry nhận biết hàm lượng DNA với thuốc nhuộm PI. Các kết quả thu được - Tối ưu hoá quy trình bỏ đói tế bào về : (1) nồng độ BSA, (2) thời gian bỏ đói nhằm đồng bộ hoá quần thể tế bào về pha G0/G1 - Hình thành quy trình nhận biết tác động kháng phân bào. Độ tin cậy của quy trình được xác định trên ba hoạt chất chuẩn camptothecin, vinblastine và plumbagin. - Chứng minh được hệ quả của quá trình kháng phân bào là apoptosis. Thời gian chuyển đổi từ kháng phân bào sang apoptosis phụ thuộc vào hiệu quả tác động, thời gian và nồng độ xử lí của tác nhân đối với dòng tế bào ung thư. 2.1.3. Thu nhận hợp chất có khả năng kháng phân bào Các hợp chất có khả năng kháng phân bào như các hợp chất từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus), Sen cạn (Tropaeolum majus), Khổ qua (Momordica charantia), Gấc (Momordia cochinchinensis), Trinh nữ Hòang cung (Crinum latifolium) , Ổi (Psidium guajava) từ Viện Công Nghệ Hóa Học. 2.1.4. Thu nhận, hoạt hóa, nuôi cấy, bảo quản 07 dòng tế bào ung thư SF-268, MCF-7, NCI-H460, HeLa, EL-4 cơ quan NCI (National Cancer Institute Hoa Kỳ), HEp-2 và RD (Viện Pasteur Tp HCM) 2.2. Ý nghĩa khoa học Hai cơ chế quan trọng và phổ biến của các hoạt chất kháng ung thư là khả năng gây kháng phân bào và cảm ứng apoptosis. Vì vậy việc xây dựng quy trình nhận biết Trang 11

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

apoptosis và kháng phân bào sẽ giúp hiểu được tác động kháng ung thư của phần lớn các hợp chất thử nghiệm. Hơn thế nữa, việc hiểu rõ diến tiến và cơ chế của quá trình apoptosis sẽ có ý nghĩa rất lớn trong việc sàng lọc thuốc và điều trị ung thư. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng trong thực tiễn: Là một quốc gia nhiệt đới cộng với đường bờ biển dài, Việt Nam có được một nguồn tài nguyên thực vật và sinh vật biển rất phong phú. Tại Việt Nam, các nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư của các chất chiết tự nhiên từ thực vật và sinh vật biển chưa được chú ý hay nếu có thì chỉ dựa trên các phương pháp cổ truyền với độ tin cậy thấp. Vì vậy, việc xây dựng một quy trình để sàng lọc và nhận biết khả năng kháng ung thư dựa trên tác động kháng phân bào và khả năng cảm ứng apoptosis là rất cần thiết. Quy trình chúng tôi xây dựng không chỉ có độ tin cậy cao mà còn đơn giản để triển khai rộng rãi tại các phòng thí nghiệm nghiên cứu dược liệu. 4. Kết quả đào tạo Thạc sĩ : 02, trong đó 01 sẽ bảo vệ vào 2006 và 01 bảo vệ vào 2007. Tiến sĩ : 01, hướng dẫn phụ cho NCS Nguyễn Ngọc Hồng – công nhận năm 2005 - Đề tài : Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của một số cây thuốc hướng tác dụng trên gan, chuyên ngành Hóa sinh học, 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đả hòan thành và sẽ công bố trong các tạp chí KH [1]. 5.2.1. Xác định hệ quả của tác động kháng phân bào trên dòng tế bào HEp2. Nguyễn Thụy Vy, Tất Tố Trinh, Nguyễn Hoài Nghĩa, Lê Chí Thanh, Trương Thị Xuân Liên, Hồ Huỳnh Thùy Dương. [2]. 5.2.2. Khảo sát động học của quá trình apoptosis trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. Nguyễn Hoài Nghĩa, Tất Tố Trinh, Nguyễn Thụy Vy, Lê Chí Thanh, Trương Thị Xuân Liên, Hồ Huỳnh Thùy Dương. 5.3. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo KH [1]. Some methods for investigate of cytotoxic activities of natural compounds. Nguyễn Hoài Nghĩa, Trần Khiêm Hùng, Tất Tố Trinh, Lê Chí Thanh, Nguyễn Thụy Vy, Nguyễn Đăng Quân, Trương Thị Xuân Liên, Hồ Huỳnh Thùy Dương. First International Conference on Development of Medical Engineering in Vietnam 2005. [2]. Xác định hàm lượng DNA và RNA bằng kỹ thuật flow cytometry để phát hiện apoptosis. Nguyễn Hòai Nghĩa và cộng sự. Hội nghị khoa học toàn quốc về CNSH, 12/2005 [3]. Nhận biết hiện tượng apoptosis dựa trên mức độ cô đặc nhiễm sắc thể. Tất Tố Trinh và cộng sự. Hội nghị khoa học toàn quốc về CNSH, 12/2005. 6. Đánh giá và kiến nghị Đề tài đã cơ bản hòan thành nhiệm vụ nghiên cứu giai đọan vừa qua. Nội dung nghiên cứu về tác động kháng oxy hóa của cây thuốc được tiến hành thông qua một đề Trang 12

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

tài luận án tiến sĩ hợp tác với trường Đại Học Y Dược TpHCM. Một nội dung mới được bổ sung cho phù hợp với tiến triển của kết quả nghiên cứu thực tế là thu thập thêm một số dòng tế bào ung thư mới. Điều này cho phép xây dựng một quy trình sàng lọc hiệu quả và đúng chuẩn quốc tế hơn. Các kết quả về đào tạo, công trình công bố đảm bảo nội dung đã đăng ký. Đề nghị được tiếp tục thực hiện giai đọan kế tiếp của nghiên cứu

INVESTIGATION OF ANTITUMORAL, ANTIOXYDANT EFFECTS OF MEDICINAL PLANTS IN VIET NAM BY SOME MOLECULAR METHODS ABSTRACT For long-term purpose the project aims at valorization of medicinal plants resources in Viet Nam for conservation and sustainable use Short-term purposes concern the establishment of modern methods to investigate antimitotic and antioxydant activities of medicinal plants in Viet Nam and the use of these methods to screen for bioactive substances The project includes : - Setting up methods to determine apoptosis causing effects of natural substances (DNA laddering, electrophoretic analysis of low-weight cellular DNA, fluorescent microscopy) - Setting up flow cytometry-based methods to determine antimitotic and cell cycle phase specificity of bioactive substances -

Use of these methods to screen bioactive substances from plant extracts

Trang 13

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY THUỐC VIỆT NAM VỚI CÁC QUY TRÌNH THỬ NGHIỆM MỚI Mã số : 64 Người chủ trì : PGS.TS. HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG Cơ quan : Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên – ĐHQG Tp HCM Địa chỉ : 227, Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp HCM Điện thoại : 8 304 924 Thành viên tham gia : 07 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Mục tiêu dài hạn của đề tài là góp phần đánh giá nguồn lợi cây thuốc Việt Nam nhằm có hướng khai thác và bảo tồn hợp lý. Mục tiêu ngắn hạn là xây dựng các phương pháp hiện đại để nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng phân bào của cây thuốc Việt Nam và sử dụng các phương pháp này để sàng lọc cây thuốc có hoạt tính mong muốn. Nội dung nghiên cứu bao gồm : - Xây dựng các phương pháp nuôi cấy các dòng tế bào ung thư người và các phương pháp thử nghiệm tính gây độc tế bào của hoạt chất (Trypan blue, MTT, clonogenic) -

Xây dựng quy trình xác định hoạt tính kháng khuẩn

- Áp dụng các quy trình đã xây dựng để sàng lọc thu nhận hoạt chất từ chất chiết thực vật 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đạt được 2.1. Kết quả nghiên cứu - 60 phân đoạn (ether dầu, methanol, chloroform) chiết xuất từ 20 cây thuốc Việt Nam. Trong đó, đã chọn được 02 phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn cao từ lá Mua (Melastoma affine) và lá Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis) - Xây dựng được 03 thử nghiệm để khảo sát hoạt tính kháng phân bào của 02 hoạt chất – plumbagin, gossypol – chiết xuất từ các cây thuốc trên các dòng tế bào ung thư người. - Hình thành 04 thử nghiệm khảo sát cách thức tác động của các chất kháng khuẩn trên tế bào vi khuẩn (màng, vách tế bào, hệ thống sinh tổng hợp protein,…). Các thử nghiệm được thiết lập trên một số kháng sinh có cách thức tác động kháng khuẩn đã biết. 2.2. Ý nghĩa khoa học Đề xuất việc sử dụng các phương pháp mới để đánh giá tính kháng khuẩn và kháng phân bào theo cách thức tác động trên tế bào vi khuẩn hay tế bào người. Trang 14

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng trong thực tiễn Các kết quả nghiên cứu đạt được trong giai đoạn 1 này là cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn vào cơ chế tác động của các hoạt chất kháng khuẩn và kháng phân bào chiết xuất từ cây thuốc. 4. Kết quả đào tạo Thạc sĩ : 02 học viên cao học đang thực hiện đề tài: 01 đề tài về chất kháng khuẩn, 01 đề tài về chất kháng phân bào Tiến sĩ: 00 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đã công bố trong các tạp chí KH [1]. Khảo sát tính kháng phân bào của gossypol và plumbagin trên dòng tế bào ung thư bằng một số phương pháp thử nghiệm. Nguyễn Đăng Quân, Dương Thị Bạch Tuyết, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thùy Dương. Tạp chí Sinh học, tập 24 – số 4, 12/2001. 5.2. Các công trình đả hòan thành và sẽ công bố trong các tạp chí KH [1]. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số cây thuốc Việt Nam. Nguyễn Đức Trúc Nguyễn Hoàng Chương, Hồ Huỳnh Thùy Dương. 5.3. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo KH [1]. Các thử nghiệm bước đầu khảo sát cơ chế tác động của chất kháng khuẩn. Nguyễn Hoàng Chương, Nguyễn Đức Trúc, Hồ Huỳnh Thùy Dương. Hội nghị Sinh Học Phân Tử và Hóa Sinh – Tp. HCM, 6/2001. 6. Đánh giá và kiến nghị Việc nghiên cứu cách thức, cơ chế tác động của hoạt chất là một lĩnh vực còn mới ở Việt Nam. Điều này có ý nghĩa cả trong nghiên cứu cơ bản lẫn trong nghiên cứu ứng dụng đối với dược liệu, góp phần vào việc đặt cơ sở khoa học và làm tăng giá trị của việc khai thác sử dụng cây thuốc. Chúng tôi đề nghị Hội Đồng Khoa Học Tự Nhiên tạo điều kiện phát triển cho các nghiên cứu dạng này nói chung và đề án này nói riêng. Theo nội dung đăng ký, kết quả nhận được cho thấy nhiệm vụ nghiên cứu đã cơ bản hoàn thành, cụ thể như sau: Nội dung đăng ký - Chiết xuất, tinh sạch hoạt chất từ 20 cây thuốc. Chọn lọc một số cây có hoạt tính kháng khuẩn và kháng phân bào cao.

Nội dung đã thực hiện - Thu nhận 60 phân đoạn (ether dầu, methanol, chloroform) chiết xuất từ 20 cây thuốc Việt Nam. Thử nghiệm kháng sinh đồ trên 60 phân đoạn. Chọn lọc được 02 phân đoạn ether dầu có hoạt tính kháng khuẩn cao từ cây Mua (Melastoma affine) và lá Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis). Tiến hành xác định MIC (Minimal In hibitory Concentration – Nồng độ ức Trang 15

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

- Hình thành các hệ thống thử nghiệm in vitro và in vivo để thử nghiệm các hoạt chất đã chọn lọc được

chế tối thiểu) của 02 phân đoạn trên. Thu nhận 02 hoạt chất có tính kháng phân bào từ cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica)và Bông (Gossypium hirsutum). - Đã hình thành hai hệ thống: (1) Hệ thống gồm 04 tử nghiệm để xác định cách thức tác động của chất kháng khuẩn, (2) Hệ thống gồm 03 thử nghiệm để khảo sát hoạt tính kháng phân bào. - Đã hình thành mô hình chuột nhắt nhiễm Staphylococcus aureus dùng cho thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn.

INVESTIGATION OF BIOLOGICAL ACTIVITIES OF MEDICINAL PLANTS IN VIET NAM USING NEW ASSAYS ABSTRACT For long-term purpose the project aims at valorization of medicinal plants resources in Viet Nam for conservation and sustainable use Short-term purposes concern the establishment of modern methods to investigate antibacterial and antimitotic activities of medicinal plants in Viet Nam and the use of these methods to screen for bioactive substances The project includes : - Setting up human tumoral cell lines culture and cell-based assays for cytotoxicity of natural substances (Trypan blue, MTT) -

Setting up methods to determine antibacterial effects

-

Use of these methods to screen for bioactive substances from plant extracts

Trang 16

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

ĐIỀU TRA KHẢO SÁT SỰ PHÂN BỐ CỦA CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ CÁC TỈNH ĐÔNG NAM BỘ Mã số đề tài: 612004 Chủ nhiệm đề tài:

PGS.TS. PHẠM THỊ ÁNH HỒNG ThS. ĐINH MINH HIỆP

Cơ quan công tác: Khoa Sinh, Trường Đại học KHTN - ĐHQG-HCM Địa chỉ liên lạc: 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, TP.HCM Điện thoại: 08.8.300.560

Email: [email protected]

Thành viên tham gia: CN. Nguyễn Thị Hồng Thương CN. Phạm Xuân Hưng CN. Nguyễn Thị Uyên Thảo KS. Nguyễn Ngọc Phúc 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Khảo sát đánh giá sự phân bố của các chủng vi nấm Trichoderma trong những hệ thống canh tác trên nền đất trồng các loại cây lương thực, cây công nghiệp và cây ăn quả. Qua đó, khai thác tiềm năng của Trichoderma như là một tác nhân sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng. 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đã đạt được 2.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu đã đạt được - Đã tiến hành thu thập 26 mẫu đất đại diện cho các loại đất khác nhau trên nền đất trồng cây lương thực, cây công nghiệp và cây ăn quả của các tỉnh Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, Bà Rịa – Vũng Tàu và TP.HCM. -

Tiến hành phân lập và phân lập thuần khiết được 18 dòng nấm Trichoderma

- Tiến hành phân loại và định danh được 12 chủng nấm đã phân lập thuần khiết theo hình thái khuẩn lạc và tế bào (thực hiện tại phòng Vi nấm – Phân Viện Cơ Điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch TP.HCM và bộ môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP.HCM) và gửi mẫu cho GS. Gary Samuel (Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ) - Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym (amylase, protease, cellulase, xylanase, pectinase) của 18 dòng nấm Trichoderma qua phương pháp định tính nhằm sơ bộ chọn lọc các chủng triển vọng. 2.2. Ý nghĩa khoa học - Chủ động tận dụng và bảo tồn nguồn tài nguyên vi sinh vật phong phú, đa dạng trong nước. Trang 17

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

- Góp phần đẩy mạnh các hướng nghiên cứu về sinh học, sinh lý – sinh hóa, di truyền và mối quan hệ giữa vi nấm đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng. - Đánh giá sự phân bố và khai thác tiềm năng của vi nấm Trichoderma trong các hệ thống canh tác khác nhau ở khu vực TP.HCM và các tỉnh miền Đông Nam bộ. - Nâng cao ý thức mọi người về nền nông nghiệp sinh thái, hạn chế sử dụng các loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật, cải tạo sinh cảnh và môi trường sống … 2.3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn - Góp phần khai thác tiềm năng ứng dụng của nguồn tài nguyên vi sinh vật bản địa vốn rất phong phú, đa dạng - Bộ giống Trichoderma được phân lập từ tự nhiên ở Việt Nam có thể dùng trao đổi với các Viện – Trung tâm nghiên cứu trong và ngoài nước, tạo nguồn giống ban đầu cho các công trình nghiên cứu tìm hiểu cơ chế tác động đối kháng của các loài vi nấm Trichoderma, góp phần làm sáng tỏ cơ sở khoa học về mối quan hệ giữa vi nấm đối kháng với nấm bệnh hại cây trồng. - Sử dụng các chủng Trichoderma như là một tác nhân sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng tại địa phương lấy mẫu phân lập. Đồng thời sử dụng các chủng này trong việc chế biến phân bón sinh học thế hệ mới vừa các tác dụng phòng ngừa tác nhân gây bệnh tồn dư trong đất vừa đẩy mạnh các quá trình phân hủy tàn dư thực vật trong đất … 3. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sỹ: 01 (đang thực hiện) “Khảo sát sự cảm ứng sinh tổng hợp enzym chitinase ở một số chủng Trichoderma sp.”, Tô Duy Khương (chuyên ngành Vi sinh, ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM) Tiến sỹ: 01 (đang thực hiện) “Nghiên cứu enzym chitinase và beta-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp. và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh ở thực vật”, Đinh Minh Hiệp (chuyên ngành Hóa sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới) 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đã công bố trong các tạp chí khoa học [1]. Hà Vân Linh, Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng, Khảo sát hoạt tính các hệ enzym thủy phân chiết tách từ môi trường nuôi cấy Trichoderma sp. và thử ứng dụng chế biến phân hữu cơ vi sinh, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ ĐHQG TP.HCM, tập 6, tháng 02/2003, trang 71-80 5.2. Các công trình đã hoàn thành và sẽ công bố trong các tạp chí khoa học [1]. Đinh Minh Hiệp, Lê Đình Đôn, Phạm Thị Ánh Hồng, Ngô Kế Sương, Nguyễn Tiến Thắng, Khảo sát cấu trúc quần thể nấm Trichoderma bản địa ở các tỉnh Đông Nam bộ (đang trong thời gian chỉnh sửa và sẽ gửi đăng tạp chí Sinh học năm 2006) Trang 18

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

5.3. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo khoa học [1]. Nguyễn Thị Hồng Thương, Đồng Thị Thanh Thu, Đinh Minh Hiệp, Khảo sát một số yếu tố tác động quá trình sinh tổng hợp hệ enzym chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma spp., Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ II nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp và y học tại Huế (25-26/7/2003), NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2003, p.1040-1043 [2]. Nguyễn Thị Uyên Thảo, Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng, Nghiên cứu tận dụng bã khoai mì nhằm thu nhận hệ enzym cellulase, xylanase, pectinase bổ sung thức ăn gia súc từ vi nấm Trichoderma, Báo cáo khoa học Hội nghị Khoa học lần thứ IV năm 2004 tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM, tháng 11/2004 6. Đánh giá và kiến nghị Đề nghị Hội đồng Khoa học Tự nhiên, Bộ Khoa học và Công nghệ tiếp tục quan tâm hỗ trợ hướng nghiên cứu này nhằm khai thác tiềm năng ứng dụng của nguồn tài nguyên vi sinh vật bản địa vốn rất phong phú, đa dạng.

SURVEY ON THE DISTRIBUTION OF TRICHODERMA IN HO CHI MINH CITY AND THE SOUTH-EASTERN PROVINCES ABSTRACT This project surveys the distribution of Trichoderma on cultivated areas of agricultural plants, industrial plants and fruit-bearing plants. Moreover, it developes the potentiality of these fungi like biological agents in preventing diseases plant

Trang 19

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

SƯU TẬP GIỐNG CÁC VI SINH VẬT TẠO HƯƠNG Mã số đề tài: 610102 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. PHẠM THÀNH HỔ Cơ quan công tác: trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc Gia TPHCM. Địa chỉ liên lạc: 227 Nguyễn văn Cừ, Q.5, TPHCM. Điện thoại: 08.8304093

Email: [email protected]

Thành viên tham gia: - Lê Thị Mỹ Phước - Nguyễn Thị Mỹ Lan - Lê Thị Thanh Loan 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Nhằm khai thác nguồn tài nguyên đa dạng của các vi sinh vật ở nước ta với định hướng ban đầu là tầm soát các vi sinh vật tạo hương. Thu thập và tìm hiểu các giống vi sinh vật có khả năng tạo hương từ trong thiên nhiên, từ các thực phẩm lên men cổ truyền và từ các môi trường tự nhiên đặc biệt (nước mặn, suối nước nóng). Nội dung nghieân cöùu - Phân lập trên diện rộng để thu thập các chủng vi sinh vật từ nhiều nguồn khác nhau (từ rau quả, nho làm rượu, nước mắm, các loại mắm ăn, yaourt, nước ruộng muối, suối nước nóng,…). -

Sơ bộ định danh để xác định các giống vi sinh vật.

-

Sơ tuyển các chủng có mùi hương để tiếp tục nghiên cứu.

-

Ly trích và xác định mùi hương thu nhận được từ các chủng được tuyển.

2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đã đạt được 2.1. Phân lập trên diện rộng Qua quá trình nghiên cứu đã thu được kết quả ph ân lập sau : 23 chủng vi khuẩn lactic (từ dưa chua, kim chi), 2 chủng từ nước mắm, 49 chủng từ các loại mắm ăn (mắm cá cơm, cá thu, mắm ruốc,…), 23 chủng vi khuẩn hiếu khí chịu mặn từ nước biển, 6 chủng vi khuẩn chịu nhiệt từ suối nước nóng khu vực phía Nam và 7 từ các lọai nho làm rượu vang (Bình Thuận). Bước đầu tiên tiến hành phân lập trên diện rộng để thu thập càng nhiều mẫu càng tốt. Các chủng phân lập được là mở rộng nghi ên cứu. 2.2. Kết quả đ ịnh danh và phân tích Phân lập, khảo sát các đặc điểm nuôi cấy, tế bào, khuẩn lạc, sinh lý và sinh hóa của các chủng nghiên cứu, dựa vào khóa phân lọai của Bergey, đã định danh được các vi sinh vật từ những nguyên liệu :

Trang 20

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

1) Từ lớp váng nổi đặc biệt trong một số thùng làm nước mắm phân lập được 2 chủng vi khuẩn: - Chủng 1: Staphylococcus intermedius Thuộc giống Staphylococcus, họ Micrococcaceae - Chủng 2: Vibrio costicola. Thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae 2) Từ một số lọai mắm ăn, phân lập được: - Chủng 1: Bacillus lichenformis - Chủng 2: Bacillus pasterii - Chủng 3: Bacillus megaterium - Chủng 4: Bacillus firmus - Chủng 5: Bacillus sphaericus - Chủng 6: Micrococcus luteus thuộc giống Micrococcus 3) Phân lập được 3 chủng vi khuẩn tứ yaourt và xác định được: - Chủng 1: Lactobacillus acidophilus - Chủng 2: Lactobacillus bulgaricus - Chủng 3: Streptococcus thermophillus Cả 3 chủng trên thuộc họ Lactobacteriaceae - Ly trích hương do các nhóm vi khuẩn này tạo ra bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước có sự hổ trợ của vi sóng: hiệu suất hương thu được ở các chủng khác nhau tứ 0,25 – 0,79%, định tính mùi hương do nhóm vi khẩn này tạo ra thuộc nhóm diacetyl, benzoylaceton. 4) Từ các lọai nho làm rượu vang (Bình Thuận) phân lập được: - Chủng 1: Saccharomyces serevisiae - Chủng 2: Saccharomyces ellipsoideus - 5 chñng nÊm men kh¸c thuéc gièng Citeromyces, ®ang ®Þnh danh ®Õn loµi. Phân tích các chất dễ bay hơi trong rượu vang nho, bằng phương pháp GC-MS thu được 11 hợp chất sinh hương như sau: Isobutyric acid, Isopentyl alcohol, Isovaleric acid, 4-Carene, 3-Carene, benzeneethanol, succinic acid-diethyl ester, octanoid acid, succinic acid-diethyl ester, o-allylguaiacol. 5) Từ các suối nước nóng (Bình Châu, Khánh Hòa, Bình Định) phân lập và định danh 5 loài : – Chủng 1: Geobacillus stearothermophilus – Chủng 2: Brevibacillus brevis – Chủng 3: Brevibacillus sp. – Chủng 4: Meithermus ruber – Chủng 5: Anoxybacillus plavithermus 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn Phân lập và định danh các vi sinh vật từ những sản phẩm lên men. Ly trích và phân tích các mùi hương thu nhận được thì nhận thấy rằng các hương này được tạo ra từ những vi sinh vật trong tự nhiên với hàm lượng khá cao, nếu được tinh sạch thì hòan tòan có khả năng ứng dụng trong công nghiệp. Ngoài ra, với các chủng có được có thể mở rộng nghiên cứu theo hướng tìm ứng dụng mới như các enzyme hay kháng sinh,…. Trang 21

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sĩ: số đã bảo vệ: 01 Tiến sĩ: số đã bảo vệ:

đang hướng dẫn: 01 (sắp bảo vệ). đang hướng dẫn:

5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo KH [1]. “ Sưu tập giống các vi sinh vật tạo hương”. Lê Thị Thanh Loan, Lê Thị Mỹ Phước, Phạm Thành Hổ. Hội nghị Khoa học toàn quốc lần 2 – Nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp, Y học – Huế 25, 26/07/2003. 6. Đánh giá và kiến nghị Trong quá trình nghiên cứu đã thu được nhiều chủng vi sinh vật và đây là nguồn vật liệu có giá trị. Nhiều chủng đã được định danh, hiện chúng tôi nhờ bảo tàng giống Quốc gia thẩm đ ịnh. H ạn chế lớn của đề tài là khó phân tích mùi hương v à rất khó khắc phục. Tuy nhiên trên cơ sở những chủng đã thu thập được chúng tôi sẽ mỏ rộng nghiên cứu sang các đặc tính khác để tìm các ứng dụng mới nhằm khai thác có hiệu quả nguồn tài nguyên đa dạng vi sinh vật ở nước ta. Sắp tới chúng tôi sẽ cố gắng công bố 2 bài báo trên các tạp chi khoa học trong nước.

COLLECTING OF AROMA MICROORGANISM PRODUCERS ABSTRACT For the exploitation of the diversity resources of microorganism in Vietnam with the primary orientation to the aroma microorganism producers. Collecting and sudying different aroma microorganism sources from the natural habitats, from the traditional fermented food and from the particular environment (such as salenity water, hot sping water,…). Studying content: – Large-scale isolation of different microorganisms from many sources (such as vegetables, wine grape, fish sauces, fermented fish pastes, salenity water, hot sping water,…). – Primary identification of gens of isolated microorganisms. – Screening the aroma microorganism producers for further studies. – Extracting and determining the aroma from screened microorganisms.

Trang 22

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

THIẾT LẬP QUI TRÌNH THAO TÁC, CHỌN LỌC CÁC TẾ BÀO SINH DỤC ĐỘNG VẬT HỮU NHŨ NHẰM TẠO NGUỒN PHÔI IN-VITRO, IN-VIVO ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI VÀ NGHIÊN CỨU TẾ BÀO MẦM Mã số đề tài: 620203 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. NGUYỄN TƯỜNG ANH Cơ quan công tác: Trường ĐHKHTN-ĐHQG Tp. HCM Địa chỉ liên lạc: 227 Nguyễn Văn Cừ -Quận 5-Tp.HCM Điện thoại: 8353193

E-mail:

Thành viên tham gia: 07 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu 1.1. Mục đích nghiên cứu Từ những thập kỷ qua, khả năng làm chủ trên các loại tế bào giao tử và phôi động vật- được gọi chung là kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (Assited Reproductive Technology-ART) đã mang lại giá trị kinh tế to lớn cho các quốc gia có ngành chăn nuôi phát triển nhờ vào khả năng chủ động được trong việc tạo ra nguồn phôi có đặc điểm di truyền tốt. Ngoài ra, tiềm năng sử dụng các nguồn tế bào này trong các lĩnh vực nghiên cứu khác như chuyển gene, nhân bản động vật, khai thác tế bào mầm… rất lớn. Ở nước ta, về các lĩnh vực trên vẫn còn nhiều mới mẻ. Do đó, những nghiên cứu tiền đề cần được mở ra. Trên cơ sở đó, đề tài xác định mục tiêu: xây dựng các quy trình thao tác trên tế bào sinh dục động vật. Thông qua các quy trình thao tác trên tạo nguồn phôi động vật hữu nhũ trong điều kiện in vitro, in vivo phục vụ cho những nghiên cứu ở mức tế bào như khai thác tế bào mầm và trong lĩnh vực tạo giống cho ngành chăn nuôi của Việt Nam. 1.2. Nội dung nghiên cứu 1.2.1. Xây dựng quy trình thụ tinh in-vitro và in-vivo ở động vật hữu nhũ a. Quy trình thụ tinh in-vitro - Xây dựng quy trình thu nhận buồng trứng từ động vật giết thịt và khảo sát môi trường nuôi chín in vitro nguồn trứng thu nhận - Khảo sát khả năng kích thích sự rụng trứng bằng kích dục tố. - Kháo sát các phương pháp tách tinh trùng b. Quy trình thu nhận phôi in- vivo - Thiết lập quy trình gây rụng trứng , thu nhận và nuôi cấy phôi ở động vật hữu nhũ. 1.2.2. Xây dựng quy trình xác định giới tính phôi ở các giai đọan 4, 8 tế bào bằng kỹ thuật sinh học phân tử. 1.2.3. Xây dựng quy trình bảo quản nguồn giao tử và phôi phục vụ cho mục tiêu bảo tồn. 1.2.4.Bước đầu khai thác tế bào mầm từ phôi động vật làm cơ sở cho các đối t ượng khác. Trang 23

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đã đạt được 2.1. Những kết quả nghiên cứu Xây dựng và hoàn thiện quy trình thu nhận, chọn lọc, nuôi cấy đến giai đoạn trưởng thành các loại tế bào giao tử (trứng, tinh trùng) của động vật (chuột nhắt trắng- Mus musculus Var.Albino và heo- Sus scrofa domestica) Xây dựng và hoàn thiện quy trình thụ tinh in- vitro trên chuột nhắt trắng và heo. Quy trình xác định giới tính phôi ở giai đoạn sớm trên heo bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Thiết lập quy trình nuôi cấy nguồn phôi chuột in-vitro, in-vivo đến giai đoạn Morula, Blastocyst. Xây dựng quy trình nuôi cấy và cấy chuyển phôi in-vitro, in-vivo trên chuột nhắt trắng. Đông lạnh phôi chuột bằng kỹ thuật đông lạnh nhanh và chậm trong Nitơ lỏng. Quy trình thu nhận, tinh sạch và nuôi cấy tế bào mầm từ nguồn phôi chuột in –vivo.

Ý nghĩa khoa học - Đề án mang ý nghĩa là những thử nghiệm bước đầu nhằm xây dựng một số kỹ thuật thao tác trên tế bào sinh dục động vật hữu nhũ áp dụng vào những vật nuôi có giá trị kinh tế như bò sữa-đối tượng được quan tâm hàng đầu hiện nay của ngành chăn nuôi Việt Nam. Nhì chung, kết quả nghiên cứu tốt sẽ có khả năng đáp ứng một số nhu cầu thuộc lĩnh vực Y học và chăn nuôi Việt Nam trong tương lai. - Những nghiên cứu cơ bản trên đối tượng động vật làm tiền đề cho những nghiên cứu và ứng dụng rộng hơn, mở ra những khả năng mới, giúp nền khoa học cơ bản n ước ta t ừng bước hoà nhập với xu hướng thế giới.

(a) Phôi chuột 8 tế bào được giải đông trước và sau nhuộm (b) Cầu sinh dục và cụmtế bào mầm 2.2. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn Nhìn chung, trong lĩnh vực chăn nuôi, thành công trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (thụ tinh nhân tạo, thụ tinh trong ống nghiệm, cấy truyền phôi) giúp cho việc phát triển và nhân giống các vật nuôi có giá trị kinh tế, tạo được hàng loạt vật nuôi có đặc điểm di truyền mong muốn.

Trang 24

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

Các quy trình nuôi cấy, đông lạnh các loại giao tử, phôi có khả năng áp dụng cho lĩnh vực bảo tồn giống vật nuôi có giá trị kinh tế và quí hiếm. Nghiên cứu tế bào mầm từ phôi là hướng nghiên cứu mang tính thời sự hiện nay trên cả thế giới vì những tiềm năng ứng dụng to lớn của chúng trong lĩnh vực y sinh học, sức khoẻ con người. 3. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sĩ: Tiến sĩ:

số đã bảo vệ: số đã bảo vệ

03 00

đang hướng dẫn: 00 đang hướng dẫn: 00

4. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 4.1. Các công trình đã công bố trong các tạp chí KH Nguyễn Thị Thương Huyền, Trần Cẩm Tú, Phan Kim Ngọc. Chuyển phôi in vivo ở chuột nhắt trắng. Tạp chí Sinh học, Tập7-số 2, tháng 6-2005. Trang 74-77 4.2. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo KH ( [1]. Nguyễn Thị Thương Huyền, Trần Cẩm Tú, Phạm Văn Phúc, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc. Thu nhận, nuôi cấy và chuyển phôi ở chuột nhắt trắng (Mus musculus var.Albino). Asian Reproductive Biotechnology Cenference, 2-7 November 2005, Bangkok, Thailand [2]. Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Nguyễn Quốc Đạt. Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm trên heo (Sus scrofa domestica). Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2003. [3]. Huỳnh Thị Lệ Duyên , Nguyễn Hoàng Chương, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thùy Dương. Thiết lập quy trình xác định giới tính heo (sus scrofa domestica) dựa trên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Hội nghị Khoa học Tự nhiên-Ngành Khoa học sự sống năm 2003 [4]. Phạm Thị Lan Hương, Nguyễn Khánh Tâm, Nguyễn Hữu Hùng, Nguyễn Thị Thương Huyền, Trần Cẩm Tú, Nguyễn Đăng Quân, Trần Thị Việt Hồng, Phan Kim Ngọc, Nguyễn Tường Anh, Đỗ Quang Minh. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự t ăng sinh của phôi 2 tế bào nuôi cấy in vitro và thử nghiệm quy trình đông lạnh phôi của chuột nhắt trắng. Hội nghị toàn quốc 2004-Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống- định hướng Y-Dược học. Trang 239. [5]. Phạm Văn Phúc, Phan Minh Liêm, Phan Kim Ngọc, Ngô Kế Sương. Thu nhận, tinh sạch tế bào mầm từ phôi chuột (Mus musculus var.Albino) (12,5ng ày) và tạo lớp feeder MEF nuôi tế bào mầm. Hội nghị toàn quốc 2005- Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống 5. Đánh giá và kiến nghị Đề tài hoàn thành được các mục tiêu nghiên cứu đề ra.

Trang 25

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

PROTOCOLS FOR MAMMALIAN GAMETES MANIPULATION, SELECTING TO PRODUCE IN-VITRO, IN-VIVO EMBRYOS APPLIED TO STUDY EMBRYONIC STEM CELLS ABSTRACT Assited Reproductive Technology (ART) consisted of mammalian gametes, embryo manipulation was established 20-30 years ago. These techniques supported important economic effects based on production of mammalian embryos with good genetic characteristics. In addition, applying of these cells (gametes, embryos ) on researches such as transgenic, cloning, embryonic stem cell (ES) is necessary. Now, studying on ART or ES is new in Vietnam. However, ART and ES cell researches should be carried out for developing of continued researches. Our subjects are: -

Establish protocols for collection, selection and in-vitro maturation culture of mammalian gametes used for in-vitro fertilization

-

Establish protocols for In-vitro fertilization , embryo culture, embryo sexdetermining (PCR technique)

-

Establish protocols for conservation of gametes and embryos.

-

Isolate and culture embryonic stem cell from mammalian embryos

Trang 26

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

THIẾT KẾ THỬ NGHIỆM VẬT LIỆU SINH HỌC PHÂN HUỶ CHẬM THUỐC VÀ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO BIỂU BÌ NUÔI CẤY IN VITRO LÀM MÀNG CHỬA BỎNG Mã số đề tài: 640503 Chủ nhiệm đề tài: TS. VÕ HUY DÂNG Cơ quan công tác: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQG-HCM. Địa chỉ liên lạc: 33 Hồ Hảo Hớn, Q.1, TPHCM Điện thoại:8364969

Email: [email protected].

Thành viên tham gia: - Phan Kim Ngọc - Trần Lê Bảo Hà - Nguyễn Kim Trinh - Nguyễn Phan Xuân Lý - Vũ Tuấn Trung 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Tổn thương bỏng ở diện rộng và vết thương sâu dưới da đã để lại các di chứng nặng nề cho bệnh nhân, hiện nay các công trình trên thế giới đang tập trung tìm kiếm các vật liệu sinh học để làm màng che phủ tạm thời hay tạo ra các màng da nhân tạo. Hàng loạt các màng sinh học đã có mặt trên thị trường như: màng epicraf, màng dermocraft, màng alloderm, intergraf ... góp phần điều trị tổng thương bỏng hiện nay trên thế giới. Tuy nhiên ở nước ta các công trình hướng nghiên cứu thiết kế màng da nhân tạo này rất còn mới mẻ, hầu hết các màng điều trị phỏng đều phải mua từ các hãng nước ngoài, vì thế các kết quả đạt được sẽ có ý nghĩa thực tiễn rất lớn trong điều trị tổn thương bỏng ở nước ta hiện nay. 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đã đạt được Thiết kế ra các màng chữa bỏng trên cơ sở các vật liệu sinh học như: PPV, chitozan, geltin, alginat... Đánh giá khả năng thải chậm các thuốc kháng sinh, thuốc chửa bỏng của các màng thiết kế, đánh giá sự lành hoá vết thương trên chuột gây bỏng nhân tạo khi đắp các màng này. Thiết lập qui trình nuôi cấy tế bào biểu bì chuột, cố định tế bào biểu bì lên vật liệu sinh học: màng gelatin-alginat, hyaluronic acid. Kết quả đạt được sẽ làm tiền đề cho việc thiết kế ra màng da nhân tạo đầu tiên ở Việt Nam 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn Tổn thương bỏng diện rộng và vết thương sâu dưới da đã để lại các di chứng nặng nề cho bệnh nhân, hiện nay các công trình trên thế giới đang tập trung tìm kiếm các vật liệu sinh học để làm màng che phủ tạm thời hay tạo các màng da nhân tạo. Hàng loạt các màng sinh học đã có mặt trên thị trường như: màng epicraf, màng dermocraft, màng alloderm, intergraf ... đã góp phần điều trị tổng thương bỏng hiện Trang 27

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

nay trên thế giới. Tuy nhiên ở nước ta, các công trình hướng nghiên cứu thiết kế màng da nhân tạo này rất còn mới mẻ, hầu hết các màng điều trị phỏng đều phải mua từ các hãng nước ngoài, vì thế các kết quả đạt được sẽ có ý nghĩa thực tiễn rất lớn trong điều trị tổn thương bỏng ở nước ta hiện nay Việc tìm kiếm các vật liệu sinh học trong điều trị bỏng đã mang lại các kết quả khả quan đặc biệt là các màng da nhân tạo được thiết kế dựa trên cơ sở: khuôn bằng vật liệu sinh học + các tế bào biểu bì (keratinocyte, fibroblast) đã mở ra một hướng ứng dụng tiềm năng trong việc điều trị bỏng và vết thương mất da sâu. Vì thế sự thành công của đề tài sẽ có giá trị thực tiễn cao trong điều trị phỏng ở nước ta. 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sĩ: Tiến sĩ:

số đã bảo vệ: 3 số đã bảo vệ: 0

đang hướng dẫn:1 đang hướng dẫn: 0

5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo KH [1]. Đỗ Lưu Hoài Niệm, Trần Lê Bảo Hà, Nguyễn Kim Trinh Phan Kim Ngọc, Võ Huy Dâng, Thử nghiệm tách và nuôi cấy tế bào da người; Hội nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, Hà Nội, 16-17/12/2003, trang 673-676 [2]. Trần Lê Bảo Hà, Vũ Quốc Hùng, Đinh Hoàng Đăng Khoa, Nguyễn Kim Trinh, Phan Kim Ngọc, Võ Huy Dâng; Thiết kế màng gelatin-alginat trong ứng dụng điều trị tổng thương bỏng; Hội nghị Khoa Học Toàn Quốc 2004, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống định hướng y dược học, 28/10/2004, trang 673-675 [3]. Trần Lê Bảo Hà, Hồ Thị Thanh Hồng, Nguyễn Phan Xuân Lý, Nguyễn Kim Trinh, Võ Huy Dâng; Tách và nuôi cấy tế bào biểu bì da bao quy đầu người; Báo cáo khoa học, Hội Nghị toàn quốc 2005, Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, 03/11/2005 Đại Học Y Hà Nội, trang 488-490. [4]. Vũ Tuấn Trung, Nguyễn Phan Xuân Lý, Trần Lê Bảo Hà, Võ Huy Dâng; Thiết kế màng chitosan-gelatin-acid hyaluronic cố định tế bào trung mô tuỷ xương lên màng; Báo cáo khoa học Hội Nghị Khoa học Toàn Quốc 2005, Công Nghệ Sinh Học trong nghiên cứu cơ bản, Trường ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội, 6/12/2005 (đang in) [5]. Nguyễn Thị Lệ Thuỷ, Trần Thị Trúc Thanh, Trần Lê Bảo Hà, Võ Huy Dâng. Phối hợp thuốc có nguồn gốc tự nhiên với màng gelatin-alginat trong điều trị tổn thương bỏng, Tạp Chí Dược Học. 6. Đánh giá và kiến nghị Đề tài đã thực hiện tốt các nội dung đề ra, các kết quả mang tính ứng dụng cao góp phần vào công cuộc điều trị phỏng ở nước ta hiện nay. Cần có cơ chế thoáng hơn cho chủ nhiệm đề tài trong việc dự trù và sử dụng kinh phí trong nghiên cứu.

Trang 28

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

TESTING DESIGNS BIOMATERIALS FOR SLOWLY DRUG DELIVERY SYSTEM AND IMMOBILIZATION IN VITRO EPITHELIAL CELL FOR BURN DRESSING ABSTRACT Burn damage in large scale and deep inside the skin made heavily sequela for patients. In present, some studies try to find out biomaterials for dressing the wound or establishment artificial membrance. Some biological membrances have presented in the market such as epicraft, dermocraft, alloderm, intergraf... have important contributed in burn treatment. However, in Vietnam studies in this field is also is very new, almost burn dresings have been exported from developed countries. So, results obtained from this research will have significant practice for burn treatment in Vietnam.

Trang 29

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

VAI TRÒ CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA TĂNG TRƯỞNG THỰC VẬT TRÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN VÀ PHÁT SINH PHÔI SOMA Ở CHUỐI (Musa sp L.) VÀ KHOAI MÌ (Manihot esculenta Crantz) Mã số đề tài: 620202 Tên chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. BÙI TRANG VIỆT Cơ quan công tác: Đại học Quốc gia TP.HCM - Trường ĐH. Khoa học Tự nhiên Địa chỉ liên lạc: 227, Nguyễn văn Cừ, Quận 5, TP.HCM Điện thoại: 8397643 Email:[email protected] Thành viên tham gia: - ThS. Phan Ngô Hoang - ThS. Trần Thanh Hương 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Sự vi nhân giống là kỹ thuật nhân nhanh vật liệu thực vật nhằm sản xuất một số lượng lớn cây giống đồng nhất và sạch bệnh dựa trên 2 quá trình phát sinh hình thái quan trọng: phát sinh cơ quan và phát sinh phôi soma. Gần đây, sự phát triển các hệ thống nuôi cấy dịch treo tế bào có khả năng phát sinh phôi mở ra hướng sản xuất ở qui mô lớn với giá thành thấp. Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật đóng vai trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái. Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này nhằm giải thích vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh cơ quan và phát sinh phôi soma ở hai loài thực vật thông thường: chuối (cây đơn tử diệp) và khoai mì (cây song tử diệp). 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đã đạt được Dịch treo tế bào chuối Cau mẵn được tạo từ mô sẹo có nguồn gốc hoa đực non, trong môi trường lỏng chứa 2,4-D 1mg/l và acid ascorbic 15mg/l. Tế bào dịch treo tăng trưởng nhanh sau 7 ngày nuôi cấy và đạt đỉnh hô hấp ở ngày 14. Sự phối hợp 2,4D 1mg/l và zeatin 0,5mg/l cải thiện sự tăng trưởng và chất lượng của dịch treo tế bào. Phôi soma hình thành khi tế bào dịch treo được chuyển sang môi trường giảm auxin. Môi trường Ma3 không hormon và mật độ tế bào ban đầu 15µl tế bào lắng/ml dịch treo tế bào thích hợp cho sự sinh phôi soma. Sự tiến hóa phôi soma từ tế bào chuối Cau mẵn qua các giai đoạn đặc trưng của sự tiến hóa phôi đơn tử diệp: phôi hình cầu, hình núi lửa, hình kim tự tháp (ảnh 1 và 2) (Bùi Trang Việt và csv 2004; Trần Thanh Hương và Bùi Trang Việt 2003, 2004). Mối quan hệ di truyền giữa Manihot glaziovii và một số giống trồng Manihot esculenta (Nền co, Cuống trầu, Sắn xanh, Chuối vàng, KM60, KM140, HL23, C9582, C9949, SC205, MPRA183, KM98-1, Rayong5 và KM94) được nghiên cứu nhờ kỹ thuật PCR-RAPD (Phan Ngô Hoang và csv 2004; Phan Ngô Hoang và csv 2005). Ở khoai mì dòng Cuống trầu, chồi ngọn và nụ nách cô lập phát triển tốt trên môi trường MS với BA 0,2mg/l, NAA 0,1mg/l và GA 0,05mg/l (Nguyễn Xuân Dũng và csv 2002). Lá cây in vitro từ các dòng: Cuống trầu, KM98-5, KM98-1, KM140, KM94, và KM108-1 cho phép tạo mô sẹo tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và

Trang 30

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

BA 0,5mg/l (Phan Ngô Hoang và Bùi Trang Việt 2004). Mô sẹo phát triển thành dịch treo tế bào trong môi trường MS lỏng có picloram 4mg/l và zeatin 1mg/l (ảnh 3). Sự sinh phôi soma xảy ra khi nuôi cấy mô sẹo từ lá và lóng thân khoai mì dòng Cuống trầu liên tục 21 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có NAA 0,2mg/l, BA 0,15mg/l và GA 0,1mg/l (ảnh 4). 1

Ảnh 1:Phôi hình cầu sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trường Ma3

2

Ảnh 2: Sự thành lập phôi sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường Ma3

3

Ảnh 3: Nhóm tế bào dịch treo tế bào khoai mì dòng Cuống trầu sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung picloram 4mg/l và zeatin 1mg/l.

4

Ảnh 4: Phôi hình cầu khoai mì dòng Cuống trầu với hệ thống tiền mạch sau 2 tuần nuôi cấy.

Các kết quả trên chuối và khoai mì phù hợp với các kết quả sau đó ở lúa (Bùi Trang Việt và csv. 2004): sự di chuyển hữu cực của auxin (auxin indol acetic) từ mô cấy xuống môi trường nuôi cấy (được giảm hay loại bỏ auxin) có vai trò quan trọng trong sự phát sinh cơ quan phôi. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn Từ các nghiên cứu cơ bản, nhóm nghiên cứu đã thực hiện có kết quả sự sinh phôi soma ở một số đối tượng như: Khoai tây, Lúa (Bùi Trang Việt và csv 2004), Huệ trắng (Phan Hoàng Anh và csv. 2005). 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sĩ: Tiến sĩ:

số đã bảo bảo vệ: 03 số đã bảo bảo vệ: 0

đang hướng dẫn: 05 đang hướng dẫn: 03 Trang 31

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đã công bố trong các tạp chí KH [1].

Bui Trang Viet and Tran Thanh Huong 2004. Growth of cell suspensions of cv. ‘Cau man’. Infomusa 13(1): 2-4.

[2].

Bùi Trang Việt, Phan Ngô Hoang, Nguyễn Thị Huệ, Trần Thanh Hương, Trịnh Cẩm Tú, Trần Thị Bích Trinh, Đòan Thị Phương Thùy, Cao Minh Phương 2004. Vai trò của auxin và cytokinin trong quá trình sinh phôi thể hệ ở khoai tây, lúa và chuối. Tạp chí KHKT nông lâm nghiệp số 2/2004: 64-67.

[3].

Phan Hoàng Anh, Phan Ngô Hoang và Bùi Trang Việt 2005. Vi nhân giống cây Huệ trắng (Lilium longiflorum Thunb). Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ. Vol 8 (8): 43-48.

[4].

Phan Ngô Hoang và Bùi Trang Việt 2004. Phân tích biến dị di truyền giữa mì cao su (Manihot glaziovii Muel-Arg) và các giồng trồng khoai mì (Manihot esculenta Crantz) bằng kỹ thuật PCR-RAPD. Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ. Vol 7 (7): 31-36.

[5].

Phan Ngô Hoang, Bùi Trang Việt và Hòang Kim 2004. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở Mì cao su (Manihot glaziovii Muel-Arg) và một số giống trồng khoai mì (Manihot esculenta Crantz). Tạp chí KHKT nông lâm nghiệp số 3/2004; 26-29.

5.2. Các công trình đã hoàn thành và sẽ công bố trong các tạp chí KH [1].

Phan Ngô Hoang, Đỗ Thường Kiệt, Bùi Trang Việt và Hoàng Kim. Khoảng cách di truyền và khả năng quang hợp ở Mì cao su (Manihot glaziovii Muel-Arg.) và một số giống trồng khoai mì (Manihot esculenta Crantz). Bài tham gia Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc trong nghiên cứu cơ bản (Hà Nội tháng 12/2005).

5.3. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo KH [1].

Phan Ngô Hoang và Bùi Trang Việt 2004. Tạo mô sẹo và dịch treo tế bào khoai mì (Manihot esculenta Crantz). Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ ba – Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống (Thái Nguyên tháng 9/2004): 405-408.

[2].

Trần Thanh Hương và Bùi Trang Việt 2003. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tăng trưởng của tế bào chuối Cau mẵn (Musa paradisiaca L.) được nuôi cấy trong môi trường lỏng. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc (Huế tháng 12/2003): 766-770.

[3].

Trần Thanh Hương và Bùi Trang Việt 2004. Tìm hiểu khả năng sinh phôi của dịch treo tế bào chuối Cau mẵn (Musa paradisiaca L.). Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ ba – Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống (Thái Nguyên tháng 9/2004): 434-437.

6. Đánh giá và kiến nghị

Trang 32

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

Tiếp tục nghiên cứu về vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh phôi soma ở các đối tượng có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam, đồng thời cải tạo và nâng cấp vườn thực nghiệm của Bộ môn để tiếp tục nghiên cứu sự phát triển của các cây ở giai đoạn sau ống nghiệm.

ROLE OF PLANT REGULATORS ON ORGANOGENESIS AND SOMATIC EMBRYOGENESIS IN BANANA AND CASSAVA ABSTRACT Micropropagation is the practice of rapidly multiplying stock plant material to produce a large number of healthy homogeneous plants, basing on the two important processes of morphogenesis: plant organogenesis and somatic embryogenesis. The recent development of embryogenic suspension cultures has paved the way to future mass production of plants at low cost. Use of plant growth substances plays a key role in morphogenesis. Therefore, the aim of this work is to explain role of these substances on organogenesis and somatic embryogenesis in two common plants: banana (monocotyledonous plant) and cassava (dicotyledonous plant).

Trang 33

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LÁT MỎNG TẾ BÀO ĐỂ NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN MỘT SỐ GIỐNG CÂY ĂN QUẢ Mã số đề tài:

62

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. BÙI VĂN LỆ Cơ quan công tác: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh Địa chỉ liên lạc:

227 Nguyễn Văn Cừ Q.5 Tp Hồ Chí Minh

Điện thoại:

8353193

Email: [email protected]

1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Để tìm các điều kiện nâng cao tần số tạo chồi trên một số giống cây ăn quả, chúng tôi đã dùng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào cắt ngang (transverse thin cell layer) và cắt dọc (longgitudinally thin cell layer) thực hiện trên các đối tượng cây ăn quả như: điều, măng cụt, cam chanh và nhãn. Kết quả nghiên cứu cho thấy tần số chồi phát sinh cao từ các lớp mỏng cắt ngang và cắt dọc trên các loài cây điều, măng cụt, cam chanh và nhãn. 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đạt được Đề tài thực hiện trên một số đối tượng cây ăn quả như cây măng cụt, cam chanh, nhãn và điều. Mục đích của đề tài là thực hiện qui trình vi nhân giống với tần số tạo chồi cao trên các loại cây ăn quả sử dụng kỹ thuật nuôi cấy cắt lát mỏng tế bào. Phương pháp được thực hiện trên các lát mỏng cắt ngang và dọc các phần khác nhau của cây thân gỗ. Kết quả nghiên cứu cho thấy qui trình thích hợp có tần số tạo chồi cao được thực hiện thành công trên các đối tượng như sau: - Lát cắt dọc trên chồi non cây cam (Poncirus trifoliate) một năm tuổi cho số chồi cao nhất là 33 chồi/lát mỏng với các nồng độ BAP (3 mg/l), NAA (0,5 mg/l) và hiệu suất là 90% (Hội nghị toàn quốc lần thứ hai, Nghiên Cứu Cơ Bản Trong Sinh Học, Nông Nghiệp, Y Học. Huế, tháng 7/2003). - Trên cây măng cụt (Garcinia mangostana), lát cắt dọc từ hạt và lóng thân cây con cho thấy sự tạo chồi thích hợp ở 1-2 mg/l BAP với 8,4 chồi/lát mỏng cho hạt và 17,3 chồi/lát mỏng cho lóng thân. Các tỉ lệ tạo chồi tương ứng là 91,6% cho hạt và 60% cho lóng thân ( Hội nghị toàn quốc 2004, Nghiên Cứu Cơ Bản Trong Khoa Học Sự Sống. Thái Nguyên tháng 9/2004). - Các kết quả tối ưu khác khi dùng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào cũng được tìm thấy trên cây nhãn (Euphoria longan) (nồng độ 2,4-D 2 mg/l), cây sung (Ficus carica) (nồng độ BAP 2 mg/l) và cây điều (Anacardium occidentale) (nồng độ BAP 5 mg/l với 17,3 chồi/lát mỏng cắt dọc) (Hội nghị toàn quốc lần thứ hai, Nghiên Cứu Cơ Bản Trong Sinh Học, Nông Nghiệp, Y Học. Huế tháng 7/2003). 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn Các kết quả này được triển khai trên các đề tài khác như khảo sát quá trình vi ghép in vitro ở cây họ cam chanh và ứng dụng trong biến nạp gen để tạo cây chuyển gen. Qui trình nhân giống cây măng cụt được dùng để chọn lọc và phục tráng cây họ Trang 34

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

măng cụt. Các qui trình khác dùng cho vi nhân giống với số lượng lớn các loại cây ăn quả tương ứng. Phương pháp còn là tiền đề cho các nghiên cứu vi nhân giống các giống cây ăn quả khác. 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sĩ: Tiến sĩ:

Số đã bảo vệ: 03 Số đã bảo vệ: 00

Số đang hướng dẫn: 00 Số đang hướng dẫn: 00

5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đã công bố trong các tạp chí khoa học [1]. DT Nhut, J.A. Teixeira da Silva, Bui Van Le and K Tran Thanh Van (2003). Thin Cell layer morphogenesis as a powerful tool in woody plants and fruit crop micropropagation and biotechnology, floral genetics and genetic transformation. In Micropropagation of woody trees and fruits. S. Mohan Jain and Katsuaki Ishii (Eds) Dordrecht: Kluwer Academic Publisher. Pp:785-814. [2]. 5.1.2. DT Nhut, J.A. Teixeira da Silva, Bui Van Le (2005). Thin Cell layer sectioning for inducing somatic embryogenesis in woody plants. In Protocol for somatic embryogenesis in woody plants. S. Mohan Jain and Pramod K.Gupta (Eds). Springer. Pp:785-814. 5.2. Các công trình đã hoàn thành và sẽ công bố trong các tạp chí KH [1]. Bùi Lan Anh, Trần Ngọc Hiếu, Bùi Văn Lệ (2005). Khảo sát qui trình chuyển gen vào lát mỏng tế bào cam ba lá (Poncitrus trifoliata) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Hội nghị Khoa Học Toàn Quốc 2005, Công Nghệ Sinh Học Trong Nghiên Cứu Cơ Bản. Hà Nội tháng 12/2005. 5.3. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo khoa học [1]. Bùi Văn Lệ, Trần Nguyên Vũ, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Lương Thị Mỹ Ngân (2003). Vi nhân giống một số cây ăn quả dùng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào. Hội nghị toàn quốc lần thứ hai, Nghiên Cứu Cơ Bản Trong Sinh Học, Nông Nghiệp, Y Học. Huế tháng 7/2003: 340-343. [2]. Kiều Phương Nam, Trần Thị Anh Nguyệt, Bùi Văn Lệ, Thái Xuân Du (2004). Khảo sát sự phát sinh cơ quan cây măng cụt (Garcinia mangostana L.) bằng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào. Hội nghị toàn quốc 2004, Nghiên Cứu Cơ Bản Trong Khoa Học Sự Sống. Thái Nguyên tháng 9/2004: 533-536. 5.4. Sách chuyên khảo đã xuất bản (tên sách, nhà xuất bản, năm xuất bản) [1]. DT Nhut, Bui Van Le , K Tran Thanh Van and Thorpe TA (2003). Thin cell layerculture system. Dordrecht: Kluwer Academic Publisher. 6. Đánh giá kiến nghị Đề tài bước đầu đã tìm được một số điều kiện thích hợp cho qui trình vi nhân giống một số giống cây ăn quả, tuy nhiên, còn nhiều hạn chế trên ứng dụng các đối tượng cây ăn quả khác cần phải thực hiện. Đề nghị cấp kinh phí tiếp cho đề tài. Trang 35

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

APPLICATION OF THIN CELL LAYER SYSTEM IN FRUIT CROP IMPROVEMENT ABSTRACT To study a method for high frequency and direct in vitro bud regeneration of fruit crop species, we used the thin cell layer system. A higher percentages of bud regeneration from longitudinally thin cell layer (lTCLs) and transverse thin cell layer (tTCLs) were obtained on citrus (Poncirus trifoliate), mangosteen (Garcinia mangostana), longan (Euphoria longan Steud) and cashew (Anacardium occidentale L.).

Trang 36

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP MỚI CHUYỂN GEN VÀO VI NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIÁN TIẾP NHỜ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Mã số đề tài: 640102 Tên Chủ nhiệm đề tài: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH Cơ quan công tác: Viện Sinh học nhiệt đới Địa chỉ liên lạc: 1 Mạc Đĩnh Chi, Q. 1 Điện thoại: 0913 733 410

Email: [email protected]

Thành viên tham gia: CN Trần Hoàng Ngọc Ai 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Agrobacterium tumefaciens được sử dụng rộng rãi để biến nạp di truyền thực vật. Hiện nay phương pháp này áp dụng cho các đối tượng khác như tế bào động vật, vi nấm, các loại nấm lớn. Biến nạp di truyền nhờ A.tumefaciens có nhiều lợi điểm so với các phương pháp biến nạp khác như tính chọn lọc, đơn giản và hiệu suất cao. Mục tiêu của đề tài là xây dụng phương pháp hoàn chỉnh biến nạp vi nấm nhờ A.tumefaciens. Thử nghiệm biến nạp trên một số loại nấm như Trichoderma, Phytophtora, Volvariella. 2. Kết qủa nghiên cứu của đề tài về mặt khoa học - Hoàn thiện quy trình biến nạp Trichoderma harzianum: biến nạp plasmid pPK2 có mang gen kháng hygromycin vào A.tumefaciens, biến nạp T.harzianum gián tiếp nhờ A.tumefaciens, theo dõi độ ổn định của các dòng biến nạp và kiểm tra sự hiện diện của gen hph (kháng hygromycin) bằng PCR. - Hoàn thiện quy trình biến nạp nấm gây bệnh cây Phytophtora palmivora: quan sát gắn kết của A.tumefaciens lên bề mặt tơ nấm P.palmivora, biến nạp P.palmivora gián tiếp nhờ A.tumefaciens, chọn ngưỡng kháng hygromycin thích hợp và theo dõi độ ổn định của các dòng biến nạp, kiểm tra sự hiện diện của gen hph bằng PCR. - Hoàn thiện quy trình biến nạp nấm ăn Volvariella volvacea: phân lập và khảo sát các điều để nuôi cấy V.volvacea trong điều kiện in vitro, biến nạp V.volvacea gián tiến nhờ A.tumefaciens, chọn ngưỡng kháng hygromycin thích hợp, theo dõi độ ổn định của các dòng biến nạp và kiểm tra sự hiện diện của chỉ thị bằng PCR. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn Đây là phương pháp mới, hữu hiệu dùng để chuyển gen vào vi nấm một cách có chọn lọc và hiệu suất cao. 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sỹ: 0 Tiến sỹ: 0 Trang 37

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo KH [1]. Hoàng Quốc Khánh, Trần Hoàng Ngọc Ai. Chuyển gen kháng hygromycin B vào vi nấm Trichoderma harzianum bằng phương pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens. Hội nghị toàn quốc lần thứ II Nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp, Y học, Huế, 25-27/7/2003. [2]. Trần Hoàng Ngọc Ai, Hoàng Quốc Khánh. Biến nạp di truyền gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens vào nấm bệnh cây Phytophtora palmivora. Hội nghị Khoa học lần thứ IV Đại học Khoa học tự nhiên TP HCM, TP Hồ Chí Minh, 21/10/2004. [3]. Hoang Quoc Khanh, Tran Hoang Ngoc Ai. Agrobacterium tumefaciensmediated genetic transformation of the phytopathogenic oomycete Phytophtora palmivora. XXII Fungal genetics Conference, Pacific Grove, USA, March 18-23, 2003. [4]. Hoang Quoc Khanh, Tran Hoang Ngoc Ai. Agrobacterium tumefaciensmediated genetic transformation of the phytopathogenic oomycete Phytophtora palmivora. XIX International Congress of Genetics, Melbourne, Australia, July 6-11, 2003. [5]. Tran Hoang Ngoc Ai and Hoang Quoc Khanh. Agrobacterium tumefaciens-mediated gentic transformation of the edible straw mushroom Vovaviella volvacea. XXIII Fungal genetics Conference, Pacific Grove, USA, March 15-20, 2005. 6. Đánh giá và kiến nghị Đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra, mặc dù gặp phải một số khó khăn về điều kiện làm việc. Tiếp tục hỗ trợ kinh phí.

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS-MEDIATED GENETIC TRANSFORMATION OF FILAMENTOUS FUNGI ABSTRACT Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation is ultilized widely in transformation of plant. Nowadays, the method is applied for different cells such as animal cells, filamentous fungi and mushroom. The goal of this project is setting up a new method for transformation of filamentous fungi by using A.tumefaciens mediation. The method was tested in different kind of filamentous fungi such as Trichoderma, Phytophtora and Volvariella.

Trang 38

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY CẢI NGỌT CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU Mã số đề tài: 10521 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. NGUYỄN VĂN UYỂN Cơ quan công tác: Viện Sinh học nhiệt đới Địa chỉ liên lạc: 1- Mạc Đĩnh Chi, Q. I , Điện thoại: 8978796

E-mail: [email protected]

Thành viên tham gia: - TS. Nguyễn Hữu Hổ - KS. Lê Tấn Đức - ThS. Phạm Thị Hạnh - CN. Phan Tường Lộc - CN. Mai Trường 1. Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu - Xây dựng hệ thống tái sinh cây cải ngọt thông qua việc nuôi cấy các cơ quan mô tế bào khác nhau như lá mầm và trụ mầm và nghiên cứu ảnh hưởng của các chất chọn lọc đến khả năng tái sinh của cây tạo tiền đề cho việc chuyển gen. - Xây dựng hệ thống chuyển gen cho cây cải ngọt. - Kiểm tra thể hiện gen bằng các phương pháp: trong môi trường có chất chọn lọc và phản ứng PCR 2. Kết quả nghiên cứu của đề tài về mặt khoa học - Xây dựng hoàn chỉnh hệ thống tái sinh cây cải ngọt từ lá mầm và trụ mầm với kết quả như sau: sự tái sinh từ lá mầm cải ngọt là sự tái sinh thông qua mô sẹo ở cuống lá mầm và sự tái sinh trụ mầm cũng từ mô sẹo. Sự kết hợp giữa môi trường MS với 4 mg/l BA và 2 mg/l NAA kích thích mạnh mẽ sự tái sinh từ lá mầm và trụ mầm đặc biệt lá mầm cho khả năng tái sinh rất cao đạt khoảng 80%. - Hoàn tất việc khảo sát ảnh hưởng của chất chọn lọc Phosphinothricin (PPT) đến khả năng tái sinh của lá mầm, trụ mầm và cây cải ngọt đối chứng (không chuyển gen). - Nghiên cứu khả năng chuyển gen từ lá mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Chúng tôi tiến hành chuyển gen nhiều lần với số lượng lá mầm khá lớn (gần 1500 mẫu). Nhận thấy số lượng lá mầm chống chịu với chất chọn lọc (4mg/l PPT) để hình thành mô sẹo khoảng 3,7% nhưng số lượng có thể tái sinh chồi chỉ ở mức 1,5% và gần như đa số các chồi đều không phát triển và chết ở các lần cấy truyền sau, đây là hiện tượng được coi là escape khá phổ biến trong nghiên cứu chuyển gen do chồi ở thể khảm (tế bào chuyển gen và không chuyển gen phát triển Trang 39

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

cùng lúc) và chỉ còn 2 chồi tiếp tục phát triển trên môi trường MS với 6 mg/l PPT- cho thấy tần số chuyển gen thấp. - Nghiên cứu khả năng chuyển gen cây cải từ trụ mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Sử dụng trụ mầm của cây gieo từ hạt 5-6 ngày tuổi, cấy trụ mầm vào môi trường tái sinh 3-4 ngày trước khi cho trụ mầm tiếp xúc với dịch vi khuẩn để lây nhiễm, thời gian nuôi chung với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là hai ngày trên môi trường nuôi cấy có bổ sung 100 µM Acetosyringone và sau khi rửa trụ mầm được cấy trên môi trường tái sinh có chất chọn lọc là 3 mg/l PPT. Sau 3-4 tuần các chồi tái sinh được tiếp tục cấy truyền trên môi trường MS có 6 mg/l PPT để kiểm tra cây chuyển gen. Chúng tôi tiến hành chuyển gen nhiều lần với số lượng trụ mầm khá lớn (hơn 1500 mẫu). Chúng tôi nhận thấy số lượng trụ mầm chống chịu với chất chọn lọc 3mg/l PPT để hình thành mô sẹo khá (khoảng 5%) nhưng số lượng có thể tái sinh chồi chỉ ở mức khoảng 0,5% tuy nhiên đa số các chồi đều không phát triển và chết ở các lần cấy truyền sau và chỉ còn 2 chồi tiếp tục phát triển trên môi trường MS với 6 mg/l PPT- cho thấy tần số chuyển gen không cao. - Sử dụng phương pháp PCR để xác định gen cryIA trong cây cải giả định chuyển gen. Kết quả cho thấy các mẫu ADN của cây giả định chuyển gen sau khi chạy điện di có xuất hiện các băng có kích thước 0,65Kb, chúng là kết của sự khuếch đại gen cryIA(c) trong khi mẫu cây đối chứng hoàn toàn không có băng. - Đã trồng các cây cải ngọt giả định chuyển gen tại vườn ươm để kiểm tra khả năng kháng sâu Heliothis armigera, kết quả cho thấy khả năng kháng sâu của một dòng khá rõ còn các dòng khác không có sự khác biệt so với đối chứng. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng thực tiễn - Góp phần nâng cao trình độ nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển nạp gen trong công tác tạo giống cây trồng. - Tạo dòng cải ngọt kháng sâu hướng phục vụ cho sản xuất nông nghiệp 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sĩ: 0 Tiến sĩ: 0 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo KH [1]. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc đến mô cây cải ngọt (Brassica integrifolia) và nghiên cứu tạo cây cải chuyển gen. Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc về Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, Hà Nội, 3/11/2005. trang 1194-1197 [2]. Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Kh ảo sát khả năng tái sinh in vitro cây cải ngọt (Brassica integrifolia) từ lá mầm và trụ mầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen. Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc về Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống, Hà Nội, 3/11/2005. trang 498-500 Trang 40

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

[3]. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, 2005. Nghiên cứu tạo cây cải ngọt (Brassica integrifolia) chuyển gen kháng sâu từ trụ mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Bài đã gửi đăng Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc về Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản, Hà Nội, 6/12/2005. 6. Đánh giá và kiến nghị Đề tài đã được thực hiện đúng tiến độ dự kiến, hoàn thành các mục tiêu đề ra 1) Xây dựng hoàn chỉnh hệ thống tái sinh in vitro cây cải ngọt đối với hai giống cải và nghiên cứu ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT đến lá mầm, trụ mầm và cây. 2) Quy trình chuyển gen cho cây cải ngọt với nguồn nguyên liệu là lá mầm và trụ mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 3) Kiểm tra cây cải ngọt giả định chuyển gen in vitro bằng chất chọn lọc PPT và kỹ thuật PCR. 4) Thử tính kháng sâu của các dòng cải ngọt giả định chuyển gen tại vườn ươm. 5) Trồng thử nghiệm cây cải ngọt chuyển gen kháng sâu tại vườn ươm để kiểm tra tính ổn định của gen chuyển và kh ả năng di truyền ở thế hệ sau.

STUDIES ON THE HIGH FREQUENCY SHOOT REGENERATION SYSTEM AND PRODUCTION OF TRANSGENIC BRASSICA INTEGRIFOLIA RESISTANT TO INSECT ABSTRACT Study on high frequency shoot regeneration system of Brassica integrifolia for genetic transformation. Effect of selective agent on the growth of Brassica integrifolia tissues used in plant transformation. Development of transgenic Brassica integrifolia plants resistant to insect from hypocotyl via Agrobacterium tumefaciens. PCR analysis to confirm the presence of cryIA(c) gene in putative transgenic plants

Trang 41

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA MỘT SỐ CÂY THÂN GỖ NHIỆT ĐỚI VÀ CẬN NHIỆT ĐỚI TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO Mã số đề tài: 62 07 02 Chủ nhiệm đề tài:

NGUYỄN THỊ QUỲNH

Cơ quan công tác:

Viện Sinh học nhiệt đới

Địa chỉ liên lạc:

1 Mạc Đĩnh Chi, Q. 1, Tp. Hồ Chí Minh

Điện thoại: 824 4905 / 897 8794 / 824 1401 Email: [email protected] Thành viên tham gia: - TS. Thái Xuân Du - Th.S. Nguyễn My Uyên - KS. Trịnh Việt Nga 1. Mục đích, nội dung nghiên cứu Nghiên cứu các điều kiện tối ưu của môi trường nuôi cấy in vitro nhằm gia tăng khả năng tự dưỡng của cây thân gỗ trong qúa trình nuôi cấy in vitro, giúp cho việc cung cấp cây giống in vitro có chất lượng cao với giá thành thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy mô truyền thống, tiến đến một công nghệ nhân giống in vitro trên quy mô sản xuất lớn bán vô trùng. 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đã đạt được - Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy như nồng độ đường và tốc độ trao đổi khí của hộp nuôi cấy Magenta lên sự tăng trưởng của cây lõi thọ (Gmelina arborea Roxb.) trong giai đoạn nuôi cấy in vitro và thuần hóa ex vitro. - Nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ đường, gía thể, cường độ ánh sáng, các kiểu nắp đậy đến sự tăng trưởng của cây hông (Paulownia fortunei) trong giai đoạn in vitro và ex vitro. - Nghiên cứu về ảnh hưởng một số yếu tố vật lý của môi trường nuôi cấy mô như cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến sự tăng trưởng của tre tầm vông (Thyrsostachys siamensis), bạch đàn (Eucalyptus tereticornis), hông (Paulownia fortunei) trong cả hai giai đoạn in vitro và ex vitro. - Các thí nghiệm đã chứng minh các cây in vitro phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy không có đường và vitamin và độ thoáng khí của bình nuôi cấy cao. Tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn giảm đáng kể (2-0%), ngược với phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường có đường và vitamin tỷ lệ nhiễm lên tới 10% trên tổng số cây nuôi cấy ban đầu. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của khí khẩu ở mặt dưới lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khẩu luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra

Trang 42

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

vườn ươm. Tỷ lệ cây sống 95-100 % sau 1 tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không đường, trái lại chỉ từ 70-80% theo phương pháp truyền thống. - Việc kiểm soát các điều kiện vật lý của môi trường nuôi cấy giúp cho cây in vitro gia tăng sử dụng CO2 trong không khí, thay vì phụ thuộc vào nguồn carbon duy nhất là đường và các chất hữu cơ khác như vitamin trong môi trường nuôi cấy, vì vậy cây in vitro trong điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng có khả năng phát triển gần giống như cây ngoài tự nhiên. Việc giảm nồng độ hay loại bỏ hẳn đường và các vitamin sẽ góp phần giảm ô nhiễm cho môi trường xung quanh do tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn trong qúa trình nuôi cấy giảm. Đồng thời sử dụng phương pháp nuôi cấy mới này còn góp phần làm giảm lượng CO2 trong không khí nhờ sự gia tăng hoạt động của cơ quan quang hợp của cây in vitro trong quá trình nuôi cấy. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu qủa ứng dụng thực tiễn - Cây in vitro ít bị nhiễm nấm bệnh do môi trường nuôi cấy không đường và vitamin. - Tạo cây cấy mô (lõi thọ, hông, cây tre tầm vông, bạch đàn) có chất lượng cao, tăng trưởng nhanh do đó rút ngắn thời gian nuôi cấy in vitro, đồng thời tỷ lệ cây chết trong giai đoạn vườn ươm thấp dẫn đến việc giảm chi phí chăm sóc khi đưa cây ra vườn ươm. 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sỹ: 0 Tiến sỹ: đang hướng dẫn: 1 NCS 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đã công bố trên các tạp chí khoa học 1.

PS Sha Valli Khan, T Kozai, Nguyễn Thị Quỳnh, C Kubota, V Dhawan. 2003. Growth and water relations of Paulownia fortunei under photomixotrophic and photoautotrophic conditions. Biologia Plantarum. 46 (2):161-166.

2.

PS Sha Valli Khan, T Kozai, Nguyễn Thị Quỳnh, C Kubota, V Dhawan. 2002. Growth and net photosynthetic rates of Eucalyptus tereticornis Smith under photomixotrophic and various photoautotrophic micropropagation conditions. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 71: 141-146.

[2]. Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Kim Linh, Đoàn Thị Ái Thuyền, Thái Xuân Du. 2002. Effects of nutrient concentration and ventilation condition of the culture vessel on the growth of Paulownia (Paulownia fortunei) cultured in vitro. Advan. Nat. Sci. Vol.3 (3): 281-287. [3]. Nguyễn Thị Quỳnh, T Kozai. 2002. Environmental control in micropropagation: II. Effects of culture medium environment and biological features on the growth of in vitro plants. Advan. Nat. Sci., Vol.3 (1): 81-90. 5.2. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị Trang 43

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

[1]. Nguyễn Thị Quỳnh, T Kozai. 2002. Photoautotrphic micropropagation systems for woody plants. pp. 43A. Abtrs. of the 10 th International Association for Plant Tissue Culture & Biotechnology (IAPTC&B), June 23-28, 2002. Orlando, Florida, USA. [2]. PS Sha Valli Khan, T Kozai, Nguyễn Thị Quỳnh, C Kubota, D Vibha. 2002. Photoautotrophic micropropagaiton of potential Energy Crops Paulownia fortunei and Eucalyptus tereticornis. pp. 66A. Abtrs. of the 10 th International Association for Plant Tissue Culture & Biotechnology (IAPTC&B), June 23-28, 2002. Orlando, Florida, USA. [3]. Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Thảo, Trần Sỹ Tuệ, Nguyễn Thị Hằng. 2003. Ứng dụng phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng trong nhân giống in vitro một số cây nhiệt đới: tre tầm vông, lõi thọ, khoai mỡ và khoai lang. Proceedings của Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc lần thứ 2, tổ chức tại Hà Nội ngày 16-17/12/2003. Nhà XB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 953957. [4]. Nguyễn Thị Quỳnh, Phan Vũ Tiên, Trịnh Việt Nga. 2003. Nuôi cấy mô quang tự dưỡng cây lõi thọ (Gmelina arborea Roxb.). Proceedings của Hội nghị Toàn quốc lần thứ 2 “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống” do Bộ Khoa học và Công nghệ, HĐ Khoa học tự nhiên, Ngành Khoa học sự sống, tổ chức tại Huế ngày 25-26/7/2003. Nhà Xuất bản Khoa học Kỹ thuât Hà Nội, 394-397. 6. Đánh giá tình hình thực hiện đề tài nghiên cứu Được sự hỗ trợ về kinh phí của Bộ KHCN, đề tài đã chứng minh được khả năng tự dưỡng của cây nuôi cấy in vitro khi nguồn carbon vô cơ (CO2) được dùng thay thế nguồn carbon hữu cơ (đường, vitamin,v.v.) trên khả năng sinh trưởng của một số giống cây trồng. Đề tài được thực hiện theo đúng chương trình đề ra ban đầu. 7. Kiến nghị Hướng nghiên cứu này cần được tiếp tục hỗ trợ mạnh để xây dựng thành hướng công nghệ nuôi cấy mô hiện đại.

EFFECT OF ENVIRONMENTAL FACTORS ON THE GROWTH OF TROPICAL AND SUB-TROPICAL WOODY PLANTS CULTURED IN VITRO ABSTRACT Optimal conditions of the micro-environment were studied with the aim to enhance the photosynthetic ability of woody plants during the in vitro stage. Results of this study will be useful for producing in vitro plants at low cost in comparison with that of conventional micropropagation, leading to a micropropagation technology used for large scale production under semi-aseptic condition. Trang 44

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY KHÔNG ĐƯỜNG KẾT HỢP VỚI KỸ THUẬT TĂNG CƯỜNG CO2 VÀ O2 TRONG HỘP NUÔI CẤY LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA MỘT SỐ CÂY TRỒNG CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ CAO TRONG GIAI ĐOẠN IN VITRO VÀ EX VITRO Mã số đề tài: 62 13 05 Chủ nhiệm đề tài:

NGUYỄN THỊ QUỲNH

Cơ quan công tác:

Viện Sinh học nhiệt đới

Địa chỉ liên lạc:

1 Mạc Đĩnh Chi, Q. 1, Tp. Hồ Chí Minh

Điện thoại: 824 4905 / 897 8794 / 824 1401 Email: [email protected] Thành viên tham gia: - Th.S. Nguyễn My Uyên - CN. Huỳnh Hữu Đức - CN. Nguyễn Đình Sỹ - CN. Nguyễn Minh Tuấn 1. Mục đích, nội dung nghiên cứu Nghiên cứu so sánh ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy mô quang tự dưỡng (môi trường không đường và vitamin) khác nhau, bao gồm hệ thống trao đổi khí tự nhiên và hệ thống bơm khí trực tiếp, lên sự tăng trưởng và ra rễ của một số loài cây trồng như phong lan, tre, nho, dâu tây trong hai giai đoạn in vitro và ex vitro với phương pháp nuôi cấy mô truyền thống, nhằm tiến đến xây dựng một công nghệ vi nhân giống hiện đại trên quy mô sản xuất lớn bán vô trùng. 2. Kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đã đạt được − Nghiên cứu ảnh hưởng của việc tăng cường CO2 cho hộp nuôi cây, nồng độ đường, cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng và giá thể đến sự tăng trưởng của cây nho (Vitis vinifera L.) trong giai đoạn in vitro và ex vitro. − Nghiên cứu ảnh hưởng của việc tăng cường CO2 cho hộp nuôi cây, nồng độ đường, và điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trưởng của lan Dendrobium trong giai đoạn in vitro và ex vitro. − Nghiên cứu thiết kế hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp nhằm tăng cường CO2 và O2, sử dụng hộp nuôi cấy lớn chứa 50-100 cây. − So sánh ảnh hưởng của hai hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng trao đổi khí tự nhiên và bơm khí trực tiếp lên sự tăng trưởng của cây tre tầm vông (Thyrsostachys siamensis) trong giai đoạn in vitro và ex vitro. − Các thí nghiệm đã chứng minh cây phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy không có đường, không có vitamin, cùng với sự gia tăng độ thoáng khí của bình nuôi cây. Tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn giảm đáng kể (2-0%), ngược với phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường có đường và vitamin (tỷ lệ nhiễm lên tới 10% trên tổng số cây nuôi cấy ban đầu). Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của khí khẩu ở Trang 45

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

mặt dưới lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khẩu luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra bên ngoài. 3. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu qủa ứng dụng thực tiễn - Tạo cây cấy mô có chất lượng cao, rút ngắn thời gian nuôi cấy, tăng tỷ lệ sống ngoài vườn ươm. - Giảm công lao động trong khâu nuôi cấy in vitro, đồng thời giảm công chăm sóc khi đưa ra vườn ươm. 4. Kết quả đào tạo sau đại học Thạc sỹ: đang hướng dẫn: 1 Tiến sỹ: đang hướng dẫn: 1 5. Sản phẩm khoa học đã hoàn thành 5.1. Các công trình đã công bố trên các tạp chí khoa học [1]. Kozai T, Xiao Y, Nguyễn Thị Quỳnh, Zobayed SMA, Afreen-Zobayed F. 2005. Photoautotrophic (sugar-free medium) micropropagation systems for large-scale commercialization. Prop. of Ornam. Plants, 5(1): 23-34. 5.2. Các báo cáo khoa học tại các hội nghị [1]. Nguyễn Thị Quỳnh, Vũ Ngọc Phượng, Nguyễn Đình Sỹ, Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn My Uyên. 2005. Sự tăng trưởng của lan Dendrobium nuôi cấy quang tự dưỡng trong điều kiện ánh sáng tự nhiên. [2]. Bài này gửi đến Ban tổ chức Hội nghị tòan quốc 2005 “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống” do HĐ Khoa học tự nhiên, Ngành KHSS tổ chức tại Hà Nội ngày 3/11/2005 nhưng đã bị làm thất lạc và không được in trong Proceedings, nên sẽ công bố trong tạp chí chuyên ngành. 6. Đánh giá và đề nghị Đề tài đã được thực hiện đúng tiến độ theo như đề cương đã đề ra trong hai năm 2005-2006. Đề tài cần được đầu tư nghiên cứu nhiều hơn ở mức quốc gia để xây dựng thành công nghệ vi nhân giống hiện đại.

EFFECT OF SUGAR-FREE MEDIUM IN COMBINATION WITH CO2 AND O2 ENRICHMENT IN THE CULTURE BOX ON THE GROWTH OF SOME ECONOMICAL PLANTS DURING IN VITRO AND EX VITRO STAGES ABSTRACT Effect of photoautotrophic (sugar-free) micropropagation, including natural ventilation and forced ventilation systems, on the growth and root formation of Trang 46

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

orchids, bamboo, grapevines, and strawberry during in vitro and ex vitro stages has been studied in comparison with those of conventional micropropagation. The research aims at establishing a modern micropropagation technology for large scale production under semi-aseptic condition.

Trang 47

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

BIẾN ĐỘNG HÀM LƯỢNG AZADIRACHTIN VÀ NIMBIN TRONG LÁ NEEM (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS) VÀ HIỆU QUẢ XUA ĐUỔI, GÂY CHẾT VÀ BIẾN DẠNG CỦA DỊCH CHIẾT NHÂN HẠT NEEM ĐỐI VỚI RẦY NÂU (Nilaparvata lugens Stal.) Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN TIẾN THẮNG Cơ quan công tác: Viện Sinh học Nhiệt đới Địa chỉ liên lạc: 1 Mạc Đỉnh chi, Q1, tp.HCM Thành viên tham gia: - Vũ Văn Độ - Lê Thị Thanh Phượng - Bùi Văn Toàn 1. Đặt vấn đề Cây neem (Azadirachta indica A. Juss) thuộc họ xoan (Meliacea) có nguồn gốc từ Ấn Độ được du nhập vào Việt Nam từ khá lâu. Đến nay, neem đã được trồng tập trung ở Bình Thuận và Ninh Thuận cho thấy khả năng thích nghi cao của nó đối với vùng đất cát, khô hạn. Nhân hạt neem bước đầu đã được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc bảo vệ thực vật thử nghiệm. Hoạt chất azadirachtin và nimbin trong hạt và lá neem có tác dụng kháng khuẩn và xua đuổi côn trùng. Nội dung báo cáo liên quan đến khảo sát biến động hàm lượng azadirachtin và nimbin trong lá neem và hiệu quả xua đuổi, gây chết và biến dạng của dịch chiết nhân hạt neem đối với rầy nâu (4,6,8). 2. Nguyên liệu và phương pháp Nguyên liệu Lá neem tươi thu hái trực tiếp trên cây, cùng thời gian vào ngày 15 hàng tháng trong năm 2004 tại Trại Thạnh Lộc và Thủ Đức TP HCM và tại Ninh Phước, Ninh Thuận được xử lý đồng thời và phân tích ngay trong ngày. Rầy nây do Trung tâm nghiên cứu bảo vệ thực vật phía Nam (Tiền Giang) cung cấp. Lúa Tài Nguyên D14 do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam cung cấp. Chiết bột nhân hạt neem bằng ethanol, hexane và nước và tiến hành thử nghiệm so sánh với dầu neem. Phương pháp :Định lượng dẫn xuất azadirachtin và nimbin trong lá neem 20 g mẫu lá neem được nghiền thành dạng past, ngâm chiết với 200 ml methanol trong 2 giờ và lọc qua giấy lọc. Lặp lại 5 lần. Gom dịch lọc và loại bỏ chlorophyll bằng than hoạt tính và rửa thôi bằng methanol. Cô dịch thu được ở 50oC còn 10 ml và loại mỡ trong dịch cô bằng n-hexane. Dịch sau loại mỡ được lọc qua lọc 0,45 µm và đem phân tích HPLC trên cột Bondapak C18, 125 A, 10 µm, 3,9 x 300 mm với lượng mẫu bơm vào cột 5 µl, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, sử dụng dung môi thôi cột là acetonitril : H2O2 (55 : 45) với detector DAD ở λ = 220 nm. Trang 48

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

Đánh giá hiệu lực xua đuổi, gây chết và biến thái đối với rầy nâu của dịch chiết nhân hạt neem Đánh giá hiệu lực xua đuổi: thả 10 con rầy nâu cái đã bị bỏ đói 5 giờ vào giữa ống nhựa dài 7 cm, đường kính 12 cm nằm ngang nối 2 chậu lúa xử lý thuốc và không xử lý thuốc. Đếm số lượng rầy nâu bám trên lúa. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với 4 loại dịch thử nghiệm ở các nồng độ: 1,0 - 5,0 - 10,0 %. Hệ số xua đuổi tính theo Saxena (9). Đánh giá hiệu lực gây chết và biến dạng: thả 20 rầy nâu (7 ngày tuổi và trưởng thành) vào mỗi lồng có sẵn chậu lúa đã xử lý các dịch thử nghiệm theo dãy nồng độ từ 0,2 -3,0%. Đếm số lượng rầy bị chết. Tiếp tục nuôi số rầy còn sống để ghi nhận sự phát triển và biến dạng của rầy trưởng thành. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với 4 loại dịch thử nghiệm ở các nồng độ: 0,2 - 0,5 -1,0 2,0 - 3,0 %. Tính tỷ lệ chết của rầy nâu theo từng nghiệm thức, từ đó tính giá trị LD50 của các dịch thử nghiệm bằng phương pháp phân tích Probit thao tác trên phần mềm Excel. Các số liệu được phân tích Anova và xếp hạng các nghiệm thức theo trắc nghiệm Duncan thao tác trên phần mềm Statgraphic 7.0 (1). 3. Kết quả và thào luận

Hình 2. Một số kiểu biến dạng rầy nâu do ảnh hưởng của dịch chiết nhân hạt neem Kết quả quan sát cho thấy ở các nghiệm thức xử lý neem, một số rầy trưởng thành bị biến dạng, trong đó nhiều nhất ở nghiệm thức neem- hexane (31,5%) và ít nhất ở nghiệm thức neem- nước (21,6%). Nghiệm thức neem- ethanol và dầu neem Ấn Độ có tỉ lệ rầy biến dạng tương đương nhau (tương ứng là 29,5 và 29,3%). Tác động gây biến dạng của các hoạt chất từ neem đã được báo cáo ở nhiều loài côn trùng như châu chấu Schistocerca gregaria, gián Blattella germanica, muỗi Aedes aegypti…(5,10). 1. Có sự dao động khá lớn hàm lượng dẫn xuất azadirachtin và nim bin trong lá neem trồng tại Việt Nam phụ thuộc mùa và thời gian trong năm, vào mùa khô hạn cao hơn so với vào mùa mưa. Hàm lượng dẫn xuất azadirachtin cao hơn so với hàm lượng nimbin và lá neem ở Ninh Thuận có hàm lượng dẫn xuất azadirachtin cao nhất. 2. Dịch chiết nhân hạt neem có khả năng xua đuổi, gây chết và làm biến dạng rầy nâu trưởng thành. Trong đó hiệu lực xua đuổi của dịch chiết neem - hexane và dầu

Trang 49

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

neem là mạnh nhất, kế đến là dịch neem - ethanol với các hệ số xua đuổi tương ứng là 0,0 ; 3,3 và 6,7 % (ở nồng độ 10%) và 16,7; 16,7 và 20,0 % (ở nồng độ 5%). Dịch chiết neem - ethanol có hiệu lực gây chết mạnh nhất (LC50 = 1,21%), dịch chiết neemnước có hiệu lực gây chết yếu nhất (LC50 = 5,67%). Dịch chiết neem - hexane gây biến dạng nhiều nhất (31,5%), dịch chiết neem - nước gây biến dạng ít nhất (21,6%).

INVESTIGATION THE DERIVATIVE AZADIRACHTIN AND NIMBIN IN LEAVES OF NEEM TREE (AZADIRACHTA INDICA A. JUSS), AND REPELLENT, INSECTICIDAL AND DEFORMING EFFECTS OF NEEM SEED KERNEL EXTRACTS ON BROWN PLANT HOPPER (NILAPARVATA LUGENS STAL.) ABSTRACT Investigation the derivative azadirachtin and nimbin contents in leaves of neem tree (Azadirachta indica A. Juss) planted at Ninh thuan province, Thu Duc District and Thanh Loc ( District 12) acording to the season and time of the year. The results showed that the leaves of the neem tree at Ninh Thuan had highest content of derivative azadirachtin, the lowest one was at Thu Duc district. There were large variety about derivative azadirachtin and nimbin in neem leaves acording to the season and months in the year. The derivative azadirachtin varied from 18.8 ppm to 348.87 ppm at Ninh Thuan, from 5.04 ppm to 50.05 ppm at Thu Duc District, and from 20.87 ppm to 205.03 ppm at Thanh Loc. Neem seed kernel extracts, viz., ethanolic, aqueous, hexane extracts and neem oil were screened as the repellent, insecticidal and deformating agents to Brown Plant Hopper (BPH) (Nilaparvata lugens Stal.). It was showed that at concentration of 10%, the hexane extract, neem oil and ethanolic extract indicated strongest repellent effect on BPH adults, with repellent index respectively 0.0; 3,3 and 6.7 %. The ethanolic extract had the highest toxicity against seven-day old and adult BPH with the LC50 being 1.21 and 4.68 %, respectively. 1% ethanolic extract was found to cause the trongest malformation to BPH with 13.8 % of deformed adults.

Trang 50

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ PHÔI SOMA TRONG CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ PHÁT TRIỂN CÂY THÔNG ĐỎ (TAXUS WALLICHIANA ZUCC) ĐANG BỊ TUYỆT DIỆT Mã số đề tài: 62-09-05 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. TRẦN VĂN MINH Cơ quan công tác: Viện Sinh học Nhiệt đới. Tp.HCM Địa chỉ liên lạc: 01 Mac Đỉnh Chi, Q.1, TP Hồ Chí Minh Điện thọai: 1. Mục đích và nội dung nghiên cứu 1.1. Mục đích Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy phôi soma trong bảo tồn và phát triển cây thông đỏ 1.2. Nội dung nghiên cứu - Tái sinh cây thông đỏ in vitro nhằm mục tiêu bảo tồn - Nghiên cứu quá trình phát sinh phôi soma in vitro nhằm mục tiêu phát triển 2. Kết quả nghiên cứu của đề tài Thời gian thực hiện đề tài trong 2 năm (2005-2006). Trong báo cáo này chúng tôi báo cáo nội dung (1) trong toàn tiến trình thực hiện đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy tái sinh cây thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc) in vitro 2.1. Vật liệu - Mẫu nuôi cấy: cây thông đỏ đầu dòng được giâm cành trong bầu đất với nhiều độ tuổi khác nhau (Trung tâm Nghiên cứu Lâm sinh ĐàLạt thu thập ở vùng núi Liang Biang, Lâm Đồng). - Điều kiện nuôi cấy: môi trường được vô trùng ở 121oC, 1at, trong 25 phút. Nhiệt độ phòng nuôi cấy 28+1oC. Cường độ chiếu sáng 34,2µmol/m2/s. Thời gian chiếu sáng 8giờ/ngày - Môi trường nuôi cấy: môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản MS (Murashige-Skoog, 1962), WPM (Lloyd & McCown, 1981), WV3 (Coke, 1996), được bổ sung BA (6-benzylaminopurine), kinetin (6-fufurylaminopurine), IBA (β-indol butyric acid), NAA (α-naphthalen acetic acid). Chất chống hóa nâu: than hoạt tính, PVP, AgNO3. 2.2. Phương pháp Thí nghiệm được bố trí theo RCBD, 4 lần lặp lại, 5 bình tam giác cho một lần lặp lại, mỗi bình cấy 5 mẫu. Số liệu được phân tích bằng phần mềm thống kê MSTSC. 2.3. Kết quả và thảo luận - Vô trùng mẫu nuôi cấy: mẫu nuôi cấy được lấy từ cây mẹ bầu đất 18 tháng tuổi. Chồi đỉnh và chồi bên được sử dụng làm mẫu nuôi cấy. Chồi non được vô trùng Trang 51

Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN

bằng hypochlorite Natri (10%) trong 15 phút. Chồi non vô trùng được đưa vào nuôi cấy in vitro - Ảnh hưởng của môi trường khoáng cơ bản đến nuôi cấy tái sinh chồi thông đỏ in vitro: chồi no được nuôi cấy trên môi trường khoáng cơ bản MS, WPM, WV3 có bổ sung BA (5mg/l). Môi trường MS tỏ ra thích hợp - Ảnh hưởng của chất chống hóa nâu đến nuôi cấy tái sinh chồi thông đỏ in vitro: cây thông đỏ thường tiết ra nhựa đỏ trên vết thương. Sau khi nuôi cấy hồi non 2 ngày thì thấy xuất hiện nhựa đỏ tiết ra vào môi trường làm hạn chế khả năng tái sinh chồi. Trên môi trường MS + BA(5mg/l) có bổ sung than hoạt tính, PVP hay AgNO3. Kết quả nghiên cứu cho thấy than hoạt tính (1000mg/l), PVP (150mg/l) và AgNO3 (150mg/l) đã hạn chế rõ rệt sự tiết nhựa vào môi trường nuôi cấy. Trong đó AgNO3 tỏ ra hiệu quả hơn - Ảnh hưởng của sinh lý mẫu nuôi cấy đến tái sinh chồi thông đỏ in vitro: sinh lý mẫu nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tái sinh chồi bên và chồi bất định in vitro. Có nhiều loạ mẫu được đưa vào nuôi cấy: (1) ngọn chính + đốt 1, (2) thân chình + đốt 2, (3) thân chính + đốt 3, (4) ngọn cành + đốt 1, (5) thân cành + đốt 2, (6) thân cành + đốt 3. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS + BA(5mg/l) + AgNO3(150mg/l). Kết quả cho thấy mẫu (1) và (2) có số chồi / mẫu cao hơn cả 1,5 và 3 - Ảnh hưởng của tuổi mẫu nuôi cấy đến tái sinh chồi thông đỏ in vitro: tuổi mẫu nuôi cấy có vai trò quan trọng, mẫu phải non, và đủ độ tuổi chín sinh lý, sẽ cho phát sinh chồi cao. Mẫu nuôi cấy có tuổi sinh lý 12-15-18 tháng tuổi, được nuôi cấy trên môi trường MS + BA(5mg/l) + AgNO3(150mg/l). Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ chồi tái sinh cao nhất với tuổi mẫu 18 tháng, phát sinh số chồi / mẫu nuôi cấy cao (3,1 chồi) - Ảnh hưởng của BA đến tái sinh chồi thông đỏ in vitro: môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản có bổ sung BA(0,5-2,5-5-10-15mg/l) + AgNO3(150mg/l). Kết quả nghiên cứu cho thấy BA(5mg/l) thích hợp cho nuôi cấy tái sinh chồi - Ảnh hưởng của BA và Kinetin đến tái sinh chồi thông đỏ in vitro: nhằm nâng cao khả năng nuôi cấy tái sinh chồi, tổ hợp BA(5mg/l) + Kinetin(0,1-0,5-1-2,5-5mg/l) + AgNO3(150mg/l) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS. Kết quả cho thấy, tổ hợp MS + BA(5mg/l) + K(1mg/l) + AgNO3(150mg/l) thích hợp cho nuôi cấy tái sinh chồi, cho số chồi / mẫu nuôi cấy nhiều (3,1 chồi) - Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy đến tỷ lệ ngã nghiêng chồi thông đỏ in vitro: cây thông đỏ có đặc tính khi giâm cành bên ngoài vườn ươm thường có tỷ lệ cây ngã nghiêng cao. Môi trường nuôi cấy tái sinh chồi: MS + BA(5mg/l) + K(1mg/l) + AgNO3(150mg/l). Mẫu nuôi cấy: (1) đỉnh thẳng đứng (2) thân thẳng đứng (3) đỉnh cành (4) thân cành. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ ngã nghiêng cao khi mẫu nuôi cấy là (3) và (4) so với độ thẳng đứng của trục tung (0o) là >45o, mẩu (1) và (2) có tỷ lệ ngã nghiêng <45o. Mẫu nuôi cấy thích hợp cho tái sinh chồi in vitro là (1) đỉnh thẳng đứng và (2) thân thẳng đứng - Ảnh hưởng của tính bảo lưu cục bộ đến sinh trưởng chồi thông đỏ in vitro: trong giâm cành, với mẫu là cành (nhánh) bên, thường cho cây ngã nghiêng. Nghiên cứu tính bảo lưu cục bộ in vitro cho thấy: trên môi trường nuôi cấy MS + BA(5mg/l) + Trang 52

Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía Nam năm 2005

AgNO3(150mg/l), với mẫu nuôi cấy (1) đỉnh cành (2) thân cành, cho kết quả: góc nghiêng so với trục tung (0o), mẫu nuôi cấy (1) có tỷ lệ ngã nghiêng thấp nhất - Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thông khí và ánh sáng đến sinh trưởng chồi thông đỏ in vitro: trên môi trường nuôi cấy MS + BA(5mg/l) + AgNO3(150mg/l), mẫu nuôi cấy là thân chính + đốt 2, bình tam giác được đậy kín bằng nắp giấy và nắp cao su, trong điều kiện chiếu sáng 11,4-22,8-34,2µmol/m2/s. Kết quả cho thấy trong điều kiện chiếu sáng 11,4-22,8µmol/m2/s và đậy bằng nắp giấy cho phát sinh chồi / mẫu cao (2,8 chồi) - Nhân nhanh cây thông đỏ in vitro: chồi non phát sinh trong nuôi cấy được sử dụng làm protocol cho quá trình vi nhân giống. Trên môi trường cơ bản MS có bổ sung BA v à K. Kết quả cho thấy môi trường nhân nhanh hiệu quả là MS + BA(5mg/l) + K(1mg/l) cho phát sinh chồi / cụm cao (3,4 chồi). Cây thông đỏ in vitro có tính ưu thế ngọn mạnh mẽ, nuôi cấy đốt thân cho phát sinh chồi bên, nuôi cấy chồi ngọn chỉ cho vươn thân chồi - Nuôi cấy phát sinh rễ chồi thông đỏ in vitro: cây con thông đỏ phát sinh rễ in vitro trên môi trường nuôi cấy WPM + NAA(3mg/l) + Rhizopon(50mg/l) sau 75 ngày nuôi cấy. 2.4. Kết luận Cây thông đỏ được nghiên cứu tái sinh và nhân nhanh in vitro nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý hiếm đang bị tuyệt diệt 3. Kết quả đã và đang ứng dụng vào thực tiễn - Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tái sinh đỉnh sinh trưởng in vitro nhằm bảo tồn số lượng cây thông đỏ còn sót lại trên Lâm Đồng - Cây thông đỏ in vitro là nguồn nguyên liệu cho dòng hóa tế bào phôi soma trong công nghệ vi nhân giống và dòng hóa tế bào trong nuôi cấy chiết xuất taxol 4. Kết quả đào tạo sau đại học Cao học: 01 (bảo vệ 12/2005) Nghiên cứu sinh: 01 (2006-2009) 5. Sản phẩm khoa học -

01 bài báo trong tạp chí KH&KT Nông Lâm nghiệp 01 bài báo trong tạp chí KH&CN 02 bài báo trong Hội nghị NCCB 2006

Trang 53