Guia De Practicas Andina Auto Guard Ado)

UNIVERSIDAD ANDINA DEL CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD GUÍA DE

PRÁCTICAS DE

BIOLOGÍA GENERAL Y DE LA BOCA

Blgo JOSÉ F. FRANCO NAVIA

CUSCO

SEMESTRE - 2009-I I PERÚ

INDICE

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PROLOGO INFORMACIÓN GENERAL NORMAS DE LABORATORIO Y BIOSEGURIDAD INSTRUMENTOS Y APARATOS DE LABORATORIO MICROSCOPIA ÓPTICA EL AGUA Y MEDIDA DEL pH CARBOHIDRATOS Y LÍPIDOS PROTEÍNAS Y ENZIMAS ÁCIDOS NUCLEICOS CÉLULA PROCARIOTICA Y EUCARIOTICA CICLO CELULAR Y DIVISIÓN MITÓTICA DIVISIÓN MEIOTICA ESPERMATOGENESIS. HERENCIA MENDELIANA (FACTOR Y GRUPO SANGUÍNEO) EXPERIMENTOS CON LA MOSCA DE LA FRUTA CROMATINA SEXUAL Y CARIOTIPO

PROLOGO La presente guía de prácticas de Biología, está destinado a los estudiantes de Ciencias de la Salud y es la segunda edición mejorada y corregida, que alberga temas fundamentales y básicos de la asignatura, vinculando los tópicos experimentales con la formación profesional de los alumnos, por lo que se resaltan las aplicaciones clínicas que corresponde, pese a que estos son temas tróncales. La Biología es la asignatura teórica fundamental sobre la que se basa las ciencias médicas (Ciencias de la salud), puesto que no se debe al azar, el que numerosos progresos alcanzados por los laboratorios de biología tengan repercusiones y trasciendan, en la medicina clínica, como es el caso de la estomatología. Para los profesionales y estudiantes de Ciencias de la salud, la biología no debe considerarse como una asignatura secundaria, pues la medicina en general es una parte de la Biología. Por estas razones, esta guía de prácticas del curso de “Biología general y de la boca”, intenta teniendo en cuenta los fines didácticos, presentar una secuencia de trabajos y demostraciones experimentales de la asignatura basándose en el syllabus vigente de la asignatura teórica y tomando como base la experiencia ganada con los alumnos de ciclos pasados, lo que nos permite enfocar de acuerdo a la realidad académica de la Universidad Andina. No es fácil amoldar en forma justa y perfecta todos los tópicos considerados en el curso teórico, por motivos de espacio, tiempo y otras limitaciones que esperamos superar gradualmente en el futuro. Gran parte de los experimentos, que proponemos, han sido estandarizados y estudiados por el autor por medio de numerosos trabajos de investigación en los cuales se utilizo como modelos experimentales, representantes de la flora y fauna regional, lo que consideramos una ventaja para el aprendizaje de esta fascinante disciplina.

José F. Franco Navia BIÓLOGO

INFORMACIÓN GENERAL Las practicas de la asignatura de Biología general y de la Boca, están Programadas como complemento de la asignatura teórica impartida en la curricular básica de la carrera profesional de estomatología. El laboratorio es curso experimental diseñado para la mencionada carrera el mismo que introduce a las técnicas básicas de manejo de equipo de laboratorio y material biológico; además, motiva al estudiante a la observación y a la búsqueda de respuestas a través del método científico. El laboratorio de Biología General y de la Boca es complemento del curso de teoría; por consiguiente es obligatorio que el estudiante desarrolle ambos en forma paralela. Las prácticas están conformadas por 14 experimentos secuenciales correlacionados en orden didáctico que tienen como objetivos servir de complemento a los diferentes capítulos teóricos. En términos generales el peso de las prácticas constituirán un 25% que Será complementado con los 75% de la teoría, para la evaluación se tomara en cuenta los siguientes aspectos: a). b). c). d).

Exámenes prácticos: Informes de Practicas: Asistencia Seminario de Practica

02 Parciales 14 Informes Obligatoria Opcional

La nota final será el promedio de todas las evaluaciones, siendo la nota aprobatoria mínima de 14 puntos y la máxima de 20 puntos. Los informes de cada práctica se entregaran en un cuaderno anillado Desarrollado íntegramente a mano alzada, no se aceptaran trabajos en Computadora. Asistencia obligatoria con mandil blanco y materiales requeridos.

Seminarios y trabajos grupales son opcionales

BIOSEGURIDAD Y MATERIALES E INSTRUMENTOS DE LABORATORIO

I Sesión de Laboratorio

A.- NORMAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA

INGRESO AL LABORATORIO: * Los alumnos (as) deben esperar fuera del laboratorio hasta que llegue el maestro o instructor (a). Una vez dentro del laboratorio los alumnos deberán solicitar permiso al instructor (a) para salir de este. * Si el maestro o instructore, no se presentan al laboratorio, las prácticas no podrán realizarse. Es responsabilidad de los técnicos administrativos (as) que los alumnos permanezcan fuera del laboratorio hasta la llegada del instructor, así como la de comunicar al Departamento, por escrito la razón de la suspensión de prácticas. * Una vez que el instructor ingrese al laboratorio se cerrarán las puertas y no se permitirá el acceso de alumnos. * Al inicio del curso el alumno (a) deberá aportar el material que le sea solicitado. El material requerido, de acuerdo a la práctica. * Los alumnos (as) que no aporten el material que les sea solicitado para alguna de las prácticas no podrán entrar al laboratorio. * Si faltan más del 50% de alumnos de un grupo, no se realizara la práctica, por lo que el profesor dara por dictada la practica y sancionara a los alumnos, si no justifican su actitud MEDIDAS DE SEGURIDAD: *Los alumnos (as) deben usar mandil BLANCO, LARGO y LIMPIO para entrar al laboratorio. Deben ponerse la bata en la zona designada para ello. * Los alumnos (as) no deberán comer, beber, masticar chicle, fumar y en general llevarse objetos a la boca dentro del laboratorio. Así como tampoco deberán usar teléfonos inalámbricos dentro del laboratorio. *El aseo del laboratorio es de primordial importancia, por lo que los alumnos (as) deberán cooperar en el mantenimiento de la limpieza de su mesa de trabajo y del material que así lo requiera. Deberán limpiar con solución desinfectante (fenol, benzal, presep, etc.) el área de trabajo ANTES de empezar y al TERMINAR la práctica. * La basura debe colocarse en los recipientes correspondientes. No deberá ser guardada en cajones y/o vertederos. Así como no deberán tirarse residuos o desperdicios a los lavabos. Deposite los residuos peligrosos biológico-infecciosos generados durante la práctica en los recipientes adecuados y en las áreas designadas al inicio del curso en cumplimiento con la normatividad vigente. Todo el material no contaminante como algodón, pipetas, envolturas, etc. deberá ser depositado en los recipientes destinados para este .

* Los alumnos (as) deberán abstenerse de colocar sobre las mesas de trabajo cualquier material que no sea el requerido para la realización de la práctica (por ejemplo: ropa, bolsas de mano, libros, etc,) Todos los objetos personales deberán ser guardados en las áreas designadas. * En caso de romper o derramar material contaminado AVISE al personal técnico o al instructor . * Los alumnos (as) no podrán permanecer dentro del laboratorio después de que el instructor haya salido. * Los alumnos (as) deben lavarse las manos con agua y jabón al finalizar cada práctica (y/o antes de salir del laboratorio). EXAMEN PREVIO: * Los alumnos (as) deben presentarse al laboratorio adecuadamente preparados. Esto incluye con la práctica a realizarse impresa en papel, para lo cual deberán consultar con anterioridad la guía de practicas, preparándose en el fundamento teórico existente. * El alumno (a) debe leer con detenimiento la técnica a seguir, en caso de existir dudas consultar con el instructor ANTES de iniciar la práctica. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA: *Los alumnos (as) deben mantener el orden dentro de los laboratorios. Al inicio de cada práctica se designará un alumno (a) como responsable de seguridad para verificar que se cumplan las normas de este reglamento. *El profesor y alumnos deben planear su trabajo de manera que la práctica se complete puntualmente, y puedan salir del laboratorio 10 minutos antes de la próxima clase o práctica, previendo el tiempo que utilizarán para recoger, ordenar el material y limpiar su mesa. *No se permite el desarrollo de actividades diferentes a la práctica durante la estancia en el laboratorio, esto incluye estudiar otras materias o realizar trabajos. *No se permiten visitas personales por parte de los alumnos (as). AL FINALIZAR LA PRÁCTICA: *Los alumnos (as) deberán enjuagar el equipo utilizado y disponer de los residuos generados de la manera apropiada. *Los alumnos (as) deberán colocar el material utilizado en la zona designada para recolección de equipo.. REPORTES DE PRÁCTICA DE LABORATORIO: *El reporte de la práctica deberá ser entregado en la siguiente semana de su realización.

*El reporte deberá ser entregado antes del inicio de la siguiente práctica. El alumno (a) tiene la obligación de colocarlo en el fólder designado para ello. Dicho fólder será cerrado antes de iniciar la siguiente práctica. *El profesor (a) anotará en el formato correspondiente la constancia de la recepción del reporte. Es responsabilidad del alumno (a) revisar dicha constancia en cada uno de sus reportes. Por ningún motivo se recibirán reportes extemporáneos *El reporte de prácticas se considera como un trabajo original generado por cada alumno (a). El contenido de la práctica deberá ser redactado íntegramente por el alumno, cuando se utilicen citas textuales, deberá indicarse la fuente.

ESTRUCTURA DEL INFORME DE PRACTICAS: Los informes de practicas se desarrollaran íntegramente a mano alzada, no se aceptara Trabajos digitados en computadora, todas las graficas y dibujos se desarrollara en el acto Y se concluirá en la casa. Toda practica deberá contener la siguiente secuencia: Introducción, Objetivos, Hipótesis , Materiales y Métodos, Resultados Conclusiones y Bibliografía consultada. El informe se entregara a la siguiente práctica siendo esta Personal. SANCIONES: El incumplimiento a estas normas será sancionado por el profesor o instructor (a). La falta a tres practicas consecutivas por el alumno(a),inhabilitan automáticamente al alumno y por lo tanto no tiene derecho a continuar en la asignatura, caso especial justificación autorizada por el docente de teoría, previa evaluación .

B) .- INSTRUMENTOS DE LABORATORIO I. OBJETIVOS • Identificar los materiales y equipos de laboratorio estableciendo las diferencias que existen entre ellas. • Conocer la importancia y uso que estos tienen en la investigación

II. FUNDAMENTO La biología al estudiar la vida y las leyes que la rigen se desarrolla y amplia por el esfuerzo constante del hombre por conocerse a si mismo y al medio que lo rodea por lo cual ha sido indispensable auxiliarse de materiales y equipos que permitan disponer de un laboratorio adecuadamente implementado, sin el cual hubiera sido imposible llegar a identificar elementos orgánicos; conocer la morfología, estructura y fisiología de la materia viva así como la estructura celular y los componentes químicos que lo conforman. ALGUNOS MATERIALES DE LABORATORIO Materiales de Vidrio Tubo de Ensayo: Se utiliza para mezclar sustancias, calentar, y ejecutar reacciones. Beaker: Se usan para preparar, disolver o calentar directamente sobre rejillas o planchas de calentamiento. Kitazato: Es un matraz de pared gruesa con un una conexión lateral, mediante una manguera que conecta a una trompa de vació y su función es filtra sustancias pastosas y sólidos de tamaño pequeño de partícula. Matraz de fondo plano: Se utiliza para calentar liquido. Matraz de fondo redondo: Se utiliza para poner volúmenes exactos de solucion. Embudo de decantación: Se utiliza para la separación de líquidos miscible e inmiscible para extraer él liquido menos denso separando del menos denso. Vidrio de Reloj: Se utiliza para cubrir recipientes, pesar, transferir sólidos, evaporar líquidos a temperatura ambiente. Matraz Aforado: Sirve para preparar volúmenes exactos de concentraciones. Bureta: Son tubos de vidrios calibrados que suelen terminar en una llave y sirven para medir volúmenes de líquidos con mayor preescisión y exactitud. Caja de Petri. En ella se cultivan microorganismos, como hongos o bacterias; también puede usarse para seleccionar muestras de animales. Frasco gotero. Con él se dosifican líquidos, como colorantes. Frasco de boca y tapón esmerilados. Se usa para conservar y almacenar sustancias. Portaobjetos. Son laminillas de cristal que pueden ser cóncavas, en ellas se depositan sustancias para su observación. Cubreobjetos. Cubren y protegen las preparaciones u objetos que se observarán al microscopio e impiden que se desprendan o muevan al ser observados. Mechero de alcohol. Se emplea como fuente de calor cuando se requiere calentamiento lento. Al usarla debe cuidarse que la mecha esté limpia y recortada para que el calor que proporcione sea adecuado. Mechero de gas o de Bunsen. Se emplea para el calentamiento rápido de sustancias. Balanza. Con ella se conoce el peso de objetos.

Microscopio. Hace visibles al ojo humano objetos diminutos. Es de suma importancia en un laboratorio. Con él se han hecho avances notables en medicina, química, biología, etc. Agitador de vidrio. Están hechos de varilla de vidrio y se utilizan para agitar o mover sustancias, es decir, facilitan la homogenización Baño María. Es un dispositivo que permite calentar sustancias en forma indirecta, es decir, sustancias que no pueden ser expuestos a fuego directo. Vasos de precipitados. Permite calentar sustancias y obtener precipitados de ellas. Pipetas. Este material existe en dos presentaciones: a. Pipetas aforadas. b. Pipetas volumétricas. Las primeras permiten medir diversos volúmenes según la capacidad de esta, las segundas no están graduadas y sólo permiten medir un volumen único. Probeta. Este material permite medir volúmenes las hay de vidrio y de plástico y de diferentes capacidades. Piceta. Es un recipiente que se utiliza para contener agua destilada, este utensilio facilita la limpieza de electrodos . Materiales de porcelana Cápsula de porcelana: Sirve para calentar y evaporar líquidos, fundir cristalizar sólidos. Crisol: Sirve para calcinar sustancias, fundir sólidos. . Mortero: Sirve para triturar, pulverizar y mezclar sólidos. . Espátula: Sirve para trasegar sólidos y tomar nuestras de sólidos. Materiales de metal Soporte universal: Pieza básica en el montaje de los sistemas y aparatos como pinzas y anillos de metal. Rejilla de Metal con Centro de Asbesto: Sirve para calentar indirectamente ya que la llama del mechero se concentra en el anillo. Trípode: Soporte de vaso de precipitado, matraces, etc. Pinza para tubo de ensayo: Se utiliza para sujetar tubos de ensayos calientes. Gradilla: Se utiliza para colocar los tubos de ensayo. Soporte para Embudo: Sirve para la fijación de instrumentos de vidrio 2.2 Algunas reglas a observar en el trabajo y laboratorio de biología RECOMENDACIONES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO a. Orden Al momento de iniciar el trabajo disponer todo en forma ordenada para evitar confusión y perdida de tiempo. Cuando es necesario, se etiqueta el material. Devolverlo a su lugar correspondiente después de haberlo usado; dejar en orden y limpio la mesa de trabajo. b. Limpieza En todo momento el trabajo del trabajo es necesario mantener la limpieza, al final del trabajo de la jornada debe limpiarse todo lo ensuciado, lavarlo convenientemente cuando sea necesario. Tal vez en ciertas ocasiones sea preciso la esterilización . Evite que en el lavadero se depositen desechos sólidos que puedan obstruirlos.

c. Cuidado con los instrumentos y aparatos La mayoría de los instrumentos, aparatos y cualquier tipo de material de laboratorio son muy costosos y por ello es necesario un especial cuidad en su manejo y conservación.

ALGUNOS INSTRUMENTOS DE LABORATORIO

MICROSCOPIA ÓPTICA II Sesión de Laboratorio

MICROSCOPIA ÓPTICA OBJETIVOS: Al finalizar la práctica el estudiante conocerá: a) El manejo adecuado del microscopio óptico, observará laminillas e identificará diferentes tipos de muestras biológicas. b) Estará en capacidad de ejecutar correctamente la limpieza del microscopio óptico FUNDAMENTO: El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño, siendo el instrumento más utilizado en los laboratorios donde se estudian microorganismos. Si bien las lentes de aumento han sido conocidas desde muy temprano en la historia, sólo se le utilizó en biología con el advenimiento del microscopio de luz moderno. Desde su invención, el microscopio ha sido una herramienta valiosa en el desarrollo de la teoría científica. En general, un microscopio está compuesto de dos elementos, los cuales constituyen un sistema similar a un telescopio: a) lentes primarias amplificadoras y b) lentes secundarias. Estos sistemas se denominan objetivo y ocular, respectivamente, y están montados en los extremos opuestos de un tubo cerrado, de forma que el primero se encuentra en el punto focal del segundo. Entonces, la luz que pasa por un objeto es focalizada por ambos sistemas de lentes, de manera que cuando se mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real (Figura 1). Actualmente existen muchos tipos de microscopios, entre los que se cuentan el microscopio óptico, el electrónico, el de sonda de barrido y el láser. No obstante, el microscopio más utilizado es el óptico, el cual se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. EL MICROSCOPIO ÓPTICO

Los microscopios ópticos pueden clasificarse en simples y complejos, diferenciándose en su capacidad amplificadora y en la complejidad del sistema de lentes asociado. La principal ventaja de un microscopio óptico es que permite observar organismos vivos y tejidos. Su principal desventaja, es que su potencia amplificadora está limitada por la longitud de onda de la luz visible. MICROSCOPIO SIMPLE: El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble, cuya distancia focal es corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. También se les denomina microscopios de bajo poder. Existen al menos dos tipos de microscopios de bajo poder: monoculares y binoculares (Figura 2). Los microscopios monoculares tienen muy bajo poder amplificador, siendo utilizado esencialmente por niños. Los microscopios binoculares, estéreo microscopios o lupas, en cambio, proveen un aumento mayor. Se

caracterizan, porque presentan dos objetivos, de modo que el objeto se puede ver en forma estereoscópica o tridimensional. MICROSCOPIO COMPUESTO: Los microscopios complejos disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores,pudiendo inclusive aumentar un objeto más de 2.000 veces. Estos microscopios son, en general, los más utilizados. En este caso, el objetivo está compuesto de varias lentes que crean una imagen real Aumentada del objeto examinado. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. III. COMPONENTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO BINOCULAR Como se observa, un microscopio óptico binocular consta de: base, pedestal, cabeza. En la base se ubica la fuente de luz. En el pedestal se ubican macro y micrométrico y la platina; sobre la platina se ubican las pinzas, y el foco coaxial, mientras que bajo ésta se ubica el diafragma. En la parte superior del pedestal se ubica el revólver, pieza que porta los objetivos. En la cabeza se ubican los oculares y el sistema regulador de la distancia focal. �Base: Corresponde a la parte inferior del instrumento, utilizada como soporte. � Pedestal o brazo: pieza que soporta al tubo que contiene el sistema de lentes y que le conecta con la base. � Cabeza: pieza, generalmente móvil, sobre la que se ubican los oculares y el sistema regulador de la distancia focal. � Fuente de luz: corresponde a una ampolleta u otra fuente luz activada por corriente o pila. Antiguamente se utilizaba un espejo que concentraba la luz ambiental. � Macrométrico: tornillo que permite el ajuste grosero de la muestra a observar. Se complementa con el uso del micrométrico. � Micrométrico: tornillo que permite un ajuste fino de la muestra a observar. � Platina: pieza dispuesta horizontalmente y sobre la cual se ubican las pinzas y el foco coaxial. Platina, pinzas y foco coaxial permiten ubicar una muestra para ser observada. La muestra debe estar dispuesta sobre un portaobjeto y protegida por un cubreobjeto). Bajo la platina se encuentran el diafragma y el filtro. � Pinzas: Piezas prensiles que permiten sujetar la muestra, contenida en un portaobjeto, contra la platina. �Foco coaxial: Sistema compuesto por dos ejes de desplazamiento horizontal, los cuales, dispuestos perpendicularmente entre sí, permiten ajustar una muestra para ser observada al microscopio. Un eje desplaza la muestra en sentido lateral (izquierda - derecha del observador) y el otro en sentido frontal (alejando - acercando la muestra del observador). Ambos movimientos se realizan en el plano que define la platina. � Diafragma: Sistema que controla la cantidad de luz que llega al objeto. El diafragma permite controlar intensidad de luz y el tamaño del cono de luz proyectado sobre la muestra. � Condensador: Conjunto de lentes que focalizan la luz sobre la muestra. La lentes condensadoras más útiles poseen poderes superiores a los 400x y más. El uso de condensador permite mejorar la observación de la muestra. Cuando está presente en el instrumento, el condensador se ubica

generalmente bajo la platina . � Filtro: Algunos microscopios portan filtros o un sistema de éstos, los que corresponden a lentes de distinto color que permiten enfatizar la observación de determinadas partes de la muestra, generalmente destacadas con tinciones. � Revólver: Mecanismo giratorio sobre el cual se disponen los objetivos. El revólver permite cambiar el aumento con que se observa una muestra determinada. Un revólver generalmente porta cuatro objetivos: 4x, 10x, 40x y un objetivo de inmersión (100x). � Objetivos: Conjunto de lentes responsables de aumentar y resolver (distinguir las distintas partes) de la muestra a observar. � Objetivo de inmersión: El objetivo de inmersión permite lograr una mejor resolución en un microscopio óptico mediante el uso de las propiedades de refracción de luz del aceite de inmersión. Requiere de la disposición de una gota de este aceite sobre la muestra, ya sea en el caso de preparaciones frescas o preparaciones fijas; el objetivo de inmersión debe acercarse a la muestra de modo que toque la gota de aceite. En la Figura 8 se compara la observación de una muestra con y sin el objetivo de inmersión. � Oculares : Conjunto de lentes especializadas en aumentar la imagen previamente formada por el objetivo. Puede desmontarse e intercambiarse por otros con distintos aumentos o funciones: agujas para señalar, retículos para recuentos u otros. � Sistema regulador de la distancia focal: Sistema que permite ajustar la distancia focal de los oculares con la distancia focal del observador. PROPIEDADES Poder de resolución Es la capacidad del instrumento de dar imágenes bien definidas de puntos situados muy próximos entre sí. Límite de resolución Es la distancia que puede existir entre dos puntos para que puedan ser definidos como tales. Es importante recordar que el límite de resolución (mínima distancia) es la inversa del poder de resolución (máxima capacidad) de manera que cuanto mayor es el poder de resolución menor es el límite de resolución. Esto último es el resultado de deducciones matemáticas que no es el caso tratar aquí y usted debiera estudiarlo en aquellos cursos que involucren física. Si se usan sistemas de gran apertura numérica e iluminación con longitud de onda corta (luz ultravioleta por ejemplo) se obtendrá el máximo de detalles ya que se ha aumentado el poder de resolución. Poder de definición Consiste en la capacidad del microscopio de dar imágenes claras de contornos precisos. Reside en la corrección de las aberraciones propias de las lentes. Poder de penetración Así como el poder de resolución permite averiguar detalles colocados a la misma altura, el poder de penetración permite averiguar hasta qué límite están estructuras situadas en diferentes planos (i.e., niveles distintos con un mismo enfoque).

Recursos materiales (reactivos, equipo, muestras): a) b) c) d) e) f)

Microscopio óptico. Laminillas con diferentes tipos celulares. Laminillas de cromosomas ,células tejidos, etc Papel y líquido para limpieza de lentes de microscopio. Aceite de inmersión. Imágenes representativas de las diferentes muestras de células tejidos ,etc En juego de fotografías. DESCRIPCIÓN DE LA PRACTICA

a).- El instructor demostrará los elementos más importantes de un microscopio óptico. Se observaran diferentes laminillas bajo el microscopio con el siguiente procedimiento: a) Coloque la laminilla sobre la platina, en el centro, deslizando los clips sujetadores. b) Verifique que el objetivo que esté colocado para la visualización sea el de menor aumento. c) Coloque mediante el movimiento de la platina la muestra de estudio en el centro. d) Mediante el ajuste macrométrico, y bajo la visión directa de la platina, acercar la platina al objetivo hasta alcanzar una distancia de 2 mm. aproximadamente entre el cubreobjetos y el objetivo. e) Posteriormente viendo a través del ocular y usando el ajuste micrométrico, enfocar la muestra a observar. Ajustar el diafragma para mejorar la iluminación. f) Una vez observando las características de la muestra con el objetivo menor, cambiar el objetivo por el siguiente de mayor aumento. Enfocar la imagen con el ajuste micrométrico y observar la diferencia. g) “Barrer” la muestra a través de movimientos de arriba hacia abajo en forma de ondas o bien horizontalmente, siguiendo las líneas de una “S” imaginaria. Familiarícese con estos movimientos. h) Cambie nuevamente el objetivo hacia el de mayor aumento. Ajuste nuevamente la imagen con el ajuste micrométrico y ajuste el diafragma para mejor iluminación. ES IMPORTANTE EL SEGUIMIENTO DE ESTOS PASOS PORQUE DE ESTO DEPENDE EL ÉXITO DE LA OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO. Los alumnos (as) observarán las laminillas que contienen cromosomas teñidos mediante la técnica para identificación de bandas G. El instructor (a) demostrará imágenes representativas de cada una de las técnicas avanzadas de microscopía.

Conclusiones: Consignar en el reporte las conclusiones relativas a la importancia del microscopio óptico en la investigación biomédica y práctica clínica. El uso de las diferentes técnicas de microscopía avanzada. PROCEDIMIENTO PARA GUARDAR EL MICROSCOPIO Terminada la observación hay que cuidar de: a. Dejar limpios los objetivos y oculares. b. Dejar limpia la platina. c. Dejar el microscopio en posición de reposo que consiste en: e. Objetivo de menor aumento en posición de enfoque. f. Diafragma abierto y condensador en el tope inferior. Mecanismo de evaluación: a) Conducta, actitud y destreza en la práctica b) Calidad de las notas de su cuaderno de prácticas c) Calidad del reporte.

Fig. 1. MICROSCOPIO BIOLÓGICO ÓPTICO.

Partes de un microscopio óptico

Fig.2. MICROSCOPIO ESTEREOSCÓPICO DE DISECCIÓN

EL AGUA Y MEDIDA DEL pH

III Sesión de Laboratorio

EL AGUA, SOLUCIONES Y MEDIDA DEL pH. OBJETIVOS • Determinar algunas propiedades del Agua • Demostrar la ionización de ClNa en el agua destilada • Preparar soluciones, Mesclas y emulsiones FUNDAMENTO La vida, tal como se conoce en la Tierra, se desarrolla siempre en medio acuoso. Incluso en los seres no acuáticos el medio interno es básicamente hídrico. La inmensa mayoría de las reacciones bioquímicas se desarrollan en el seno del agua y obedecen las leyes fisicoquímicas de las disoluciones acuosas. Por todo ello no es de extrañar que el agua sea el principal componente de los seres vivos en cuanto a su cantidad. El cuerpo humano, por ej., está formado por término medio por un 75% de agua, aunque los tejidos que necesitan mucha actividad como el nervioso son agua en un 90%. Sólo los tejidos esqueléticos y las semillas de las plantas presentan una baja proporción de agua. El agua reúne una serie de características que la convierten en un disolvente único e insustituible en la Biosfera. En cuanto a sus propiedades fisicoquímicas cabe destacar: 1.- La molécula de agua tiene un marcado carácter dipolar. Aunque tiene una carga total neutra (posee el mismo número de protones y de electrones), presenta una distribución asimétrica de sus electrones: alrededor del O se concentra una densidad de carga negativa (�-) debido a que es un elemento mucho más electronegativo que el H, por ello los núcleos de H quedan desnudos, desprovistos parcialmente de sus electrones y manifiestan, por tanto, una densidad de carga positiva (�+). Este carácter dipolar de la molécula de agua es de trascendental importancia y tiene múltiples consecuencias: La más relevante es que se pueden establecer interacciones dipolo-dipolo entre las propias moléculas de agua formando uniones electrostáticas llamadas puentes o enlaces de H: la carga parcial negativa del O de una molécula ejerce atracción electrostática sobre las cargas parciales positivas de los átomos de H de otras moléculas adyacentes. Aunque son uniones débiles, el hecho de que alrededor de cada molécula de agua se dispongan otras 3 moléculas unidas por puentes de H permite que se forme en el agua (líquida o sólida) una estructura reticular, responsable de su comportamiento anómalo y de la peculiaridad de sus propiedades fisicoquímicas. Todas las restantes propiedades del agua son, pues, consecuencia de ésta. 2.- El amplio margen de temperaturas en que permanece en fase líquida (0º-100º) proporciona variadas posibilidades de vida, desde los organismos psicrófilos que pueden desarrollarse a temperaturas próximas a 0º, hasta los termófilos que viven a 70º-80º. 3.- La anómala variación de la densidad con la temperatura, con una densidad máxima a 4ºC, determina que el hielo flote en el agua líquida actuando como aislante térmico y, en consecuencia, posibilitando

el mantenimiento de la gran masa de agua de los océanos en fase líquida albergando a la mayor parte de la Biosfera. 4.- El agua es el líquido que más sustancias disuelve (disolvente universal). Esta propiedad, tal vez la más importante para la vida, se debe a su capacidad para formar puentes de H, además de con otras moléculas de agua como se dijo anteriormente, con otras sustancias polares (grupos -OH de alcoholes y azúcares, grupos -NH2 de aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.), pues se disuelven cuando interaccionan con las moléculas del agua. MATERIALES A). Tubos de Ensayo B). Pipeta pasteur C). Mortero D). Probeta. E). Becker F). Agua destilada G). Cloruro de Sodio H). Cloruro de Potacio I). Aceite comercial J). Bencina (opcional) K). Glicerina (Opcional) l). HCl (Opcional) M). Na (OH) (Opcional) METODOLOGIA: 1. Desarrollar una solución, mezclando en un tubo de ensayo agua destilada y NaCl, KCl, C6H12O6, 2. Preparar una emulsión de aceite con agua destilada. 3. Explicar las diferencias en los dos experimentos. 4. Medir el pH de las sustancias, antes y después de preparar cada solución

DETERMINACIÓN DEL pH OBJETIVOS • Familiarizarse con el uso de la cinta indicadora del pH * Familiarizarse con el manejo del Potenciómetro.. FUNDAMENTO El termino pH es la expresión de la concentración de H+ por medio de una función logarítmica. El termino pH puede definirse así: pH = log 1 H+ El pH 7 representa la neutralidad, un valor inferior a 7 representa solución ácido y superior a 7 solución alcalina. La escala pH es logarítmica, en una

solución de pH 6 hay 10 veces hidrogeniones que en una cuyo pH es 7, y un pH 5 indica que esa relación es de 100 a 1 respecto a la solución de pH 7. La diferencia de concentración de hidrogeniones entre el pH 5 y 5,1 es mucho mayor que la existente entre 5,9 y 6,0. Los métodos que se utilizan más actualmente es mediante el papel indicador y el aparato (Potenciometro). 1. POTENCIOMETRO En 1909, el químico danés Sorensen definió el potencial hidrógeno ( pH ) como el logaritmo negativo de la concentración molar ( mas exactamente de la actividad molar ) de los iones hidrógeno. Esto es: pH = - log [H + ] Desde entonces, el término pH ha sido universalmente utilizado por la facilidad de su uso, evitando asi el manejo de cifras largas y complejas. Por ejemplo, una concentración de [H+] = 1x10-8 M ( 0.00000001) es simplemente un pH de 8 ya que : pH= - log[10 -8] = 8 La relación entre pH y concentración de iones H se puede ver en la siguiente tabla, en la que se incluyen valores típicos de algunas sustancias conocidas: DETERMINACIÓN DE pH El electrodo de vidrio es relativamente inmune a las interferencias del color, turbidez, material coloidal, cloro libre, oxidantes y reductores. La medición se afecta cuando la superficie de la membrana de vidrio esta sucia con grasa o material orgánico insoluble en agua, que le impide hacer contacto con la muestra, por lo anterior se recomienda la limpieza escrupulosa de los electrodos. La temperatura tiene dos efectos de interferencia, el potencial de los electrodos y la ionización de la muestra varían. El primer efecto puede compensarse haciendo un ajuste en el botón de la " temperatura" que tienen todos los aparatos. El segundo efecto es inherente de la muestra y solo se toma en consideración, anotando la temperatura de la muestra y su pH; para más exactitud, se recomienda que la muestra esté a 25 ° C, que es la temperatura de referencia para la medición del pH. . PAPEL INDICADOR DE pH Para la determinación de pH el papel indicador con el papel indicador. Este método se basa en el cambio de color de ciertas sustancias en función de la variación de la magnitud del pH. El uso del papel indicador de pH es un valor cercano a lo real. Se emplea generalmente papeles o cartulinas con los colores patrón para efectuar la comparación. Estos abarcan valores de pH de 1- 14. Fig. 4 CINTA INDICADORA DEL pH

INDICADORES DE pH CASEROS A continuación se describe el procedimiento para obtener un indicador de pH, basado en la diferente coloración que adquieren algunos compuestos naturales (antocianinas, curcumina) o sintéticos (fenolftaleína) en función del pH. Con este indicador casero se puede determinar el carácter ácido o básico de muchas sustancias y realizar algunas experiencias curiosas y sencillas, relacionadas con las reacciones ácido-base. Antocianinas Las antocianinas (o antocianos) constituyen un grupo de pigmentos hidrosolubles (son solubles en agua, en ácido acético y en alcohol, pero no en aceites) responsables de la coloración roja, azul o violeta de muchas flores, frutas, hortalizas, etc. Se usan como colorantes en la alimentación (E-163), obteniéndose, en este caso, sólo a partir de comestibles, tales como fresas, cerezas, ciruelas, col lombarda, cebollas rojas, berenjenas, uvas, etc (BOE, 1996). Las antocianinas son muy sensibles a las variaciones de pH. En general, adquieren un color rojo en medio ácido y cambian de color a azul oscuro cuando el pH se hace básico, pasando por el color violeta. De hecho, antiguamente se empleaban estas sustancias naturales como indicadores del pH (Accum, 1836). En los extractos vegetales pueden encontrarse varios tipos de antocianinas juntas, las cuales confieren a cada extracto particular diferentes cambios de color frente al pH. Seguidamente se describe el procedimiento a seguir para obtener el indicador de pH basado en las antocianinas obtenidas a partir de col lombarda (brássica olerácea capitata rubra) y el Lirio Inka Speroccyphyun herrera estudiado por el Dr. Oswaldo Baca Mendoza. En la figura se muestra una col lombarda. Esta hortaliza es similar a la col normal (orepollo) pero de color morado. Es más fácil encontrarla en el mercado durante los meses de invierno, aunque actualmente puede adquirirse durante casi todo el año.

REPOLLO MORADO LIRIO INKA Es conveniente observar los colores de estos extractos con la luz solar o con la luz de una bombilla de filamento incandescente (normal o halógena), ya que la luz de las bombillas de bajo consumo o la de los tubos fluorescentes puede alterar el tono del color. Para obtener el extracto de col lombarda y determinar posteriormente el carácter ácido o básico de algunas sustancias sólo se necesitan un par de hojas de col lombarda y agua o alcohol etílico, dependiendo de cómo se vaya a

obtener el extracto; en esta experiencia y en las sucesivas no es necesario usar alcohol etílico farmacéutico, se puede usar el cosmético, que se vende en supermercados y es bastante más barato. Lógicamente, para observar los cambios de color del extracto se necesitan sustancias básicas, tales como amoniaco (NH3), sosa cáustica (hidróxido sódico, NaOH), lejía (hipoclorito sódico, NaClO), etc., y sustancias ácidas, tales como agua fuerte (ácido clorhídrico, HCl), vinagre (ácido acético, CH3-COOH), etc. También conviene disponer 92 de varios vasos, un cuchillo, una cucharilla de acero inoxidable, papel de filtro de café y un embudo. Además, si se obtiene el extracto con agua hirviendo se necesita un cazo y un hornillo, mientras que si se obtiene el extracto con alcohol etílico se necesitará una maza y un mortero. Conviene que los vasos usados sean incoloros y transparentes con el fin de observar claramente los colores del indicador. El procedimiento a seguir es el siguiente. En primer lugar se trocea finamente un par de hojas de col lombarda y se introducen en el cazo. Se agrega agua y se calienta al fuego. Se mantiene en ebullición durante unos 10 minutos y posteriormente se retira del fuego para dejarla enfriar. A continuación se filtra el líquido de las hojas usando un embudo con papel de filtro. El líquido que se ha obtenido es el indicador de pH, que tendrá un intenso color violeta. Los restos de las hojas de col lombarda han perdido el color violeta y ahora tienen una tonalidad verdosa; principalmente las hojas externas, que son las expuestas a la luz y las que poseen más clorofilas. El extracto obtenido mediante este procedimiento es algo turbio debido a que el agua ha extraído de la col lombarda otras sustancias además de las antocianinas. Otra forma de obtener el extracto es machacar con un mortero las hojas de col lombarda finamente troceadas con unos 100 ml de alcohol etílico, en lugar de hervirlas con agua. Luego se filtra el extracto con el embudo y el papel de filtro. De esta forma el extracto que se obtiene no tiene turbidez. Aunque el procedimiento en el que se hierve la col con agua tiene la ventaja de que se puede cocer una col entera, obtener una gran cantidad de extracto y luego podemos comernos la col; incluso puede hervirse usando una olla a presión. Conviene destacar que si se obtiene el extracto con agua hirviendo, al dejarlo unos días a temperatura ambiente comenzará a descomponerse y perderá el color debido a la acción de microorganismos. Para conservarlo más tiempo se puede congelar o bien agregarle una octava parte de su volumen de alcohol etílico. Se puede impregnar tiras de papel de filtro de café con el extracto y dejarlo secar. También se puede concentrar el extracto hirviendo la disolución o poniéndola al baño María. Si concentramos el extracto hasta que se vuelva sólido podemos extraer con alcohol etílico el colorante y separarlo de aquellas sustancias no solubles en alcohol que sí estaban presentes en el agua. Esta disolución será mucho más estable, ya que a los microorganismos les cuesta más desarrollarse en ella. Además se han eliminado sustancias que enturbian la disolución. En cualquier caso, con el paso del tiempo estos indicadores de pH se degradan y pierden su color. Comprobación del carácter ácido o básico de algunas sustancias

Para observar los cambios de color que se producen en los extractos obtenidos al variar el pH, se coloca un poco de agua en tres vasos transparentes e incoloros. A continuación se agrega a cada uno de los vasos un poco del extracto que queramos estudiar. El vaso central se usará como patrón, mientras que los dos vasos restantes se usarán para determinar las variaciones de color al agregarles diversas sustancias, tanto ácidas como básicas. En principio, no tiene por qué conocerse el carácter de las sustancias empleadas. Conviene destacar que es más fácil observar los colores colocando un folio blanco debajo de los vasos.

ACIDO

NEUTRO

ALCALINO

FIGURA Algunos de los colores que adquiere el extracto de col lombarda al cambiar el pH. El pH de la disolución aumenta hacia la derecha.

CARBOHIDRATOS Y LÍPIDOS

IV Sesión de Laboratorio

CARBOHIDRATOS Y LÍPIDOS OBJETIVOS • Determinar algunas propiedades de los carbohidratos y lípidos • Reconocer los Monosacáridos y polisacáridos • Desarrollar la saponificación de los ácidos grasos MATERIALES -

Tubos de ensayo Gradilla Pinzas Mechero Pipetas Solución de Lugol - Solución de Fehling A y B (Opcional) - Solución alcalina (sosa, potasa, bicarbonato, etc.) ClH diluido Solución de Benedic TÉCNICA . . . . . .

Poner en los tubos de ensayo 3ml de la solución de glucosa, maltosa, lactosa fructosa o sacarosa (según indique el profesor). Añadir 1ml de solución de Fehling A (contiene CuSO4) y 1ml de Fehling B (lleva NaOH para alcalinizar el medio y permitir la reacción) Calentar los tubos a la llama del mechero hasta que hiervan. La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo y será negativa si queda azul o cambia a un tono azul-verdoso. Observar y anotar los resultados de los diferentes grupos de prácticas con las distintas muestras de glúcidos. Mesclar una solución de glucosa con reactivo de Benedit, anotar el cambio de coloración.

Glúcido Reduct or

Glucosa

Maltosa

Lactosa Fructosa

Sacaros a

INVESTIGACIÓN DE POLISACÁRIDOS (ALMIDÓN) FUNDAMENTO El almidón es un polisacárido vegetal formado por dos componentes: la amilosa y la amilopectina. La primera se colorea de azul en presencia de yodo debido no a una reacción química sino a la adsorción o fijación de yodo en la superficie de la molécula de amilosa, lo cual sólo ocurre en frío. Como reactivo se usa una solución denominada lugol que contiene yodo y yoduro potásico. Como los polisacáridos no tienen poder reductor, la reacción de Fehling da negativa. TÉCNICA . . . . .

Colocar en un tubo de ensayo 3ml de la solución de almidón. Añadir 3 gotas de la solución de lugol. Observar y anotar los resultados. Calentar suavemente, sin que llegue a hervir, hasta que pierda el color. Enfriar el tubo de ensayo al grifo y observar cómo, a los 2-3 minutos, reaparece el color azul.

RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS MATERIALES -

Tubos de ensayo Gradilla Varillas de vidrio Mechero Vasos de precipitados Pipetas

20% acetona -

Solución de NaOH al Solución de Sudán III Tinta china roja Eter, cloroformo

o

Aceite de oliva

SAPONIFICACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en consecuencia las sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicos (lipasas) que dan lugar a la formación de ácidos grasos y glicerina.

. . .

TÉCNICA Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%. Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño María de 20 a 30 minutos. Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia semisólida que es el jabón formado y una superior lipídica de aceite inalterado.

TINCIÓN FUNDAMENTO Los lípidos se colorean selectivamente de rojo-anaranjado con el colorante Sudán III. TÉCNICA . . . . .

Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2ml de aceite. Añadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solución alcohólica de Sudán III. Al otro tubo añadir 4-5 gotas de tinta roja. Agitar ambos tubos y dejar reposar. Observar los resultados: en el tubo con Sudán III todo el aceite tiene que aparecer teñido, mientras que en el tubo con tinta, ésta se irá al fondo y el aceite no estará teñido. 2.3. SOLUBILIDAD

FUNDAMENTO Los lípidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas gotas formando una emulsión de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que, por su menor densidad, se sitúa sobre el agua. Por el contrario, las grasas son solubles en disolventes orgánicos, como el éter, cloroformo, acetona, benceno, etc.

TÉCNICA

. . . .

Poner 2 ml de aceite en dos tubos de ensayo. Añadir a uno de ellos 2ml de agua y al otro 2ml de éter u otro disolvente orgánico, Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar. Observar los resultados: Se verá cómo el aceite se ha disuelto en el éter y, en cambio no lo hace en el agua y el aceite subirá debido a su menor densidad. CUESTIONES 1. ¿Qué son los jabones? 2. ¿Cómo se pueden obtener los jabones? 3. ¿Por qué en la saponificación la glicerina aparece en la fase acuosa? 4. ¿Qué enzima logra en el aparato digestivo la hidrólisis de las grasas? 5. Indica lo que ocurre con la mezcla aceite-Sudán III y aceite-tinta y explica a qué se debe la diferencia entre ambos resultados. 6. ¿Qué ocurre con la emulsión de agua en aceite transcurridos unos minutos de reposo?¿Y con la de benceno y aceite?¿A qué se deben las diferencias observadas entre ambas emulsiones?

PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS Y ENZIMAS

VI Sesión de Laboratorio

PROTEÍNAS Y ENZIMAS____________ PROTEÍNAS OBJETIVOS • Determinar algunas propiedades de las proteínas • Demostrar la desnaturalización de una proteína. • Reconocer la actividad enzimática frente a un sustrato. DESNATURALIZACION DE PRÓTIDOS MATERIALES -

Tubos de ensayo Gradilla Mechero Vasos de precipitados Pipetas

Solución de HCl concentrado Alcohol etílico Solución de SO4Cu al 1% NaOH al 20% Clara de huevo o leche Solución de albúmina al1-2%

FUNDAMENTO Las proteínas debido al gran tamaño de sus moléculas forman con el agua soluciones coloidales que pueden precipitar formándose coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a 70ºC o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc. La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados que al actuar sobre la proteína la desordenan por destrucción de sus estructuras secundaria y terciaria. . .

TÉCNICA Colocar en tres tubos de ensayo una pequeña cantidad de clara de huevo (puede diluirse en un poco de agua para obtener una mezcla espesa) o 2-3ml de leche. Calentar uno de los tubos al baño María, añadir a otro 2-3ml de HCl concentrado y al otro añadir solucion de K (OH) concentrada

REACCIONES COLOREADAS ESPECÍFICAS (BIURET) FUNDAMENTO Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto para su identificación, destaca la reacción del Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CONH que se destruye al liberarse los aminoácidos. El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre(II) y sosa, y el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas. TÉCNICA . . . . .

Colocar en un tubo de ensayo 3ml de solución de albúmina al 1-2%. Añadir 4-5 gotas de solución de SO4Cu al 1%. Añadir 3ml de solución de NaOH al 20%. Agitar para que se mezcle bien. Observar los resultados. CUESTIONARIO: *¿Cómo se manifiesta la desnaturalización de la clara de huevo? *¿Cuál de los tres agentes utilizados tiene mayor poder de desnaturalización? *¿Cómo podríamos saber que una sustancia desconocida es una proteína? *¿Qué coloración da la reacción del Biuret? *¿Una proteína coagulada podría dar la reacción del Biuret? *Si se realiza la reacción del Biuret sobre un aminoácido como la Glicina ¿es positiva o negativa? ¿Por qué?

ENZIMAS FUNDAMENTO En los seres vivos se están desarrollando continuamente una serie de reacciones químicas que, si se realizaran en un laboratorio, sólo podrían llevarse a cabo mediante altas temperaturas, descargas eléctricas u otras fuentes de energía que las células no podrían resistir. Por ello, las reacciones que tienen lugar en los organismos no pueden ser violentas, lo cual se consigue gracias a la existencia de los

biocatalizadores, entre los cuales el lugar más destacado lo ocupan los enzimas. Para que una reacción se lleve a cabo es necesario que la/s sustancia/s que van a reaccionar (sustratos) reciban una determinada cantidad de energía que las active, denominada energía de activación. Los catalizadores son pues aquellas sustancias que, al disminuir las necesidades de energía de activación de una reacción, la facilitan y la aceleran. Los catalizadores no intervienen en la reacción que catalizan, de tal manera que, una vez terminada ésta, quedan libres y pueden volver a ser utilizados, no se consumen durante la reacción. Todos los enzimas conocidos son proteínas de gran solubilidad en los medios líquidos del organismo. Salvo raras excepciones son solubles en agua. Según su composición se clasifican en dos grupos: • Enzimas holoproteínas: Constituidos solamente por secuencias de aminoácidos. Son poco frecuentes, pudiéndose citar como ejemplos la ribonucleasa y la lisozima. • Enzimas heteroproteínas: La mayoría de los enzimas son de este tipo. Están formados por dos componentes, uno de naturaleza proteica llamado apoenzima y otro no proteico, el grupo prostético, que puede ser inorgánico, cofactor, o bien orgánico, en cuyo caso se denomina coenzima. El conjunto de los dos componentes, apoenzima y coenzima, forma el enzima completo que se llama holoenzima. Tanto el apoenzima como el coenzima son inactivos por si mismos, han de estar unidos para que el enzima (holoenzima) sea activo. APOENZIMAS: El apoenzima sirve de soporte al coenzima y está exclusivamente formado por secuencias de aminoácidos. Es el que determina la especificidad de la reacción enzimática. En el apoenzima se distinguen 4 tipos de aminoácidos según la función que desempeñen en la actividad enzimática: • No esenciales: No contribuyen ni directa ni indirectamente en el proceso catalítico, por lo que pueden ser eliminados de la cadena polipeptídica sin que se pierda actividad enzimática. • Estructurales: Son los que mantienen la estructura terciaria de la proteína enzimática. • De unión o fijación: Sujetan el apoenzima al sustrato. • Catalíticos: Son los responsables directos de la actividad enzimática y forman el llamado “sitio catalítico”. Además, junto con los de unión, forman el centro activo del enzima que es una oquedad tridimensional cuya forma depende de la estructura terciaria de la molécula proteica del apoenzima y que ocupa una pequeña parte de ésta.

. COENZIMAS: Difiere del apoenzima en que es de bajo peso molecular y no es de naturaleza proteica aunque sí es orgánico. Es el responsable del tipo de reacción enzimática que realiza el enzima. Por esta circunstancia, el número de coenzimas no es muy elevado ya que pueden ser comunes a muchos enzimas uniéndose a diferentes apoenzimas, desempeñando todos ellos la misma acción enzimática y, sin embargo, siendo específicos para las distintas reacciones enzimáticas según el apoenzima al que están unidos. Muchos coenzimas son vitaminas, lo cual significa que no pueden ser sintetizados por el organismo y deben ser incorporados en la dieta como tales o como sustancias transformables en vitaminas, es decir, provitaminas. DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA MATERIALES: A). Tubos de ensayo B). Pipetas Pasteur C). Almidon de trigo D). Agua destilada E). Saliva humana F). Lugol G). Incubadora a 37ºC PROCEDIMIENTO •

Preparar en un tubo de ensayo una solución de almidón en agua destilada (Testigo).

•

Preparar otra solución de almidón en saliva humana en otro tubo de ensayo e incubar a 37ºC por 20 minutos. * Colocar en ambos tubos unas gotas de lugol *

Comparar los resultados.

*

Explicar las diferencias.

EXPERIMENTO COMPLEMENTARIO ACTIVIDAD DE LA CATALASA EN HÍGADO DE POLLO: • En un tubo de Ensayo que contiene 10 a 20 ml de Peróxido de Hidrogeno

Coloque un trozo de hígado de pollo cosido. • En otro tubo similar introduzca en el peróxido de hidrogeno un trozo de Hígado de pollo crudo minutos

•

Utilizando un termómetro controle la temperatura cada 2

•

Explique los fenómenos.

ÁCIDOS NUCLEICOS

VII Sesión de Laboratorio

ÁCIDOS NUCLEICOS FUNDAMENTO La moderna ciencia de la Genética se originó cuando Gregor Mendel descubrió que las características hereditarias estaban determinadas por unidades hereditarias que se transmitían de una generación a la siguiente de manera uniforme y predecible. Se inició en este momento (finales s.XIX) una carrera científica cuyo objeto primordial era solucionar dos problemas, en principio muy distintos, pero, como se vio más tarde, muy relacionados entre sí. El primer problema fue el de identificar exactamente el material genético, su localización y su naturaleza química. El desarrollo de esta línea de investigación ha dado lugar a una rama de la Genética denominada Genética Molecular. El segundo problema consistía en descubrir el modo en que se transmiten y se heredan de generación en generación las manifestaciones de ese material hereditario, es decir, los caracteres biológicos. Se creó así otra rama de la Genética llamada en honor de Mendel Genética Mendeliana. En cuanto al primer problema, un paso previo a iniciar la búsqueda e identificación del material genético consiste en establecer

los requisitos que debe cumplir. Se establecen 4 requisitos generales que se espera que cumpla el material genético: 1.- Que se replique exactamente antes de la duplicación celular. 2.- Que su estructura sea lo suficientemente estable para que los cambios hereditarios (mutaciones) sólo se produzcan raramente. 3.- Que pueda llevar cualquier tipo de información biológica necesaria. 4.- Que transmita la información a la célula. REPLICACIÓN DEL ADN

La necesidad de que el material genético se autoduplique exactamente es la primera exigencia que debe cumplir. Ya en el modelo de Watson y Crick se planteaba la posibilidad de que las hebras de la doble hélice se separaran y cada una sirviera de matriz para formar la cadena complementaria. Este proceso recibió el nombre de replicación. Tal y como se había descrito hasta ese momento debía ser semiconservativo, es decir, cada doble hélice de ADN resultante sólo llevaba una de las dos hebras del ADN original, mientras que la complementaria era de nueva formación. Esto se demostró concluyentemente con los experimentos de Meselson y Stahl: cultivaron bacterias E.coli en un medio que contenía como única fuente de nitrógeno cloruro amónico marcado con 15N hasta que llegó un momento en que el ADN sólo presentaba en sus bases nitrogenadas 15N. Posteriormente cambiaron el medio de cultivo por otro con 14N normal. Las bacterias de la primera generación presentaban en su ADN 14N y 15N en igual cantidad. El proceso de replicación es similar tanto en los organismos procariotas como en los eucariotas, pero es en los primeros donde más se conocen los detalles; en concreto la más estudiada es la replicación en E.coli. Es un proceso complejo en el que intervienen más de 50 proteínas distintas agrupadas en complejos multienzimáticos. El enzima principal se denomina ADN-polimerasa y para que actúe es necesario que existan en el medio iones Mg2+ y una mezcla de 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP). Es suficiente con que falte uno de los cuatro para que no actúe la ADNpolimerasa. Básicamente este enzima realiza dos funciones: 1.- Recorre las hebras del molde y selecciona en cada momento el desoxirribonucleótido-trifosfato que tenga la base complementaria (G-C, A-T). Una vez localizado, la ADN-polimerasa cataliza su

hidrólisis separando un grupo pirofosfato (P-P) y uniendo el resto (desoxirribonucleótido-monofosfato) a la cadena de ADN que se está formando mediante un enlace fosfodiéster. La energía necesaria para esta unión se obtiene de la hidrólisis del grupo pirofosfato. Ésta es la función polimerizadora de la ADN-polimerasa. 2.- La ADN-polimerasa es también autocorrectora ya que después de unir cada nucleótido comprueba si se han producido errores antes de incorporar el nucleótido siguiente. Si detecta un error, elimina el último nucleótido colocado y lo sustituye por el correcto. Sin embargo la ADN-polimerasa debe resolver dos problemas relacionados con su actividad catalítica: 1.- La ADN-polimerasa es capaz de ir leyendo las hebras que actúan de molde en sentido 3'--5' y va sintetizando la nueva cadena en sentido 5'--3'. Esta última hebra recibe el nombre de hebra conductora. Sin embargo, la hebra molde complementaria discurre en sentido antiparalelo, es decir, 5'--3' y la ADN-polimerasa es incapaz de leerla en ese sentido. Para solucionar este problema, la ADNpolimerasa sintetiza pequeños fragmentos de ADN llamados fragmentos de Okazaki que crecen en sentido 5'--3' igual que la hebra conductora y más tarde se unen para formar la hebra completa, que en este caso se llama hebra retardada porque se sintetiza más lentamente. 2.- Otro problema que plantea la actividad catalítica de la ADN-polimerasa es que es incapaz de iniciar por sí sola la síntesis de una nueva cadena de ADN y necesita un corto fragmento de ARN, llamado ARN-cebador, que actúe como iniciador de las réplicas y que se elimina posteriormente del ADN formado. En resumen, el proceso completo de la replicación del ADN en E.coli es el siguiente: El paso previo para que pueda actuar la ADN-polimerasa es el desenrrollamiento y apertura de la doble hélice de ADN. La separación de las cadenas comienza en puntos concretos llamados puntos de iniciación. A partir de ellos se van separando las dos hebras de ADN formando la llamada burbuja de replicación. Los dos extremos de la burbuja por donde continua la separación reciben el nombre de horquillas de replicación. La síntesis de las cadenas complementarias comienza con la síntesis del ARN cebador que es una corta cadena de ARN con una secuencia complementaria de una de las porciones de las hebras del

ADN y frente a la cual se coloca. En la hebra que tiene el sentido 3'--5' la ADN-polimerasa va colocando nucleótido tras nucleótido a continuación del ARN cebador. Esta hebra complementaria que va creciendo en sentido 5'--3' es la hebra conductora. En la hebra opuesta del ADN original no se puede realizar el mismo proceso porque discurre en sentido 5'--3'. Por tanto, a continuación del ARN cebador se coloca un fragmento de Okazaki y, después de éste, un nuevo ARN cebador seguido de otro fragmento de Okazaki. En este momento actúa una ribonucleasa que elimina el ARN cebador que está entre dos fragmentos de Okazaki. El hueco que queda es rellenado por la ADN-polimerasa. El proceso continuaría con la colocación de un nuevo ARN cebador, otro fragmento de Okazaki, eliminación del ARN cebador y llenado del hueco por la ADNpolimerasa. Y así sucesivamente. La hebra que se sintetiza de esta manera es la retardada y crece en sentido 3'--5'. La replicación llevada a cabo por la ADN-polimerasa es un proceso muy exacto, sobre todo por su actividad autocorrectora. Sin embargo, aún así se produce un error de apareamiento de bases por cada 107 pares de bases. En una bacteria esto podría resultar suficiente debido a que su cromosoma sólo posee 3·103 pares de bases. Sin embargo en el ADN humano existen 3·109 pares de bases y durante el desarrollo embrionario, a partir del zigoto el ADN humano se duplica 1015 veces, por lo que la información genética pronto se perdería. Para aumentar más todavía la perfección de la replicación del ADN existe un complejo enzimático que detecta el nucleótido mal emparejado, lo elimina y regenera la secuencia correcta. De este modo se logra alcanzar una perfección de un error cada 1010 pares de bases. Este proceso se conoce con el nombre de corrección postreplicativa. OBJETIVOS

• Determinar algunas propiedades de los Ácidos Nucleicos • Demostrar la presencia del ADN • Demostrar la Presencia de RNA RECONOCIMIENTO DE ADN Y RNA

MATERIALES: A). Catafila de cebolla. B). Portaobjetos. C). Cubreobjetos. D). Solución de Feulgen E). Solución de HCl al 0.1N. F). Camara oscura de Madera. PROCEDIMIENTO: Colorear directamente las catafilas de cebolla con la solución Feulgen En condiciones de oscuridad, por 30 minutos. • Observar al microscopio las células. •

• Interpretar la reacción de Schiff.

CELULA PROCARIOTICA Y EUCARIOTICA

VIII Sesión de Laboratorio

CELULA PROCARIOTICA Y EUCARIOTICA FUNDAMENTO La materia viva puede entenderse como el resultado de la interacción de componentes, los cuales están organizados de un modo particular, que la hace reconocible. De acuerdo con la naturaleza, número de unidades constituyentes y tamaño de los componentes es posible reconocer distintos niveles de organización de la materia viva. El conjunto integrado de procesos generados a partir a partir de la organización de los componentes, que se conoce como la "vida", se materializa en una unidad fundamental, la célula. Es en la célula donde es posible reconocer, desde el punto de vista morfológico, la presencia de agregados supramoleculares y organelos, los que pueden ser estudiados, ya sea aprovechando algunas de las propiedades de las macromoléculas que las componen, o bien mediante el uso de instrumentos ópticos cuyo poder de aumento y resolución permite la visualización directa de las estructuras celulares. Dado que el ojo humano sólo es capaz de resolver dos puntos separados por más de 0.1 mm (10 μm) y como la mayoría de las células son de tamaño mucho menor, es imprescindible hacer uso del poder de resolución del microscopio óptico (0.2 μm). Los diversos tipos de microscopios de luz se basan fundamentalmente en su capacidad para detectar pequeñas diferencias de índice de refracción de las estructuras celulares. Los colorantes utilizados en citología e histología acentúan estas diferencias permitiendo un mayor contraste de las estructuras observadas. Para estudiar la morfología celular, es posible estudiar las células directamente, in vivo, o bien, después de un proceso que implica la muerte celular por medio de fijación. OBJETIVOS

• Observar las células procarióticas • Observar las células eucarióticas • Determinar las diferencias entre célula procariótica y

La célula eucariótica

CÉLULA PROCARIOTICA OBJETIVOS Conocer y evaluar algunas técnicas que se utilizan comúnmente para observar células procarioticas al microscopio óptico. REALIZACIÓN 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Preparar los frotis bacterianos. Teñir con cristal violeta 1min. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. Cubrir con Lugol 1min. Lavar con agua el exceso de Lugol. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color (30seg) 7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. 8. Teñir con safranina 1min. 9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. 10. Secar la preparación. 11. Examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color de cada preparación. Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batería de colorantes para realizar la tinción Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos. En un laboratorio de Microbiología, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrón de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar así los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables. Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho más caro.

CÉLULA EUCARIOTICA VEGETAL MATERIALES SUMINISTRADOS AL ALUMNO

Microscopio, colorante, portaobjetos y cubreobjetos, tallo de planta verde, hojas de afeitar.

CÉLULAS BACTERIANAS TINCIÓN GRAM

CÉLULAS DE CIANOFITAS NOSTOC

MATERIALES QUE EL ALUMNO DEBE TRAER Lápiz grafito; Lápices de colores; Goma blanda DESARROLLO PRÁCTICO Algunos métodos para estudiar la morfología de la célula. Examen inmediato. Es la observación directa al microscopio de luz de tejidos o células sin la utilización previa de tratamientos y técnicas. Observación de hojas de Elodea (Elodea sp) Observe al microscopio hojas de Elodea. En ella reconozca los cloroplastos. Aumente el nivel de luz y vea cómo los cloroplastos se mueven (Ciclosis). Haga esquemas. Anote los aumentos. DIBUJE Y ROTULE!!! . Observación de una preparación de epidermis de Tradescantia virgineana. Para montar su muestra desprenda la epidermis. La técnica de desprendimiento se explicará durante la actividad práctica. Haga esquemas. Anote los aumentos. DIBUJE Y ROTULE!!! Un estoma corresponde a una abertura pequeña en la epidermis de las hojas y tallos, rodeada por células oclusivas, a través de la cual difunden los gases. La vacuola es un organelo limitado por una membrana (tonoplasto) llena de fluido, situado en el citoplasma de una célula . Examen mediato. Los tejidos y células a observar son procesados previamente a la observación. Observación de un corte histológico transversal de tejido vegetal (tallo). Observe esta preparación histológica con los tres aumentos de su microscopio. Haga un esquema con el aumento mediano (DIBUJE Y ROTULE). Compare con el examen inmediato y haga una breve discusión sobre lo observado.

CELULA ANIMAL OOCITO DE ORESTIAS

Células Vegetal - Haga una preparación fresca de una hoja de Tradescantia virgineana. Observe las vacúolas (Aquellas que están teñidas de un color rosado-violeta, por la presencia de un pigmento llamado Antociano). Agregue gotas de agua de mar (solución hipertónica) en un borde del cubreobjetos y mediante un trozo de papel filtro aplicado al borde opuesto, extraiga el agua haciendo penetrar de este modo, el agua de mar a la preparación. Observe las células. Reemplace el agua de mar por agua destilada usando el mismo procedimiento anteriormente indicado. Note los cambios en la célula y explíquelos. Esquematice. CUESTIONARIO

Para responder el cuestionario consulte la literatura necesaria. Recuerde que en los controles futuros debe conocer la respuesta a estas preguntas. 1. ¿Por qué el agua, siendo una molécula polar, puede difundir libremente a través de la membrana plasmática? 2. ¿Qué funciones puede cumplir la membrana plasmática? 3. ¿Qué moléculas se encuentran participando en la estructura de la membrana plasmática? 4. ¿Cuáles son las diferenciaciones de la membrana que permiten comunicación con otras células y su entorno?

CÉLULA VEGETAL CATAFILO DE CEBOLLA

OBSERVACION DE CELULAS ANIMALES SANGRE MATERIALES • • •

Microscopio Portas y cubre-objetos Soporte de preparaciones

• • •

Lanceta Alcohol Metanol

Cubeta • Giemsa Sangre obtenida por un pinchazo en el pulpejo del dedo •

TECNICA 1. Limpiar el pulpejo del dedo con una gota de alcohol, hacer una punción para conseguir una gota de sangre. 2. Depositar la gota de sangre, en un lado y en el centro de un porta bien limpio. 3. Seguidamente, con el empleo de un porta de borde esmerilado se hace un frotis o extensión de sangre. 4. El porta con el que se hace la extensión debe deslizarse bien colocado y lo más perfectamente aplicado en su borde contra el otro porta sobre el que se hace la extensión. Sólo debe pasarse una vez, de forma continua e ininterrumpida.

5. Es conveniente realizar dos o tres extensiones, con el fin de seleccionar para la tinción la mejor lograda. Las extensiones o frotis deben secarse al aire lo más rápidamente posible. La desecación se facilita con movimiento en forma de abanico, nunca

soplando o por calor. La rápida desecación evita la deformación de los glóbulos sanguíneos. COLORACION 1. Depositar el porta con la extensión de sangre encima del soporte de tinciones y éste sobre la cubeta. 2. Dejar caer sobre la extensión unas gotas de metanol y esperar que el alcohol se evapore, con lo que se consigue el fijado. 3. Depositar cubriendo toda la extensión, unas gotas de Giemsa, evitar la desecación y dejar actuar el colorante unos cinco minutos. 4. Lavar la preparación, hasta que arrastre todo el colorante. 5. Tomando el porta por los cantos secar aireando el porta, o bien al calor muy lento de la llama del mechero. OBSERVACION AL MICROSCOPIO 1. Con débil aumento explorar la preparación para localizar la zona en la que el frotis es más perfecto. Los lugares más aptos son aquellos en los que la extensión de los glóbulos se ha conseguido en una sola capa, están bien teñidos y no se han producido precipitados de los colorantes. Cuando se observe una zona apta, pasar a aumentos más fuertes. 2. En el campo del microscopio, se verán con un dominio predominante los glóbulos rojos, hematíes o eritrocitos , teñidos en color rojo. No tienen núcleo y son más delgados por el centro que por los bordes. Los glóbulos blancos o leucocitos de identifican fácilmente por la presencia de núcleo. Hay varias clases de glóbulos blancos: o los linfocitos algo mayores que los glóbulos rojos, con un núcleo muy voluminoso que ocupa casi todo el glóbulo, aparece fuertemente teñido en color violeta oscuro. o los monocitos son los leucocitos mayores, poco frecuentes normalmente, hay que desplazarse por la preparación para encontrar alguno. Tienen un núcleo muy grande y redondeado que aparece teñido en color violeta.(Es bueno que recuerdes su función que es la de fagocitosis). o los polinucleares presentan el núcleo como fragmentado o con aspecto arrosariado. o los eosinófilos, con granulaciones abundantes de color rojizo y el núcleo teñido de color azul marino. Estos glóbulos aumentan su número en caso de parasitosis o procesos alérgicos. o los basófilos presentan un núcleo teñido de rojo y las granulaciones del citoplasma de color muy oscuro. Las plaquetas aparecen como pequeños fragmentos teñidas de color violeta. Estas células intervienen en el proceso de coagulación sanguínea.

3. Si la extensión ha salido bien, merece la pena conservarla. Para ello, añadir una gota de euparal, dpx, u otro producto similar y colocar un cubre-objeto. 4. El número promedio de glóbulos rojos en el hombre es de 5.000.000 por mm3 de sangre. La cifra media de glóbulos blancos es de 7.000 a 8.000 por mm3. Hay por tanto un glóbulo blanco por cada 600 ó 700 glóbulos rojos. Por lo tanto para ver todos los tipos de glóbulos blancos debes buscarlos en distintos campos de la preparación. El número de plaquetas es de unas 250,000 por mm3

CICLO CELULAR Y MITOSIS

IX Sesión de Laboratorio

DIVISIÓN CELULAR MITÓTICA FUNDAMENTO: La división celular es un proceso por el cual a partir de una célula madre se producen dos células hijas que genética, estructural y funcionalmente son iguales entre sí e iguales a la propia célula madre. Ello se debe a que han recibido, excepto en el caso de procesos anormales, la misma información genética de la célula madre y, por lo general en la mayoría de los organismos la misma cantidad de citoplasma y orgánulos. Este fenómeno se produce tanto en procariotas como en eucariotas. En los procariotas y eucariotas unicelulares o de vida libre la división celular es el proceso por el cual se propaga la información genética y aumenta el número de individuos de la población, mientras que en los organismos pluricelulares la división celular es esencial para el desarrollo del organismo a partir del zigoto y para la reparación de las células que han muerto por desgaste o por lesiones ocurridas en los tejidos. Existen diferencias entre la división celular de procariotas y eucariotas derivadas de la distinta estructura y de la diferente cantidad de ADN que poseen estos tipos de células. En las células eucariotas el proceso de división es más complejo debido a la existencia de un núcleo en el que se almacena la cromatina condensada en forma de cromosomas que, en algunos casos, pueden ser muy numerosos. El mecanismo utilizado para la división celular se denomina mitosis, aunque es el mecanismo que afecta al material genético. Normalmente este mecanismo se continúa con la división del citoplasma denominada citocinesis. El objeto de la presente práctica es identificar las células que se encuentran en mitosis y las distintas fases de ésta mediante la tinción y observación de meristemos de raíz de cebolla. Una vez identificadas las fases de la mitosis, se puede calcular el índice mitótico y la distribución porcentual de cada una de las fases mitóticas de meristemos de raíz de cebolla crecidos en diferentes condiciones. Con estos datos realizaremos un informe a modo de trabajo de investigación explicando la metodología utilizada, los objetivos, resultados y comentarios al respecto. CICLO CELULAR El ciclo celular es una secuencia regular y repetitiva de crecimiento y división celulares que sufren todas las células. La duración de este ciclo es variable y depende del tipo celular, del organismo y de factores externos como la temperatura, factores de crecimiento, nutrientes y toxinas.

El ciclo celular consta de cinco fases: G1, S, G2, mitosis y citocinesis (Figura 5.1). Las tres primeras fases se agrupan en lo que se denomina interfase durante la cual la célula se prepara para realizar la división celular formada por las dos últimas fases. La función de las fases de la interfase quedan resumidas de la siguiente forma: Fase G1.- Durante esta fase se desarrolla una alta actividad bioquímica cumpliendo con las distintas funciones que la célula presente en el organismo. Normalmente, en un organismo pluricelular, las células, que no se dividen normalmente salvo en presencia de ciertos factores de crecimiento, se enquistan en una subfase denominada G0. La fase G0 indica únicamente que las células no se encuentran en un ciclo contínuo de crecimiento y duplicación. En un organismo diploide, la cantidad de ADN en el núcleo es de 2n. Fase S.- Cuando las células se encuentran en un ciclo contínuo de crecimiento y división celular o reciben una señal extracelular adecuada, pasan a duplicar la cantidad de ADN y sintetizar una serie de proteínas encargadas de la compactación del ADN. Por lo tanto, al final de la fase S, una célula de un organismo diploide ha pasado a tener una dotación doble de ADN. No se puede decir que sea tetraploide (4n) sino que sigue siendo diploide pero con cada uno de los cromosomas duplicados, las indicaremos como 4c. Fase G2.- Las células han terminado la síntesis de ADN (4c) y se preparan para sufrir el complejo proceso de la división celular. En esta fase se sintetizan las proteínas necesarias para llevar a cabo la mitosis y se concluye la duplicación y separación del centriolo en células animales.

ESQUEMA DEL CICLO CELULAR

La regulación del ciclo celular es muy importante en organismos pluricelulares ya que un descontrol de la velocidad del ciclo podría descompensar y alterar el equilibrio funcional del organismo dando lugar a consecuencias tan negativas como el cáncer. MITOSIS 1.1.Profase

La cromatina comienza a condensarse y espiralizarse formando los cromosomas. Durante toda la profase los cromosomas van acortándose debido a este proceso progresivo de espiralización. Los cromosomas desde el principio aparecen formados por dos cromátidas hermanas que son, genética y morfológicamente idénticas. Ambas cromátidas se mantienen unidas por el centrómero. Mientras la membrana nuclear esté intacta y el o los nucleolos sean visibles, se dice que la célula está en profase. Al final del periodo profásico el nucleolo o nucleolos se desorganizan y la membrana nuclear se desintegra. Los cromosomas quedan libres en el espacio celular. Mientras tanto, en el citoplasma, los centriolos se han duplicado y cada diplosoma (par de centriolos), ha emigrado a un polo de la célula. Entre ambos se forma y se extiende el huso acromático o mitótico, constituido por filamentos (fibras del áster), en los que se insertan los cromosomas por el centrómero y comienzan a emigrar hacia la placa encuatorial. Este período desde que desaparece la membrana nuclear hasta que los cromosomas se localizan en el plano ecuatorial se denomina prometafase. 1.2.Metafase Los cromosomas han alcanzado su máximo grado de espiralización. Se disponen en círculo en la placa ecuatorial con los centrómeros perfectamente orientados, con cada cromátida hacia un polo celular. Esta orientación asegura la correcta separación en la fase siguiente. La acción de determinados tratamientos como la colchicina, la colcemida, la mescalina, la hidroxiquinoleína, el bromonaftaleno, el paradiclorobenceno etc..o agua con hielo, inhiben la formación de los microtúbulos y por tanto la migración hacia los polos en anafase. Estos tratamientos se utilizan en citogenética experimental para acumular células en metafase, que resultan apropiadas para el análisis cariotípico. 1.3.Anafase En esta fase las cromátidas de cada cromosoma se separan y emigran hacia los polos, de manera que a cada uno van 2n cromátidas. Este movimiento se realiza gracias al huso acromático. Como ambas cromátidas son idénticas, porque se formaron por duplicación de la fase S de la interfase, los polos celulares reciben, exactamente el mismo material genético. La anafase concluye cuando todos los cromosomas han alcanzado los polos. 1.4.Telofase Las cromátidas han terminado su migración hacia los polos. La membrana nuclear se reconstruye alrededor de las cromátidas, los nucleolos vuelven a formarse y las cromátidas se desespiralizan volviendo a formar la cromatina. Se han formado 2 núcleos hijos.

ETAPAS DE LA MITOS 4 Mitosis2.Citocinesis La citocinesis es el proceso por el cual el citoplasma de la célula madre queda distribuido entre las 2 células hijas y estas se independizan por la formación de la membrana celular. La separación de las 2 células hijas es diferente en células animales y vegetales. En las células animales se produce la plasmocinesis, en la que a partir de la periferia de la célula el citoplasma se va estrangulando hasta que las células hijas se ponen en contacto. En las células vegetales se forman vesículas membranosas en la zona comprendida entre los núcleos hijos. Estas vesículas se fusionan unas con otras dando origen a la membrana plasmática, quedando entre las membranas el contenido de las vesículas que constituirá la pared celular.

Lamina 5.- Celulas de meristemo radicular de cebolla en interfase

Profase mitótica

Anafase mitótica

Metafase mitótica

Telofase mitótica

Células de meristemo radicular de cebolla en interface

TRABAJO PRÁCTICO Observación de distintas fases de la mitosis en ápices radiculares de cebolla. 1. Obtención del material. Se cortan raíces jóvenes de cebolla, aproximadamente unos 20 mm, comprobando que conservan el ápice radicular, que se distinguirá por el cambio de color. 2.Fijación. Se prepara la mezcla fijadora. Existen diversos fijadores: -3 Etanol:1 Acético (Carnoy). -3 Metanol:1Acético -7 Metanol:3 Acético -3 Metanol:1 Propiónico -4 Etanol:1 Acético:1 Cloroformo Según el fijador utilizado el tiempo y temperatura de la fijación varía. Las raicillas de cebolla se han fijado en 3 Metanol:1 Acético a 4ºC. 3.Conservación Se lava el material varias veces con la mezcla fijadora y se conserva a 4ºC. 4.Preparación Las raicillas de cebolla que se hallan en mezcla fijadora se hidrolizan en HCl 1N durante 10 minutos a 60ºC. Transcurridos los 10 minutos de la hidrólisis, se lavan las raicillas en agua destilada y se colocan las raicillas sobre una gota de orceína acética o de orceína lactopropiónica para su tinción, durante 10 a 15 minutos. A continuación se realiza la preparación. Primeramente, se toma una raicilla y se coloca sobre un vidrio portaobjetos y se corta el ápice radicular con un bisturí. Para realizar esta operación se utiliza la lupa. Este ápice radicular se corta a su vez en 4 fragmentos, se hace un corte longitudinal y otro transversal. Se separan los cuatro trozos y a continuación se añade una gota del colorante. Seguidamente se coloca un cubreobjetos sobre el material que deseamos observar. Con la ayuda de un bastoncillo de madera se golpea y extiende el material. A continuación se presiona con el dedo pulgar y se retira el exceso de colorante con un papel de filtro. 5.Observación.

Se observa al microscopio empezando con el objetivo de menor aumento. No es necesario utilizar el objetivo de inmersión. Se deben distinguir y dibujar, tal y como se ven, todas las fase s de la mitosis.

Cuestionario de practicas 1.Dibuje cada una de las distintas fases de la mitosis, además de la interfase. 2.¿Por qué se encuentra mayor número de células en interfase que en división en las preparaciones de raíz de cebolla? 3.La cebolla Allium cepa es una especie vegetal con 2n=16 cromosomas ¿Cuántas cromátidas recibe cada polo en anafase? 4.¿Cuántas cromátidas tiene uno de los cromosomas de cebolla en telofase? 5.Un individuo diploide y homocigótico AA, ¿Cuántas copias del alelo A tiene en el periodo G1 de la interfase y cuántas en metafase? 6.Un individuo diploide y heterocigótico Aa, ¿Cuántas copias del alelo A tiene en el periodo G1 de la interfase y cuántas en metafase? 6.¿Existe alguna diferencia entre endomitosis y endorreduplicación? 7.¿Por qué se bloquea la continuación de la mitosis en metafase en especies que presentan haplocromosomas?.

DIVISIÓN CELULAR MEIOSIS

X Sesión de Laboratorio

DIVISIÓN MEIOTICA FUNDAMENTO

La meiosis es un proceso celular, ligado a la reproducción sexual, por el cual, la célula madre de naturaleza diploide, da origen a los gametos de naturaleza haploide, de tal manera que en la fecundación se reestablece el número diploide de cromosomas. Así, mientras la mitosis es un proceso de división celular con formación de dos núcleos hijos con el mismo número de cromosomas que la célula original, en la meiosis en cambio hay dos divisiones celulares con reducción del número de cromosomas a la mitad. Fases de la meiosis La meiosis es un proceso citológico que comprende dos divisiones celulares. En la primera división meiótica ocurre una serie de intercambios de material genético entre los cromosomas homólogos. Este fenómeno es un proceso complejo que comprende una larga profase en la que, para su mejor estudio y comprensión, se distinguen los estadíos: Leptoteno, Cigoteno, Paquiteno, Diploteno y Diacinesis. Profase I Leptoteno. El comienzo de la profase I de la célula se caracteriza porque los cromosomas que se encuentran completamente desenrollados en el núcleo, debido a los procesos de síntesis de los momentos premeióticos, comienzan a estructurarse según un doble modelo de espiralización, que conduce en definitiva a un aumento del volumen nuclear. Cigoteno. La célula diploide presenta en estos momentos 2n cromosomas homólogos completamente espiralizados (contraídos), los cuales se aparean cada uno con su homólogo. Es una sinapsis perfecta, cromómero a cromómero, formando por tanto n bivalentes. Paquiteno. En este estadío se terminaliza el apareamiento de los cromosomas homólogos n-bivalentes se visualizan engrosados, y cada uno de los cromosomas compuestos de dos cromátidas, hace que el bivalente se presente como una tétrada.

Diploteno. Las dobles parejas de cromátidas homólogas comienzan a separarse, permaneciendo unidas por ciertos puntos que son los quiasmas, los cuales constituyen la visualización citológica del mecanismo de intercambio de material genético denominado sobrecruzamiento (crossing-over). Diacinesis. En este estadío las tétradas aparecen muy condensadas con bucles unidos por los quiasmas; al mismo tiempo que se terminalizan hacia los extremos de la tétrada Metafase I A lo largo de la profase I, los centriolos duplicados se orientan dos a dos, hacia cada uno de los polos de la célula, visualizándose ya en la metafase I el aparato mitótico, al mismo tiempo que las tétradas se disponen en la placa ecuatorial del aparato mitótico. Anafase I En este estadío ocurre la rotura y desaparición de la membrana nuclear y la migración de n cromosomas a cada polo. Es importante señalar en primer lugar que la repartición de n cromosomas homólogos a cada polo ocurre al azar, y en segundo lugar que a diferencia con la mitosis, en esta primera división meiótica no hay división longitudinal del centrómero, y por lo tanto separación de las cromátidas, sino que éstas permanecen unidas por sus respectivos centrómeros. Por lo tanto, esta división meiótica I es una división reduccional Telofase I Ocurre la individualización de las dos células de la división meiótica I, con la aparición de la membrana plasmática que las separa, y la reaparición de la membrana nuclear.

Figura 6. Células del testículo del saltamontes Chorthippus jucundus teñidas con orceína lacto-propiónica. A.Núcleo de una espermatogonia en interfase. El cromosoma sexual ha sido señalado con una X. B.- Metafase espermatogonial. C.- Núcleo prepaquiténico. Posiblemente corresponde a un núcleo en leptotene. D.- Paquitene medio. E.- Paquitene tardío. F.- Diplotene. Se ha señalado la posición de los quiasmas (cabezas de flecha) en un bivalente monoquiasmático (M7), en uno con dos quiasmas (M4) y en un tercero que presenta cuatro (L1

División meiótica II Entre la telofase I y el comienzo de la segunda división meiótica, a diferencia con la mitosis, no hay un período de síntesis y duplicación del ADN, por lo demás la división meiótica II, tiene lugar como la mitosis normal en cada una de las células haploides (meiocitos de segundo orden), resultantes de la división meiótica I. Profase II En este estadío los centriolos aparecen duplicados y migran dos a dos hacia los polos, constituyendo el huso mitótico. Metafase II Los n cromosomas de cada una de las células hijas, se disponen en la placa ecuatorial del huso, al mismo tiempo que desaparece la membrana nuclear Anafase II Ocurre la división longitudinal del centrómero y repartición al azar de n cromátidas a cada uno de los polos, de modo que las cromátidas hermanas (que no serán idénticas por el sobrecruzamiento) van siempre a lados opuestos. Telofase II En esta fase tiene lugar la individualización de las cuatro células hijas, con aparición de las membranas plasmáticas y nuclear. Ahora bien, a diferencia con la mitosis, las dos células resultantes de cada meiocito de segundo orden son diferentes, porque sus cromátidas han intercambiado material genético previamente en la profase I. A continuación, ocurre la desespiralización de las cromátidas y el periodo de síntesis y duplicación del ADN. No obstante, se presentan numerosas excepciones a este esquema general de la meiosis, según sean los ciclos haplontes, diplontes o diplohaplontes de las especies, o en una misma especie en la espermatogénesis y ovogénesis.

Espermatocitos de Chorthippus jucundus teñidos con orceína lacto-propiónica. A.- Diplotene tardío-diacinesis. B.- Metafase-I. C.- Anafase-I. El cromosoma sexual X migra completo al polo superior de esta célula. D.- Telofase-I. E.- Intercinesis/Profase-II. La célula de la parte superior de la fotografía posee el cromosoma X, mientras que la de la parte inferior carece de él.

Células del testículo de Chorthippus jucundus teñidas con orceína lacto-propiónica. A.- Metafase-II. Se observa la disposición radial de los cromosomas. B.- Anafase-II. Las cromátidas están comenzando a separarse. C.Anafase-II. D.- Telofase-II. E.- Espermátidas tempranas. La situada en la parte superior de la fotografía posee el cromosoma sexual (X), mientras que la de la parte inferior carece de él. F,G,H- Espermátidas en diferentes estados de maduración: redondeada, lanceolada, alargada…

1.- TECNICA DE PREPARACION MEIOTICA EN TESTICULOS DE SALTAMONTES Seleccionamos testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético 3:1 al menos con una semana de antelación y los colocamos en agua destilada para su hidratación durante 10 minutos. A partir de este momento conviene realizar todo el proceso en el mismo recipiente, preferiblemente plástico y no vidrio. No utilizar ningún elemento metálico. Hidrolizar los testículos en HCl 5N durante 30 min. Transcurrido este tiempo se lavan abundantemente en agua destilada. Posteriormente se introducen en colorante de orceina acetica durante 10 minutos a temperatura ambiente. Este proceso es preferible realizarlo en oscuridad. Se lavan los testículos, que tendrán un color rojo, en agua sulfurosa y posteriormente en agua del grifo, donde se almacenarán hasta la confección de los aplastados. Separamos un par de túbulos seminíferos del testículo y los colocamos sobre un portaobjetos. Sobre ellos se coloca inmediatamente una gota de ácido acético al 50% en agua destilada y se deja un par de minutos (¡Cuidado, no dejar secar el material!). Se coloca sobre el túbulo un cubreobjetos y utilizando la punta de un lápiz y con presión muy suave se dispersa el material. Con un trozo de papel de filtro se elimina el acético que ha rebosado por los laterales del cubreobjetos y, con cuidado de no moverlo, se realiza el aplastado presionando fuertemente con el dedo pulgar sobre una superficie completamente plana. Observar los aplastados en el microscopio tratando de determinar las diferentes etapas del proceso meiótico, así como las espermátidas en los diferentes estadíos de la espermiogénesis. TÉCNICA DEL GOTEO Y COLORACIÓN GIEMSA ab.c.d.e.f.g).h.i.j.-

Con ayuda del microscopio estereoscopio, aislar los testículos de saltamontes. Fijar los testículos en solución carnoy por 5 a 10 minutos. Disgregar los testículos ,con aguda de estiletes y suspender en solución de Tripsina. Incubar por 15 minutos . Colocar la suspensión celular en tubos y centrifugar a 1000 r.p.m. por 5 minutos Decantar la tripsina y resuspender en carnoy Centrifugar a 1000 r.p.m. por 5 minutos. Eliminar el carnoy. y agregar al paquete celular 2 0 5 ml de fijador, agitar con la pipeta ,hasta homogenizar la suspensión celular. Dejar caer una gota de suspensión en una lamina y secar al aire . Colorear con Giemsa al 2% por 10 minutos CUESTIONARIO

1-Dibuje cada una de la fases de la meiosis 2-¿Qué es un bivalente? ¿En qué fase o fases se observa?. 3-¿Qué diferencia existe entre una anafase I y una anafase II? 4-La cebada tiene 2n = 14 cromosomas, ¿cuántos cromosomas tiene una célula de cebada en una metafase de una mitosis, en una metafase I y II de una meiosis? 5-Si tiene una preparación en la que observa células anafásicas en las que se separan cromátidas ¿cómo sabrá si se trata de una anafase de una mitosis o de una anafase II de una meiosis?

ESPERMATOGENESIS EN INVERTEBRADOS

X Sesión de Laboratorio

ESPERMATOGENESIS EN INVERTEBRADOS FUNDAMENTO Existe un proceso celular destinado a producir células idénticas genéticamente: la mitosis. Por el contrario,la mayoría de los organismos vivos utilizan parte de su vida o tejidos especializados para producir células esencialmente diferentes de las progenitoras en cuanto a las combinaciones posibles de su material hereditario. Este mecanismo celular está enclavado en un proceso especial de división celular: la meiosis. En organismos superiores la meiosis tiene lugar en los órganos sexuales tanto masculinos como femeninos, dentro de un proceso general que se denomina respectivamente espermatogénesis y ovogénesis. Tanto uno como otro no sólo producen células diferentes genéticamente, sino que reducen el número de cromosomas de las células a la mitad y las modifica para poder ser fecundadas o fecundar dependiendo del sexo donde se realice. ESPERMATOGÉNESIS Ham, discípulo de Leuwenhoek, observa por primera vez en 1677 en el semen humano la presencia de unos "animáculos" móviles que muchos científicos de la época consideraron como parásitos o simbiontes. En 1780 Spallanzani comprueba que si del semen eran eliminados estos cuerpos móviles, éste perdía su capacidad fertilizante. Pero fue en la segunda mitad del siglo XIX cuando se concluyó que estos "animáculos" eran los gametos masculinos, y se les denominó espermatozoides. De esta forma se estableció que los espermatozoides se originaban en los testículos y que poseían núcleo y citoplasma: eran células. Desde este momento y hasta nuestros días la morfología de los espermatozoides y de las células que les dan origen ha sido ampliamente estudiada. En una primera etapa de la citología clásica, empleando cortes en parafina, no sólo se describen gran cantidad de formas distintas de espermatozoides, sino que también se pone gran interés en el estudio de los tejidos en los que se originan. Posteriormente, con el avance de la técnica y la aparición del microscopio electrónico, se determina la ultraestructura de los espermatozoides y de las células intermedias en su formación. La introducción de nuevas técnicas de estudio como pueden ser las citoquímicas para microscopía óptica y electrónica, la aplicación de microscopía de barrido, el empleo de anticuerpos marcados a nivel morfológico y ultraestructural, la microscopía confocal o metodologías puramente bioquímicas han ayudado a un mejor conocimiento del proceso de formación de los gametos masculinos, la espermatogénesis. Desde antiguo recibió gran atención el proceso de cómo se formaban estas células, ya que a partir de una célula prácticamente indiferenciada, la espermatogonia, se produce una complicada y a veces dramática serie de cambios morfofuncionales que desembocan en la formación del espermatozoide: la espermatogénesis. Podríamos definir la espermatogénesis como el conjunto de cambios que ocurren en una célula prácticamente indiferenciada, espermatogonia, y que tienen como final la formación de una célula altamente especializada, con un número “n” de cromosomas recombinados, una carga “c” de ADN y que es capaz de fecundar: el espermatozoide. Teniendo en cuenta los cambios que se producen en la espermatogonia, y por tanto los nuevos tipos celulares y los procesos en los que participan, podemos dividir a la espermatogénesis como proceso en las siguientes etapas: a) Proliferación. b) Crecimiento y meiosis: recombinación, división y reducción. c) Espermiogénesis

A) ESPERMATOGONIAS B) Y C) ESPERMATOCITOS D)ESPERMATIDES a) Proliferación. Este período comprende el desarrollo de las espermatogonias, las cuales se dividen no sólo aumentando la población celular sino manteniendo la población troncal existente. Las divisiones de población espermatogonial llegan en algunas especies hasta ocho. Así, partiendo de una espermatogonia inicial, van surgiendo por divisiones sucesivas grupos de ellas que, normalmente, se encuentran interconectadas por sus citoplasmas. El número final de gonias presentes en un cisto, indicará por lo tanto las veces que se han dividido a partir de la espermatogonia primordial. De esta forma un cisto con doscientas cincuenta y seis gonias revela la existencia previa de ocho divisiones mitóticas. En esta fase de divisiones rápidas y continuas es fácil observar el cariotipo de la especie. b) Crecimiento y meiosis. La meiosis se caracteriza por presentar dos divisiones sucesivas del material hereditario (División I y División II) precedidas por un único período S (de síntesis de ADN). La profase de la primera división meiótica es extremadamente larga pudiendo durar desde días (en machos) hasta años (generalmente en hembras). Para su estudio, se ha dividido en base a la morfología del núcleo celular en varias etapas:

. Durante la prometafase los bivalentes experimentan movimientos de congresión hasta alinearse finalmente en placa en la metafase. En la primera anafase meiótica los cromosomas homólogos, que previamente se han recombinado, migran completos a polos opuestos. Tras una interfase muy corta y a veces inexistente denominada intercinesis, se efectúa la segunda división meiótica. Ésta es esencialmente igual que una división mitótica convencional con la excepción de que cada célula solamente posee un complemento cromosómico de la especie ya recombinado. El resultado final es la formación, por cada una de las células que entró en la profase I, de cuatro células con “n” cromosomas y una carga "c" de ADN: las espermátidas. c) Espermiogénesis. Se conoce con este nombre a toda la serie de cambios tanto citoplásmicos como nucleares que sufren las espermátidas hasta convertirse en espermatozoides. Estos cambios morfofuncionales son muy variables y dependen de la especie estudiada. No obstante, y como rasgos generales, podemos decir que se centran en la compactación de la cromatina en el núcleo, la pérdida de casi la totalidad del citoplasma, la génesis de una vesícula acrosómica y la adquisición de un aparato locomotor por parte de la célula. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA En esta práctica se utilizarán dos tipos diferentes de material de trabajo así como dos metodologías completamente distintas. Por una parte se analizarán las diferentes fases de la espermiogénesis en preparaciones obtenidas mediante la técnica de aplastado a partir de testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético en proporción 3:1. Por otra, estudiaremos la organización de las células que cursan la espermatogénesis y el túbulo seminífero en cortes de testículo de saltamontes fijado con Bouin e incluido en parafina. 1.- Aplastados de testículo de ortóptero teñidos con Feulgen. Seleccionamos testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético 3:1 al menos con una semana de antelación y los colocamos en agua destilada para su hidratación durante 10 minutos. A partir de este momento conviene realizar todo el proceso en el mismo recipiente, preferiblemente plástico y no vidrio. No utilizar ningún elemento metálico. Hidrolizar los testículos en HCl 5N durante 30 min. Transcurrido este tiempo se lavan abundantemente en agua destilada. Posteriormente se introducen en reactivo de Schiff durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este proceso es preferible realizarlo en oscuridad. Se lavan los testículos, que tendrán un color fucsia, en agua sulfurosa y posteriormente en agua del grifo, donde se almacenarán hasta la confección de los aplastados. Separamos un par de túbulos seminíferos del testículo y los colocamos sobre un portaobjetos. Sobre ellos se coloca inmediatamente una gota de ácido acético al 50% en agua destilada y se deja un par de minutos (¡Cuidado, no dejar secar el material!). Se coloca sobre el túbulo un cubreobjetos y utilizando la punta de un lápiz y con presión muy suave se dispersa el material. Con un trozo de papel de filtro se elimina el acético que ha rebosado por los laterales del cubreobjetos y, con cuidado de no moverlo, se realiza el aplastado presionando fuertemente con el dedo pulgar sobre una superficie completamente plana. Observar los aplastados en el microscopio tratando de determinar las diferentes etapas del proceso meiótico, así como las espermátidas en los diferentes estadíos de la espermiogénesis. El análisis de cortes de parafina supone la realización de tres procesos: la inclusión del material en un medio sólido, el corte y desparafinado del mismo y la tinción de los cortes (ver el anexo). Las secciones de testículo se observarán en el microscopio determinando la disposición de los túbulos seminíferos en el conjunto, así como las zonas apicales y basales de los túbulos.

ESPERMATOZOIDES

HERENCIA MENDELIANA (FACTOR Y GRUPO SANGUÍNEO)

X Sesión de Laboratorio

FACTOR Y GRUPO SANGUINEO FUNDAMENTO El fundamento de esta práctica se encuentra en los glóbulos rojos. Los glóbulos rojos o hematíes son células sanguineas, por lo tanto todos los tenemos. Sin embargo, en la membrana de los glóbulos rojos pueden existir unas proteínas especiales: son las glucoproteínas A y B. Así, un glóbulo rojo puede tener proteína A, proteína B, tener ambas o no tener ninguna. De manera que un individuo tendrá grupo sanguíneo A si sus glóbulos rojos tienen la glucoproteína A en su membrana, siguiendo el mismo criterio para el resto de los grupos (si no existe proteína, entonces será de grupo sanguineo O). Estas proteínas corresponderían a lo que denominan antígenos. Ahora bien, en el plasma sanguineo tenemos anticuerpos. Evidentemente, un individuo del grupo A no podrá tener anticuerpos anti-A, pues ésto no sería viable (la sangre coagularía). Así : • • • • •

los individuos A tendrán anticuerpos anti-B los individuos B tendrán anticuerpos anti-A los individuos AB no tendrán anticuerpos de este tipo los individuos O tienen los dos tipos de anticuerpos. los individuos O tienen los dos tipos de anticuerpos.

Grupo sanguineo

A

B

AB

O

Glóbulos rojos

En la membrana En el plasma

Antígeno A Anti-B

Antígeno B Anti-A

Antígenos A y No antígenos B Anti-A y No anticuerpos Anti-B

De la misma manera, el factor Rh es otra proteína que existe en los glóbulos rojos de algunas personas. Su nombre viene del mono en el que fue descubierta, el macacco rhesus. El factor Rh positivo es un factor hereditario dominante. Este asunto tiene especial importancia en donaciones de sangre. Como hemos visto, un individuo A tiene en su plasma anticuerpos anti-B, así que no podrá recibir sangre de un individuo B, pues estos anticuerpos provocarían la coagulación de la sangre del donante en los vasos sanguineos de la persona receptora. En la siguiente tabla vemos las compatibilidades a la hora de donar y recibir sangre. Como vemos, el grupo AB puede recibir de cualquier otro grupo y de sí mismo, así que se llama "receptor universal". El grupo O ,sin embargo, puede donar a cualquier grupo, así que se conoce como "donante universal"

RECEPTOR grupo A grupo B grupo AB grupo O D O grupo A SI NO SI NO N grupo B NO SI SI NO A NO SI NO N grupo AB NO T grupo O E

SI

SI

SI

SI

OBJETIVOS 1. Que cada alumno y alumna del grupo conozca su grupo sanguineo y el factor rh. 2. Presenciar la técnica que se utiliza para determinar el grupo sanguineo. (Esta determinación debe ser realizada por el profesor o profesora) 3. Interpretar dicha técnica MATERIALES • • •

Solución anti-A Solución anti-B Solución anti-D(anti Rh)

• • •

Material punzante estéril Algodón Agua oxigenada

•

Tarjetas de identificación

•

Una gota de sangre

TECNICA

1. Colocar en la tarjeta una gota se suero anti-A, una de anti-B, una mezcla de anti-A y anti-B, y una gota de anti-D, cada una en su casilla correspondiente, como se indica en la FIGURA 1.

FIGURA 1 2. Pinchar la yema del dedo, previa desinfección con alcohol o agua oxigenada. Depositar una gotita de sangre en cada casilla y mezclar con los sueros. FIGURA 2.

FIGURA 2 3. Observar los resultados. El grupo sanguineo del individuo corresponderá con el de la casilla en la que la sangre haya coagulado. Si el individuo es del grupo AB, la sangre coagulará en las tres primeras casillas. Además, si la sangre coagula en la casilla "anti-D", el individuo será Rh positivo, de lo contrario será Rh negativo. Personalmente, prefiero hacer la determinación del factor Rh en un porta, en el que puedo observar mejor la coagulación sanguinea. FIGURA 3.

FIGURA 3 � En las tarjetas de la FIGURA 4, se puede observar el aspecto que presentan dos casos opuestos. En la tarjeta superior se observa que no existe coagulación en ninguna casilla. Las tres primeras corresponden a los sueros del grupo sanguineo, por lo que interpretamos que esta persona pertenece al grupo O, la cuarta es la del factor Rh, y al no existir coagulación interpretamos que es Rh negativo. En la tarjeta inferior, vemos coagulacion en todas las casillas, por lo que de una forma similar interpretamos que el alumno es del grupo sanguineo AB y Rh positivo. (Nota: El grupo sanguineo AB es poco frecuente, y en el análisis a 45 alumnos y alumnas, solamente salió en una alumno)

FIGURA 4

•

los individuos O tienen los dos tipos de anticuerpos.

Grupo sanguineo

A

B

AB

O

Glóbulos rojos

En la membrana

Antígenos A y No antígenos B Anti-A y En el plasma Anti-B Anti-A No anticuerpos Anti-B De la misma manera, el factor Rh es otra proteína que existe en los glóbulos rojos de algunas personas. Su nombre viene del mono en el que fue descubierta, el macacco rhesus. El factor Rh positivo es un factor hereditario dominante. Antígeno A

Antígeno B

Este asunto tiene especial importancia en donaciones de sangre. Como hemos visto, un individuo A tiene en su plasma anticuerpos anti-B, así que no podrá recibir sangre de un individuo B, pues estos anticuerpos provocarían la coagulación de la sangre del donante en los vasos sanguineos de la persona receptora. En la siguiente tabla vemos las compatibilidades a la hora de donar y recibir sangre. Como vemos, el grupo AB puede recibir de cualquier otro grupo y de sí mismo, así que se llama "receptor universal". El grupo O ,sin embargo, puede donar a cualquier grupo, así que se conoce como "donante universal"

RECEPTOR grupo A grupo B grupo AB grupo O D O grupo A SI NO SI NO N grupo B NO SI SI NO A NO SI NO N grupo AB NO T grupo O SI SI SI SI E

EXPERIMENTOS CON LA MOSCA DROSOPHILA

XI Sesión de Laboratorio

EXPERIMENTOS CON LA MOSCA DROSOPHILA FUNDAMENTO

La mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, es un organismo eucariótico de experimentación en Genética. Tiene las siguientes ventajas: 1) un ciclo vital relativamente corto a temperatura ambiente, entre 10-14 días; 2) es fácil de criar en botellas o tubos de vidrio con un medio de cultivo barato y sencillo de preparar; 3) una gran productividad, una pareja produce varios cientos de descendientes; 4) un número cromosómico bajo, 4 pares de cromosomas; y 5) un gran número de caracteres heredables que afectan la morfología del adulto. Los objetivos de este práctico es introducir al estudiantes en aspectos de la biología y genética en D. melanogaster. Se realizarán cruzamientos genéticos para estudiar el modo de herencia,ubicación y mapeo de un locus incógnita en D. melanogaster. El practico permitirá elaborar un informe final en base a las observaciones y el análisis de los datos de los cruzamientos realizados en clase y discutidos por el grupo participante. Dada la dinámica de los prácticos de Drosophila, se recomienda LEER el protocolo antes de asistir a clase. Se trabajará en grupos de tres a cuatro estudiantes. OBJETIVOS

En este práctico se observará distintos aspectos del _ objetivos generales del práctico _ ciclo de vida, _ reconocimiento de los sexos, _ comportamiento sexual, _ observación de mutantes que afectan el fenotipo del adulto, y

_ técnica de anestesia, manejo y observación de las moscas. Ciclo de Vida D. melanogaster (Clase: Insecta; Orden: Diptera) es un insecto holometábolo, su ciclo vital consta de cuatro estadios: huevo, larva, pupa y adulto (o imago) (FIGURA 1). Las hembras comienzan a depositar los huevos alrededor del tercer día de vida del imago y continúa hasta su muerte. Los huevos son puestos en la superficie del alimento (o medio de cultivo). A simple vista los huevos se ven como un objeto pequeño, blanco y oblongo, con un par de filamentos anteriores. El desarrollo del huevo comienza con la fecundación y consta principalmente de la formación de los tejidos larvales. Después de un día o dos, las larvas emergen de los huevos y comienzan a introducirse en el medio de cultivo. Como la cutícula de los insectos no es elástica, la larva muda periódicamente. Existen tres estadíos larvales, separados por las mudas correspondientes. Durante el tercer estadio larval, la larva se alimenta hasta estar pronta a pupar, en ese momento, se dirige fuera del medio de cultivo hacia un lugar seco donde se detiene. .Durante el estadio pupal ocurre una reorganización de tejidos (metamorfosis) y a los 4 días emerge el adulto de la cubierta pupal. En buenas condiciones de cultivo y a 25°C transcurren alrededor de 10 días desde la puesta de los huevos hasta la emergencia del imago; el adulto puede sobrevivir y permanecer fértil por un mes. Si la temperatura permanece entre 22°C y 27°C, se producirá una nueva generación de moscas en aproximadamente 2 semanas (por ello el practico se realiza cada 15 días, para sincronizar con el ciclo de vida). Medio de cultivo Las moscas se pueden cultivar en un medio compuesto por agar-levadura-harina de maíz-glucosa. A la papilla se le agrega un conservante conocido como nipagin. Este medio se dosifica en tubos o botellas de vidrio o plástico. Los tubos son identificados con el tipo de cruzamiento, fecha ynombre del grupo. Procedimiento para anestesiar las moscas

Para adormecer las moscas utilizaremos los vapores de trietilamina (=TE). Se procederá así: 1) Dosifique entre 10 y 15 gotas de trietilamina (TE) en una piseta con algodón dentro. Note que los vapores que saldrán estarán impregnados de fuerte olor. 2) Transfiera las moscas a un tubo de plástico (Falcon) anestesiador (=TA),, tape el mismo con un tapón de polifom y dosifique vapores de TE dentro de dicho tubo por el orificio del tapón. 3) Una vez que TODAS las moscas estén inmovilizadas, deposítelas inmediatamente sobre una tablilla. Las moscas permanecerán anestesiadas por 45’. La exposición prolongada a TE puede matar las moscas y se presentarán con alas y patas extendidas en ángulo recto del cuerpo y Mutante incógnita en D. melanogaster – 2006 4 algunos caracteres fenotípicos, como los ojos, se oscurecerán y deformarán, en tal caso descarte las moscas muertas. 4) En caso de utilizar las moscas anestesiadas para realizar un cultivo o cruzamiento, disponga el frasco de cultivo en forma horizontal hasta que las moscas se despierten. Identificación de los sexos Se pueden utilizar varios criterios para distinguir los sexos en los adultos (FIGURA 2) 1. Tamaño del adulto. La hembra es generalmente más grande que el macho. 2. Forma del abdomen. El abdomen de la hembra se curva y termina en punta; el abdomen del macho es redondeado y más corto. 3. Marcas en el abdomen. Bandas claras y oscuras alternan en la porción posterior de la hembra; mientras que en el macho están fusionados y forman una banda oscura. 4. Apariencia del peine sexual. En los machos existe un pequeño penacho de setas en el segmento basal del tarso en el primer par de patas llamado “peine sexual”, es el único carácter sexual secundario que diferencia los machos jóvenes de las hembras. El "peine sexual" también sirve para sexar individuos en pupas.

5. Genitalia externa del abdomen. La genitalia es un carácter sexual primario y característico de cada sexo. En las hembras se encuentra el ovipositor en la punta del abdomen. En el macho existen ganchos pigmentados, ordenados en forma circular y localizados en el extremo caudal. 6. Órganos sexuales durante el estadio larval. Los sexos en larvas se diferencian por el tamaño de los testículos (más grandes) que los ovarios ubicados en el tercio posterior de la larva y distinguidos a través del tegumento en larvas de tercer estadio. En moscas recién emergidas de la carcasa pupal, el color es grisáceo, las bandas dorsales del abdomen se oscurecerán más tarde, las alas pueden no estar extendidas y aparecerán como una estructura oscura y húmeda, las alas luego se secan y despliegan. El proceso se acelera bajo el calor de la luz del microscopio. Podrán ver las alas desplegadas en un período de 5-10 minutos. Utilice un pincel o espátula para mover las moscas. Comportamiento sexual Todos los insectos muestran una compleja repuesta a estímulo sexual; Drosophila no es la excepción. El apareamiento comienza con el golpeteo del macho sobre el abdomen de la hembra, con su pata anterior, cono conocido como la primera respuesta del cortejo del macho hacia la hembra. Este es el modo de identificar su propia especie. Se aproxima a la hembra desde adelante y realiza círculos alrededor de ella efectuando medias vueltas. Extiende un ala que hace vibrar por unos segundos. Si la hembra es receptiva resulta la cópula. Los espermatozoides del macho son depositados en el útero de la hembra y retenidos allí en el receptáculo seminal y la espermateca. Puede existir más de un apareamiento. ¿Cómo podemos observar el cortejo de Drosophila melanogaster? Para observar el comportamiento de cortejo, se debe emplear hembras vírgenes ya que el macho puede aparearse muchas veces. Para ello se les proporcionarán hembras vírgenes y machos jóvenes. Observe las diferentes etapas del cortejo y la copula.

Procedimiento para observar las moscas al microscopio Mutante incógnita en D. melanogaster - 2006 5 Ajuste el microscopio MENOR aumento, haga FOCO. Si es necesario, aumente la magnificación. Coloque las moscas anestesiadas en fila horizontal sobre la tablilla blanca. No coloque la luz muy cerca de las moscas, el calor excesivo las deshidratará y acabará matándolas. Identifique la morfología de las moscas y el reconocimiento de los sexos con la ayuda de la FIGURA 2 Y 3. Cabeza La cabeza está compuesta de seis segmentos fusionados. 1. Antenas, cada una consiste de tres segmentos 2. Aristas. ramificadas y surgiendo cerca de la base del segmento distal de cada antena. 3. Proboscis. lengua. 4. Ojos compuestos, constituidos por un gran número de facetas separadas (omatidia). 5. Ocelos, ojos simples en número de tres ubicados entre los ojos compuestos sobre la superficie dorsal de la cabeza. 6. Setas. Vibrillas, orbitales, ocelares, verticales, postverticales. Torax El tórax está compuesto de tres segmentos fusionados. 1. Protórax, consiste de húmeros pares, y el primer par de patas (cada pata consiste de coxa,trocánter, fémur, tibia y 5 articulaciones tarsales; recuerde que el "peine sexual" está presente solamente en el segmento proximal del tarso en los machos). 2. Mesotórax, consiste del mesonoto ubicado dorsalmente y el escutelo, la mesopleura ubicada lateralmente, la pteropleura y la esternopleura; las alas (observe la posición general de las venas longitudinales y de los nudos); y el segundo par de patas. 3. Metatórax, consiste en el mesonoto, hipopleura y los balancines (alas posteriores modificadas) y el tercer par de patas.

4. Espiráculos torácicos, en número de dos. 5. Setas: dorsocentrales, notopleurales, presuturales, supraalares, postalares, escutelares. Abdomen El abdomen consiste de siete u ocho segmentos visibles en la hembra y cinco ó seis en el macho. 1. Tergitos, escleritos dorsales (placas tegumentales) una por segmento. 2. Esternitos, escleritos ventrales, uno por segmento (numero diferente entre los sexos) 3. Espiráculos abdominales, siete en cada lado del abdomen. 4. Región genital, arco genital en machos. LOS CARACTERES HEREDITARIOS Antes de observar los mutantes, uno necesita familiarizarse con el aspecto del tipo salvaje de Drosophila, es decir, el más frecuentemente encontrado en poblaciones naturales. Se conocen miles de mutaciones en Drosophila pero se enumerarán solo aquéllas relevantes a esta práctica. Ojos Tipo salvaje: rojos, de forma oval y con muchas facetas. Mutantes: cambios en el color, forma y número de facetas. Alas Tipo salvaje: bordes lisos, venación uniforme, se extienden más allá del abdomen. Mutantes: cambios en tamaño y forma; ausencia de venas específicas; cambios en la posición de las alas en la posición de descanso. Setas Tipo salvaje: Largas y suaves (nótese la distribución en la cabeza y el tórax). Mutantes: más cortas, gruesas ó deformadas, pueden cambiar su distribución. Mutante incógnita en D. melanogaster - 2006 6 Color del cuerpo Tipo salvaje: básicamente gris, con un patrón de áreas claras y oscuras. Mutantes: negro (variando los grados), amarillo, el color mutante puede ser determinado mas claramente observando el color de las venas de las alas, cetas del cuerpo y las patas. EL GENOMA DE DROSOPHILA D. melanogaster tiene cuatro pares de cromosomas: los cromosomas sexuales X/Y y los autosomas 2, 3 y 4.

El cuarto cromosoma (o”dot”) es el más pequeño. El par sexual en hembras es XX, y en machos XY. Individuos X0 son machos, pero estériles aunque su aspecto sea normal, mientras que individuos XXY producen hembras normales y fértiles El tamaño del genoma de Drosophila es alrededor de 165 millones de bases y estimado unos 14.000 genes (por comparación, el genoma humano tiene 3.300 mb y unos 70.000 genes). El genoma ha sido completamente secuenciado y esta en curso la secuenciación y anotación del genoma de otras 11 especies de Drosophila. La posición relativa de muchos genes de D. melanogaster a lo largo de los cromosomas ha sido identificada y mapeada basándose en la frecuencia de recombinación con los genes vecinos. Esta ubicación se denomina mapa de ligamiento o mapa genético.

CROMOSOMAS POLITENICOS

CROMATINA SEXUAL Y CARIOTIPO HUMANO

XI Sesión de Laboratorio

CROMATINA SEXUAL Y CARIOTIPO HUMANO FUNDAMENTO Pasaron muchos años antes de que pudiera establecerse una diferencia entre las células masculinas y las femeninas durante la interfase. Pero gracias a los trabajos experimentales en neurofisiología, de Barr y Bertram (1949), se observó por primera vez una diferencia morfológica entre las células de las gatas y los gatos. Las primeras, presentan un pequeño corpúsculo de una a dos micras de diámetro, adherido a la membrana nuclear, que no aparece en las células masculinas normales y que durante mucho tiempo se denominó corpúsculo de Barr. Por las relaciones que guarda con la presencia de los cromosomas X, a este cromocentro se le llama actualmente cromatina X. Muy rápidamente, las observaciones realizadas por Barr se replicaron en otros tejidos por diferentes investigadores, lo que condujo al mejoramiento de los métodos de estudio de esta cromatina en individuos sanos y enfermos. De estos últimos, se realizaron estudios en individuos que presentaban alteraciones o fallas en la diferenciación sexual con síndromes como el Turner y klinelfelter El desarrollo de estos métodos permitió además, estudiar una gran diversidad de células para la observación de la ahora llamada cromatina sexual, tal es el caso de los neutrófilos, las neuronas, la mucosa vaginal y como en el caso de esta práctica células de la mucosa bucal. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL • Observar la cromatina sexual en células humanas masculinas y femeninas OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Reconocer el cuerpo de Barr en células de la mucosa bucal. • Comprender la importancia de la cromatina sexual en aquellos síndromes que cursan con problemas de diferenciación sexual. MATERIALES • Espátula metálica o de madera con extremo redondeado • Solución fijadora: 3 partes de etanol al 95% + 1 parte de ácido acético glacial. • Cubetas de coloración • Aceto-orceína • Papel filtro • Láminas y laminillas. • Gasa

PROCEDIMIENTO 1. Limpie la mucosa de la cavidad oral con un pedazo de gasa. El paciente debe mantener la boca abierta y disponer la lengua en el lado opuesto al que va a ser frotado. 2. Para el frotis de la mucosa se utiliza la espátula. Este debe hacerse con presión moderada, asegurándose de obtener una capa de material blanquecino. 3. El material de la espátula se extiende delgada y suavemente sobre una lámina y ésta se sumerge inmediatamente en la solución fijadora. Pueden obtenerse tres láminas de cada lado de la boca. 4. Las láminas pueden permanecer en el fijador entre un minuto y una semana. 5. Las láminas se colocan en una cubeta de coloración y el colorante acetoorceína se aplica por 10 minutos. Sí solo cuenta con orceína en el laboratorio, entonces adicione a 1gramo de esta 45 mL de ácido acético concentrado; caliente hasta ebullición, deje enfriar y filtre para obtener la aceto-orceína. 6. Se dispone una laminilla sobre la lámina y el colorante en exceso se remueve aplicando papel de filtro y ejerciendo firme presión. 7. Observe inmediatamente con el objetivo de menor aumento, para buscar áreas donde las células estén bien extendidas. 8. Observe con el objetivo de mayor aumento (o inmersión) e identifique las estructuras ligeramente alargadas o plano-convexas, adyacentes a membrana nuclear de coloración oscura en comparación con el resto del núcleo. CUESTIONARIO �Consulta, que otras patologías diferentes a los síndromes de Turner y klinelfelter, están relacionados con la cromatina sexual. � ¿Cual es el patrón de herencia de las patologías consultadas?. � Investiga acerca de los genes holándricos y su importancia Biomédica. � ¿Que otros métodos diferentes al utilizado en esta práctica, se pueden utilizar para identificar cromatina sexual?. � Investiga sobre las aplicaciones que en medicina legal tiene la determinación de cromatina sexual.

CUERPO DE BAR

Cariotipo Las características más importantes que identifican los cromosomas durante la mitosis son su número, tamaño relativo, estructura, comportamiento y organización interna. Cariotipo es el complemento o conjunto cromosómico típico del individuo o de la especie en el que se describe el número, forma y tamaño de los mismos. El cariotipo se perpetúa normalmente en la progenie (Battaglia, 1953). Es decir, en términos generales, se admite la constancia en forma, tamaño y número de los cromosomas, en todas las células que componen el núcleo de un individuo y en los individuos de cada especie. En el cariotipo se ordenan los pares de homólogos en series, de acuerdo a su longitud, en forma creciente. La representación esquemática del cariotipo se conoce con el nombre de Idiograma.

El análisis de la morfología cromosómica se lleva a cabo en el estado de metafase que es el momento en el que los cromosomas presentan el mayor grado de espiralización, y compactación. Es en este estado también cuando muestra las mejores condiciones de tinción con tintes que presentan afinidad por los ácidos nucleicos; razón que favorece aún más el estudio citogenético de una determinada especie en esta fase del ciclo de división celular. Para confeccionar un cariotipo se deben tener en cuenta: 1.-Número básico de cromosomas. 2.-Morfología cromosómica 1.-Número básico de cromosomas En principio, todos los individuos de una especie tienen el mismo número de cromosomas. Dos especies distintas pueden tener el mismo número de cromosomas. 2.-Morfología de los cromosomas En la morfología de los cromosomas distinguimos: 2.1.-Posición del centrómero 2.2.-Localización de satélites y constricciones secundarias 2.3.-Distribución de regiones hetero y eucromáticas 2.1.-Posición del centrómero La morfología depende de la posición del centrómero. Según sea la posición del centrómero: Posición media, submedia, subterminal o terminal los cromosomas se clasificarán en: a)metacéntricos o isobraquiales (centrómero equidistante de los extremos, brazos de igual longitud). b)submetacéntricos o heterobraquiales (centrómero muy próximo al centro) acrocéntricos o cefalobraquiales (centrómero muy próximo a un extremo) d)telocéntricos (centrómero terminal, no se puede hablar propiamente de constricción, ni de brazos, sólo existe un brazo) La posición del centrómero o constricción primaria se calcula teniendo en cuenta los siguientes parámetros: c= largo total del cromosoma l= largo del brazo mayor s= largo del brazo menor y la posición será igual a: c = l + s d = c – s El índice centromérico es: i = (s x 100)/ c

95

c) 96

PRACTICA . . . . . .

La lámina 1 representa un cariotipo humano. Recorta cada uno de los cromosomas. Agrúpalos de acuerdo con su tamaño, forma y bandas de tinción. Identifica cada pareja de homólogos ayudándote del cariotipo ordenado de la lámina 2. Pega cada pareja en la plantilla vacía de la ficha del alumno.

LAMINA PARA RECORTAR PRACTICA . . . . .

La lámina 1 representa un cariotipo humano. Recorta cada uno de los cromosomas. Agrúpalos de acuerdo con su tamaño, forma y bandas de tinción. Identifica cada pareja de homólogos ayudándote del cariotipo ordenado de la lámina 2. Pega cada pareja en la plantilla vacía de la ficha del alumno.

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ESTUDIO DEL CARIOTIPO HUMANO FICHA DEL CURSO______

ALUMNO___________________________________________

1. ¿Cuántos pares de cromosomas tiene la especie humana? 2. ¿Cuál es el sexo del individuo cuyo cariotipo has investigado? Razona la respuesta. 3. ¿A qué se denominan autosomas? 4. ¿Tiene algo que ver el número de cromosomas de una especie con su tamaño? Pon ejemplos. 5. ¿Qué es una anomalía cromosómica?

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RELACION DE PAGINAS WEBS RELACIONADAS CON LA BIOLOGIA CELULAR COMPILACION: J FRANCO http://gened.emc.maricopa.edu/bio/bio181/BIOBK/BioBookTOC.html Curso general sobre biología

http://www.whfreeman.com/lodish/ Página del libro “Molecular cell biology”, con buenas imágenes, esquemas y videos http://www.cbs.dtu.dk/dave/roanoke/biology101_unit1.html - 28_Jan_98 Completo curso de biología celular, con numerosos esquemas, fotografías y enlaces http://cellbio.utmb.edu/cellbio/cellsch.htm Curso interactivo sobre biología celular con numerosos esquemas y microfotografías http://www.cytochemistry.net/Cell-biology/ Atlas de microanatomía y biología celular (muy buenas fotos y esquemas) http://www.mblab.gla.ac.uk/~julian/Dict.html Completo diccionario en línea de biología celular http://www.my-edu2.com/eduframe.htm Colección de enlaces relacionados con la biología http://www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/T/TOC.html Curso de biología celular http://www.unl.edu/CMRAcfem/glossary.htm - lens Glosario de términos relacionados con la microscopía, con algunos esquemas y enlaces http://ntri.tamuk.edu/cell/ Curso sobre biología celular, con numerosos esquemas y microfotografías http://www.kean.edu/~biology/lab_help.html Curso general sobre biología http://www.life.uiuc.edu/help/courses.html Cursos sobre biología http://web.idirect.com/~klg/biology.html Colección de enlaces sobre biología http://www.biology.arizona.edu/default.html Curso de biología incluyendo biología celular, bioquímica, desarrollo, etc http://esg-www.mit.edu:8001/esgbio/ Hipertexto de biología celular http://www.cbc.umn.edu/~mwd/cell_www/cell.html Curso en línea de biología celular

http://highered.mcgrawhill.com/sites/0070271348/student_view0/chapter27/elearning.html Curso sobre Biología con muy buenos documentales para visualizar con Real Player Biology Interesante página que acumula gran cantidad de animaciones sobre procesos biológicos básicos

http://www.lifesign.ac.uk/public/catalogue/default.asp?cat=Biochemistry Colección de documentales y animaciones (algunos de casi una hora de duración) sobre importantes procesos en Biología Celular, Bioquímica, Microscopía, etc. http://www.ibiblio.org/virtualcell/index.htm Página sobre una visita virtual a la célula, con muy buenos dibujos y animaciones. Incluye además un “libro virtual” sobre química orgánica y biología celular. Puede descargarse completa en un archivo comprimido e instalarla en el propio ordenador. http://www.ulb.ac.be/sciences/biodic/index.html Galería de imágenes ultraestructurales

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http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/jairo/celular/cell2.htm Completo curso en español sobre biología celular http://www.bioanim.com/ Interesante página la que se pueden encontrar numerosos modelos interactivos en 3D sobre biología celular e histología http://www2.uah.es/biologia_celular/LaCelula/Celula.html Página dedicada al estudio de los componentes celulares http://www.life.uiuc.edu/plantbio/cell/ Visita virtual a una célula vegetal, recorriendo todos sus orgánulos http://www-sci.lib.uci.edu/~martindale/MedicalAnatomy.html Completa colección de enlaces con todo lo relacionado con histología, anatomía, técnicas, etc http://www.kumc.edu/instruction/medicine/anatomy/histoweb/ Página atlas de histología con imágenes comentadas de diversos tejidos y órganos al microscopio óptico http://biodidac.bio.uottawa.ca/info/browse.htm Colección de imágenes macro y microscópicas y esquemas de animales y vegetales http://teaching.anhb.uwa.edu.au/mb140/ Completa página atlas de histología con descripciones de las imágenes, acompañada de preguntas de examen. También incorpora un microscopio virtual para practicar el manejo y un resumido curso de estereología http://www.uni-mainz.de/FB/Medizin/Anatomie/workshop/EM/EMAtlas.html Atlas al microscopio electrónico de citología, histología y organografía microscópica. Incluye imágenes y videos del Visible Human, así como un completo glosario. Algunas de las subpáginas están en alemán. http://www3.usal.es/histologia/histologia.htm Completo programa para la enseñanza de la histología y organografía, a base de dibujos y microfotografías http://www.mc.vanderbilt.edu/histo/ Página con texto e imágenes comentadas al microscopio óptico y electrónico de diversos tejidos y órganos http://medocs.ucdavis.edu/CHA/402/course.htm Atlas histológico con variadas microfotografías comentadas. Contiene laboratorios c imágenes interactivas al microscopio electrónico http://www.unomaha.edu/~swick/index.html Página para la enseñanza de la histología y organografía con texto e imágenes comentadas http://www.med.uiuc.edu/histo/atlas/index.htm Completa página interactiva de enseñanza de la histología con numerosas imágenes comentadas al microscopio óptico y electrónico, sobre las que se puede hacer zoom y obtener información de cada zona, interactivamente con el ratón http://www.meddean.luc.edu/lumen/index.html Página para la enseñanza de la histología, mediante imágenes al microscopio óptico y electrónico, con sus correspondientes comentarios http://online-media.uni-marburg.de/histologie/introhis/HIS/his.htm Muy buenas imágenes al microscopio electrónico de citología e histología humana. Otras al óptico, a manera de atlas, con breves explicaciones de cada una http://www.medinfo.ufl.edu/year1/histo/glossary.html - reticular_fiber Completo glosario de términos de histología, con imágenes al microscopio óptico http://www.uq.edu.au/nanoworld/images_1.html

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Catálogo de numerosas imágenes, tanto de zoología como de botánica, al microscopio electrónico de transmisión y barrido, con sus comentarios http://www.udel.edu/Biology/Wags/histopage/histopage.htm Atlas de imágenes histológicas al microscopio óptico y electrónico (numerosas), además de esquemas en dos y tres dimensiones de cada tejido y órgano http://www.medinfo.ufl.edu/year1/histo/ Tutorial de histología con texto e imágenes, expuesto en forma de preguntas de examen http://www.medsch.wisc.edu/anatomy/histo/htm/toc.htm Atlas con imágenes de los diversos tejidos y órganos al microscopio óptico, comentadas e ilustradas http://www.bu.edu/histology/m/index.htm Atlas de histología con numerosas imágenes interactivas y esquemas de los diferentes aparatos y sistemas http://www.vh.org/Providers/Textbooks/MicroscopicAnatomy/MicroscopicAnatomy.html Completo atlas de histología y organografía, acompañado de una parte donde se comentan las principales técnicas de preparación de muestras y tinción http://casweb.cas.ou.edu/pbell//Histology/Outline/contents.html Atlas de histología y organografía, con muy buenas imágenes al M.O. incluyendo manuales de tinción y manejo del microscopio http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar/index.asp Página en español sobre histología, microscopía y técnicas, descritas en una serie de módulos, con numerosas imágenes. http://www.e-histologia.unileon.es/1inicio/home/Inicio800x600.html Página en español sobre histología y organografía mciroscópica animal. Con numerosas imágenes interactivas muy didácticas. Incluye además un apartado de técnicas y una interesante autoevaluación, para comprobar los conocimientos adquiridos http://www.uniovi.es/~morfologia/Atlas/es/download.htm Página de la Universidad de Oviedo, desde donde se puede descargar (HTTP) Instalador Windows (40MB) un atlas interactivo de histología. Seguidamente se intala en el ordenador y se puede consultar cuando se desee

http://escuela.med.puc.cl/paginas/Cursos/segundo/histologia/HistologiaWeb/indice General.html Completa página sobre histología, con abundante texto e imágenes de buena calidad http://www.sct.ub.es:801/Galeria/Galeria.htm Galería de imágenes de microscopía electrónica y confocal, con algunas animaciones de éste último http://www.botany.uwc.ac.za/sci_ed/pupil/angiosperms/index.htm Anatomía e histología vegetal, con dibujos, microfotografías y preguntas http://atlasveg.ib.usp.br/ Atlas interactivo de histología vegetal http://koning.ecsu.ctstateu.edu/Plant_Biology/schedule.html Curso sobre anatomía y fisiología vegetal http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e00/contents.htm Microscopía, citología, histología y bioquímica vegetal, con numerosas imágenes al ME y modelos moleculares en 3D, que pueden girarse en el espacio http://images.botany.org/ Colección de microfotografías comentadas sobre histología vegetal http://www.life.umd.edu/classroom/bsci124/main.html

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Citología y fisiología vegetal http://149.152.32.5/Plant_Physiology/schedule.html Cursos sobre anatomía y fisiología vegetal http://128.171.207.10/faculty/webb/BOT410/anatweb/pages/default.htm Una de las mejores páginas sobre histología vegetal, incluyendo además tutoriales para manejo de microscopio y algunas aplicaciones informáticas http://www.esb.utexas.edu/mauseth/weblab/ Colección de microfotografías sobre histología vegetal http://www.wisc.edu/botit/img/bot/130/ Amplio directorio de micro y macrofotografías http://www.unex.es/botanica/presenta.htm Curso sobre botánica, incluyendo histología, con numerosos esquemas y dibujos animados http://bugs.bio.usyd.edu.au/2003A+Pmodules/ Atlas de histología vegetal http://www.cas.muohio.edu/~meicenrd/ANATOMY/syllabus.html Curso sobre histología vegetal, con numerosos esquemas y microfotografías http://www.cas.muohio.edu/~meicenrd/tcourses.htm Acceso a varios cursos sobre botánica e histología vegetal

http://157.88.160.17/web/materiales/web/histologia/inicio_real.htm Atlas histológico interactivo, en español, con abundante texto y numerosas imágenes http://www.biologia.edu.ar/plantas/indplantas.htm Curso sobre citología, histología, organografía y fisiología vegetal, con texto explicativo, esquemas, imágenes y algunas animaciones. En la misma página pueden encontrarse varios cursos sobre otros temas biológicos http://www.dipbot.unict.it/tavole/index.html Atlas interactivo con gran cantidad de imágenes e información complementaria. En italiano http://botit.botany.wisc.edu/images/130/ Completo atlas de histología vegetal http://www.inea.uva.es/web/materiales/web/histologia/inicio_real.htm Completa página sobre citología, histología y organografía vegetal con muy buenas imágenes http://www.biologia.edu.ar/botanica/index.html Completo curso sobre histología y organografía vegetal http://anubis.ru.ac.za/virtualplant/ANATOMY/B1PR2000.htm Completo curso sobre citología, histología y organografía vegetal. Cuenta con sesiones prácticas con imágenes comentadas de preparaciones microscópicas http://botweb.uwsp.edu/anatomy/ Atlas fotográfico de anatomía vegetal. Incluye numerosas macro y microfotografías http://www.euita.upv.es/varios/biologia/programa.htm Extensa colección de apuntes de histología vegetal, con numerosos esquemas ilustrados INSTRUMENTOS Y TÉCNICAS http://www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/ Microscopía confocal y de fluorescencia

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http://www.leica-microsystems.com/llt_index.html Página de la casa Leica, sobre fundamentos de este microscopio y modelos http://www.denniskunkel.com/ Curiosas microfotografías con microscopía de barrido y posibilidad de manejar virtualmente uno de estos microscopios http://www.nottingham.ac.uk/pathology/default.html Completa colección de técnicas de tinción, con sus correspondientes protocolos http://www.cs.ubc.ca/spider/ladic/intro.html Página de introducción al funcionamiento del microscopio confocal, preparación de muestras y procesado de las imágenes http://bris.ac.uk/pathandmicro/cpl/lablinks.html Manual de técnicas de preparación de muestras y tinción http://wwwcivm.mc.duke.edu/civmGallery/L1Gallery.html Fundamentos de la microscopía de resonancia magnética y completa galería de imágenes animadas http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html Una de las mejores páginas sobre microscopía, con amplios textos sobre los diversos tipos de microscopios y su funcionamiento. Numerosos tutoriales en java sobre el manejo de distintos microscopios. Se puede descargar un completo manual sobre microscopía en formato Acrobat. http://www.mos.org/sln/sem/ Descripción y funcionamiento del microscopio electrónico de barrido y galería de imágenes http://www.mse.iastate.edu/microscopy/home.html Fundamentos del microscopio electrónico de barrido, descripción del funcionamiento con numerosos esquemas. Galería de imágenes http://em-outreach.sdsc.edu/web-course/toc.html Completo tratado sobre microscopía electrónica: fundamentos, microscopios, preparación de muestras y procesado digital de las imágenes http://www.btrip.mednet.ucla.edu/bri/homepage.htm Fundamentos teóricos de microscopía óptica, fluorescencia y confocal http://www.unl.edu/CMRAcfem/em.htm Descripción y fundamento de los microscopios electrónicos de transmisión y barrido

http://www.library.cornell.edu/preservation/tutorial-spanish/contents.html Completo tutorial de digitalización de imágenes, donde se explican los términos básicos http://www.scioncorp.com/frames/fr_download_now.htm http://rsb.info.nih.gov/ij/ Direcciones desde donde pueden descargarse dos programas de análisis de imagen (Scion Image e ImageJ) respectivamente http://www-medlib.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTO.html Se describen numerosos protocolos de tinción y otras técnicas histológicas http://swehsc.pharmacy.arizona.edu/exppath/index.html Página con numerosos enlaces relacionados con microscopía y técnicas http://olan.marseille.inserm.fr/confocal/plus-conf.html#principe Principios sobre la microscopía confocal y la fluorescencia http://www.udel.edu/Biology/Wags/b617/b617.htm Completa página sobre técnicas relacionadas con la microscopía electrónica y digitalización de imágenes http://www10.uniovi.es/spi/tutoriales.htm

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Tutoriales sobre el fundamento de la microscopía confocal y de fluorescencia y el procesado digital de imágenes http://www.uniovi.es/bos/Asignaturas/TecnicasImagen/index.html Incluye abundante información sobre técnicas histológicas, de microscopía y análisis de imagen, además de numerosos enlaces con otras interesantes páginas http://nobelprize.org/physics/educational/microscopes/1.html Presenta los fundamentos de los diferentes microscopios, además de la posibilidad de utilizarlos de forma virtual, explorando diferentes muestras con gran realismo http://www.gonda.ucla.edu/bri_core/homepage.htm Principios de microscopía óptica, electrónica, de fluorescencia y confocal. http://photonics.cnb.uam.es/Photonic_sp/Review/formacion.htm Completa página en español con información sobre fundamentos de análisis de imagen y fundamentos de diversas técnicas de microscopía avanzada. http://www.sct.ub.es:801/Galeria/Galeria.htm Galería de imágenes de gran calidad, obtenidas con microscopios confocal y electrónicos.

ANEXO

PREPARACION DE REACTIVOS

1. Acido-Alcohol: (decolorante para tinción Ziehl-Neelsen) o Ácido clorhídrico concentrado ..........................................................3 ml o Etanol 95% ....................................................................................97 ml 2. Azul de metileno: Colorante de contraste para tinción de flagelos. o Azul de metileno................................................................................1 g o Agua destilada...............................................................................10 0 ml 3. Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples. o Solución de hidróxido potásico al 1%.................................................1 ml o Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................30 ml o Agua destilada...............................................................................10 0 ml 4. Colorante para esporas: o Solución acuosa saturada de verde malaquita

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5. Colorante para flagelos de Leifson: o Solución A  Fucsina básica .........................................................................1, 2g  Etanol 95%.............................................................................10 0 ml o Solución B  Ácido tánico.............................................................................. ..3 g  Agua destilada......................................................................... 100 ml o Solución C  Cloruro sódico..........................................................................1, 5g  Agua destilada......................................................................... 100 ml Para preparar la solución de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado herméticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas. 6. Cristal violeta: Para tinción Gram y tinción simple. o Cristal violeta (violeta de genciana)....................................................0,5 g o Agua destilada.................................................................................1 00 ml 7. Eosina: Para observación de células sanguíneas. o Eosina....................................................................................... ........0,3 g o Ácido acético glacial......................................................................0,025 ml o Agua destilada................................................................................... 100 ml 8. Fucsina diluida: Para tinción Gram y tinción simple. o Fucsina fenicada de ZiehlNeelsen......................................................10 ml o Agua destilada.................................................................................1 00 ml 107

9. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tinción ácido-alcohol resistente. o Fucsina básica...................................................................................... 1g o Etanol 95%........................................................................................1 0 ml o Fenol 5% en solución acuosa............................................................100 ml 10. Hematoxilina: Para observación de células sanguíneas. o Hematoxilina............................................................................ .............2 g o Agua destilada................................................................................... ...1 l 11. Lactofenol: Para preparaciones microscópicas en fresco de mohos. o Ácido láctico.....................................................................................1 00 ml o Fenol......................................................................................... .......100 g o Glicerol..................................................................................... ........200 ml o Agua......................................................................................... ........100 ml 12. Lactofenol al Azul Algodón: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos. o Solución de azul algodón  Sol. saturada de azul algodón (azul anilina soluble)......................10 ml  Glicerol............................................................................ .........10 ml  Agua................................................................................ .........80 ml Mezclar esta solución con lactofenol a partes iguales 13. Lugol: Solución de yodo para tinción Gram. o Yodo......................................................................................... ..........1 g o Yoduro potásico..................................................................................2 g o Agua destilada.................................................................................3 00 ml 108

14. Orceína A: Tinción de cromosomas. o Orceína..................................................................................... ...........2 g o Ácido acético..................................................................................... 45,8 ml o Ácido clorhídrico 1 mol/l......................................................................8,3 ml o Agua......................................................................................... .........45,8 ml 15. Orceína B: Tinción de cromosomas. o Orceína..................................................................................... ...........2 g o Ácido acético..................................................................................... 55 ml o Agua......................................................................................... .........55 ml 16. Safranina: Colorante de contraste para tinción Gram (preferible a la fucsina) y esporas. o Safranina.................................................................................. .......0,25 g o Agua destilada.................................................................................. 100 m 17. Sudán III: Tinción específica de grasas. o Alcohol etílico...................................................................................10 0 ml o Sudán III...................................................................................hasta saturación 18. Verde de metilo acético: Igual composición que la eosina (num. 7)

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