Fundamentos De Engenharia Genetica

Agrupamento Vertical de São João da Pesqueira Escola E.B. 2,3 / Secundária de São João da Pesqueira

Biologia

Fundamentos de Engenharia Genética

Elaborado por: Ana Vieira Andreia Peneda Paula Pereira

2006/2007

nº17 nº22 nº23 12ºA

Índice

Introdução ……………………………………………………. Enzimas de restrição ……………………………………….. Técnica do DNA recombinante (rDNA) …………………… DNA complementar (cDNA) ……………………………….. Impressões digitais genéticas ……………………………... Reacções de polimerização em cadeia …………………... Conclusão .…………………………………………………… Bibliografia ……………………………………………………

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Fundamentos de Engenharia Genética

Introdução A descoberta, em meados do século passado, da estrutura das moléculas que contém a informação genética abriu caminho para uma nova área do conhecimento. Um dos passos mais marcantes ocorreu em 1953, quando Watson e Crick apresentaram o modelo de dupla hélice para a molécula de DNA. Segundo este modelo, a molécula de DNA é composta por duas cadeias polinucleotídicas que se dispõem

em

sentidos

inversos,

designando-se, por isso, antiparalelas.

Fig.1 – Watson e Crick

Cada nucleótido é formado por uma base azotada, (glícido

uma

pentose

com

cinco

carbonos) e um grupo fosfáto (ácido fosfórico). Os

nucleótidos

formam

uma

que cadeia

polinucleotídica ligam-se

Fig.2 – Nucleótido

entre si através de ligações covalentes. A ligação entre as duas cadeias é feita por complementaridade entre as bases azotadas, verificando-se que a adenina só emparelha com a timina (através do estabelecimento de duas pontes de hidrogénio), enquanto que a guanina só se liga à citosina (através do estabelecimento de três pontes de hidrogénio).

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Fig.3 – Estrutura e composição química do DNA

O outro ácido nucleico – o RNA – é formado por uma cadeia simples

de

nucleótidos,

apresentando

dimensões muito inferiores ás da molécula de

DNA.

Contudo,

em

determinadas

regiões, a molécula de RNA pode dobrarse devido ao estabelecimento de pontes de

hidrogénio

entre

as

bases

complementares (a adenina emparelha

Fig.4 – Nucleótido

com o uracilo e a guanina com a citosina). Para que a informação contida no DNA seja expressa é necessário que, em primeiro lugar, a informação seja passada ao RNA, que se forma por complementaridade com o DNA, e que, posteriormente, essa informação, agora veiculada pelo RNA, seja traduzida sob a forma de proteínas. Este fluxo unidireccional de informação entre os ácidos nucleicos e as proteínas ficou conhecido como “dogma central da Bioquímica”. DNA → RNA → Proteína 4

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Fig.5 – Dogma central da Bioquímica.

A partir da década de 70 do século XX, porém, ocorreu uma verdadeira

revolução

profundamente

ligadas

biotecnológica. e

Ciência

interdependentes,

e têm

Tecnologia, fornecido

importantes conhecimentos sobre a vida e, simultaneamente, começaram a manipula-la. Abriram a molécula de DNA, extraíram genes, transplantaram-nos para outras células, multiplicaram alguns desse genes milhões e milhões de vezes e “criaram, em tubo de ensaio”, seres que não surgiram como resultado de milhões de anos de evolução. É a engenharia genética que permite conhecer melhor algumas das doenças humanas, oferece produtos sectores à indústria e quer libertar a agricultura das suas dependências em relação aos adubos e aos pesticidas.

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A

engenharia

genética

precisa de técnicas de elevada precisão, ao mesmo tempo que os comités de bioética vão analisando e reflectindo sobre os avanços e as controvérsias.

Fig.6

Um dos grandes problemas com que se depararam os investigadores que tentavam manipular o DNA era o isolamento dos genes. Ao longo da década de 60 do mesmo século, diversas investigações com microrganismos tinham permitido descobrir enzimas capazes de seleccionar o DNA em locais específicos. Estas enzimas denominadas enzimas de restrição, começaram, então, a ser utilizadas em técnicas de manipulação in vitro. Podemos afirmar que as enzimas de restrição estão na base da engenharia genética, cujo objectivo é a manipulação directa de genes com um fim prático.

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Enzimas de restrição As enzimas de restrição fragmentam o DNA por hidrólise em locais específicos. A especificidade é dada pela sequência de nucleótidos que a enzima reconhece, fragmentando o DNA sempre que encontra essa sequência.

Fig.7 – Reconhecimento da sequência 5` GAA TTC 3` pela enzima EcoRI

Como funcionam as enzimas de restrição? Os vírus invadem frequentemente as bactérias e afectam o seu DNA. Algumas bactérias possuem um mecanismo de defesa contra os vírus que consiste na produção de enzimas de restrição. Estas enzimas actuam em pontos específicos, as chamadas zonas de restrição, catalisando o desdobramento da DNA

em

fragmentos

menores.

Estes

fragmentos contêm nas suas extremidades a sequência que foi reconhecida pela enzima de restrição. Estas porções terminais designam-se por extremidades coesivas. Fig.8 – “Ferramentas” da engenharia genética 7

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As

extremidades

coesivas

podem

então

ligar-se,

por

complementaridade, a outro DNA. Neste processo intervêm outras enzimas, chamadas ligases do DNA, que catalisam o processo que permite que fragmentos de DNA se voltem a ligar.

Fig.9 – Acção das enzimas de restrição e da DNA ligase

A descoberta das enzimas de restrição e das ligases do DNA fornecem aos investigadores a oportunidade de manipular e transferir genes de uma molécula de DNA para outra, isto é, de um organismo para outro. Nesta transferência de genes é também necessária a existência de um vector, isto é, uma molécula capaz de transportar o fragmento de DNA para uma célula. Os bacteriófagos (vírus que atacam bactérias) e os plasmídeos (pequenos fragmentos livres de DNA com forma circular que estão presente em bactérias) são dois exemplos de vectores.

Fig.10 – Vector

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Fig.11 – Vírus bacteriófago

Fig.12 – Plasmídeos

As enzimas de restrição permitiram desenvolver umas das metodologias mais utilizadas pela engenharia genética – a tecnologia do DNA recombinante (rDNA) – isto é, produzir moléculas de DNA a partir da combinação de genes com proveniências diferentes.

Fig.13 – DNA recombinante

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Técnica do DNA recombinante (rDNA) Na técnica do DNA recombinante, recorrendo a enzimas de restrição para cortar o DNA em pontos específicos e a ligases do DNA para reconstruir a molécula, uma porção de DNA, natural ou sintético, é inserido noutro DNA estranho.

O processo básico da técnica do rDNA consiste em: 1-

“Abertura” da molécula de DNA do plasmídeo, num ponto

específico, pela enzima se restrição; 2- Isolamento de genes de interesse noutras moléculas de DNA “ doadoras” recorrendo a enzimas de restrição do mesmo tipo; 3- Junção do gene a inserir do plasmídeo e de ligases do DNA; 4- Ligação do gene ao plasmídeo formandose o DNA recombinante; 5- Introdução do plasmídeo recombinante em bactérias, que funcionam como células hospedeiras do novo gene; 6- Produção da proteína desejada a partir do DNA recombinante.

Fig.14 – Técnica do DNA recombinante

Esta técnica permite, por exemplo, introduzir porções de DNA de uma determinada espécie num microrganismo, que, em condições adequadas, se divide, permitindo a criação de inúmeras cópias do gene (ou do produto do gene) aí inserido. Trata-se de uma clonagem do segmento de DNA manipulado.

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A

nova

molécula

de

DNA

presente

nos

clones

do

microorganismo onde foi inserido o DNA recombinante permitirá a produção de uma nova proteína, de acordo com a nova informação genética que possui. Desta forma, é possível, por exemplo, introduzir um gene humano em bactérias para que estas produzam, em larga escala, uma determinada proteína humana.

Fig.15 – Produção de insulina humana utilizando a técnica do DNA recombinante 11

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A insulina é uma hormona produzida pelo pâncreas e controla a entrada de glicose nas células. A sua falta provoca uma doença conhecida por diabetes. Durante anos, a única forma de obter insulina era extraindo-a do pâncreas de porco. Contudo, este procedimento era bastante dispendioso e além disso ocorriam, frequentemente, reacções alérgicas nos indivíduos que recebiam esta insulina. A técnica do DNA recombinante permitiu baixar o custo de produção de insulina e, sobretudo, torná-la mais segura. Evitandose as reacções alérgicas. Para tal, os investigadores procederam ao isolamento do gene responsável pela produção desta hormonas, através

da

utilização

de

enzimas de restrição e à sua inserção em bactérias, tendo, para

esse

efeito,

utilizando

plasmídeos

como

vectores.

as

bactérias

Dado

que

utilizadas se reproduzem muito rapidamente, ao fim de um curto intervalo de tempo, é possível

obter

um

Fig.16 – Vectores utilizados na técnica do DNA recombinante

elevado

número destes microrganismos capazes de produzir insulina humana em larga escala. De seguida, a insulina é isolada do meio que contém diversos nutrientes e produtos do metabolismo bacteriano, sendo purificada de forma a poder ser utilizada no tratamento de diabetes. Actualmente, além da insulina, muitas outras substancias são produzidas à custa da técnica do DNA recombinante.

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Substância obtida pela técnica do rDNA Hormona de crescimento

Aplicação Disfunção de hipofisária

Factor de crescimento da Processos de cicatrização epiderme de feridas Interferão

Cancro

Factores de VII, VIII, IX

coagulação Hemofilia

Vacina para hepatite

Hepatite B

Teste da SIDA

Despiste da SIDA

Superóxido dismutase

Evita e extensão de danos após do miocárdio

Eritropoetina

Anemia

O processo de multiplicação dos organismos que contêm rDNA permite não só a produção da substância codificada pelo gene inserido, como também a clonagem desses genes. Os investigadores

conservam,

assim,

cópias

desses

genes,

constituindo bibliotecas genómicas ou bibliotecas de genes. Esses

genes

armazenados

ficam,

assim,

disponíveis

para

posteriores utilizações.

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Fig.17 – Biblioteca de genes

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DNA Complementar (cDNA) Este DNA é obtido a partir do mRNA por complementaridade de bases, um mRNA que já sofreu processamento (não contém intrões). A produção de cDNA è possível por acção da enzima transcriptase reversa o mRNA funciona como molde para a síntese de uma cadeia de DNA, um processo inverso do que se passa habitualmente na transcrição. Após a formação da primeira cadeia de cDNA, a DNA polimerase forma a cadeia complementar, constituindo-se uma molécula estável.

Fig.18 – Produção de cDNA 15

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A comparação entre o cDNA (sem intrões) e o DNA original permite localizar as regiões codificantes (exões) e as não codificantes Fig.19

(intrões) de um determinado gene.

O cDNA facilita a produção de proteínas de seres eucariontes em bactérias uma vez que estas não possuem mecanismos de processamento do mRNA, isto é, em presença de um DNA original transcreviam toda o gene, incluindo os intrões, obtendo-se proteínas diferentes das pretendidas. Ao ser inserido um clone de cDNA garante-se a produção da proteína normal. A manipulação do genoma foi iniciada em microrganismos, mas alargou-se a outros seres vivos; actualmente, é praticada em plantas e animais.

De

forma

genérica,

designa-se

organismos geneticamente modificados (OGM) ou transgénicos aqueles cujo genoma foi manipulado,

apresentando

diferenças

relativamente à sua constituição original. A manipulação genética permite obter, de forma

rápida,

organismos

detentores

de

Fig.20 – Organismos geneticamente modificados

características vantajosas. Verifica-se que as plantas são mais facilmente manipuláveis, do ponto de vista genérico, do que os animais. Actualmente, já existem diversas variedades de plantas de cultivo geneticamente modificadas. A inserção de determinados genes confere-lhes novas características, tais como: - maior resistência a doenças, a herbicidas, ao calor, à seca, à geada e redução das necessidades em fertilizantes;

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- desenvolvimento de produtos com maior valor e qualidade alimentar (frutos de maior tamanho, tubérculos com maior valor nutritivo, etc.; - produção de fármacos (como, por exemplo, vacinas) que sejam administrados nos seres humanos juntamente com o alimento.

Fig.21 – Produção de um organismo geneticamente modificado

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Impressões digitais genéticas Com excepção dos gémeos verdadeiros, cada indivíduo possui o seu próprio DNA, que é único. Em 1984, com base nestes princípios, foi possível desenvolver uma técnica destinada a identificar porções de DNA. Esta técnica designa-se por DNA fingerprint ou impressões digitais genéticas. No seio do DNA encontram-se zonas de restrição – sequências repetitivas ao longo da molécula – cujo número, tamanho e localização são variáveis de indivíduo para indivíduo. Este facto pode ser utilizado de diversos modos para identificar geneticamente os indivíduos.

Fig.22 – Zonas de restrição

A partir de uma pequena amostra de material biológico que contenha material genético, como leucócitos, por exemplo, faz-se a extracção do DNA. Submetido à acção de enzimas de restrição, o DNA fragmenta-se em porções de diferentes tamanhos e pesos moleculares.

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Estes pedaços de DNA, sujeitos a electroforese revelam um padrão de fragmentos de restrição que é único para cada indivíduo, funcionando como um “código de barras” genético.

Fig.23 – “Código de barras” genético

A electroforese consiste em colocar a amostra de uma determinada proteína num gel ao qual se aplica uma corrente eléctrica no sentido de proceder à separação de variantes da proteína, isto é, a mesma proteína pode diferir em alguns aminoácidos, o que lhe confere propriedades eléctricas diferentes.

Fig.24 – Técnica do DNA fingerprint 19

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Ao longo do DNA há bases que se repetem e que variam de indivíduo

para

indivíduo,

determinando

um

polimorfismo.

Comparando porções da molécula de DNA de diferentes indivíduos é possível investigar problemas relacionados com a filiação biológica, mas sobretudo, em ciência forense, na investigação criminal. Analisando pequenas porções de sangue, cabelo, sémen ou qualquer tecido encontrado nos vestígios do crime, é possível fazer o DNA fingerprint que, depois de comparado com o dos indivíduos suspeitos se podem identificar corpos irreconhecíveis ou mesmo resolver problemas da história.

Fig.25 – Aplicação forense do DNA fingerprint

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Fig.26 – Testes de paternidade

Um outro material genético que pode ser utilizado em investigações de natureza médico-legal ou na pesquisa de ancestrais de determinado indivíduo é o genoma mitocondrial. Trata-se de material genético proveniente exclusivamente da mãe e organizado em moléculas circulares da hélice dupla. A maioria das mitocôndrias possui 5 a 10 cópias do DNA mitocondrial que não está ligado a proteínas.

Fig.27 – Análise do DNA fingerprint 21

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Reacções de polimerização em cadeia É uma das técnicas para clonar DNA de modo a obter grandes quantidades a partir de uma pequena amostra.

Fig.28 – Reacção de polimerização em cadeia (PCR)

Fases do processo de amplificação de uma determinada porção de DNA: Ö Aquecimento do DNA para separar as duas cadeias; Ö Adição de nucleótidos e da enzima DNA polimerase para que a dupla hélice seja reconstruída a partir de uma das cadeias simples; Ö Repetição do procedimento de modo a produzir cópias suficientes do DNA em estudo.

Fig.29 22

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Uma dificuldade que se levantou nesta técnica foi a de conciliar um processo que decorre a elevadas temperaturas com a fragilidade da enzima DNA polimerase. Recorreu-se uma vez mais aos microrganismos, utilizando-se a DNA polimerase, extraída de bactérias que vivem em meios muito quentes. A terapia génica somática, isto é, a substituição de genes que provocam doenças hereditárias num indivíduo adulto, foi já utilizada em 1999 em crianças com menos de 1 ano. A terapia génica germinal, em embriões, não tem actualmente justificação e é reprovada pelos comités de bioética. Considera-se preferível seleccionar embriões isentos de determinados genes na reprodução assistida.

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Conclusão A Engenharia Genética tem desenvolvido técnicas que são utilizadas, hoje, em diversas áreas, como a Medicina, a Agricultura e a Indústria. Estes progressos têm tanto de notáveis como de perturbadores. Questiona-se a sua segurança, bem como as suas implicações éticas, sociais e mesmo religiosos. Se não é novidade que as novas tecnologias geram dívidas e inquietações na sociedade, é certamente a primeira vez que o Homem interfere de forma tão drástica nos processos biológicos, ultrapassando as barreiras reprodutivas que existem entre as espécies e os mecanismos de selecção natural. A tecnologia do DNA Recombinante permite produzir novas combinações de genes que naturalmente nunca se encontrariam. Que consequências poderão decorrer desta reunião? Que reacção deverá ter a sociedade perante esta capacidade de manipulação do genoma dos seres vivos e particularmente do ser humano? Sabe-se que a inserção de genes em determinados locais do genoma pode activar oncogenes; serão as manipulações seguras a este nível? Não poderão os vectores transportar outros genes para além dos desejados? Até que ponto os organismos geneticamente modificados, ao serem libertados no ambiente, não poderão alterar o equilíbrio dos ecossistemas? Não poderão as novas tecnologias ser postas ao serviço de políticas discriminatórias e eugénicas? Que potencial esconde a Engenharia Genética que possa ser aplicado nas armas biológicas e no terrorismo?

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Estas e outras questões inquietam, naturalmente, os mais diversos sectores da sociedade. Contudo, não podemos esquecer que a Engenharia Genética e a Biotecnologia em geral, têm permitido proezas que se reflectem na melhoria da qualidade de vida da sociedade. Julga-se, assim, ser fundamental que os cidadãos conheçam e compreendam, de forma rigorosa, o impacto que as novas tecnologias de manipulação dos seres vivos e da vida produzem ou podem vir a produzir. A ciência deve avançar de forma cautelosa, pois os perigos e os benefícios desta área do conhecimento estão, ainda, longe de ser totalmente conhecidos.

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Bibliografia Ö Silva, A. D.; Santos, M. E.; Mesquita, A. F.; Baldaia, L.; Félix, J. M. (2006). Terra, Universo de Vida – Biologia 12º ano. Porto: Porto Editora. Ö Matias, O.; Martins, P. (2005). Biologia 12º Ano. Porto: Areal Editores.

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