Gen Eukariotyczny Ii Rok 2008

Gen eukariotyczny Działanie i regulacja

"

Geny eukariotyczne   Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i

czasie   Każdy gen ma własny promotor, nie występują operony   Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów   Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne   Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana

po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) – złożoność proteomu przekracza złożoność genomu

Po co regulacja?

  Większa liczba genów wymusza bardziej złożoną/ścisłą

regulację   Homeostaza komórki   Odpowiedź na zmienne środowisko   Komunikacja między komórkami i utrzymanie funkcji

organizmu u wielokomórkowców   Rozwój

Etapy ekspresji/poziomy regulacji   struktura chromatyny   transkrypcja   obróbka i kontrola jakości RNA   transport RNA   degradacja RNA   translacja   modyfikacje post-translacyjne   degradacja białka

Losy mRNA w komórce • Transkrypcja • Dodanie „czapeczki” na końcu 5’ • Składanie (splicing) • Poliadenylacja na końcu 3’

• Transport do cytoplazmy • Translacja • Degradacja

Transkrypcja   Kluczowym etapem regulacyjnym większości genów jest

transkrypcja   Regulacja z reguły na poziomie inicjacji transkrypcji   Czynniki cis – sekwencje regulatorowe w obrębie

promotorów i enhancerów (wzmacniaczy)   Czynniki trans – białka wiążące się z sekwencjami

regulatorowymi (elementami cis)

Czynniki cis

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Czynniki trans

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

3 (+1) główne polimerazy RNA Eukaryota   Polimeraza I – geny rRNA   Polimeraza II – geny kodujące białka, większość snRNA,

miRNA   Polimeraza III – małe RNA: tRNA, snoRNA, 5S rRNA, U6

snRNA   Polimeraza mitochondrialna

Polimeraza I i rRNA

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Polimeraza III i małe RNA

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Polimeraza II

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Promotor i czynniki podstawowe

Podstawowe czynniki tworzą platformę, do której wiąże się polimeraza

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Enhancer i aktywatory

Aktywatory ułatwiają przejście polimerazy do kompleksu otwartego i start transkrypcji Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory   Podstawowe – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w

proksymalnej części promotora   Specyficzne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały

regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach   Koaktywatory –uczestniczą w aktywacji transkrypcji, ale nie

wiążą się z DNA. Działają przez oddziaływania z białkami kompleksu transkrypcyjnego   Kompleks mediatora jest ogólnym koaktywatorem polimerazy II

Kompleks transkrypcyjny

Czynniki transkrypcyjne   Struktura domenowa:   domena wiążąca DNA (specyficznie)   domena aktywująca transkrypcję

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Domeny wiążące DNA

  Palce cynkowe   Helisa-skręt-helisa (H-T-H) – np. homeodomena,

domena HMG, domena PAU   Helisa-pętla-helisa (H-L-H)   i wiele innych

Domeny wiążące DNA

Homeodomena

Palec cynkowy

Dimeryzacja czynników transkrypcyjnych   Suwak leucynowy   Np. protoonkogeny rodziny c-Fos

i c-Jun

System Myc-Max

Komórki nie dzielące się Homodimer Max – brak aktywacji

Komórki dzielące się Heterodimer Myc-Max – aktywacja Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Represory

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Podstawowe elementy cis   Promotor rdzeniowy – wiąże czynniki podstawowe

kompleksu polimerazy II   element TATA (wiązanie TBP)   miejsce inicjacji   Elementy promotora podstawowego – wiążą czynniki

wspólne dla wielu różnych promotorów i zapewniające podstawowy poziom transkrypcji   element CAAT –czynniki NF-1 i NF-Y   element GC – czynnik Sp1   oktamer – czynnik Oct1

Specyficzne elementy cis promotorów i enhancerów   Moduły odpowiedzi na sygnał   np. moduł CRE – odpowiedź na cAMP (czynnik

transkrypcyjny CREB)   Moduły specyficzne dla komórek i tkanek   np. moduł mioblastowy rozpoznawany przez czynnik

MyoD; moduł limfoblastoidalny – czynnik NF-κB   Moduły rozwojowe   np. moduły Bicoid i Antennapedia D. melanogaster

Regulacja kombinatoryczna   W sekwencjach regulatorowych występują różne kombinacje

elementów cis wiążących różne czynniki trans, co daje bardzo wiele możliwości regulacji przy udziale stosunkowo niewielkiej liczby regulatorów – kombinatoryka

Promotor ludzkiego genu insuliny

Alternatywny start transkrypcji   Wiele genów wyższych eukariontów posiada wiele

alternatywnych miejsc startu transkrypcji (promotorów), specyficznych tkankowo   Dzięki temu z jednego powstają różne transkrypty i białka w

różnych komórkach i tkankach kora

mięśnie móżdżek

siatkówka

kom. Schwanna

Gen dystrofiny człowieka

pozostałe tkanki

Struktura chromatyny   Wiele poziomów organizacji   Heterochromatyna – skondensowana,

nieaktywna. Powstawanie heterochromatyny jest jednym z mechanizmów wyciszania genów i całych chromosomów   Stała (np. centromery, telomery, część Y)   Fakultatywna   Euchromatyna – może być aktywna

transkrypcyjnie

Nukleosomy a regulacja

  Występowanie nukleosomów decyduje o dostępności

promotora i jest elementem regulacji inicjacji   Modyfikacje histonów i DNA są mechanizmami

regulacyjnymi   Podczas elongacji konieczne jest usuwanie nukleosomów

przez specjalne czynniki elongacyjne

Regulacja dostępności chromatyny

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Remodelowanie chromatyny

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Domeny strukturalne euchromatyny

Pętle DNA – domeny strukturalne Obszary wiązania macierzy jądrowej

Domeny funkcjonalne i izolatory   Izolatory oddzielają domeny

funkcjonalne w chromatynie   Białka wiążące się z izolatorami

uniemożliwiają interferencję regulatorów z sąsiedniej domeny (innych genów)

Izolator

Izolator

Obszary kontrolujące loci

  LCR (locus control regions) – utrzymują domeny

funkcjonalne otwarte, czyli aktywne transkrypcyjnie

Modyfikacje histonów i DNA

  Modyfikacje histonów (“kod histonowy”)   Acetylacja (aktywacja) i deacetylacja (inaktywacja)

histonów   Metylacja – efekty długoterminowe   Fosforylacja   Ubikwitynacja, SUMOilacja   Metylacja DNA – wyciszenie

Metylacja DNA   Metylacja prowadzi do

wyciszenia ekspresji przez upakowanie chromatyny   Rzadka u niższych Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

eukariontów, powszechna u kręgowców (do 10% C)   Powstaje 5-metylocytozyna

Metylacja DNA

  Inaktywacja jednej kopii X u samic   Piętno genomowe

Piętno genomowe   Stwierdzone u ssaków, podobne procesy mogą występować u

D. melanogaster i roślin, niezbędne do prawidłowego rozwoju zarodka   Ekspresja wyłącznie jednego z pary alleli genu,

odziedziczonego po konkretnym rodzicu (matce lub ojcu)   Przykład – gen Igf2 – aktywna wyłącznie kopia

odziedziczona po ojcu   Metylacja DNA utrzymuje się podczas mitozy, ale w

procesie mejozy jest usuwana

Piętno genomowe

Mejoza

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Piętno genomowe i choroby genetyczne   W przypadku genów podlegających piętnowaniu efekt może

być różny przy dziedziczeniu od ojca lub matki   Np. delecje na chromosomie 15 (15q11-q13)   U matki – zespół Angelmana   U ojca – zespół Prader-Willi

Obróbka RNA

  Czapeczka na końcu 5’   Poliadenylacja końca 3’   Wycinanie intronów – składanie (splicing)   Transport z jądra do cytoplazmy   Degradacja

Czapeczka 5’

  Synteza tuż po inicjacji transkrypcji   Istotna dla eksportu i translacji

mRNA

Terminacja i poliadenylacja

Terminacja i poliadenylacja

Poliadenylacja

  Kontroluje (zwiększa) stabilność mRNA   Dotyczy większości mRNA, wyjątkiem są mRNA kodujące

histony

Składanie

  Introny – fragmenty pierwotnego transkryptu, które są

wycinane i nie występują w dojrzałym transkrypcie   Większość genów wyższych eukariontów zawiera introny, w

przeciętnym genie stanowią przeważającą większość sekwencji transkrybowanej   Alternatywne składanie – różne kombinacje eksonów dają

różne ostateczne transkrypty tego samego genu

Składanie mRNA

Mechanizm składania

Składanie mRNA   W składaniu uczestniczą kompleksy białek i snRNA: snRNP

Alternatywne składanie   Wybór różnych miejsc łączenia (tzw. miejsca kryptyczne)   Składanie różnych kombinacji eksonów   Jeden gen – wiele białek   Często tkankowo-specyficzne

Alternatywne składanie przykłady   Bardzo wiele genów człowieka   Amylaza śliniankowa i wątrobowa   Tachykininy:   neurotransmitery w narządach zmysłów   neuropeptyd P w układzie nerwowym   neuropeptyd K w tarczycy i jelicie   Determinacja płci Drosophila

Redagowanie (editing)   Zmiana konkretnego nukleotydu w RNA po transkrypcji   Częste w organellach niższych eukariontów   Np. apolipoproteina B człowieka

Wątroba, białko 4563 aa

Jelito, białko 2153 aa

Kontrola jakości RNA

  Tylko w pełni obrobione (czapeczka, poliadenylacja,

składanie) transkrypty są eksportowane z jądra   Transkrypty nieprawidłowo obrobione są degradowane   Degradacja transkryptów z przedwczesnym kodonem STOP

(NMD – nonsense mediated decay) – wykrywane nieprawidłowe położenie STOP względem miejsc styku intron/ekson

Degradacja RNA   Czas życia mRNA jest krótki (średnio 10-20 min. drożdże,

kilka godzin ssaki)   Różne ścieżki degradacji   3’-> 5’ (egzosom)   deadenylacja, usunięcie czapeczki, egzonukleaza 5’->3’   Na stabilność wpływają sekwencję nie podlegające translacji

(UTR) i poliA   Może podlegać regulacji przez czynniki trans

Regulowana degradacja RNA

Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.

Translacja

  Regulowany może być każdy etap translacji   Wybór kodonu AUG   Inicjacja   Elongacja   Terminacja   Np. zahamowanie translacji i indukcja GCN4 w odpowiedzi

na głodzenie u drożdży

Białka też podlegają złożonym modyfikacjom   Fałdowanie – wspomagane przez białka opiekuńcze   Modyfikacje chemiczne (fosforylacja, glikozylacja

itp.)   Ubikwitynacja i degradacja   Naturalna   Degradacja źle sfałdowanych białek

Nowe role RNA Odkrycie roku 2002 – regulacyjna rola małych RNA

Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello

Interferencja RNA

  Wyciszanie ekspresji genów przez krótkie dwuniciowe RNA

homologiczne do sekwencji genu   Może działać na różnych etapach   PTGS – posttranskrypcyjne wyciszanie genów   hamowanie translacji   degradacja RNA

  TGS – transkrypcyjne wyciszanie genów   wpływ na strukturę chromatyny   zmiana aktywności czynników transkrypcyjnych

siRNA, miRNA, stRNA...  siRNA (short interfering RNA) – pochodzą z dwuniciowych

cząsteczek, głównie egzogenne (np. wirusy RNA)  miRNA (micro RNA) – pochodzą z cząsteczek o strukturze szpilki

do włosów, kodowane w genomie  stRNA (small temporally regulated RNA) – miRNA regulujące rozwój (odkryte u nicieni)  smRNA (small modulatory RNA) – reguluje działanie genów w

neuronach przez zmianę funkcji białka regulującego transkrypcję (represor → aktywator)

siRNA a miRNA

siRNA – egzogenny dsRNA (np. wirusa)

miRNA – endogenny dsRNA

siRNA - jak to działa?

dsRNA jest egzogenny Efekt – degradacja mRNA Hannon G.J.: ‘RNA interference’, Nature 418, July 11, 2002

miRNA – jak to działa?

dsRNA kodowany w genomie

Efekt – degradacja mRNA lub hamowanie translacji

Regulacyjne RNA działają też na transkrypcję

Efekt – zmiana struktury chromatyny

RNA też może modyfikowac ekspresję chromosomu

Wyciszanie jednej kopii chromosomu X u kobiet przez RNA XIST

Zastosowania   Badanie funkcji genów (“odwrotna genetyka”) - szczególnie skuteczne u

nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin

  Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania

wirusów czy nowotworów)

RNA a terapia genowa   siRNA skierowane przeciwko:   wirusom (HIV, HCV)   zmutowanym genom (np. pląsawica Huntingtona)   onkogenom   obniżenie poziomu cholesterolu LDL u myszy przez siRNA

przeciwko apolipoproteinie B

Podsumowanie

  Eukaryota mogą regulować każdy z licznych i złożonych

etapów ekspresji   Złożoność mechanizmów regulacyjnych wzrasta ze wzrostem

złożoności organizmu   Obok białek regulatorowych istnieją też liczne regulatorowe

RNA, których istnienie poznaliśmy niedawno

Dziękuję za uwagę dr Paweł Golik [email protected]

"