Etude Phytochimique Et Biologique De Leea Guinensis (leeaceae)

UNIVERSITE JOSEPH FOURIER – GRENOBLE I U.F.R. DE PHARMACIE Année 1999

Thèse N°

THESE présentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE JOSEPH FOURIER –  GRENOBLE I SPECIALITE : Chimie Moléculaire Option : Sciences Pharmaceutiques Présentée et soutenue publiquement le 14 décembre 1999 Par

Philippe OP de BECK

ETUDE PHYTOCHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DE  LEEA GUINEENSIS G. DON (LEEACEAE) JURY

1

M. 

LECLERC G. Professeur à l’Université de Grenoble I

Président

M. 

BARRON D. Professeur à l’Université de Lyon I

Rapporteur

M. 

DAVID B. Docteur, Institut de Recherche Pierre FABRE

Rapporteur

M. 

HOSTETTMANN K. Professeur à l’Université de Lausanne

Mme

MARIOTTE A.M. Professeur à l’Université de Grenoble I

Mme

DIJOUX­FRANCA M.G. Maître de Conférence à l’Université de Grenoble I

2

A ma sœur Christelle.

A ma famille, sources constantes d’encouragement, de soutien, de confiance et d’affection.

A Perrine, pour le soutien et l’aide si précieuse que tu m’apportes au quotidien.

A mes amis.

3

Remerciements

Nous tenons tout d’abord à remercier les Laboratoires Pierre FABRE et notamment : Monsieur André CASSAN, Président de l’Institut KLORANE. Nous avons été très sensible à votre appui, au financement que nous avons bénéficié ainsi qu’à la confiance que vous nous avez témoignée. Veuillez recevoir ici notre profonde reconnaissance et tous nos remerciements.

Au membre du jury : A Monsieur le Professeur Kurt HOSTETTMANN, Professeur de Pharmacognosie et de Phytochimie de l’Université de Lausanne. Nous vous remercions d’avoir accepté de juger ce travail malgré vos nombreuses sollicitations. Nous sommes honorés par votre présence à notre jury. A Monsieur le Docteur Bruno DAVID, Directeur du Département Phytochimie du Centre de  Recherches   sur   les   Substances   Naturelles   de   l’Institut   de   Recherche   Pierre   FABRE   à  Ramonville. Nous exprimons nos vifs remerciements pour avoir accepté de juger ce travail. D’un contact toujours aimable, vous avez répondu présent à nos nombreuses demandes malgré vos multiples taches Vos remarques et discussions ainsi que l’aide efficace que vous nous avez apportées dans la réalisation de ce travail ont été très appréciées. Soyez en vivement remercié. A Monsieur le Professeur Denis BARRON, Professeur de Biochimie Végétale à l’Université Claude Bernard Lyon I. Soyez remercié d’avoir bien voulu accepté de juger ce travail. Sachez aussi que vos travaux sur les flavonoïdes sulfatés nous ont beaucoup inspirés et que nous sommes très sensibles à l’honneur que vous nous faite d’être rapporteur.

4

A Monsieur le Professeur Gérard LECLERC, Professeur de Chimie Organique à l’UFR de Pharmacie de Grenoble et Directeur du Département de Pharmacochimie Moléculaire. Nous sommes sensible à l’intérêt que vous portez à juger notre travail. Recevez ici le témoignage de ma gratitude. A Madame le Professeur Anne-Marie MARIOTTE, Professeur de Pharmacognosie à l’UFR de Pharmacie de Grenoble. Votre accueil dans votre laboratoire m’a permis de faire mes premiers pas dans la recherche sur les substances naturelles. Recevez ici, mes sincères remerciements. A Madame le Docteur Marie-Geneviève DIJOUX-FRANCA, Maître de Conférence en Pharmacognosie à l’UFR de Pharmacie de Grenoble. Qu’il me soit ici permis de te remercier pour l’autonomie dont j’ai bénéficiée ainsi que pour les conseils et ta disponibilité pour l’apprentissage de l’enregistrement des spectres RMN. Tu m’as aussi réconcilié avec l’anglais, bravo ! En témoignage de ma profonde gratitude, trouves ici mes plus vifs remerciements.

Aux personnes qui ont participé "de près ou de loin" à son élaboration : A Monsieur Jean Marie BESSIERE, Professeur à l’Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier. Je vous remercie pour les analyses CG/SM que vous avez effectuées ainsi que pour le constant suivi du devenir de ces composés volatils. Comme vous le dites si bien, on touche au but ! A Mesdames M.-F. ARIES, C. VAISSIERE, A. BEL et C. CHARVERON du Département Evaluation et Exploration Fonctionnelle et Cutanée, Laboratoire de Biologie Cellulaire de l’Institut de Recherche Pierre FABRE de Toulouse. Nous vous remercions pour les analyses effectuées au sein de votre unité.

5

A Monsieur Claude BOSSO, Directeur de l’unité de Spectrométrie de Masse du Centre d’Etude et de Recherche sur les Macromolécules Végétales de Grenoble. Soyez remerciez pour la réalisation et les analyses des spectres de masse. Vos conseils judicieux et votre disponibilité ont été très appréciés. A Monsieur François TOMASSON, Ingénieur recherche, responsable du service commun de RMN de l’UFR de Pharmacie, pour m’avoir donner la possibilité de manipuler l’AC200. L’obtention généreuse de ces précieuses unités RMN pour les soirées, les WE ou les vacances ainsi que vos discussions à propos de nos travaux scientifiques ou en ce qui concerne nos si belles montagnes ont été fortement appréciées. A Monsieur Gilbert CARTIER, le "Géotrouvetout" du Laboratoire de Pharmacognosie pour la préparation des extraits et leur lyophilisation. Je vous remercie pour votre disponibilité et votre enthousiasme très communicatif. A Messieurs DEBOUZY et BRAHME du Laboratoire de Biophysique du Centre de Recherche du Service de Santé des Armées de Grenoble, pour nous avoir donné la possibilité d’effectuer des analyses spectrales (RMN, MS/MS). A Monsieur Achoundong, Botaniste au Cameroun, pour la récolte de Leea guineensis. Sans vous point d’étude ! A Monsieur Jean Marc NUZILLARD, Directeur de Recherche CNRS au Laboratoire de Pharmacognosie de l’Université de Reims pour avoir passer un échantillon sur le 500 MHz tant rêvé ! A Monsieur Ahcène BOUMENDJEL, Maître de Conférence au Laboratoire de Pharmacognosie, pour tes conseils, ton intérêt à nos travaux et nos discussions éclectiques.

6

A Monsieur Patrick RAVANEL, Professeur de Biologie Végétale, Directeur du Laboratoire Ecosystèmes et Changements Environnementaux de Grenoble, pour tes encouragements tout au long de ce travail, ton aide et ta disponibilité. J’ai aussi beaucoup aimé tes diapos sur les plantes toxiques de France, il va de soit que ta narration avec l’accent d’la Yaute y sont pour quelque chose ! A Madame Claude VIAL, pour sa gentillesse et sa disponibilité pour les nombreuses recherches en ligne que nous avons effectuées. A Diderot Noungoue Tchamo, je te remercie, entre autre, pour m’avoir offert ton amitié et amené Leea guineensis. Reçois ici, toi qui es devenu Maître de Conférence à Yaoundé, un témoignage de ma profonde amitié. A Gilles BRUN, "le Dupont bis", ton travail sur Catharanthus roseus, nous aura confronté aux mêmes situations. Reçois ici un témoignage de mon Amitié. A toutes les personnes du Laboratoire de Pharmacognosie, pour l’ambiance chaleureuse rencontrée et leur vive sympathie. A Stéphane, thésard au Laboratoire de Chimie bioorganique pour avoir enregistré les spectres au 300 MHz au CEA cet été ! A Jin, Médecin Pharmacologue de l’Université de Shanghai, en stage chez nous qui a essayé de mettre au point un test antioxydant pour l’analyse de nos produits ainsi que pour les résultats préliminaire sur la relaxation des muscles lisses. Au Laboratoire de Pharmacologie Médicale de l’UFR de Médecine pour les premiers résultats sur la recherche d’une activité relaxante sur les veines saphènes humaines. A ma sœur Muriel et son entreprise O de Gamme pour avoir eu la gentillesse de me scanner les planches et dessins de Leea.

7

Liste des abréviations

13

C J modulé spectre carbone 13 réalisé avec J modulation BAW Butanol-Acide acétique-Eau BuOH butanol C(x) Solvant de Chromatographie de type (x) C-18 Chromatographie sur support en phase inverse C-18 CCM Chromatographie sur Couche Mince CCMprep Chromatographie sur Couche Mince Préparative CDCl3 chloroforme deutérié CD3OD méthanol perdeutérié CG/SM couplage Chromatographie Gazeuse-Spectrométrie de Masse CHCl3 chloroforme cHex cyclohexane CH2Cl2 dichlorométhane CLMP Chromatographie Liquide Moyenne Pression CO chromatographie sur Colonne Ouverte COLOC XH shift Correlation by Long range Coupling COSY Correlated SpectroscopY CPG Chromatographie en Phase Gazeuse CV Composés Volatils DCI Desorption by Chemical Ionisation DIC Degré d’Insaturation et de Cycle DMSO diméthyl sulfoxyde DMSO-d6 diméthyl sulfoxyde hexadeutérié E(x) Elution de type x EI Electronic Impact EtOAc acétate d’éthyle EtOH éthanol FAB Fast Atom Bombardement F () ST Flavonol Sulfotransférase J (Hz) constante de couplage exprimé en Hz L. Leea LH-20 chromatographie sur gel de Sephadex LH-20 MeOH méthanol m/z masse/charge électronique nd non déterminé PM Poids Moléculaire ppm partie par million Rdt rendement rel relatif Rf Rapport frontal Rha Rhamnosyl RMN Résonance Magnétique Nucléaire RP Phase Inverse Si et SiO2 support chromatographique en silice SM Spectrométrie de Masse ST Sulfotransférase uma unité de masse atomique 8

UV Visiprep VLC XHCORR δ (ppm) λmax

Ultra-Violet Colonne prête à l’emploi de type Visiprep Vacuum Liquid Chromatography XH shift CORRelated 2D NMR déplacement chimique exprimé en ppm longeur d’onde d’absorbance maximale

9

TABLE DES MATIERES PAGE

Introduction

2

Première Partie – Bibliographie

4

Chapitre I - Etude Botanique

5

I­ Position systématique

5

A) Historique de la taxonomie du genre Leea B) Position systématique de la famille des Leeaceae

5 7

C) Conclusion

9

II- Généralités sur le genre Leea

11

A) Classification et composition du genre

11

B) Principaux caractères botaniques

14

C) Répartition géographique

15

III- Généralités sur l’espèce Leea guineensis G. Don

17

A) Dénomination et synonymies

17

B) Noms vernaculaires

20

C) Répartition géographique

21

D) Description botanique

22

E) Divers

26

Chapitre II – Etudes phytochimique et biologique des Leeaceae I- Etude phytochimique

27 27

A) Criblage phytochimique

27

B) Huile essentielle

28

C) Composés phénoliques

28

10

11

II- Etude biologique des Leea A) Activités des différentes espèces de Leea

31 31

B) Activités de Leea guineensis

35

C) Conclusion

39

Chapitre III - Les Flavonoïdes Sulfatés

40

I­ Introduction

40

II­ Classification, Structure

40

A) Les flavones sulfatées

42

B) Les flavonols sulfatés

45

III­ Distribution

49

IV­ Fonctions

50

A) Détoxification

51

B) Transfert d’ion

51

C) Bioactivation

51

D) Régulation du transport de l’auxine

52

V­ Enzymologie

52

VI­ Métabolisation et Bioconversion

54

A) Métabolisation

54

B) Bioconversion

55

VII­ Propriétés biologiques des flavonoïdes sulfatés

55

A) Activité Antiallergique B) Activité Mutagène – Carcinogène

55 56

C) Inhibition des déshydrogénases

57

D) Inhibition de l’aldose réductase

57

E) Activité Anti-oxydante – Antiradicalaire

60

F) Chimioprévention des cancers du sein

61 12

Conclusion

63

13

Deuxième Partie ­ Travaux Personnels

64

Chapitre I - Matériel végétal et Chimie Extractive

65

I- Matériel végétal

65

II- Chimie extractive

65

A Extraction solide-liquide des feuilles

65

B Extraction liquide-liquide

65

C Hydrodistillation

66

Chapitre II - Isolement des composés

68

I- Extrait hexanique

68

II- Extrait dichlorométhane

69

III- Extrait acétate d’éthyle

70

IV- Extrait butanolique

71

V- Extrait aqueux

72

Chapitre III - Analyse Structurale

73

A- Etude des composés volatils

73

I- Analyse

73

II- Discussion

77

B- Etude des Terpénoïdes

80

I- Identification de Terp-1

80

II- Identification de Terp-2

83

III- Identification de Terp-3

IV- Identification de Terp-4 V- Identification de Terp-5

87

89 91 14

VI- Identification de Terp-6

95

VII- Identification de Terp-7

100

C- Etude des Flavonoïdes

103

I Identification de Flav-1

103

II Identification de Flav-2

105

III Identification de Flav-3

107

IV Identification de Flav-4

109

V Identification de Flav-5

115

VI Identification de Flav-6

118

VII Identification de Flav-7

120

D- Etude des composés divers

125

I Identification de Ac Ph-1

125

II Identification de Ac Ph-2

126

III Identification de AG-1

128

Chapitre IV – Activités Biologiques

130

A– Evaluation des extraits EtOAc, BuOH, H2O sur la viabilité cellulaire

130

I- Introduction

130

II- Résultats

131

III- Conclusion

132

B– Activité du palmitate de β-amyrine et des extraits EtOAc, BuOH, H2O sur la production de prostaglandines 6KF1α

133

I- Introduction

133

II- Résultats

134

III- Conclusion

136

C– Activité du palmitate de β-amyrine sur l’expression de l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1

137 15

I- Introduction

137

II- Résultats

138

III- Conclusion

138

D– Activité antiradicalaire des extraits EtOAc, BuOH, H2O et de certains composés

139

I- Introduction

139

II- Résultats

140

III- Conclusion

142

Discussion

144

Conclusion

155

Bibliographie

159

Annexes

173

Matériels et Méthodes

174

I Lyophilisation

174

II Matériel chromatographique

174

A Chromatographie analytique en couche mince (CCM)

174

B Chromatographie préparative 174 C Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

176

III Méthodes chromatographiques 177 A Extrait hexanique

177

B Extrait dichlorométhane

179

C Extrait acétate d’éthyle

181

D Extrait butanolique

182 16

E Extrait aqueux

183

IV Mesures spectrales

184

A spectre UV 184 B Spectre de masse (SM)

184

C Spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN)

184

D Pouvoir rotatoire 184 V Méthodes chimiques

185

A Recherche de tanins 185 B Recherche d’alcaloïdes 185 C Recherche de saponines 185 D Hydrolyse du palmitate de β-amyrine 185 VI Tests biologiques

186

A Evaluation de la viabilité cellulaire

186

B Evaluation de la production de prostaglandines 6KF1α par les kératinocytes humains 188 C Evaluation de l’expression de l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1

189

D Evaluation d’une activité antiradicalaire 191 VII Fiches produits

193

VIII Liste des noms usuels des flavones

210

IX Liste des noms usuels des flavonols

210

X Liste des figures

211

XI Liste des tableaux

213

17

Philippe OP de BECK

Etude Phytochimique et Biologique de Leea guineensis G. Don (Leeaceae) Mots Clés : Leea guineensis G. Don, Leeaceae, Composés volatils, Flavonoïdes, Flavonols sulfatés,  Terpènoïdes, Triterpènes acylés, Acides phénoliques, Anti­inflammatoire, Cardiovasculaire,  Antiradicalaire, RMN, CG/SM Résumé : Très peu étudiée, Leea guineensis G. Don appartient à la famille monogénérique des  Leeaceae.   Elle   est   utilisée   en   médecine   traditionnelle   notamment   dans   les   domaines  cardiovasculaire et anti­inflammatoire. Pou ces raisons, l’étude phytochimique et biologique  de cette plante est intéressante. Dans   une   première   partie,   nous   avons   rappelé   les   données   bibliographiques  concernant la classification et la description botanique de cette plante, ses utilisations en  médecine populaire et les études phytochimiques déjà réalisées.  Une deuxième partie présente les résultats de notre propre étude phytochimique et  biologique. Ainsi, 73 composés volatils et 17 métabolites provenant de cinq extraits (hexane,  dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanol et eau) des feuilles ont été identifiés. L’utilisation  conjointe de plusieurs méthodes spectroscopiques (CG/SM, UV, RMN 1D et 2D, SM) a  ainsi mis en évidence 7 terpénoïdes dont 3 triterpènes acylés, 7 flavonoïdes dont 3 flavonols  sulfatés, 2 acides phénoliques et 1 acide gras. La présence de flavonoïdes sulfatés et de terpénoïdes dans cette famille est recensée  pour la première fois. Le coriolate de  β­amyrine, la quercitrine 3’­sulfate et la quercétine  3,3’,4’­trisulfate sont isolés pour la première fois du règne végétal. Les activités anti­inflammatoire et antiradicalaire ont été recherchées sur les extraits polaires  et   quelques   composés   purs.   L’activité   anti­inflammatoire,   mesurée   par   la   production   de  prostaglandines, est peu significative pour les extraits alors que le palmitate de  β­amyrine  s’est montré actif. Par ailleurs ces mêmes extraits ainsi que les acides phénoliques et les  flavonols non sulfatés présentent une activité antiradicalaire. Abstract : The Leeaceae is a monogeneric family close to the Vitaceae. Leea guineensis is a widespread shrub that grows in tropical climate. It was reported to be used in traditional African medicine for its cardiac and antalgic properties. Our phytochemical investigations led to the identification of 73 volatils compounds from the wood and leaves, and of 17 compounds coming from five different extracts from leaves (hexane, dichloromethane, ethylacetate, butanol and water). They were identified by means of their spectroscopic data (GC/MS, UV, NMR, SM) and especially 2D NMR experiments, as 7 terpenoids (including 3 acylated triterpens), 7 flavonoids (including 3 sulphated flavonols), 2 phenolic acids and 1 fatty acid.

18

Sulphated flavonoids and terpenoids have never reported previously in the Leeaceae. Coriolic ester of β-amyrine, quercitrine 3’-sulphate and quercetine 3,3’,4’-trisulphate are reported for the first time in the plant kingdom. Biological activity of the polar extracts and of some pure compounds have been  evaluated on prostaglandins production and metalloproteinase expression in keratynocyts.  Besides these anti­inflammatory activities, a potential antiradicalar property was mesured.

INTRODUCTION

19

INTRODUCTION

Au sein du Département de Pharmacochimie Moléculaire, unité mixte de recherche CNRS/UJF (5063), dont la thématique de recherche est la conception, la synthèse et le criblage de molécules à activités antioxydante et cardiovasculaire, le Laboratoire de Pharmacognosie a pour objectif, l’isolement, l’identification et l’hémisynthèse de molécules naturelles actives. Dans cette optique, il m’a été confié l’étude d’une plante camerounaise, Leea guineensis (Leeaceae). Celle-ci est notamment utilisée en médecine traditionnelle pour ses effets anti-inflammatoires et antihypertensifs. Or, l’analyse de la littérature montre que la famille des Leeaceae a été très peu étudiée. On ne répertorie, de 1959 à 1991, qu’une vingtaine de dérivés phénoliques (flavonoïdes et acides phénoliques), et quelques criblages préliminaires faisant apparaître des tanins, des alcaloïdes et des saponines pour certaines espèces. L’étude entreprise sur Leea guineensis offre deux intérêts majeurs. Premièrement, toute l’analyse phytochimique sera nouvelle pour cette espèce, car avant nous, aucun travail n’a été entrepris. L’identification des constituants majoritaires permettra aussi de mieux connaître la famille et de la situer dans la systématique moderne. Deuxièmement, une étude des propriétés biologiques des extraits ainsi que des composés isolés, permettront de valider les usages de cette plante en médecine traditionnelle ou d’apprécier de nouvelles propriétés. La première partie, bibliographique, est consacrée à une étude botanique très générale de la famille des Leeaceae, et de l’espèce Leea guineensis G. Don. L’étude phytochimique et biologique des Leeaceae fait l’objet d’un second chapitre. Cette étude bibliographique est complétée par un troisième chapitre consacré aux flavonoïdes sulfatés. L’isolement de ces composés n’ayant encore jamais été rencontrés chez les Leeaceae, il paraît intéressant de rappeler leurs principales caractéristiques. La deuxième partie est consacrée aux travaux personnels. Dans un premier temps, nous exposons comment à partir de la préparation de différents extraits de polarité croissante, nous avons purifié les composés. Puis nous analyserons les principaux composés obtenus par

20

hydrodistillation du bois et des feuilles par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. L’étude des extraits provenant des feuilles, a permis, après des fractionnements successifs sur différents supports chromatographiques, d’isoler et d’identifier des composés essentiellement de nature terpénique et phénolique. L’identification de ces molécules est obtenue par l’analyse conjointe de plusieurs techniques spectrales comme l’UV, la spectrométrie de masse, la résonance magnétique nucléaire RMN 1D et 2D (COSY, COLOC, XHCORR). Le chapitre suivant présente les recherches menées sur les activités biologiques des extraits acétate d’éthyle, butanolique et aqueux des feuilles, ainsi que de quelques composés purifiés, ceci afin de vérifier l’utilisation de la plante en médecine traditionnelle. Les activités anti-inflammatoire et antiradicalaire sont ainsi déterminées.

21

Première Partie : Bibliographie

Botanique Phytochimie et biologie des Leeaceae Flavonoïdes sulfatés

22

Chapitre I - Etude Botanique

Ce chapitre présente les données générales de l’évolution historique au sein de la systématique du genre Leea et de la famille des Leeaceae, ainsi que les difficultés rencontrées pour classer cette famille dans la taxonomie actuelle. Une étude des caractéristiques botaniques du genre Leea et de l’espèce étudiée, Leea guineensis G. Don, est ensuite présentée, suivie d’une revue bibliographique concernant la phytochimie et les diverses activités biologiques de cette famille et plus particulièrement de notre espèce.

I- Position systématique Pour la plupart des auteurs, Leea guineensis G. Don appartient aux Dicotylédones Dialypétales, à l’ordre des Rhamnales, à la famille des Leeaceae. Cette hypothèse soutient la thèse de Cronquist [1988]. Cependant la position taxonomique du genre Leea van Royen ex L. a subi diverses modifications au cours du temps. A) Historique de la taxonomie, positionnement du genre Leea : Les recherches de Suessenguth [1953], Nair [1968] et Ridsdale [1975] montrent toutes les difficultés rencontrées pour classer le genre Leea au sein de la systématique. Les premières traces "pré-Linnéenne" montrent que le genre était connu par Rheede (vers 1678-79), qui fut le premier à le décrire et l’illustrer sous le nom de Nalugu. Plus tard, Rumphius (1743) décrit et représente deux espèces provenant d’Ambon, une île d’Indonésie. Ces taxons sont aujourd’hui connus comme étant L. aculeata et L. aequata. Ce n’est que depuis 1767 que cette famille est monogénérique et a pour nom de genre, Leea. Ce genre a été nommé ainsi en l’honneur de James Lee (1715-1795), horticulteur qui a créé une pépinière à Hammersmith à Londres et qui avec son collègue William Malcolm a été le premier à cultiver les Leea en Europe dès 1767. Les collections de ces spécimens cultivés sont préservées au British Museum. Quant à la famille Leeaceae, sa création est attribuée à Dumortier (1829), qui place cette famille près des Sapotaceae. Cela n’empêchera pas au cours de l’histoire de voir les Leea ballottées dans différentes familles et sous-familles.

23

Tableau 1 : Classement taxonomique du genre Leea Classement genre Nalugu genre Leea genre Staphylea genre Aquilicia genre « Sapotis affinia » Leea dans une tribu Ampelideae famille Leeaceae Leea dans famille Meliaceae famille monogénérique Leeaceae Leea dans Vitaceae (Ampelidaceae) Leea dans Vitaceae (Ampelidaceae) Leea dans Vitaceae (Ampelidaceae) (relation avec Meliaceae) Leea hors des Vitaceae Leea dans sous-famille Leeoïdeae à côté des Vitioïdae dans famille Vitaceae famille Leeaceae Leeoïdae élévés en famille Leeaceae famille Leeaceae (relation avec Buettnerinae des Sterculiaceae) genre Leea hors des Vitaceae Leea inclus dans Vitaceae famille Leeaceae à côté des Vitaceae famille Leeaceae sous-famille Leeoïdae dans les Vitaceae famille Leeaceae

Auteurs Rheede Lee Burm. Mantissa De Jussieu De Candolle Dumortier Mérat et De Lens Bartling Lindley Bentham et Hooker Le Maout, Decaisne Planchon Gild

Années 1678 1767 1768 1771 1789 1824 1829 1829 1830 1833 1862 1876 1887 1896

Gagnepain Gild, Brandt Suessenguth Periasamy Hutchinson Behnke et Dahlgren Cronquist Thorne Takhtajan

1910 1912 1953 1962 1973 1976 1988 1992 1997

Aujourd’hui, le genre Leea est placé dans la famille des Leeaceae proche des Vitaceae. Mais si on remonte dans la systématique, on se rend compte que le choix d’appartenance à un ordre est tout aussi difficile. En effet, la place des Leeaceae a subi aussi diverses modifications.

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B) Position systématique de la famille dans un ordre La   famille   des   Leeaceae,   tout   en   étant   étroitement   liée   à   celle   des   Vitaceae,   est  généralement placée dans l’ordre des Rhamnales. Or cette position est parfois contestée. Ainsi  même s’il existe des différences entre les graines de Leeaceae et de Vitaceae, celles­ci sont  trop différentes de celles des autres familles de l’ordre des Rhamnales pour justifier cette  inclusion [Corner 1976]. De même Behnke et Dahlgren [1976] montrent que les Vitaceae et Leeaceae ont des plastides de type P (avec des protéines cristalloïdes polygonales) alors que chez les Rhamnaceae, ils sont de type S (avec de l’amidon). Ainsi, il faut séparer clairement ces deux groupes de familles. Cronquist sépare les Leeaceae des Vitaceae, et les place aux côtés des Rhamnaceae [Cronquist 1988]. Ces trois familles sont placées dans l’ordre des Rhamnales. Plus récemment, Takhtajan [1986, 1997], sépare le groupe des Leeaceae et Vitaceae de la famille des Rhamnaceae, et place celui-ci dans un même ordre, les Vitales, issu du superordre des Vitanae. En effet, les Leeaceae et Vitaceae diffèrent, entre autres, des Rhamnaceae par la présence de raphides (absence chez les Rhamnaceae), de fruits qui sont des baies, (drupes chez les Rhamnaceae), de plastides de type P (type S chez les Rhamnaceae) et par l’anatomie des graines. Ces derniers critères sont aussi ceux que Cronquist utilise pour étudier l’ordre très diversifié  des Rhamnales. Et bien que les Leeaceae et les Vitaceae soient très proches, ces deux familles  sont bien distinctes des Rhamnaceae.

L’évolution de la position des Leeaceae dans la systématique moderne peut être résumée dans  le tableau suivant :

Tableau 2 : Situation des Leeaceae dans la systématique moderne Auteur Année Superordre Ordre Sous-ordre

Hutchinson 1973 Rhamnales

Dahlgren Cronquist 1989 1988 Santaliflorae Vitales Rhamnales

Thorne 1992 Cornales Vitinae

Takhtajan 1986 - 1997 Vitanae Vitales

25

Famille Sous-famille (Nbre d’espèces)

Vitaceae (Leeaceae incluse)

Vitaceae

Leeaceae

Vitaceae

(70)

Leeoideae (34)

Leeaceae (70) en 1986 (34) en 1997

Cet historique sur la taxonomie des Leea nous aura permis de les placer dans une famille monogénérique, les Leeaceae, proche des Vitaceae. A l’heure actuelle, il est préférable de placer ces deux familles dans un même ordre, celui des Rhamnales. Cette classification est simple et a l’avantage de grouper des familles proches dans un même ordre, tout en les séparant distinctement. Mais comme nous avons pu le remarquer, la position systématique des Leea a été quelque peu controversée. Des affinités ont même été suggérées avec les Sapotaceae [Suessenguth 1953], les Meliaceae [Le Maout 1876] et les Sterculiaceae [Nair 1968]. Néanmoins, c’est surtout avec les Vitaceae qu’elles ont été longtemps classées. Or, les Leeaceae semblent avoir suffisamment de caractères distinctifs pour en être séparées (Tableau 3), (Figure 1). Ce sont les études sur l’anatomie florale, l’embryologie, la palynologie et la chimiotaxonomie qui ont permis de classer en tant que famille monogénérique les Leeaceae, et de les séparer des Vitaceae [Gagnepain 1911, Suessenguth 1953, Nair 1957 et 1968, Tarnavschi 1968, Ridsdale 1975, Corner 1976, Patil 1984, Gerrath 1990, Umadevi 1991, Verdcourt 1993, Thakhtajan 1997]. Tableau 3 : Différences essentielles entre les Leeaceae et les Vitaceae :

Différences Port Vrilles Inflorescence Tube staminal Nombres de carpelles par ovaire Nombre de loges

Nombre d’ovule dans chaque loge Graines

Nombre de chromosomes Stomates

Vitaceae lianescent présence extra-axillaire absent 2 simple

2 1-3 ovoïdes ruminées 2n=38 ou 40 2n=24 pour quelques Cissus gros, peu nombreux

Leeaceae droit absence terminale présent + de 2 double (3-8) (par la formation de fausse cloison) au moins 1 4-6 triangulaires-ovalées très ruminées (souvent à 5 croissances) 2n=24 petits et nombreux

26

Figure 1 : Différents types de graines de Vitaceae et Leeaceae [Ridsdale 1975]

C) Conclusion sur la systématique Bien qu’il y ait de très fortes affinités avec les Vitaceae, les Leea ont suffisamment de caractères distinctifs pour être considérées comme une famille monogénérique à part entière ; les Leeaceae, appartenant à l’ordre des Rhamnales.

D’après tous ces critères, et avant d’aborder les généralités propres aux Leea, nous pouvons situer dans la systématique la plante qui fait l’objet de ce travail, Leea guineensis G. Don (Figure 2).

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Magnoliophyta (Angiospermes) 220000 espèces

Sous-embranchement

Classes

Liliopsida (Monocotylédones) 55000 espèces

Magnoliopsida (Dicotylédones) 165000 espèces

Sous-classes

Magnoliidae

Hamamelidae Caryophyllidae

Dilleniidae

Asteridae Rosidae 116 familles (60000 espèces)

Ordres

Rosales Fabales

Proteales

Podostemales

Haloragales

Myrtales

Rhizophorale s

Cornales

Santalales

Rafflesiales

Celastrales

Euphorbiales

Linales

Polygalales

Sapindales

Geraniales

Apiales

Rhamnales 3 familles (1700 espèces)

Familles Rhamnaceae (900 espèces)

Leeaceae (70 espèces)

Vitaceae (700 espèces)

Genre Leea

Espèce Leea guineensis G. Don Figure 2 : Situation dans la systématique de Leea guineensis G. Don (selon Cronquist 1988)

28

II- Généralités sur le genre Leea Avant d’aborder les principaux caractères des Leea, nous discuterons des possibilités de division du genre. A) Classification et composition du genre Leea Ce genre a été divisé par Clarke en 1881 en deux séries en fonction de la couleur des  fleurs (Tableau 4). Puis, ces séries furent sous­divisées en sections contenant une ou plusieurs  espèces. Les sections dressées par Clarke consistent à grouper les espèces parentes, mais sont  insuffisantes pour former des séparations formelles entre elles [Suessenguth 1953, Ridsdale  1975].

Tableau 4 : Classification selon Clarke (1881)

Séries

Sections

Espèces typiques

Rubiflorae (fleurs rouges)

Edgeworthiae Laetae Rubrae

L. alata L. laeta L. rubra

Viridiflorae (fleurs vertes)

Pycnoneurae Paucifoliolosae Sambucinae Aequatae

L. crispa L. macrophylla L. sambucina L. aequata

Cette   division   du   genre   en   deux   séries   n’est   pas   satisfaisante   et   d’autres   caractères   plus  importants   sont   à   prendre   en   compte  pour   la   connaissance   et   la   description   des   espèces.  Gagnepain [1910] a lui aussi tenté de classer les différentes Leea. Il commence l’analyse par  les caractères floraux qui, bien que très homogènes dans la famille, montrent des variations  très précises de l’androcée suivant les espèces. Il sépare ainsi en 4 groupes les  Leea. A ces  caractères floraux, il ajoute l’analyse des feuilles (simples, composées, glabres ou plus ou  moins velues), et la coloration des fleurs pour distinguer 19 espèces de Leea asiatiques.

29

Selon les travaux de Burt (1935), on peut séparer le genre en subdivisions reposant sur  le type structural de la fleur (pentamère ou tétramère). Cette suggestion est pratique pour les  taxas des Philippines (qui présentent par ailleurs de nombreux types de graines). C’était un  bon moyen pour séparer le genre en groupes distinctifs, mais de récentes collections montrent  par exemple que L. tetramera est une espèce qui peut être tétra ou pentamère [Ridsdale 1975].

Kirtikar et Basu [1975] distinguent quant à eux 3 groupes selon les feuilles de quelques Leea asiatiques : Tableau 5 : Classification selon Kirtikar et Basu [1975]

Groupe Feuilles A Feuilles simples B Feuilles simplement pennées (le plus souvent) C Feuilles bi- ou tripennées glabres faces inférieures velues

Espèces L. macrophylla L. crispa L. indica L. robusta L. diffusa L. aspera L. hirta

Ces   différentes   études   montrent,  qu’il   est   difficile   de   diviser   de   façon   formelle   le  genre,   aussi   est­il   préférable   de   parler   de  famille   monogénérique.   La   détermination   des  différentes  espèces  se  fera sur  l’utilisation d’une clef du type  de celle  mise au point par  Ridsdale [1975].

Ridsdale [1975] a fait une révision complète de la famille, dans laquelle il reconnaît 34 espèces. 32 se rencontrent dans l’aire Indo-Malaisienne, et 2 sont limitées dans l’aire AfroMalgache. Il a remarqué qu’il était très difficile de différencier certaines espèces sur les seuls critères des feuilles et des fleurs (la séparation des espèces n’étant possible qu’en considérant de grosses différences dans la longueur de certains organes).

30

31

Voici la liste des différentes espèces qu’il reconnaît : L. aculeata Bl. ex Spreng.

L. macrophylla Roxb. ex Hornem.

L. acuminatissima Merr.

L. macropus K. Schum. & Laut.

L. aequata L.

L. magnifolia Merr.

L. alata Edgeworth

L. papuana Merr. & Perry

L. amabilis Masters

L. philippinensis Merr.

L. angulata Korth. ex Miq.

L. quadrifida Merr.

L. compactiflora Kurz

L. rubra Bl. ex Spreng

L. congesta Elm.

L. saxatilis Ridl.

L. coryphantha Laut.

L. setuligera Clarke

L. crispa van Royen ex L.

L. simplicifolia Zoll. & Moritzi

L. curtisii King.

L. smithii Koorders

L. gonioptera Laut.

L. spinea Desc.

L. grandifolia Kurz

L. tetramera Burtt.

L. guineensis G. Don

L. thorelii Gagnep.

L. heterodoxa K. Schum. & Laut.

L. tinctoria Baker

L. indica (Burm f) Merr.

L. unifoliata Merr.

L. krukoffiana Ridsd.

L. zippeliana Miq.

Par ailleurs, il recense trois espèces douteuses : L. erecta Voll. & Brade qui serait une espèce non reconnue en botanique, L. humilis Hassk. qui serait probablement L. aequata L. javanica Bl. ex Spreng. qui serait une espèce dont on ne retrouve plus trace. Il exclue aussi 6 espèces : L. cordata Wall. qui devient une espèce de Vitis (Vitaceae). L. dielsii Léveillé qui est Ampelopsis chaffanjoni (Léveillé) Rehder (Vitaceae). L. laevis Heyne ex Wall. qui est Trichilia connaroides (W. & A.) Bentv. (Meliaceae). L. odontophylla Wall. qui est Ampelopsis latifolius (Wall.) Planch. (Vitaceae). L. spinosa Spreng. qui est Aralia chinensis L. (Araliaceae). L. theifera Léveillé qui est Ampelopsis cantoniensis (Hook. & Arn.) Planch. (Vitaceae).

32

Avec le nouveau mode de communication qu’est Internet, on retrouve d’autres espèces  [Phytochemical   and   ethnobotanical   database,   GRIN   database].   Peut­être   s’agit­il   de   noms  synonymiques non répertoriés ? L. coccinea Boj. L. guinensis L. hirta Banks ex Roxb. L. robusta L. sambucina Schum. et Thonn.

Cette famille monogénérique Leea Royen ex Linn., Mant. I, 17, (1767), 124. comprend à ce jour plus de 70 espèces réparties dans différentes régions d’Afrique, d’Asie, d’Australie et d’Océanie.

B) Principaux caractères botaniques [Descoings 1967] Les Leea peuvent être des plantes herbacées, des arbres, ou des arbustes de 2 à 10 m de hauteur. 

Les tiges et les feuilles

Les tiges sont droites, ramifiées ou non, généralement lenticellées, parfois munies de fortes épines, sans vrille, à feuilles généralement groupées aux extrémités. Les feuilles sont composées, pennées, bi- ou triternées, à rachis caniculé, à pétiole élargi et embrassant à leur base. Les stipules sont soudées aux pétioles, et caduques. 

Les folioles

Les folioles de forme et de taille variables, sont généralement simples, à bord crénelé ou denté, à nervation simple, pennée.

33



Les inflorescences

Elles sont grandes, corymbiformes et sont opposées aux feuilles supérieures. 

Les fleurs

Elles sont rouge ou jaune verdâtre, de taille réduite (5­6 mm) et pédicellées.  

Les fruits

Ce sont des baies globuleuses, côtelées faiblement charnues, à 4­6 graines avec la présence de  raphides. 

Les graines

Elles sont ovales, anguleuses, à section transversale triangulaire par compression latérale et présentent sur les faces latérales des dessins ou un léger creux. Elles sont constituées d’un embryon linéaire à radicule infère, avec un albumen ruminé montrant de profondes fossettes.

C) Répartition géographique On rencontre les Leea principalement dans les zones tropicales d’Asie et d’Afrique alors qu’elles ne sont pas présentent sur le continent américain. Le genre est centré sur la Malaisie et s’est développé vers l’ouest en Afrique et Madagascar, et vers l’est aux îles Fiji [Suessenguth 1953, Harriman 1991, Ridsdale 1975]. Les espèces afro-malgaches ont des similitudes bien établies avec celles présentes en Asie et en Indonésie. Cela laisse présumer une origine orientale fondée sur la théorie wegenerienne de la dérive des continents plus qu’à un moyen de dispersion par les courants marins [Cadet 1980].

34

Les Leea sont rencontrées dans des zones humides ne dépassant guère 900 m d’altitude et de formations forestières ombragées. De plus, certaines d’entre-elles comme L. indica, semblent jouer un grand rôle dans l’embroussaillement des trouées forestières car elles sont à croissance rapide et à tempérament grégaire. Leur bois est tendre. Elles constituent donc rapidement des fourrés denses dépassant 2m de hauteur à l’âge de 2 à 3 ans en présence d’autres espèces telles que Trema orientalis (Ulmaceae) et Macaranga roxburghii (Euphorbiaceae) [Blasco 1971].

___

zone de répartition des Leea

Figure 3 : Répartition géographique des Leea [Suessenguth 1953]

35

III- Généralités sur l’espèce Leea guineensis G. Don

Figure 4 : Représentation de Leea guineensis [Lavergne 1990]

A) Dénomination et synonymies Appelée Leea guineensis G. Don, Gen. Hist. I (1831) 712, on retrouve plusieurs noms synonymiques pour cette espèce, qui peuvent être à l’origine de nombreuses confusions : L. sambucina auct. non Will., L. maculata Desf., L. arborea Telf. ex W. & A., L. arborea Sieber ex Boj., L. sambucina Willd. var. arborea Miq., L. manillensis Walp., L. aurantiaca Zoll. & Mor., L. coccinea Planch., L. lucida Linden ex Planch., L. punctata Desf. ex Planch., L. cuspidifera Baker, L. javanica auct. non Bl., L. speciosa Sieb. ex Miq., L. laeta Wall., L. sanguinea Wall., L. acuminata Wall., L. cumingii Clarke, L. pumila auct non Kurz, L. wightii Clarke, L. parva Elm., L. negrosense Elm., L. palawanensis Elm., L. euphlebia Merr., L. parvifoliola Merr., L. papillosa Merr., L. luzonensis Elm., L. robusta auct. non Roxb., L. dentata Craib, L. schomburgkii Craib, L. brunoniana auct. non Clarke, L. pallidifolia Kanehira, L. bulusanensis Elm.

36

Il faut noter que cette espèce présente de nombreuses variabilités dues à sa répartition géographique ou écologique. C’est en partie pour cela que cette espèce est répertoriée sous plus de 30 noms synonymiques car bien des travaux ont décomposé cette espèce en plusieurs entités. Or la plupart de ces taxas ne sont séparés que par des différences végétatives mineures. Ainsi, même entre des espèces africaines et asiatiques telles que L. guineensis et L. manillensis, il n’existe qu’une petite différence de couleur du tube staminal (due semble-t-il aux habitats différents) ; les caractères morphologiques des feuilles et des fleurs sont en tous points identiques [Ridsdale 1975]. Ainsi, le mauvais usage des synonymies peut être illustré par l’exemple de L. rubra sensu auct. non Blume ex. Sprengel et L. sambucina sensu auct. non Willd [Staples 1996]. Des horticulteurs ont employé L. rubra pour désigner une forme de L. guineensis ayant des feuilles rougeâtres, alors que L. rubra est une authentique espèce déjà existante. Quant à L. sambucina, c’est une espèce dont le nom a été mal employé dans la littérature, car L. sambucina est un des synonymes de L. indica. Toutefois certaines différences ont permis à Descoings [1967] lors de son étude sur la flore de Madagascar d’observer des variétés locales bien distinctes : L. guineensis G. Don ­ var. longifoliolata  Desc. Folioles supérieures très grandes, jusqu’à 25 X 6cm, oblongues, très étroites, de largeur plus grande vers la base, acuminées au sommet, à bords crénelés. Folioles inférieures de taille réduite et de forme variable. Dans les marais à raphias et bas fonds. - var. monticola Desc. Folioles petites, 7-11 X 2-3.5cm, oblongues-elliptiques, oblongueslancéolées, de largeur plus grande vers le milieu, à base en coin, à sommet acuminé, à bords crénelés. Dans les régions montagneuses.

37

- var. spiculata Desc. Folioles de taille moyenne à faible, 9-12 X 3-4cm, elliptiques, oblonges elliptiques, acuminées, à bords présentant 5-7 paires de lobes très atténués, terminés par une dent en spicule courte, épaisse, fortement saillante vers l’extérieur. Plateaux calcaires. - var. truncata Desc. Folioles grandes, 12-15 X 4.5-11cm, oblongues-ovales, de largeur plus grande dans la partie supérieure, à base en coin, à sommet tronqué, largement arrondi, terminé par un long acumen, à bords crénelés. Forêts ombrophiles. - var. cuspidifera Desc. –L. cuspidifera Bak. Pubescence cuspidée des tiges, pétioles rachis et ramifications, surtout aux insertions. Folioles elliptiques ou elliptiques-lancéolées, 4-18 X 2-8cm, à base en coin ou obtuse, à sommet en acumen long et étroit (10-30 X 1.5-3 mm) obtus, à bords crénelés ou dentés. Forêts tropophiles, sur sables et calcaires. - var. comoriensis Desc. Folioles grandes, 10-15 X 4.5-6cm, ovales-elliptiques, elliptiques, à base obtuse ou arrondie, à sommet longuement acuminé, à bords crénelés, à pubescence généralement nettement concentrée aux confluents des nervures. Forêts ombrophiles. - var. orientalis Desc. Endémique Folioles oblongues-elliptiques, elliptiques, 8-16 X 3-6cm, à base en coin, à sommet acuminé, à bords finement dentés, à pubescence régulièrement répartie. Forêts ombrophiles.

38

Pour notre plante, l’échantillon présente une foliole supérieure très grande 18 X 6 cm,  acuminée au sommet, des folioles inférieures de taille réduite de forme variable, acuminées.  De plus, celle­ci provient d’une forêt à raphiales marécageuse ou périodiquement inondée.  Bien qu’aucune variété ne soit décrite pour Leea guineensis au Cameroun [Descoings 1972],  notre échantillon fait penser à la variété longifoliolata rencontrée à Madagascar.

Figure 5 : Feuille séchée de Leea guineensis provenant du Cameroun

B) Noms vernaculaires La liste n’est pas exhaustive, car chaque tribu a sa propre appellation. Nous n’en donnerons que quelques exemples : La Réunion

bois de source, bois de sureau

Inde

karkatajihva (sanscrit)

République Centrafricaine

gamboula (gbaya)

Gabon

mopaga-poga (apindji), debole-nyembaka (bakele)

Madagascar

fanamboavanana, mahimboavana, sadrakidraky

Côte d’Ivoire

diawa (guimini), koulateo (guéré)

Cameroun

essong, n’top fitta, utua-bisson (yaoundé), wabozeende (mabea) 39

C) Répartition géographique L. guineensis pousse dans les forêts humides, les galeries forestières, notamment dans les raphiales marécageuses, les forêts marécageuses ou périodiquement inondées et dans le lit des ravines - d’où peut-être l’appellation de Bois de Source - des zones tropicales. Elle est présente en Afrique tropicale, en Angola, au Bénin, Burkina Faso, Burundi, Cameroun, Congo, Côte d’Ivoire, Gabon, Guinée, Kenya, Madagascar, Malawi, Mali, île Maurice, Nigeria, Ouganda, île de La Réunion, République Centrafricaine, République Démocratique du Congo, Sierra Leone, Soudan, Tanzanie, Togo, Zambie. On la rencontre aussi en Asie : Ceylan, Cambodge, Chine, Inde, Indonésie (Java, lle

Sumatra, N Guinée), Laos, Malaisie, Népal, Philippines, Taïwan, Thaïlande.

zone de répartition de L. guineensis Figure 6 : Répartition géographique de L. guineensis.

40

D) Description botanique (Figure 8) [Descoings 1967] C’est un arbuste de 2 à 5 m, à tiges droites, peu ramifiées, renflées aux nœuds, à  lenticelles nombreuses, petites, à feuilles groupées aux extrémités. 

Les feuilles bi- ou triternées atteignant 30 X 30 cm avec : - un rachis (30-60 cm) et des ramifications (20-40 cm) ± caniculées sur le dessus et présentant de petits tubercules vers la base, glabres ou faiblement pubescents aux insertions ; - pétiole renflé et ± engainant ; - stipules épaisses rapidement caduques (Figure 7). Figure 7 : Schéma d’une stipule de L. guineensis [Ridsdale 1975]



Les folioles sont de forme très variable : elliptiques, ovales-elliptiques, ovales

oblongues, oblongues, oblongues-elliptiques, avec : - toujours la base en coin, rarement obtuse, et le sommet à acumen long, étroit, obtus ; - les bords crénelés ou dentés; de 7-25 X 3-11 cm; 8 à 10 paires de nervures secondaires, peu saillantes en dessous, assez fortement sur le dessus ; - le réticulum presque plan à la face supérieure, en léger relief sur la face inférieure ; - une pubescence pratiquement nulle, sauf parfois quelques poils aux intersections des nervures. - le limbe plan, assez épais, vert luisant sur les deux faces. 

Les inflorescences sont opposées aux feuilles du sommet, très grandes : - en corymbes de 10-16 cm de diamètre ; - au pédoncule et ramifications épais, ± cylindriques, sillonnés, munis de quelques rugosités, à pubescence lâche, courte, irrégulièrement répartie et rapidement caduque ; -

aux bractées ovales, deltoïdes, aiguës, de 1-1,5 X 1-1,5 mm, minces, faiblement pubescentes, rapidement caduques.

41

1 -représentation d’un rameau avec son inflorescence x1/3 ; 2 -détail du bord du limbe x1 ; 3 -fleur mature x8 ; 4 -bouton floral x8 ; 5 -coupe schématique de la fleur fermée (étamines omisent) x8 ; 6 -anthère (vue arrière) x15 ; 7 -agrandissement de la couronne étalée x8 ; 8 -fruit x2 ; 9 -graine x5 ; 10 -section transversale médiane de la graine x5 Figure 8 : Représentation de L. guineensis [Descoings 1972, Verdcourt 1993]

42



Les fleurs de ± 5 mm de long, ± 3 mm de diamètre sont glabres avec (Figure 9) : - un bouton floral ovale ou conique ; - un pédicelle de 1-2 mm de long, cylindrique, nettement épaissi sous le calice, faiblement pubescent. - un calice rouge corail, de 2-2,5 mm de haut, ± 2,5 mm de diamètre, épais, rigide, généralement glabre, à dents deltoïdes, aiguës. - une corolle rouge corail à l’extérieur, plus pâle à l’intérieur, de ± 4 mm de long, en tube dans la partie inférieure sur ± 1,5 mm de hauteur. - aux segments oblongs-ovales, rétrécis vers la base, à plus grande largeur vers le tiers inférieure, au-dessus longuement atténués en coin, aigus au sommet et nettement cucullés, de ± 1,6 mm de large, épais. - une coronule blanche, rose ou citrine, de 2,5-3 mm de hauteur et 2-2,5 mm de diamètre ; - aux lobes de ± 2 X 0,8 mm, oblongs, épais, un peu élargis dans la partie supérieure, présentant deux petites dents obtuses ; sinus très minces, profonds, échancrés jusqu’à 0,8-1,2 mm en dessous du sommet des lobes ; - le talon ne descend pas au fond de la fleur et entoure à sa base le style seulement, de 0,6-0,8 mm de haut, épais sauf dans sa partie inférieure, fortement aminci du côté interne avec juste au-dessus un très fort bourrelet en saillie vers l’extérieur, horizontal ou ± oblique, généralement très net. - les étamines à filets blancs, sont fixées un peu au-dessus du milieu du connectif ; - les connectifs sont oblongs, étroits, ± bilobés au sommet, aigus à la base, de ± 1,8 X 0,6 mm, dépassant un peu les loges au sommet. - l’ovaire est 5-côtelé, de ± 1 mm de diamètre, ± 0,6 mm de haut, glabre ; - le style de ± 1,5 mm de long, cylindrique, isodiamétrique ; - et stigmate capité peu distinct.

43

feuille bourgeon axillaire

inflorescence

sépale

pétale

étamines

gynoecium

axe d’inflorescence

Figure 9 : Diagramme floral [Gerrath 1990]

44



Les baies rouges à maturité, sont glabres, à péricarpe mince, bourrées de raphides

comprimées sur les faces supérieure et inférieure. Elles ont 8 à 10 mm de diamètre, 6-7 mm de longueur. 

Les graines de ± 5 X 4 mm, sur leurs faces latérales présentent des dessins très nets en lignes larges, épaisses, saillantes, beaucoup plus visibles en creux sur l’albumen mis à nu, (une ligne courbe concave avec parfois 1-3 petites ramifications simples et peu prononcées du côté ventral, et du côté dorsal, 1-5 ramifications courtes et simples).

E) Divers Leea guineensis G. Don est considérée comme plante fétiche par plusieurs ethnies de Côte d’Ivoire et du Burkina Faso : le charbon de racines constitue un fard bénéfique. Il est recommandé, lorsqu’on part pour un long voyage, de se munir de bâtonnets de tiges qui, sucés pendant la route, préservent des accidents et des mauvais sorts toujours possibles [Kerharo 1950]. La population locale au Cameroun s’en sert aussi comme bois de chauffage. L. guineensis dans un dialecte africain, le "baoulé du sud", se nomme adiapokouadiabrien et traduit une onomatopée rappelant le bruit de la navette (y’a-t-il un lien avec le métier à tisser ?). On la retrouve aussi sous le nom de akohima-tui, ces deux mots voulant dire coq et fusil. Traduit comme "fusil du coq" (est-ce la sarbacane ?) [Garnier 1976]. Le développement morphologique de L. guineensis est maintenant connu, tant du point de vue du développement végétatif [Lacroix 1990] que floral [Gerrath 1990]. Par ailleurs, L. guineensis ou "Bois de sureau" est un arbuste très élégant, de part ses grandes feuilles composées, sa jolie floraison, et ses fruits décoratifs. S’acclimatant à de faibles conditions lumineuses, il peut être cultivé en zone humide et ombragée comme plante ornementale d’extérieure ou d’intérieure [Lavergne 1990, Gerrath 1997].

45

Chapitre II – Etudes phytochimique et biologique des Leeaceae

Les plantes de la famille des Leeaceae sont très peu étudiées, sans doute parce qu’elles ont été souvent intégrées dans la famille des Vitaceae qui comprend plus de 700 espèces (Vitis vinifera...). Néanmoins, quelques études relativement récentes ont été faites sur la phytochimie de différentes Leea. I- Etude phytochimique A) Criblage phytochimique Les données présentées ici doivent être considérées avec une certaine réserve, car ce sont essentiellement des tests d’orientation. Ces tests ont été réalisés pour trois espèces différentes, et ont montré la présence de saponosides, d’alcaloïdes, de flavonoïdes et de tanins : Tableau 6 : Criblage de quelques Leea Plantes Sap Alc Tri St Flav Ta Référence (partie utilisée si connue) L. indica + [Bin Rahmani 1985] L. compactiflora (Kurz) + + [Brahman 1989] racines L. indica (Burm. F) Merr. [Brahman 1989] tiges, feuilles et fruits L. guineensis G. Don + + [Lavergne 1990] feuilles cat Sap=saponines, Alc=alcaloïdes, Tri=triterpènes, St=stéroïdes, Flav=flavonoïdes, Ta=tanins, cat=catéchiques Test phytochimique positif (+) ou négatif (-)

Par ailleurs, l’étude de Lavergne [1990] montre pour L. guineensis G. Don, plante médicinale de l’Ile de la Réunion : -la présence de phénols, de flavanes et de proanthocyanidols. -l’absence d’anthraquinones libres ou hétérosidiques, de coumarines et d’anthocyanes. -l’absence d’alcaloïdes (réactions négatives aux tests de Mayer, de Dragendorff et silicotungstique). B) Huile essentielle

46

C’est en 1953 que Gupta et Chopra isolent pour la première fois une huile essentielle d’une plante appartenant à la famille des Leeaceae : L. hirta Roxb. Les seules données sont les caractéristiques physiques et biochimiques.

Cette

huile essentielle provient d’une

hydrodistillation avec un rendement de 0,15 %. Elle est odorante, se solidifie à température ambiante et présente une activité tuberculostatique [Gupta 1953].

C) Composés phénoliques (Figure 10 p 30) C’est la classe de composés la plus étudiée (Tableau 7 p 29). Bates-Smith [1959] a entrepris une recherche de constituants phénoliques, après hydrolyse, dans les feuilles de nombreuses Dicotylédones afin de rechercher des liens chimiotaxonomiques. Ainsi par chromatographie sur couche mince il a montré l’existence dans les feuilles de L. coccinea Planch. de 5 composés phénoliques : kaempferol (1), quercétine (2), myricétine (3), delphinidine (7), cyanidine (8). Chez L. rubra Blume, on recense dans les feuilles un flavonoïde et trois acides phénols : la myricétine 3-O-α-rhamnosyl (6), l’acide p-hydroxybenzoïque (12), l’acide syringique (14) et l’acide gallique (17), et dans les tiges une leucoanthocyane, le leucocyanidol (10) [Yem Yok Siv 1971]. Hegnauer [1990] cite pour les Leea, en plus des composés déjà cités pour L. coccinea Planch (kaempferol (1), quercétine (2), myricétine (3), leucodelphinidine (7), leucocyanidine (8)), la présence de tanins dans les fruits de L. rubra Blume, et dans les feuilles et les racines de L. sambucina Willd. L’étude de la taxonomie des Vitaceae a permis une analyse de quatre Leea qui sont L. herbaceum Wall., L. indica Merrill., L. macrophyla Roxb. et L. sambucina Willd où l’on recense un grand nombre de flavonoïdes et d’acides phénoliques [Umadevi 1991]. Les résultats de ces travaux sont reportés dans le tableau ci-dessous : Tableau 7 : Principaux métabolites secondaires identifiés des différentes Leea

47

Composés

L. herbaceum Wall. a

L. indica Merrill. a +

L. macrophyla Roxb. a

L. sambucina Willd. a

L. coccinea Planch. b + + +

L. rubra Blume c

kaempferol (1) quercétine (2) + + myricétine (3) + + + + 3’-OMe-quercétine (4) + + + 3’,4’-di-OMe-quercétine (5) + + + 3-O-rhamnosyl de myricétine (6) delphinidine (7) + cyanidine (8) + proanthocyanidine (9) + + + + leucocyanidol (10) acide gentisique (11) + + acide p-hydroxybenzoïque (12) + + + acide vanillique (13) + + + + acide syringique (14) + + + acide mélilotique (15) + + acide protocatéchuique (16) + acide gallique (17) + + + + acide cis-p-coumarique (18) + + acide trans-p-coumarique (19) + + acide férulique (20) + + + glycoflavone + tanins + + + + alcaloïdes + Références : a) [Umadevi 1991], b) [Bates-Smith 1959], c) [Yem Yok Siv 1971] et [Hegnauer 1990].

+

+ + + +

+

48

R1

OMe R2

HO

OH OR

O

HO

O

OH

HO

O

R3

OH

OH OH

OH

O

OH

O

O

OH

O O

OH OH OH

CH3

(1) R1=R3=H, R2=OH

(4) R=H

Kaempferol

3’-OMe-quercétine

(2) R1=R2=OH, R3=H

(5) R=Me

(6)

Quercétine

3’,4’-diOMe-quercétine

3-O-rhamnosyl de myricétine

(3) R1=R2=R3=OH Myricétine OH OH

HO

OH

OH

OH HO HO

O

O R

OH

O

HO

O

H OH

H OH

OH

H

OH O

OH

OH

H

OH

H HO

(7) R=OH

(10)

Delphinidine

H

(8) R=H

OH

Leucocyanidol

HO

Cyanidine

(9) Proanthocyanidine

R4

R5

O

O

O

R OH

R3

OH

OH OH R2

HO

R1

(11) R1=R3=R4=H, R2=R5=OH Acide gentisique (12) R1=R2=R4=R5=H, R3=OH Acide p-hydroxybenzoïque (13) R1=R4=R5=H, R2=OCH3, R3=OH Acide vanillique

(15)

(18) R=H, cis

Acide mélilotique

Acide cis-p-coumarique (19) R=H, trans Acide trans-p-coumarique (20) R=OCH3, trans Acide férulique

(14) R1=R5=H, R2=R4=OCH3, R3=OH Acide syringique (16) R1=R4=R5=H, R2=R3=OH Acide protocatéchuique (17) R1=R5=H, R2=R3=R4=OH Acide gallique

Figure 10 : Les structures chimiques identifiées chez différentes Leea :

49

II- Etude biologique Les différentes activités biologiques seront présentées pour chaque espèce connues (avec leur synonymies), puis nous recenserons les activités propres à Leea guineensis G. Don.

A) Activités des différentes espèces de Leea (Tableau 8 p 38) La plupart des données sur ce sujet sont assez récentes, mais en règle générale les espèces du genre ont des propriétés calmantes, émollientes et astringentes [Kirtikar 1975]. L. sp. : -l’extrait aqueux de feuilles de L. sp. présente des propriétés antifongiques avec 100% d’inhibition contre Drechslera oryzae [Ganesan 1994]. L. aequata L. : - au Népal, les tubercules et les tiges de L. aequata Linn. sont astringentes et mucilagineuses [Suwal 1970] ; - utilisée en cas de blessures, elle est calmante, antiseptique, bactéricide. Elle est aussi préconisée pour soigner la fièvre, la dysenterie, la dysurie, la neuralgie, la paralysie, la pleurésie, la pneumonie, la tuberculose, les rhumatismes [Phytochemical and Ethnobotanical Database]. L. hirta Roxb. ex Hornem (syn. L. aequata Linn.) : - l’huile essentielle (0,15 %) inhibe la croissance de Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus et Pasteurella pestis aux concentrations de 10 µg/ml, 100 µg/ml et

50 µg/ml respectivement [Gupta 1953] ; - en Inde les tubercules et les tiges sont utilisées pour leur activité astringente et

sont riches en mucilages [Chopra 1956] ; - les racines sont amères, âcres, épicées, et sont dotées de propriétés anthelmintique, vulnéraire, antipyrétique, “ alexitérique ”, anesthésique locale. Elles sont utilisées en cas de bronchite, de dyspepsie, de fièvres nauséeuses, de lèpre, de démangeaisons et d’ulcères tuberculeux (Ayurveda) [Kirtikar 1975] ; - on retrouve les même indications sur Internet que l’espèce précédente [Phytochemical and Ethnobotanical Database]. 50

L. angulata Korth. : - comme répellant du tigre à Java [Phytochemical and Ethnobotanical Database]. L. crispa Linn : - en Inde et au Bengal, les feuilles sont froissées et appliquées sur les blessures. Les tubercules sont un remède contre le vers de Guinée [Chopra 1956, Kirtikar 1975] ; - comme larvicide et contre les blessures [Phytochemical and Ethnobotanical Database]. L. curtisii King : - contre l’alopécie [Phytochemical and Ethnobotanical Database]. L. gigantea Griff. (syn L. indica Merr.) : - des travaux sur des extraits méthanoliques de plantes de Malaisie, montrent que les feuilles de L. gigantea ont une activité modérée contre Bursaphelenchus xylophilus à 10 mg/ball [Mackeen 1997] ; - est préconisée contre les douleurs d’estomac, la fièvre, les blessures [Phytochemical and Ethnobotanical Database]. L. indica Merrill : - une des premières traces d’une activité biologique potentielle, remonte à 1829 [Mérat 1829]. Il est dit de Leea sambucina Willd. (appelé autrefois Aquilicia) que : “ Aquilicia sambucina , arbrisseau de l’Inde, contient des baies à suc violent et caustique. La décoction de ses racines est employée contre les douleurs de l’estomac ; celle du bois, contre la soif ; ses feuilles broyées, torréfiées et appliquées sur la tête, soulagent le vertige et la faiblesse du cerveau ; la vapeur de leur décoction suspend les douleurs de la goutte ; le suc, exprimé de ses feuilles tendres, pris en boisson, aide la digestion... ”. Plus loin, “ ...La décoction de ses feuilles est usitée en Guinée pour les femmes enceintes dont le ventre est douloureux ; elle dissipe les nausées. La poudre de l’écorce sert à frotter les parties enflées. ”. - en Inde, les racines de L. indica Merrill sont utilisées contre les diarrhées, la dysenterie et sont sudorifiques. La décoction de racines est prescrite contre les coliques, comme rafraîchissant et soulageant de la soif. Les feuilles grillées sont appliquées sur la tête contre les vertiges [Chopra 1956] ; 51

- en Inde, dans le Goa, les racines de L. indica Merrill sont utilisées contre les diarrhées et dysenteries chroniques. Le jus de jeunes feuilles est digestif [Kirtikar 1975] ; - en Malaisie, l’intérêt porté aux plantes utilisées en médecine indigène montre que l’extrait éthanolique de feuilles de L. indica a une activité antivirale contre le virus herpes simplex de type 1 (HSV1) à 0,05 mg/ml [Ali 1996] ; - on retrouve l’usage de L. indica contre les maux de tête, les piqûres de chenilles, les dermatoses, les furoncles, la colique, les diarrhées, la dysenterie, les vertiges, les verrues. Elle est apaisante et sudorifique [Phytochemical and Ethnobotanical Database]. L. linearifolia : - les racines de cette herbe de saveur froide, insipide selon la médecine bouddhique traditionnelle Theravada, neutralisent les fièvres « supérieures », le vent « Sandan », cause de coliques chroniques [Phou Ngeun Souk-Aloun 1995]. L. macrophylla Roxb.ex Hornem. : - en Inde, les racines sont connues pour être astringentes, et utilisées contre la teigne, et le vers de Guinée. Réduites en poudre, elles sont appliquées sur les blessures pour les cicatriser ou sur la peau pour soulager les douleurs [Chopra 1956] ; - ses racines sont un bon alexipharmaque1 (antidote Ayurveda). Elles sont astringentes et réputées être un remède de la pelade. Les Birmans l’appliquent sur les blessures pour stopper les effusions de sang [Kirtikar 1975] ; - au Népal, on retrouve les mêmes activités qu’en Inde, si ce n’est que les feuilles et les fruits sont connus pour être comestibles [Suwal 1970] ; ­   la   plante   est   indiquée   comme   étant   calmante,   astringente,   cicatrisante,  larvicide   et   vermifuge.   Elle   est   préconisée   contre   la   dysenterie,   le   vers   de   Guinée   (ou  dracunculose), les fractures vétérinaires, les neuralgies, la pleurésie, la pneumonie, la teigne,  les douleurs, et les blessures [Phytochemical and Ethnobotanical Database]. L. robusta Roxb. (syn. L. macrophylla Roxb.) - en Inde et dans le Chota Nagpur, les racines (molles et charnues) sont appliquées localement pour apaiser les douleurs et sont données au bétail pour soigner les diarrhées [Chopra 1956, Kirtikar 1975] ; - au Bengale, à Orissä et au Bihär, la médecine vétérinaire utilise 25 ml d’extrait aqueux de racine en association avec 20 mg de gingembre pour le traitement des diarrhées et 1

Du grec alexein (défendre contre), c’est un antidote actif contre les poisons et les venins.

52

dysenteries des buffles, vaches et moutons. De plus, 15 ml de cet extrait avec la poudre de 7 grains de poivre noir et d’une petite quantité de sel est administré en cas de fièvre, aux chèvres et moutons [Pal 1980] ; - au Népal, on retrouve les mêmes propriétés, mais il est fait mention de l’utilisation des racines contre la dysenterie [Suwal 1970] ; - la plante est aussi indiquée pour soigner les diarrhées, la dysenterie [Phytochemical and Ethnobotanical Database]. L. rubra Blume : - au Cambodge, les racines bouillies constituent une boisson contre les coliques [Douk 1966] ; - cette plante est aussi employée comme diurétique [Yem Yok Siv 1971] ; - l’irritation provoquée par les baies a été mise en relation avec la présence de raphides (cristaux d’oxalate de calcium) [Sakai 1984] ; - elle soigne la dysenterie, les intoxications. Elle est aussi taenifuge [Phytochemical and Ethnobotanical Database].

Sur Internet, on trouve les résultats d’un sreening effectué par le NCI (National Cancer Institute) fait sur quatre extraits de Leeaceae (espèce(s) non précisée(s) !) sur diverses cellules tumorales humaines. Ils montrent une inhibition significative de la croissance des cellules tumorales de leucémie, du colon et du sein. La DL50 n’est pas significative ou est modeste pour les cellules tumorales du sein, et du colon [Cancer cell line screening data].

53

B) Activités propres à Leea guineensis Lavergne [1990] relate l’ancien usage médical de L. guineensis G. Don. Il remonte à Pingre (1761) qui, sous le terme de “ Sureau de Bourbon l’employait en topique contre l’hydropisie et la difficulté d’uriner. Sa seconde écorce guérirait également les brûlures ”. Ce nom de "Bois de Sureau" est à l’origine de quelques ambiguïtés, car certains auteurs se sont aventurés à lui attribuer les mêmes vertus que le Sureau d’Europe. Pour Leclerc (1864), la décoction de tiges et de feuilles du "Bois de Sureau" est “ journellement employée ” pour des bains et des fomentations2, contre les érysipèles et “ les engorgements qui surviennent aux pieds et aux jambes ”. Contre le tambave3, Leclerc cite le “ remède de la bonne femme Olivette ” préparé à Maurice. C’est une association de Bois de sureau, de Lingue café (Mussaenda arcuata Poiret (Rubiaceae)), de Cochléria du pays (Centella asiatica L. (Apiaceae)), de Petit Tamarin blanc (Phyllanthus amarus (Euphorbiaceae)), de Gros Indigo (Sophora deneduta (Leguminosae)), de Guérivite (Siegesbeckia orientalis (Asteraceae)), d’Herbe la mare (Cyperus sp. (Cyperaceae)) et de Cadoque (Caesalpinia bondue (Caesalpiniacae)). Daruty (1886 et 1889) accorde à cette Leeaceae des vertus antiseptiques et détersives lorsqu’elle est appliquée sur les plaies et les ulcères. Il conseille de râper l’écorce et d’en répandre la poudre sur les plaies préalablement détergées avec une décoction de Guérivite (Siegesbeckia orientalis (Asteraceae)). A la Réunion, Cordemoy (1895) n’attribue que des effets néfastes au Bois de Sureau. “ Le suc de ses baies est caustique. Une personne qui en avait écrasé et manié une certaine quantité pour en faire une encre de couleur vit une heure après sa main rougir, puis se tuméfier. Elle éprouva une forte douleur, et un sentiment de brûlure. Un érysipèle se déclara, qui fut suivi de démangeaisons pendant trois semaines ”. Selon Ducheman (1900), la décoction de fleurs ou de feuilles de Bois de Sureau “ combat  l’éléphantiasis   par   bain   chaud ”.   Plus   tard,   Bosse   (1977)   et   Bersez   (1983)   reparleront   de  l’éléphantiasis, alors que cette parasitose est oubliée dans l’île de la Réunion. Les racines quant à elles, sont connues pour être sudorifiques [Kirtikar 1975]. L’utilisation de L. guineensis est aujourd’hui plus restreinte [Lavergne 1990]. Une recette consiste en l’association de Bois de sureau, Bois de reinette (Dodonea viscosa Fomentation : action d’appliquer la chaleur comme moyen thérapeutique. Affection tropicale des jeunes enfants dont les principaux symptômes sont : diarrhée rebelle, selle verdâtre, éruptions cutanées (et du cuir chevelu). L’enfant est amaigri et couvert de petits boutons. 2 3

54

(Sapindaceae)), Bois puant (Foetidia mauritiana (Lecythidaceae)), Patate à durand (Ipomoea pescaprae (Convolvulaceae)), Eucalyptus (Eucalyptus sp. (Myrtaceae)), Pignon d’Inde, Thombé (Leucas lavandulaefolia (Lamiaceae)) et marc de Café pour soigner les rhumatismes. D’autres tisaneurs considèrent le Bois de sureau comme rafraîchissant. Ainsi, il est prescrit également pour les troubles circulatoires, les douleurs articulaires, les douleurs dentaires et contre les refroidissements. Les bains aux Bois de sureau sont également indiqués contre les rhumatismes, les douleurs, la polynévrite. Certains la préconisent pour soigner le tambave, d’autres l’utilisent en boisson et en bain, contre la goutte et “ l’enflure ”, ou pour des tisanes dites de « refroidissement et saisissement ». Au Cameroun, les tradipraticiens utilisent L. guineensis principalement pour soigner les problèmes inflammatoires et l’hypertension. En Côte d’Ivoire et au Burkina Faso, L. guineensis G. Don. est utilisée en lavement à base du jus des feuilles pour guérir les maux de reins et les crises d’épilepsie. Le macérât de feuilles, bu le matin à jeun, calmerait les maux de ventre des femmes enceintes, tandis que les frictions avec la pulpe de feuilles serait un bon remède contre les rhumatismes [Kerharo 1950]. De plus, nous pouvons retenir son action analgésique et calmante sur les douleurs musculaires et articulaires, son emploi comme fortifiant, à caractère parfois aphrodisiaque, et enfin son utilisation lors de certains accouchements difficiles [Bouquet 1974]. Au Gabon, les jeunes pousses, en association avec la graine de Xylopia aethiopica (Anonaceae) sont ingérées en cas de palpitations cardiaques [Adjanohoun 1984]. En République Centrafricaine, la décoction de l’écorce de tige est employée en lavement pour combattre la constipation. Les feuilles sont utilisées pour soigner la conjonctivite des nouveau-nés ; la préparation consiste à ramollir les feuilles au feu, les froisser, les presser et administrer l’extrait dans les yeux [Aké Assi 1985]. Dernièrement, Leea guineensis est citée dans le catalogue des plantes médicinales majeures de l’Afrique. Les parties utilisées sont les feuilles et les racines, qui sont antiinfectieuses, analgésiques, antidiabétiques, et aphrodisiaques [Iwu 1993].

55

Plus récemment, l’utilisation comme diurétique de L. guineensis à la Réunion a été mis en relation avec l’inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE). On note 90 et 100% d’inhibition de l’ACE respectivement pour les extraits acétonique et éthanolique des feuilles [Adsersen 1997]. Cette inhibition enzymatique est également à rapprocher de son usage contre les troubles cardiovasculaires. On lui attribue aussi des effets contre les maux de dents, les coliques, les convulsions, la dyspepsie, l’épilepsie, la blennorragie, les rhumatismes, les enflures, les vertiges et les problèmes liés à la grossesse. Elle est aussi purgative et apaisante [Phytochemical and Ethnobotanical Database].

On peut remarquer que les utilisations traditionnelles se retrouvent d’un pays à un autre. De plus, il existe de nombreuses similitudes entre les activités propres de L. guineensis et celles des autres espèces. Ceci est un bon argument pour reconnaître la pertinence des renseignements car les espèces proviennent aussi bien d’Asie que d’Afrique.

56

Tableau 8 : Différentes activités biologiques décrites pour le genre Leea L. macrophylla Roxb.

L. robusta Roxb.

+ +

+

+

+

+

+

+

+

+

+ + +

+ + +

+

+ + +

+

+

+

+ +

+ +

+

+ +

+ +

+

+

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

L. guineensis G. Don.

L. indica Merr. +

L. linearifolia

L. hirta Roxb. + +

+

L. rubra Blume

L. gigantea Griff

L.curtissi King

+ +

+ +

L. crispa Linn.

analgésique - antalgique antiseptique - cicatrisant - vulnéraire contre blessures et brûlures antiarthritique - antirhumatismal goutte anti-inflammatoire (pleurésie, pneumonie, bronchite, polynévrite, blennorragie, conjonctivite, brûlure) antidermatique – antiprurigineux (dermatose, teigne, pelade, érysipèle, alopécie) antidiarrhéique - tambave antidysentérique anti-infectieux - anticontagieux (lèpre, tuberculose, érysipèle) anthelminthique - parasiticide larvicide antifongique - bactéricide - vers Guinée digestif - dyspepsique diurétique dysurie contre hydropisie astringent elephantiasis antihemmoragique anti-ulcéreux anti-arythmique antihypertensif trouble circulatoire antipyrétique sudorifique anesthésique local antidiabétique neuralgie - paralysie vertige - nausée - maux de tête épilepsie - convulsions accouchement difficile - maux de ventre des femmes enceinte aphrodisiaque mucilagineux contre intoxications contre soif - rafraîchissante refroidissements

L. aequata L.

Activités

+

+

+ + + + +

+ + +

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+ + +

+

+ +

+ + +

+

+ +

+ + +

+ +

57

L’intérêt pour les Leeaceae semble justifié par leurs capacités à soigner les problèmes d’ordre infectieux, inflammatoire, digestif, urinaire et circulatoire. Leea guineensis a aussi ses

activités.

Les

tradipraticiens

la

préconisent

essentiellement

pour

ses

vertus

antirhumatismale, antalgique, antihypertensive et diurétique.

C) Conclusion En résumé, cette famille a été très peu étudiée tant sur le plan chimique que biologique. Nous retiendrons cependant la présence dans cette famille de flavonoïdes, d’acides phénoliques et de tanins. L’utilisation en médecine traditionnelle montre que le genre a des propriétés essentiellement

calmante,

anti-infectieuse,

anti-inflammatoire,

antidysentérique,

antirhumatismal et cardiovasculaire. Ainsi, une étude phytochimique et pharmacologique sur les extraits et les composés qu’ils contiennent semble intéressante afin d’établir un lien avec ces utilisations en médecine traditionnelle.

58

Chapitre III - Les Flavonoïdes Sulfatés

I- Introduction Les flavonoïdes sont connus pour être d’importants métabolites synthétisés par les plantes, responsables entre autres de la pigmentation et de la protection des plantes en réponse à un stress d’irradiation UV, ou d’attaque microbienne (les phytoalexines). Récemment, ces molécules ont été impliquées dans l’induction et l’inhibition des gènes de nodulation du Rhizobium ou comme régulateur du transport de l’auxine (phytohormone de croissance) [Varin 1992a]. Dès 1975, tous ces composés possédant un ou des groupements sulfates ont été classés dans un groupe appelé flavonoïde sulfaté [Harborne 1975a]. Une récente étude a recensé toutes les données concernant ces composés (distribution, méthodes générales d’extraction, de purification, d’analyse structurale, et de synthèse) [Barron 1988a, 1987c, 1988b, c]. Aussi, nous n’avons pas souhaité reprendre ici ces travaux, mais préférons plutôt effectuer une « mise à jour » à partir de 1988 de ces données bibliographiques.

II- Classification, Structure En 1988, Barron répertorie 101 flavonoïdes sulfatés [Barron 1988a]. A ce jour, nous avons recensé 134 flavonoïdes sulfatés dans la littérature, qui se répartissent en 131 flavones et flavonols sulfatés. On dénombre 74 flavonols sulfatés dont 19 structures sont nouvelles et 57 flavones sulfatées dont 12 nouvelles (Tableaux 9 p 42 et 10 p 45). A cela, nous pouvons ajouter 2 anthocyanes sulfatées extraites de Babiana stricta (Iridaceae) (Figure 11) et 1 dihydroflavonol sulfaté, isolé de Myrica rubra (Myricaceae) (Figure 12).

59

OMe OH

+

HO

O OMe

O-Gluc O O RO

OSO3H

HO HO

R= H R= malonyl

3-glucosyl-5-(2’’-sulfatoglucosyl)-malvidine 3-glucosyl-5-(2’’-sulfato, 6’’-malonylglucosyl)-malvidine

Figure 11 : Antocyanes sulfatées isolées de Badiana stricta (Iridaceae) [Toki 1994]

OSO3K OH

HO

O OH

O OH

O

OH O

OH OH

3-galloyl-3’-sulfate-dihydromyricitine ou myricatine Figure 12 : Dihydroflavonol sulfaté isolé de Myrica rubra (Myricaceae) [Nonaka 1983]

60

A) Les flavones sulfatées Tableau 9 : Les flavones sulfatées Vitéxine

Isovitéxine

Orientine

Iso-Orientine

+

Tricine

+

Tricétine

+

Hypolaétine

Jaceosidine

+

Nodiflorétine

+

Népétine

Diosmétine

+

6-OH Lutéoline

Chrysoeriol

+

Lutéoline

Hispiduline

+

Isoscutellaréine

Apigénine

Position de Sulfatation

+

+

+

+

Génine Monosulfatée 6 7 8 3’ 4’

+ +

+ +

+ +

+

+

+

+

Génine Disulfatée 6, 7 7, 3’ 7, 4’ 3’, 4’

+ +

+ + +

+ Sulfatoglycosylée  6-sulfatoglucoside 7-sulfatoglucoside + + + 7-sulfatogalactoside + 7-sulfatoglucuronoside + +  7-sulfatorutinoside + 7-disulfatoglucuronoside   7-disulfatoglucoside Glycosylée et sulfatée 3’-glucuronoside, 7-sulfate + 3’-rutinoside, 7-sulfate + 8-glucoside, 7-sulfate 8-glucoside, 3’-sulfate Divers 7-OMe, 3’-sulfatoglucuronoside 7-OMe, 3’-sulfatogalactoside 4’-OMe, 8-Glucoside, 3’-sulfate  4’-OMe, 8-(2’’-sulfatoglucoside)  7,4’-diOMe, 3’-sulfate  = produits nouvellement recensés depuis [Barron 1988a] (Cf. Figure 13 p 44)

  

+

+

+

+ + +

 +   +

D’après ce tableau qui présente 17 génines de base ; -

20 flavones sont monosulfatées sur la génine, pour la plupart en position 7 (excepté pour l’hypolaétine, la tricétine, la tricine et l’isoscutellaréine).

-

8 sont disulfatées sur la génine.

-

20 autres flavones sont sulfatées sur la partie osidique (constituée d’un glucose, d’un galactose, d’acide glucuronique, ou d’un rutinose). Il y a 7 nouvelles structures :

-

la lutéoline et le chrysoériol 7-disulfatoglucoside isolés de Phoenix dactylifera (Palmae) [Tomás Lorente 1988],

61

-

le chrysoériol 7-sulfatoglucuronoside isolé de Meeboldinama hysanantha (Restionaceae) [Williams 1998].

-

le premier sulfatoglucoside, fixé en position 6 sur l’hydroxylutéoline a été isolé chez Tradescanta (Commelinaceae) [Del Pero Martìnez 1993].

-

trois sulfatoglycosides de l’hypolaétine ont été isolés chez des Restionaceae [Williams

1998],

les

7-sulfatoglucoside

et

7-sulfatogalactoside

chez

Leptocarpus elegans (Restionaceae), ainsi que le 7-sulfatoglucuronique chez Meeboldinama hysanantha (Restionaceae).

-

On ne recense que 4 flavones dont la génine est à la fois sulfatée et glycosylée. Une seule structure de ce groupe est nouvelle, c’est l’hypolaétine 8-glucoside, 7-sulfate toujours isolée d’une Restionaceae, l’Hypolaena fastigiata (Restionaceae) [Williams 1998].

-

Dans le dernier groupe, 4 flavones sulfatées sont nouvelles car elles sont à la fois méthoxylées et sulfatées ou sulfatoglycosylées. Nous avons :

-

l’isoscutellaréine 4’-méthoxy, 8-(2’’-sulfatoglucoside) de Althaea officinalis (Malvaceae) [Gudej 1991],

-

la lutéoline 7,4’-diméthoxy, 3’-sulfate [Harborne 1994], toujours des Restionaceae,

-

deux hypolaétines, la 7-méthoxy, 3’-sulfatoglucuronoside de Leptocarpus elegans

(Restionaceae),

et

la 7-méthoxy,

3’-sulfatogalactoside

de

Leptocarpus tenax (Restionaceae) [Williams 1998].

62

R2 R3

R1

O

OH

O

R1= disulfatoglucosyl, R2= OH, R3= OH

7-disulfatoglucosyl-lutéoline

R1= OMe, R2= OSO3 ; R3= OMe

7,4’-diméthoxy-3’-sulfate-lutéoline

R1= disulfatoglucosyl, R2= OMe, R3= OH

7-disulfatoglucosyl-chrysoériol

R1= sulfatoglucuronyl, R2= OMe, R3= OH

7-sulfatoglucuronyl-chrysoériol

-

R4 OH R3 O

R2

R1 OH

O

R1= sulfatoglucosyl, R2= OH, R3= H, R4= OH

6-sulfatoglucosyl-lutéoline

R1= OH, R2= OSO3 , R3= glucosyl, R4= OH

7-sulfate-8-glucosyl-hypolaétine

-

R1= OH, R2= sulfatoglucosyl, R3= OH, R4= OH

7-sulfatoglucosyl-hypolaétine

R1= OH, R2= sulfatogalactosyl, R3= OH, R4= OH

7-sulfatogalactosyl-hypolaétine

R1= OH, R2= sulfatoglucuronyl, R3= OH, R4= OH

7-sulfatoglucuronyl-hypolaétine

R1= H, R2= OMe, R3= OH, R4= sulfatoglucuronyl

7-méthoxyl-3’-sulfatoglucuronyl-hypolaétine

R1= H, R2= OMe, R3= OH, R4= sulfatogalactosyl

OH

7-méthoxy-3’-sulfatogalactosyl-hypolaétine

OH H O

HO

OCH3

O

HO OSO3HO

O

OH

O

Isoscutellaréine 4’-méthoxy, 8-(2’’-sulfatoglucosyl) Figure 13 : Structure des nouvelles flavones sulfatées

63

B) Les flavonols sulfatés Tableau 10 : les flavonols sulfatés Tamarixétine

Rhamnazine

Ombuine

+ +

+

+

+

+ +

+

+

+

+

+

Myricétine

Isorhamnétine

+

Gossypétine

Rhamnétine

+  

Eupatine

Quercétine

+

Veronicafoline

Eupalitine

+

Jaceidine

Eupafoline



Spinacetine

6-OH Kaempferol

+

Eupatolitin

Rhamnocitrine



Patulétine

Kaempferide

+ +

Quercétagétine

Kaempferol

Position de Sulfatation

Génine Monosulfatée 3 7 3’ 4’

+ Génine Disulfatée

3, 7 3, 3’ 3, 4’

+

+ + +

Génine Trisulfatée 3,5,4’ 3, 7, 3’ 3, 7, 4’ Génine Tétrasulfatée 3, 7, 3’, 4’ Sulfatoglycosylée 3-sulfatoglucoside 3-(3’’-sulfatoglucoside) 3-(4’’-sulfatorutinoside) 3-(6’’-sulfatoglucoside) 3-(6’’-sulfatogentiobioside) 3-sulfatorhamnoside 3-sulfatorutinoside Glycosylée et sulfatée 3-glucuronoside, 7-sulfate 3’-glucuronoside, 3,5,4’-trisulfate 8-glucuronoside, 3-sulfate 8-glucoside, 3-sulfate 3-glucoside, 7-sulfate 3-rhamnoside, 3’-sulfate 3-glucuronoside, 3’-sulfate Divers 3’-OMe, 3-sulfate 7,4’-diOMe, 3-sulfate 6-OMe, 3-sulfate 6,7,4’-triOMe, 3-sulfate 7,3’,4’-triOMe, 3-sulfate 3-OMe, 7-sulfate 3,7-diOMe, 4’-sulfate 3-acétyl, 7,3’,4’-trisulfate 6,3’,4’-triOMe, 3-sulfate 3-glucoside, 4’-OMe, 7-sulfate 3-OMe, 5-glucoside, 3’-sulfate 7-OMe, 3,3’-disulfate

+ +

+

+ 

+ +

+

+

+  +

+

 + + + +

+ +

+

+

+ + + + + + +

   +

  

 

+

+  + +   

 = produits nouveaux depuis [Barron 1988a] (Cf. Figure 14 p 47 et 48)

64

Dans le tableau précédent, nous avons recensé 21 flavonols comme structure de base dont : -

24 sont monosulfatés sur les génines, la plupart en position -3. Il existe trois exceptions (jacéidine (qui porte un méthoxyl à cette position), quercétagétine et myricétine). Dans ces dérivées monosulfatés, il y a 4 nouvelles structures ;

-

le kampferide 3-sulfate isolé de Tamarix spp. (Tamaricaceae) [TomàsBarberan 1990],

-

le 6-hydroxykaempferol 3-sulfate d’Inula britanica (Compositae) [Öksüz 1987]

-

la quercétine 7-sulfate isolée chez Frankenia pulverulenta (Frankeniaceae) [Harborne 1975b],

-

et la quercétine 3’-sulfate de Hypericum elodes (Guttiferae) [Seabra 1991].

14 flavonols sont polysulfatés, avec le plus souvent, la quercétine comme génine. Il y a une seule génine tétrasulfatée, 8 génines disulfatées, 5 trisulfatées dont 1 est nouvelle ;

-

la rhamnétine 3,5,4’-trisulfate de Tamarix aphylla (Tamaricaceae) [Harborne 1988]. Ce composé semble provenir de la rhamnétine 3’-glucuronyl3,5,4’-trisulfate [Saleh 1975].

-

Tout comme pour les flavones, il y a 12 flavonols sulfatoglycosylés (les oses rencontrés sont le glucose, le gentiobiose, le rhamnose et le rutinose). Les 2 nouvelles structures dans ce groupe, sont :

-

la quercétine 3-sulfatoglucoside isolée de Phoenix dactylifera (Palmae) [Tomás Lorente 1988]

-

et l’isorhamnétine 3-(4’’-sulfatorutinoside) de Zygophyllum dumosum (Zygophyllaceae) [Li 1996].

-

Par ailleurs, nous avons recensé 9 structures qui étaient à la fois glycosylées et sulfatées, dont 2 sont nouvelles :

-

la quercétine 3-glucuronyl-3’-sulfate isolée de Hypericum elodes (Guttiferae) [Seabra 1988]

-

la quercétine 3-rhamnosyl-3’-sulfate ou quercitrine 3’-sulfate isolée de Leea guineensis (Leeaceae) [Op de Beck 1998].

-

De plus, on dénombre 15 composés méthoxylés et sulfatés et parfois même glycosylés. C’est d’ailleurs dans ce groupe que l’on recense le plus grand nombre de 65

structures nouvelles. Il s’élève à 10 dont la plupart dérive de la quercétine. Nous avons :

-

le 6-méthoxykaempferol 3-sulfate isolé de Flaveria chloraefolia (Compositae) [Ibrahim 1995],

-

le

6-hydroxy-7,4’-diméthoxykaempferol

3-sulfate,

le

6,7,4’-triméthoxykaempferol 3-sulfate, et la 6,7,4’-triméthoxyquercétagétine 3-sulfate isolés chez Brickellia longifolia (Compositae) [El-Sayed 1990].

-

Enfin,

nous

comptons

6

nouveaux

dérivés

3’-méthoxyquercétine

3-sulfate

ou

4’-méthoxyquercétine

7-sulfate

isolées

de

percicarine de

la et

quercétine,

la

la

3-glucosyl-

Polygonum

hydropiper

(Polygonaceae) [Haraguchi 1996], la 7,3’,4’-triméthoxyquercétine 3-sulfate et la 3,7-diméthoxyquercétine 4’-sulfate de Ipomoea regnellii (Convolvulaceae) et la 7-méthoxyquercétine 3,3’-disulfate isolée d’une autre Convolvulaceae Argyreia mollis [Mann 1999], la 3-méthoxy-5-glucosylquercétine 3’-sulfate isolée de Calorophus elongatus (Restionaceae) [Williams 1998]. OMe

HO

O

OSO3OH

O

3-sulfate de kaempferide

R3

R2

O

OSO3-

R1 OH

R1= OH, R2= OH, R3= OH R1= OMe, R2= OH, R3= OH R1= OH, R2= OMe, R3= OMe R1= OMe, R2= OMe, R3= OMe

O

3-sulfate-6-hydroxykaempferol 6-méthoxy-3-sulfate de kaempferol 6-hydroxy-7,4’-diméthoxy-3-sulfate de kaempferol 6,7,4’-triméthoxy-3-sulfate de kaempferol

Figure 14 : Structure des nouveaux flavonols sulfatés

66

R3 R4

R2

O

R1 OH

O

R1= OH, R2= OSO3-, R3= OH, R4= OH R1= OH, R2= OH, R3= OSO3-, R4= OH R1= sulfatoglucosyl, R2= OH, R3= OH, R4= OH R1= 4’’-sulfatorutinosyl, R2= OH, R3= OMe, R4= OH R1= glucuronyl, R2= OH, R3= OSO3-, R4= OH R1= rhamnosyl, R2= OH, R3= OSO3-, R4= OH R1= OSO3-, R2= OH, R3= OMe, R4= OH R1= glucosyl, R2= OSO3-, R3= OH, R4= OMe R1= OSO3-, R2= OMe, R3= OMe, R4= OMe R1= OMe, R2= OMe, R3= OH, R4= OSO3R1= OSO3-, R2= OMe, R3= OSO3-, R4= OH

7-sulfate de quercétine 3’-sulfate de quercétine 3-sulfatoglucosyl de quercétine 3-(4’’-sulfatosulfatorutinosyl) d’isorhamnétine 3-glucuronyl-3’-sulfate de quercétine 3’-sulfate de quercitrine 3-sulfate-3’-méthoxy de quercétine 3-glucosyl-4’-méthoxy-7-sulfate de quercétine 3-sulfate-7,3’,4’-triméthoxy de quercétine 3,7-diméthoxy-4’-sulfate de quercétine 3,3’-disulfate-7-méthoxy de quercétine OH OMe

MeO

O

OSO3-

MeO OH

O

6,7,4’-triméthoxy-3-sulfate de quercétagétine OSO3OH

HO

O

OMe O-gluc

O

3-méthoxy-5-glucosyl-3’-sulfate de quercétine OH OSO3-

MeO

O

OSO3OSO3-

O

3,5,4’-trisulfate de rhamnétine Figure 14 (suite) : Structure des nouveaux flavonols sulfatés

67

III- Distribution Les flavonoïdes sulfatés bénéficient d’une large distribution. C’est pour cette raison  que nous ne pouvons pas parler de traceur chimiotaxonomique au sens strict. Leur répartition  fait d’avantage référence à leur situation géographique et écologique (milieux salins et/ou  marécageux). En 1988, les travaux de Barron dénombraient 250 espèces réparties dans 17  familles des Dicotylédones et dans 15 familles des Monocotylédones [Barron 1988a]. Depuis,  nous   avons   dénombré,   3   nouvelles   familles   chez   les   Dicotylédones   (Cf.   Tableau   11  ).  Quelques   espèces   sont   représentées   chez   les   Ptéridophytes,   comme  Adiantum   capillaris­ veneris (Adiantaceae), Asplenium filix­foemina, A. fontanum, A. septentrionale (Aspleniaceae)  et  Cystopteris   fragilis  (Athyriaceae).   Par   contre,   aucun   flavonoïde   sulfaté   n’a   encore   été  rencontré chez les Bryophytes et les Gymnospermes. On peut cependant noter que les flavonoïdes sulfatés permettent de séparer les espèces  en   groupes   distincts   dans   certaines   familles   comme   les   Cyperaceae,   les   Palmae   ou   les  Zosteraceae [Ibrahim 1995]. De même, les flavonoïdes sulfatés rencontrés chez les espèces de Flaveria (Compositae) peuvent être classés en étroite relation avec les 4 groupes déjà créés selon leurs modèles photosynthétiques [Hanoufa 1994]. On rencontre par exemple pour le modèle photosynthétique de type C3, des monosulfates de quercétine et patulétine. Pour le type C3-C4, des mono et disulfates principalement de quercétine et de patulétine. Pour le type C4-like, des mono, di, tri et tétrasulfates principalement de quercétine. Et pour le type C4, des mono, di et trisulfates de kaempferol, d’isorhamnétine et d’apigénine [Hannoufa 1994]. A petite échelle, ces flavonoïdes sulfatés peuvent donc jouer un rôle dans la systématique.

68

Tableau 11 : Répartition des flavonoïdes sulfatés dans les Magnoliophyta (Angiospermes) Classe Magnoliopsida (Dicotylédones)

Sous-classe Hammamelidae Caryophyllidae Dilleniidae

Rosidae

Asteridae Liliopsida (Monocotylédones)

Alismatidae

Arecidae Commelinidae

Zingiberidae Liliidae

Ordres Myricales Caryophyllales Polygalales Plumbaginales Dilleniales Theales Malvales Violales

Rosales Myrtales Rhamnales Sapindales Apiales Solanales Lamiales Asterales Alismatales Hydrocharitales Najadales Arecales Arales Commelinales Cyperales Restionales Juncales Zingibérales Liliales Orchidales

Familles Myricaceae Chenopodiaceae Polygonaceae Plumbaginaceae Dilleniaceae Guttiferae Malvaceae Bixaceae Cistaceae Frankeniaceae Tamaricaceae Davidsoniaceae Rosaceae Onagraceae Leeaceae  Zygophyllaceae  Umbelliferae Convolvulaceae  Verbenaceae Compositae Alismataceae Hydrocharitaceae Zamielelliaceae Zosteraceae Palmae Araceae Commelinaceae Cyperaceae Gramineae Restionaceae Juncaceae Marantaceae Liliaceae Iridaceae Orchidaceae

IV- Fonction En dépit des récentes avancées en phytochimie, le rôle des flavonoïdes sulfatés dans les plantes reste encore mal connu. On peut cependant, avancer quatre hypothèses :

69

A) Détoxification Tout comme dans le règne animal, la sulfatation des flavonoïdes peut être considérée  comme un mécanisme de détoxification, en rendant hydrosolubles les produits en vue de leur  stockage dans des compartiments cellulaires hydrophiles. Il s’agit notamment de détoxifier la  plante à l’égard des groupes hydroxyles des flavonoïdes très réactifs, et de pouvoir excréter,  tout comme les mécanismes de glycosylation, les flavonoïdes afin d’éviter leurs interactions  avec des sites enzymatiques [Harborne 1977].

B) Transfert d’ions La sulfatation peut aussi être un moyen de séquestrer les ions sulfates, et ainsi de jouer  sur le dynamisme de la balance ionique. En effet, la plupart des plantes qui synthétisent ces  dérivés, vivent dans un environnement écologique aquatique et/ou salin. La plante aurait donc  par   ce   système,   la   possibilité   de   stocker   l’excès   d’ions   sulfates   présents   dans   son  environnement. Ce phénomène pourrait également servir de transfert de groupes sulfates ou  de soufre inorganique à une forme organique. Une expérience consistant à l’incorporation de  35

SO42­  dans  les  tissus   de  Zostera  (Zosteraceae)  a révélé  que 36  heures   après, 50%   de  la 

radioactivité était présente dans la fraction contenant les flavonoïdes [Nissen 1964, Harborne  1975a, 1977].

C) Bioactivation

On sait aussi que la sulfatation dans le règne animal est un moyen de bioactivation d’un certain nombre de composés comme les hormones stéroïdiennes, et les neurotransmetteurs, pour la modulation des activités biologiques. La sulfoconjugaison est même impliquée dans l’activation des prodrogues (c’est le dérivé sulfaté du Minoxidil® agent antihypertenseur, qui est actif) [Falany 1997]. Il en est de même chez certaines plantes, comme le Limonium 70

(Plumbaginaceae), qui, en réponse à un stress de salinité, accumule du sulfate de choline, ou chez le Mimosa (Fabaceae), dont l’acide 4-(6’-sulfoglucosyl)-gallique est responsable des mouvements seismonastique et nyctinastiques [Varin 1997]. D) Régulation du transport de l’auxine La croissance des plantes est régulée par l’accumulation d’auxine, phytohormone de croissance. L’auxine est elle-même stimulée par la quercétine et d’autres flavonoïdes. Or, les dérivés 3-, 7- et 3’-sulfate de la quercétine bloquent cette stimulation [Faulkner 1992]. Cette hypothèse est confirmée par le fait que l’on rencontre les plus fortes concentrations en flavonols sulfatés et en sulfotransférase (ST) dans les zones en croissance de la plante, alors qu’elles sont les plus faibles dans les tissus âgés [Hannoufa 1991]. De plus, chez Flaveria bidentis (Compositae), la régulation de la flavonol 3-ST par l’auxine a été démontrée. Cela suggère donc que la sulfatation chez Flaveria, joue un rôle dans le contrôle du transport de l’auxine [Ibrahim 1995].

V- Enzymologie Dans les plantes il existe peu de sulfatases. Ce n’est que très récemment que des flavonols sulfotransférases (F-ST) ont été identifiées à partir de Flaveria (Compositae) : la flavonol 3-sulfotransférase (3-ST), ainsi que la 3’-ST, la 4’-ST et la 7-ST [Varin 1989, 1991, 1992b]. Ces enzymes sont très spécifiques, ainsi, la 3-ST ne reconnaît que la position 3 des flavonols pour produire exclusivement le flavonol 3-sulfate selon une préférence allant de la rhamnétine, l’isorhamnétine, la quercétine, la patulétine au kaempferol. La 3’ et 4’­ST ne reconnaissent que les flavonols 3­sulfate, et la 7­ST que les flavonols  3,3’­disulfate   ou   3,4’­disulfate.   Cette   constatation   a   permis   d’établir   une   séquence  enzymatique de sulfatation pour expliquer la présence des flavonols déjà isolés dans cette  espèce (Figure 15). La première étape étant la sulfatation en position 3 [Varin 1992a].

71

Quercétine-3-sulfate 3'-ST Quercétine-3,3'-disulfate

Flaveria bidentis

7-ST Quercétine-3,7,3'-trisulfate

4'-ST Quercétine-3,4'-disulfate 7-ST

Flaveria Flavériachloraefolia chloraefolia

Quercétine 3-ST

Quercétine-3,7,4'-trisulfate

4'-ST

3'-ST

Quercétine-3,7,3',4'-tetrasulfate Sulfatase Quercétine-3,7,3'-trisulfate/3,7,4'-trisulfate Sulfatase Quercétine-3,7-disulfate

Figure 15 : Modèle biosynthétique des flavonoïdes sulfatés des espèces de Flaveria (Compositae) [Varin 1992a]

La réaction se fait par un mécanisme BI-BI qui utilise la PAPS (3’-Phosphoadénosine 5’-sulfate) comme premier substrat, puis vient le flavonol. Il y a réaction et libération du flavonol sulfate puis du PAP. Tableau 12 : Caractéristiques des flavonols sulfotransférases (F-ST) de Flaveria [Varin 1992a]

Propriétés Km Flavonoïdes (µM) Km PAPS (µM) pH optimum pI apparent Poids moléculaire (D) Substrat

F 3-ST 0,2 0,2 6,0 ; 8,5 5,4 35 000 Quercétine (Q)

F 3’-ST 0,29 0,35 7,5 6,0 35 000 Q-3-sulfate

F 4’-ST 0,36 0,38 7,5 5,1 35 000 Q-3-sulfate

F 7-ST 0,24 0,33 7,5 6,5 35 000 Q-3,3’-disulfate

Il y a de très fortes homologies de séquences entre les ST [Varin 1992a, 1997]. Ainsi  entre la 3­ST et la 4’­ST il y a 70% d’homologie de séquence entre elles et environ 30% avec  les ST animales, justifiant ainsi la présence de régions très conservées. Par mutagénèse, on connaît à présent les sites de fixation du flavonol spécifique et du co-substrat [Marsolais 1997, 1998]. L’activité de ces ST est fortement liée au développement végétatif de la plante [Hannoufa 1991]. 72

On localise même les flavonols sulfatés dans le compartiment nucléaire, et de manière  transitoire dans le cytosol. Une protéine nucléaire qui a d’ailleurs une forte affinité avec la  quercétine 3­sulfate (85 nM) est en cours d’étude [Grandmaison 1996]. Tout cela suggère une  fonction probable de régulation. Rappelons que les flavonoïdes activent l’expression du gène  nod du Rhizobium [Harborne 1994], et que chez les mammifères, les métabolites sulfatés sont  impliqués dans la croissance et le développement cellulaire.

VI- Métabolisation et Bioconversion A) Métabolisation Il est maintenant admis que les flavonoïdes sont métabolisés par les cellules de mammifères et excrétés dans la bile et/ou l’urine sous forme de dérivés glucuronoconjugués ou sulfatés [Harborne 1982, 1994]. La sulfatation enzymatique joue un grand rôle dans la détoxification des métabolites endogènes et des xénobiotiques, mais cette sulfatoconjugaison est aussi impliquée dans la bioactivation. Ainsi, la quercétine est métabolisée par le foie et donne des dérivés monosulfatés ainsi que des dérivés sulfatés et glucuronoconjugués [Shali 1991]. De plus, la quercétine, au pouvoir antioxydant reconnu, est administrée par sonde intragastrique à des rats. Le sang prélevé au bout d’une heure, puis de six heures, de l’aorte abdominale ne contient plus de quercétine libre, mais plusieurs de ses métabolites, dont des dérivés sulfatés et sulfoglucuronés. Le plasma de rat contenant ces métabolites inhibent d’avantage la peroxydation lipidique induite par le sulfate de cuivre, que le plasma contenant seulement de la quercétine [da Silva 1998]. Aussi, la liquiritine (7,4’-dihydroxyflavone) qui a une activité antihépatotoxique in vivo par voie orale chez le rat est métabolisée en 5 composés dont les dérivés sulfatés suivants : 7,4’-disulfate, 7-sulfate-4’glucuronoside et 7-glucuronoside4’-sulfate. Le rein participe aussi à la métabolisation en dérivé 7,4’-disulfate [Shimamura 1993]. Il en est de même pour la génistéine qui est connue pour son activité inhibitrice de la protéine tyrosine kinase ou pour son activité oestrogénique. Ces activités sont essentiellement dues à ces dérivés sulfatés. En effet, l’administration de génistéine par voie orale chez le rat est rapidement suivie d’une métabolisation, conduisant à l’élimination par voie urinaire et biliaire de la génistéine 4’-sulfate et de son dérivé glucuroné en –7 essentiellement [Yasuda 1996]. B) Bioconversion 73

Les synthèses spécifiques de dérivés sulfatés ne sont pas toujours faciles [Barron 1988a]. Aussi, la bioconversion semble avoir un avenir certain par l’obtention de réaction spécifique avec de bons rendements. Par exemple, Streptomyces fulvissimus est capable, en suspension, de biotransformer la 5-hydroflavone en son dérivé 4’-sulfate [Ibrahim 1989]. De même, dans la flore intestinale humaine, il existe une arylsulfotransférase qui sulfate des polyphénols comme les xanthones, chalcones et flavonols. Ainsi, la bactérie isolée de la flore intestinale (Eubacterium A-44) peut catalyser par exemple, le transfert d’un sulfate sur la quercétine à partir du sulfate de p-nitrophenyl ou PNS (et non pas à partir du PAPS). Cette enzyme bactérienne est plusieurs milliers de fois plus active que les enzymes d’origine animale ou végétale. Si le PNS est en excès, on obtient les dérivés 3,3’-disulfate et 3,3’,7-trisulfate. Lorsque le PNS est mis dans des conditions équimolaires ou en léger excès, seul le dérivé 3,3’-disulfate est obtenu [Koizumi 1990]. Cette étude montre aussi qu’administrée oralement, la quercétine peut être sulfatée par les bactéries intestinales et devenir plus hydrosoluble et par conséquent moins absorbable. Par ailleurs, il est connu que la quercétine est mutagène in vitro mais ne semble pas être carcinogène in vivo [Fukuoka 1980]. La sulfatation de la quercétine par la flore intestinale entraînerait-elle cette détoxification ?

VII- Propriétés biologiques des flavonoïdes sulfatés A) Activité antiallergique [Nagai 1975] La baicaléine est un flavonoïde antiallergique peu soluble, isolée de la racine de Scutellaria baicalensis (Lamiaceae) utilisée dans la médecine traditionnelle chinoise lors des crises allergiques ou d’asthme. Deux dérivés plus hydrosolubles ont été synthétisés. Il s’agit des sels de sodium de la baicaléine 6-sulfate (BSS) et de la baicaléine 6-phosphate (BPS), testés pour leur activité antiallergique.

HO

O

R OH

O

74

R=OH Baicaléine R=OSO3Na Baicaléine 6-sulfate de sodium

Il existe trois groupes de réactions d’hypersensibilité allergique : -

L’hypersensibilité de type I ou hypersensibilité immédiate se produit lorsqu’un allergène est reconnu par une IgE qui active un mastocyte. Le mastocyte activé libère de l’histamine qui provoque la réaction allergique. Lorsque l’allergène pénètre dans les bronches, l’hypersensibilité peut se manifester par une crise d’asthme avec diminution du volume d’air inhalé.

-

L’hypersensibilité de type II est liée à la présence d’anticorps dirigés contre les membranes et d’antigènes cellulaires qui activent le complément.

-

L’hypersensibilité de type III est le résultat du dépôt du complexe immun (Ac-Ag) sur les parois des vaisseaux et dans les tissus provoquant la destruction de ceux-ci par la libération par les phagocytes de dérivés actifs de l’oxygène. Cette hypersensibilité est mise en évidence par la réaction d’Arthus qui est une réaction cutanée qui se présente sous forme d’une zone rouge et gonflée après injection intradermique de l’antigène.

Cette étude a montré que BPS et BSS inhibent les hypersensibilités de type I et II,  mais qu’ils n’ont aucun effet sur l’hypersensibilité de type III (responsable de la polyarthrite  rhumatoïde ou du lupus érythémateux disséminé entre autres). B) Activité Mutagène - Carcinogène [Fukuoka 1980] Les extraits aqueux de feuilles et de graines d’Anethum graveolens et d’A. sowa (Umbelliferae) comestibles présentent une activité mutagène sur les souches TA98 et TA100 de Salmonella typhimurium. Les auteurs ont recherché le principe mutagène, et examiné l’effet carcinogène chez le rat en complémentant son alimentation durant 450 jours, par un apport de 33% de poudres de feuilles ou de graines. Après fractionnement et purifications successives, les auteurs montrent que ce sont la persicarine (isorhamnetine 3-sulfate) et la quercétine 3-sulfate qui sont responsables de cette activité mutagène.

75

OR OH

HO

O

OSO3OH

O

R=CH3 Persicarine ou Rhamnétine 3-sulfate R=H

Quercétine 3-sulfate

Ils soulignent bien que ces flavonols sulfatés sont mutagènes in vitro mais pas carcinogènes in vivo ! Avec un apport journalier de 33% de poudres de feuilles et de graines, le taux de flavonols sulfatés n’est pas suffisant pour induire des tumeurs.

C) Inhibition des déshydrogénases Les dérivés de la quercétine 3,7,3’,4’-tétrasulfate et 3-acétyl-7,3’,4’-trisulfate inhibent la réduction des groupes carbonyles catalysés par les alcool déshydrogénase ainsi que lactate et malate déshydrogénases [Pérez 1986].

D) Inhibition de l’aldose réductase [Varma 1986] L’aldose réductase est une enzyme clé dans la voie de synthèse des polyols  via  le  métabolisme des sucres :

76

Aldose réductase Glucose

Sorbitol

NADPH

NADP Polyol déshydrogénase Fructose

Sorbitol

NAD

NADH

Figure 16 : Métabolisme des polyols

L’aldose réductase est présente dans de nombreux tissus dont le cristallin. Chez les  diabétiques, cette enzyme produit beaucoup de sorbitol, et cette accumulation dans le cristallin  est responsable de la cataracte. Ce sont ces polyols qui sont responsables de l’opacification du  cristallin   car   ils   diffusent   mal   à   travers   les   membranes   cellulaires   et   provoquent   une  importante entrée d’eau dans les cellules par osmose. Ce phénomène serait responsable de  certaines rétinopathies et neuropathies périphériques associées au diabète humain. La recherche de composés inhibiteurs de l’aldose réductase est d’un grand intérêt thérapeutique dans la lutte contre les complications du diabète. Certains flavonoïdes inhibent cette enzyme comme la quercitrine notamment qui a une CI50 de 10-7M. Mais la limitation de l’usage de ces flavonoïdes en thérapeutique est leur faible hydrosolubilité. Pour cela, les Laboratoires Zyma© (Nyon Suisse) ont synthétisé des dérivés sulfatés pour les rendre plus hydrosolubles. Il s’avère que ces flavonoïdes sulfatés sont les composés les plus actifs (CI50 108

M). Tableau 13 : Flavonoïdes sulfatés inhibiteurs de l’aldose réductase du cristallin obtenus par synthèse

Composés Quercitrine Quercétine 3-acétyl, 7,3’,4’-trisulfate Quercétine 3,7,3’,4’-tétrasulfate Quercétine 3,5-diacétyl, 7,3’,4’-trisulfate Quercétine 5,7,3’-triacétyl, 3,4’-disulfate

% d’inhibition à 10-8M 0 70 55 75 75

77

Cette action a été également démontrée pour d’autres flavonoïdes sulfatés isolés de Polygonum hydropiper (Polygonaceae) sur l’aldose réductase du cristallin de porc [Haraguchi 1996]. Tableau 14 : Flavonoïdes sulfatés inhibiteurs de l’aldose réductase du cristallin isolés de Polygonum hydropiper

Composés

IC50 (µM) de l’aldose réductase 50,1 50,9 >95,0 69,0 1,8 >91,0 30,1 16,0 5,0

Quercétine Quercétine-3-sulfate Isorhamnétine Isorhamnétine-3-sulfate Isorhamnétine-3,7-disulfate Rhamnazine Rhamnazine-3-sulfate Isoquercitrine Tamarixétine-3-glucoside-7-sulfate

Ce tableau montre que les dérivés sulfatés les plus actifs sont l’isorhamnétine-3,7disulfate (IC50 =1,8 µmol.l-1) et la tamarixétine-3-glucoside-7-sulfate (IC50 = 5,0 µmol.l-1). La sulfatation de l’hydroxyle en 7 semble être un facteur important dans l’inhibition de l’aldose réductase. On remarque aussi que l’introduction d’un groupement sulfate sur une génine augmente son activité de façon non négligeable. Ainsi l’activité de la rhamnazine-3-sulfate (IC 50 = 30,1 µmol.l-1) est trois fois plus importante que la génine correspondante (IC 50 >91,0 µmol.l1

). R4 R5

R3

O

R1 R2

O

R1 = Rhamnosyl, R2 = OH, R3 = OH, R4= OH, R5 = OH

Quercitrine

R1 = OSO , R2 = OH, R3 = OSO3 , R4= OSO3 , R5 = OSO3 3

-

-

Quercétine 3,7,3’,4’-tétrasulfate

-

R1 = Acétyl, R2 = OH, R3 = OSO3 , R4= OSO3 , R5 = OSO3 -

-

Quercétine 3-acétyl-7,3’,4’-trisulfate

-

R1 = Acétyl, R2 = Acétyl, R3 = OSO3 , R4= OSO3 , R5 = OSO3 Quercétine 3,5-diacétyl-7,3’,4’-trisulfate -

-

-

R1 = OSO3-, R2 = Acétyl, R3 = Acétyl, R4= Acétyl, R5 = OSO3- Quercétine 5,7,3’-triacétyl-3,4’-trisulfate R1 = OSO3-, R2 = OH, R3 = OSO3-, R4= OMe, R5 = OH

Isorhamnétine 3,7-disulfate

R1 = Glucosyl, R2 = OH, R3 = OSO3 , R4= OH, R5 = OMe

Tamarixétine 3-glucosyl-7-sulfate

-

78

E) Activité Anti-oxydante – Antiradicalaire Antiradicalaire [Brasseur 1987] La rutine est un des flavonoïdes majeurs de la thérapeutique, utilisée notamment dans les troubles de la circulation veineuse, de l’athérosclérose, de l’hypertension et les radiodermites (souvent associé à l’acide ascorbique). Malheureusement peu soluble dans l’eau, des dérivés solubles ont été hémisynthétisés dont la rutine sulfate sous forme de sel sodique. Afin de savoir si ses dérivés ont conservé l’activité de la molécule originale, les auteurs ont effectué différents tests. OH OH

RO

O

O-Gluc-Rha OH

O

R=H R=OSO3Na

Rutine Rutine sulfate

Tableau 15 : Activité comparée de la rutine et de la rutine sulfate (exprimés en %)

Action radical DPPH

Concentration M 3.10-6

Rutine 36

Rutine sulfate 7

radical OH

10-4

20

17

antilipoperoxydante

10-3

25

2

10-4

67

40

10-3

248

186

% de capture du radical % de dégagement d’éthylène formé par réaction entre le radical et le KMB* soumis à irradiation λ % d’inhibition de formation de lipoperoxyde

antioxygène % de la teneur résiduelle en acide ascorbique

biosynthèse des prostaglandines

% de stimulation de la biosynthèse * KMB : acide méthyl-4-oxo-2 butyrique

On observe que la rutine reste la plus active. Les auteurs soulignent tout de même que le sulfate de rutine qui est testé, bien que majoritaire, contient des impuretés ( notamment des dérivés de rutine dont le système ortho-dihydroxyl du cycle B n’est plus libre).

79

Antioxydante [Yagi 1994] Isolés

de

Polygonum

hydropiper

(Polygonaceae),

la

quercétine

3-sulfate,

l’isorhamnétine 3,7-disulfate et la tamarixétine 3-O-β-glucoside 7-sulfate ont montrés une forte activité antioxydante. La méthode au thiocyanate ferrique montre que ces trois flavonoïdes ont une activité supérieure à celle de la quercétine et de l’α-tocophérol (ces derniers étant connus pour être de très bons antioxydants naturels). R3 R4

R2

O

R1 OH

O

R1=OSO3K

R2=OH

R3=OH

R4=OH

Quercétine 3-sulfate

R1=OSO3K

R2=OSO3K

R3=OCH3

R4=OH

Isorhamnétine 3,7-disulfate

R1=O-Gluc

R2=OSO3K

R3=OH

R4=OCH3

Tamarixétine 3-glucosyl, 7-sulfate

De même, la méthode utilisant l’anion superoxyde montre qu’ils sont plus actifs que la quercétine pour capter ces anions induits par le système xanthine-xanthine oxydase (l’IC50 étant en dessous de 10 ppm).

F) Chimioprévention des cancers du sein [Peterson 1996, Wong 1997] Des   études   épidémiologiques   ont   montré   le   très   faible   taux   de   cancer   chez   les  personnes ayant une alimentation riche en isoflavones (asiatiques,…). Bien que ce soit des  génines non sulfatées qui sont consommées, celles­ci sont métabolisées en dérivés sulfatés par  l’organisme. Ce sont ses dérivés qui sont fortement impliquées dans le processus d’inhibition  de la croissance des tumeurs mammaires. En effet, dans les cellules de cancer du sein MCF­7, la génistéine est métabolisée en  dérivés   sulfatés   dont   la   génistéine   7­sulfate.   Ces   métabolites   sont   rapidement   excrétés, 

80

entraînant une chute de la concentration intracellulaire en génistéine. Ce processus permet  d’inhiber la croissance mammaire. De même, la biochanine A, active les cellules MCF­7 par la métabolisation en génistéine puis  conversion en génistéine 7­sulfate.

R2

O

R1

O R3

R1=H

R2=OH

R3=OH

daidzéine

R1=OH

R2=OH

R3=OH

génistéine

R1=OH

R2=OH

R3=OMe

biochanine A

R1=OH

R2=OSO3-

R3=OH

génistéine 7-sulfate

R1=H

R2=OH

R3=OSO3-

daidzéine 4’-sulfate

R1=H

R2=OSO3

R3=OSO3

daidzéine 7,4’-disulfate

-

-

Une autre voie dans la prévention des cancers du sein est celle de l’inhibition d’enzyme spécifique comme la stérol sulfatase. En effet, les stéroïdes oestrogéniques jouent un rôle dans l’évolution cancéreuse. Ces stéroïdes sont véhiculés sous forme de sulfoconjugués, inactifs sous cette forme. La stérol sulfatase les activent en les désulfatant. C’est cette désulfatation qui entraîne l’évolution cancéreuse. Or, les dérivés sulfatés de daidzéine inhibent la stérol sulfatase. La daidzéine 4’-sulfate et 7,4’-disulfate ont une IC50 de 6 et 1,5 µM respectivement, alors que le Tamoxifen® (et ses métabolites non-sulfatés), principal antioestrogène, inhibe cette même enzyme à 270 µM. La génistéine ou la biochanine A ont une IC50 de 1,2 µM alors que la daidzéine n’inhibe pas cette enzyme. Notons aussi que la daidzéine et la génistéine inhibent une enzyme de synthèse de l’œstrogène et des androsténédiols ce qui a pour conséquences de diminuer leurs concentrations dans les cellules mammaires et donc de diminuer l’évolution cancéreuse.

81

Conclusion

Depuis 1988, nous avons recensé 134 flavonoïdes sulfatés, dont 33 sont nouveaux (la plupart étant à la fois méthylés et/ou glycosylés et sulfatés). Hormis une flavone sulfatée chez les

Malvaceae,

notons

que

les

nouvelles

flavones

sulfatées,

proviennent

des

Monocotylédones. Nous avons vu aussi que les flavonoïdes sulfatés sont présents dans 38 familles avec trois nouvelles familles chez les Dicotylédones et que leur répartition est liée au milieu dans lequel ces plantes poussent (salin ou marécageux). La plupart des propriétés décrites sont les mêmes que celles des flavonoïdes en général. Mais le fait que les flavonoïdes se métabolisent en dérivés sulfatés hydrosolubles et les travaux effectués montrent que les propriétés citées pour les flavonoïdes sont étroitement liées aux activités de ces dérivés sulfatés.

82

Deuxième Partie : Travaux personnels

Chimie extractive Isolement des composés Analyse structurale Activités biologiques

83

Chapitre I Chimie Extractive

I- Matériel végétal Toute l’étude a été effectuée sur l’espèce Leea guineensis G. Don. Celle-ci a été récoltée en avril 1995 au Cameroun à Bella au sud d’Edea (3°14’N, 10°13’E) par le botaniste le Dr Achoundoung. Un échantillon de la plante est conservé à l’Herbier National de Yaoundé sous le numéro 3145 : Achoundoung. Les feuilles et le bois provenant du même arbuste ont été séchés séparément à l’ombre pendant une quinzaine de jours, puis ont été respectivement broyés. Les poudres de feuilles 1,5 Kg et de bois 1,5 Kg ont alors été envoyés au laboratoire de pharmacognosie de Grenoble.

II- Chimie extractive A Extraction solide-liquide des feuilles 1 Kg de poudre de feuilles est soumis à une extraction à l’hexane (25 L) pendant 11H dans un appareil de type Soxhlet. Les marcs sont séchés et épuisés au dichlorométhane (25 L, 15H). Ces deux extraits obtenus sont ensuite concentrés alors que les marcs subissent une extraction hydroalcoolique 50% (30 L pendant 4 jours à température ambiante) (Figure 17 p 67). B Extraction liquide-liquide L’extrait hydroalcoolique est concentré sous vide afin d’obtenir 10 L de solution, dont 1 L est prélevé après homogénéisation et lyophilisé. Le reste subit une succession d’extraction liquide-liquide avec les solvants de polarité croissante suivants : dichlorométhane, acétate d’éthyle et butanol. L’extraction est réalisée plusieurs fois pour chaque solvant. Les solutions extractives sont alors concentrées. Les résidus des extraits EtOAc et BuOH sont repris dans l’eau et lyophilisés (Figure 18 p 67).

84

Au total, nous obtenons 7 extraits dont les rendements d’extraction sont les suivants : Tableau 16 : Rendements d’extraction

Type d’extraction Extraction Solide-Liquide Extraction Liquide-Liquide

Extraits Hexane Dichlorométhane Hydroalcoolique Dichlorométhane Acétate d’éthyle Butanol Aqueux résiduel

Quantité en g 26 42 143 7 38 15 36

Rdt / Extrait EtOH-H2O 100 5 27 10 25

Rdt total / Feuilles 2,6 4,2 14,3 0,7 3,8 1,5 3,6

Tous les extraits ont été analysés. C Hydrodistillation La recherche des composés volatils (CV) de L. guineensis G. Don, est menée par un entraînement classique à la vapeur d’eau à partir d’échantillons de 100g de feuilles ou de bois sec. Le protocole utilisé est celui de la Pharmacopée Française Xèmeéd. [1983]. La durée d’hydrodistillation a été de 4H pour les feuilles et le bois. Les distillats obtenus dans les deux cas sont de couleur jaune foncée et sont plus légers que l’eau. Les rendements sont : CV des feuilles :

Rdt = 0,3%

CV du bois :

Rdt = 0,4%

85

FEUILLES broyées 1Kg Soxhlet Hexane 25 L, 11H

Extrait Hexanique 2,6 %

Marc Soxhlet dichlorométhane 25 L, 15H

Extrait Dichlorométhane 4,2 %

Marc Macération EtOH-H2O 50:50 30 L, 4J, TA

Extrait Hydroalcoolique 14,3 %

Marc

Figure 17 : Extraction solide – liquide des feuilles

Extrait EtOH-H2O 30L Concentration

Extrait H2O 10 L

Prélèvement d’ 1L lyophylisé

CH2Cl2 1 x 25 L

Extrait Dichlorométhane 0,7 %

concentration

Phase H2O EtOAc 3 x 20 L

Extrait Acétate d’éthyle 3,8 %

Concentration Lyophylisation

Extrait Butanol 1,5 %

Figure 18 : Extraction liquide – liquide

Phase H2O Concentration Lyophylisation

BuOH 5 x 8 L Concentration Lyophylisation

Extrait Aqueux final 3,6 %

86

Chapitre II - Isolement des composés I- Extrait hexanique Cet extrait visqueux et vert foncé contient beaucoup de pigments chlorophylliens. Pour cela, nous avons chromatographié 20 g de cet extrait sur une colonne ouverte (CO) de charbon afin de fixer ces pigments sur le support. L’extrait est élué au dichlorométhane. Deux fractions principales sont obtenues A et B qui seront chacune chromatographiée sur des colonnes de silice normale et de silice greffée C-18 sous moyenne pression (CLMP). Cet extrait hexanique conduit à la purification de 7 composés de nature terpénique (Terp-1 à Terp-7). De plus, le fractionnement classique de 5g d’extrait a conduit à l’isolement de Terp2.

5g

Extrait hexanique CO charbon E1

20 g

A

CO Si E2

B CLMP Si E3

Terp-5 (1g)

Aa CCMP Si C7

Terp–7 (6mg)

Aaa

CLMP Si E5

Terp-1 (20mg)

CLMP C18 E4

112B

Visiprep Si E6

CCMP Si C1

Terp-2 (25mg)

Terp-3 (9mg)

Abaa

Terp-4 (20mg) Terp-6 (9mg)

Ca

Baa CLMP C18 E4

CLMP C18 E4

Ba

Terp-5 (500mg)

Aba CLMP C18 E4

Aaaa CLMP C18 E4

Ab CLMP Si E5

C CLMP Si E3

CCMP Si C2 Visiprep Si E7

Terp-3 (1mg)

E1

CH2Cl2

E2

CHCl3

E3

gradient cHex-CHCl3-MeOH

E4

gradient MeOH-CHCl3

E5

gradient cHex-CHCl3

E6

gradient cHex-EtOAc

E7

CHCl3-MeOH 9:1

C1

cHex

C7

cHex-EtOAc 7:3 cHex-EtOAc 9 :1

Figure 19 : Isolement des composés de l’extrait hexanique C2

87

II- Extrait dichlorométhane Cet extrait verdâtre a subit dans un premier temps une chromatographie sous vide afin d’obtenir deux fractions enrichies A et B. Une chromatographie d’exclusion diffusion sur Sephadex© LH-20 de la fraction A conduit à deux fractions importantes Aa et Ab. La fraction Aa riche en chlorophylle est passée sur charbon avant d’être chromatographiée sur une colonne de silice. La fraction Ab est chromatographiée sur un support inverse pour conduire à deux composés. La fraction B, plus polaire subit différentes chromatographies classiques. Ainsi, de l’extrait dichlorométhane sont isolés 3 composés, un hydrocarbure (AG-1), un ester phénolique (Ac Ph-2) et un flavonoïde (Flav-7). E8

gradient cHex-CH2Cl2-MeOH

E9

CHCl3-MeOH 5:5

E10

gradient CHCl3-MeOH

E11

gradient H2O-MeOH

E13

H2O-MeOH 5:5

E14

MeOH

E15

gradient CH2Cl2-EtOAc

C5

Extrait dichlorométhane

A

B

Aa

Ab CO Charbon E10

Aaa

Aaab

Ba

Bb

CLMP C18 E11

Ac Ph-2 (4mg)

CLMP Si E15

Aaaa

CLMP Si E10

CO Sephadex LH20 E9

EtOAC-MeOH-H2O 100:16,5:13,5

AG-1 (30mg)

VLC silice E8

6g

CLMP C18 E13

Aba

Bba CO Sephadex LH20 E14

Bbaa

Bbab

CCMP Si C5

Flav-7

Figure 20 : Isolement des composés de l’extrait dichlorométhane(3mg)

88

III- Extrait à l’acétate d’éthyle 10 g de cet extrait brunâtre sont chromatographiés sur une colonne de silice sous moyenne pression, et permettent d’obtenir un composé et 3 fractions majoritaires A, B et C. Ces fractions subissent ensuite des chromatographies classiques en phase inverse et des CCM préparatives afin de purifier 5 composés, un acide phénol (Ac Ph-1) et 4 flavonoïdes (Flav-1 à Flav-4).

Extrait acétate d’éthyle CLMP silice E17

10 g

A

B

Flav-1 (36mg)

C CLMP C18 E11 CLMP C18 E11

CLMP C18 E18

Ac Ph-1 (30mg)

Aa

Ba

Bb CMMP Si C5

Bc CMMP Si C5

Ca CO Sephadex LH20 E14 CMMP Si C5

CO Sephadex LH20 E9

Flav-3 (20mg)

Ac Ph-1 (50mg)

Flav-3

Flav-4 (30mg)

Flav-2 (50mg)

Caa Visiprep C18 E11

Flav-3 E9

CHCl3-MeOH 5:5

E11

gradient H2O-MeOH

E14

MeOH

E17 E18 C5

gradient EtOAc-MeOH gradient H2O-MeOH-CHCl3 EtOAC-MeOH-H2O 100:16,5:13,5

Flav-4 (8mg)

Figure 21 : Isolement des composés de l’extrait acétate d’éthyle

89

IV- Extrait butanolique Une chromatographie sous vide sur 2 g de cet extrait butanolique conduit à deux fractions A et B. Celles-ci sont alors chromatographiées sur un gel de Sephadex LH20 et si la purification n’est pas suffisante, elle est poursuivie par une CLMP en C18. Nous purifions ainsi 3 flavonoïdes (Flav-4 à Flav-6).

Extrait butanol 2g

VLC silice E20

A

B CO Sephadex LH20 E14 CO Sephadex LH20 E14

Flav-4 (6mg)

Flav-5 (20mg)

Aa

Ba CLMP C18 E11 CLMP C18 E11

Flav-6 (6mg)

Flav-5 (3mg)

Baa CLMP C18 E21

E11

gradient H2O-MeOH

E14

MeOH

E20

gradient CH2Cl2-MeOH

E21

H2O

Flav-6 (3mg)

Figure 22 : Isolement des composés de l’extrait butanolique

90

V- Extrait aqueux 4 g de cet extrait après une chromatographique rapide sous vide, conduit à l’obtention d’un composé pur et d’une fraction A qui après une CLMP C-18 conduit à une autre fraction Aa et à deux composés purs. La fraction Aa est alors purifiée sur Sephadex LH20 pour obtenir un dernier composé. De cet extrait aqueux nous obtenons 3 composés appartenant à la classe des flavonoïdes (Flav-2, 5 et 6).

Extrait aqueux 4g

VLC silice E22

A

Flav-5 (6mg)

CLMP C18 E11

Aa

Flav-5

Flav-2

CO Sephadex LH20 E14

Flav-6 (11mg)

E11

gradient H2O-MeOH

E14

MeOH

E22

CH2Cl2-MeO-H2O

Figure 23 : Isolement des composés de l’extrait aqueux

91

Chapitre III - Etude Phytochimique - Analyse Structurale

A- Etude des composés volatils I- Analyse L’analyse de la composition de ces distillats est réalisée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG/SM). La méthodologie ainsi que les caractéristiques de l’appareil sont décrites en

Ac. myristique

Ac. caprique

Ac. nonanoïque

Ac. Laurique

annexe : Matériels et Méthodes p 176.

(a) Figure 24 : Profil chromatographique des composés volatils de bois (a).

92

Hexahydrofarnésylacétonee

Acide myristique

Acide laurique

géranylacétone

Acide nonanoïque Acide caprique

Anethole

Naphtalène

(b) Figure 24 (suite) : Profil chromatographique des composés volatils des feuilles (b).

Au total, 69 composés volatils sont recensés. Ils ont été identifiés par leur indice de rétention [Jenings 1980, Kondjoyan 1996, Davies 1990], leur spectre de masse [Jennings 1980, McLafferty 1989, Stenhagen 1974, Banque informatisée de l’INRA 1997], et après comparaison avec les données de la littérature [Kim Ha 1989]. On peut remarquer que, pour chaque échantillon, l’huile volatile est un mélange complexe de plusieurs composés. La classe la plus représentée est celle des hydrocarbures et de leurs dérivés (51,5% et 39,2% respectivement pour le bois et les feuilles). On retrouve beaucoup d’acides gras et d’esters (37,3% et 28,7% au total) avec notamment les acides nonanoïque, caprique, laurique, myristique et pentadécanoïque. Nous avons aussi, dans cette classe, des alcanes, des alcools, des aldéhydes et des composés cétoniques. Les autres classes sont celles des terpénoïdes (17,6% et 46,7% comprenant mono-, diet sesquiterpénoïdes), des phénylpropanoïdes rencontrés uniquement dans le bois et des composés divers (9,1% et 0,7%).

93

Tableau 17 : Composés volatils de bois et de feuilles de L. guineensis Composés

Indice de Rétention

Bois % rel.

Feuilles % rel.

Dérivés d’hydrocarbures a) alcanes, alcools Undécanol* Tétradécanol* Heptadécane

1381 1677 1700

b) aldéhydes Heptanal n-octanal (E)-2-octènal Nonanal (E)-2-nonènal Décanal (E, E)-2,4-nonadiènal (E)-2-décènal (E, Z)-2,4-décadiènal (E, E)-2,4-décadiènal (E)-2-undécènal Pentadécanal

Σ 0,0

2,4 0,4 0,2 Σ 3,0

882 989 1042 1089 1146 1188 1193 1249 1274 1294 1345 1698

c) cétones (E)-3-nonèn-2-one Undécan-2-one Dodécan-2-one Pentadécan-2-one Heptadécan-2-one

0,2 0,2 0,5 1,2 1,4 0,4 10,3 Σ 14,2

0,2 1,3 0,3 0,8 0,8 0,5 0,4 0,9 0,3 Σ 5,5

1122 1288 1389 1683 1887

d) acides gras et esters Acide caproïque (hexanoïque) Acide heptanoïque Caprilate de méthyle Acide caprilique (octanoïque) Acide nonanoïque Acide (E)-non-2-ènoïque Acide caprique (décanoïque) Acide undécanoïque Laurate de méthyle Acide laurique (dodécanoïque) Acide tridécanoïque Acide myristique (tétradécanoïque) Acide pentadécanoïque Palmitate de méthyle Acide (Z)-hexadéc-9-ènoïque Acide palmitique

Σ 0,0

0,2 0,2 0,9 0,3 0,4 Σ 2,0

1008 1091 1175 1183 1278 1321 1371 1469 1508 1566 1668 1765 1866 1908 1939 1965

Terpènoïdes 6-méthyl-hept-5-èn-2-one 1,8-cinéole (Z)-linalyloxide (E)-linalyloxide 6-méthyl-3,5-heptadièn-2-one* Linalol α-terpinéol β-cyclocitral Vitispirane α-ionone Géranylacétone

1,6 0,4 0,3 1,9 4,3 0,8 5,3 1,0 3,3 10,0 5,1 0,9 2,4 Σ 37,3

3,8 2,7 1,0 0,5 7,4 1,0 7,3 2,1 2,4 0,5 Σ 28,7

973 1024 1066 1079 1085 1094 1181 1197 1270 1408 1433

0,3 0,2 0,4 0,6 0,3 2,9 1,8 0,7 2,3

0,2 0,3 0,8 0,3 0,3 1,2 4,2 3,4

94

(E)-β-ionone Dihydroactinidiolide (E, E)-pseudoionone 4-oxo-β-ionone Cadalène Hexahydrofarnésylacétone 6,10,14-triméthylpentadéc-3-èn-2-one* Farnésylacétone* Isophytol (E)-phytol

1466 1490 1563 1635 1662 1836 1877 1895 1943 1950

Phénylpropanoïdes Estragole Anisaldéhyde (E)-cinnamaldéhyde (E)-anéthole Anisylacétone

0,3 5,4 0,4 2,0 Σ 17,6

2,3 0,5 0,3 0,7 1,2 28,2 1,5 0,5 0,3 0,5 Σ 46,7

1181 1221 1239 1267 1350

Composés divers Naphthalène Salicylate de méthyle γ-heptalactone Triméthyldihydronaphthalène* Dibenzofurane Benzoate de benzyle Muskolactone

1,8 1,0 2,1 3,5 0,2 Σ 8,6

Σ 0,0

1165 1174 1324 1338 1490 1730 1846

4,8 0,4 0,5 0,2 3,2 Σ 9,1

0,3 0,4 Σ 0,7

Σ 86,8 43

Σ 86,6 47

total 69 composés * isomères non déterminés

HE BOIS

Phénylpropanoï de s

HE FEUILLES Divers

Divers

1%

10%

Hydrocarbures

Hydrocarbures

10%

60%

Terpenoï des

45% Terpenoï des 54%

20%

Figure 25 : Répartition des différentes classes de constituants des distillats

Ainsi, nous pouvons constater que l’huile volatile du bois diffère significativement de celle des feuilles. La composition respecte bien les données de la littérature en ce qui concerne les taux de terpénoïdes et de phénylpropanoïdes en fonction de la partie végétale étudiée [Engel 1998]. On observe une quantité appréciable de phénylpropanoïdes (8,6%) dans l’huile volatile de bois, parmi lesquels figurent l’estragole (1,8%), l’anisaldéhyde (1,0%), le cinnamaldéhyde (2,1%), l’E-anéthole (3,5%) et l’anisylacétone (0,2%). Ceux-ci sont absents dans le distillat de feuilles. 95

Par contre, le distillat de feuilles est bien plus riche en terpénoïdes (46,7% contre 17,6%). On note un fort taux d’hexahydrofarnésylacétone (28,2%), et la présence de deux composés à 13 carbones, qui sont des composés rares d’huiles essentielles, le triméthyldihydronaphthalène (0,3%) et le vitispirane (1,2%). Ce dernier est un composé important de l’arôme de vanille [Schulte-Elte 1978]. Il a aussi été identifié dans les composés volatils du jus de raisin, de vin de table et de spiritueux de vin [Simpson 1977,Tattje 1979]. Pour les calculs, l’analyse est classiquement arrêtée à l’acide palmitique. Cependant, nous avons pu, après celui-ci, identifier (Rt, SM ) 4 acides gras. Ce sont : l’acide margarique (C-17), l’acide stéarique (C-18), l’acide oléique (C-18:1) et l’adipate de dioctyle.

II- Discussion L’analyse des composés volatils de L. guineensis (Leeaceae) a été réalisée car une HE a été décrite dans une autre espèce de Leea, L. hirta Roxb. La composition de celle-ci n’est pas connue, par contre, elle aurait une activité tuberculostatique [Gupta 1953]. L’analyse des distillats de feuilles et de bois permet l’identification d’un grand nombre de composés qui n’ont jamais été décrits dans cette plante, ni même dans la famille. On remarque toutefois que les acides gras sont les composés majoritaires du bois, contrairement aux feuilles, où la fraction en terpénoïdes est la plus importante même si on retrouve aussi en grande quantité ces acides gras. Par ailleurs, l’identification du vitispirane est un élément important. Ce composé rare, présent dans les distillats de vin (Vitis vinifera (Vitaceae)) montre une fois de plus la proximité des deux familles Leeaceae et Vitaceae.

96

α-terpinéol

vitispirane

O

OH

α-ionone

linalol OH

O

Hexahydrofarnésylacétone

E-anéthole OCH 3

O

Figure 26 : Quelques exemples de spectres SM obtenus

97

estragol

isophytol

OH OCH3

Géranylacétone

E-cinnamaldéhyde O

O

Anisaldéhyde O

OCH3

Figure 26 (suite) : Quelques exemples de spectres SM obtenus

98

B- Etude des Terpénoïdes I- Identification de Terp-1 Ce composé purifié de l’extrait hexanique se présente sous la forme d’une huile opalescente (20 mg). Sa faible polarité sur CCM et sa coloration violette, après révélation à l’acide sulfurique et chauffage, laissent penser qu’il s’agit d’un terpénoïde. Le spectre de masse en DCI indique l’adduit à m/z 314 [M+NH4]+ et l’ion pseudomoléculaire à m/z 297 [M+H]+ correspondant à la formule brute C20H40O. Cette formule indique la présence d’une insaturation ou d’un cycle, DIC de 1 [McLafferty 1980]. Nous observons différents pics identifiables tels que les pics à m/z 296 [M+NH4-H2O]+ et m/z 279 [M-H2O+H]+ qui correspond à la perte d’un hydroxyle par α-clivage. Plusieurs pics sont caractéristiques d’un squelette de type phytol : m/z 81 (C6H9+), 83 (C6H11+), 97 (C7H13+) et 123 (C9H15+) [Rasool 1991]. Par ailleurs, nous avons un pic m/z 85 (C5H9O+) qui résulte d’un clivage alpha d’un alcène. L’allure générale du spectre RMN 1H ci-dessous, suggère que le composé est de nature terpénique. Me-3

H-1

H-16 Me-15 Me-7 Me-11

H-4

H-2

H-15

Figure 27 : Spectre 1H de Terp-1 (200 MHz, CDCl3)

Nous observons à δ 5,39 (tq, J = 6,9 et 1,2 Hz, 1H), le proton éthylénique H-2 (Tableau 18 p 82). Ce déplacement chimique indique une double liaison trisubstituée. On note un couplage trans-allylique de 1,2 Hz avec le méthyle déblindé en 3 à 1,65 ppm (sl, 3H) et un 99

couplage vicinal avec H-1 à 4,13 ppm (d, J = 6,9 Hz, 2H) dont le carbone est hydroxylé. Ces couplages sont confirmés par le spectre COSY. La troisième substitution est un CH2 déblindé à 1,97 ppm (H-4, t, J = 7,4 Hz) qui couple lui-même avec un RCH2. Nous pouvons donc dessiner le motif suivant : 4

3

R H

2

CH3 OH 1

On devine vers 1,53 ppm un heptuplet (J = 6,4 Hz, 1H) relatif au proton H-15, qui couple avec 2 méthyles H-16 et Me-15. Parallèlement, ces deux méthyles résonnent sous forme de doublets caractéristiques à 0,85 ppm (d, J = 6,5 Hz, 6H). Les méthyles en 7 et en 11 résonnent quant à eux à 0,83 ppm (d, J = 6,3 et 6,2 Hz, 6H). En outre, la zone à 1,5-1,0 ppm correspond à 20 protons. Sur le spectre RMN 13C, de nombreux carbones ont le même déplacement chimique. Nous confirmons la présence d’une double liaison par les carbones à 140,3 ppm (C-3), 123,1 ppm (C-2) et par le carbone déblindé à 39,9 ppm (C-4) qui est en alpha de celle-ci. La configuration E de la double liaison est confirmée par les valeurs spectrales et la comparaison faite avec le géraniol (E) et le nérol (Z) [Breitmeier 1990]. Notons que le méthyle en position 3 est significativement moins déblindé dans l’isomère E, alors que le carbone 4 est au contraire plus déblindé.

OH

Géraniol

Nérol OH

Carbones

Terp-1

C-1 C-4 Me-3

59,5 39,9 16,2

Géraniol (E) 59,3 39,6 16,2

Nérol (Z) 58,9 32,0 17,6

Nous observons aussi, un carbone hydroxylé (56,5 ppm), 3 groupes de méthyles à 22,7,  19,8   et   16,2   ppm   correspondant   aux   méthyles   C­16   et   Me­15,   Me­7   et   Me­11,   et   Me­3  respectivement.

Tableau 18 : données RMN de Terp-1 (200/50 MHz, CDCl3) :

100

Position

H δ (ppm), mult, J (Hz) 59,5 4,13 (d, 6,9, 2H) 123,1 5,39 (tq, 6,9, 1,2, 1H) 140,3 39,9 1,97 (tl, 7,4, 2H) 25,2 36,7 32,8 37,4 24,5 24,8 39,4 28,0 1,53 (hept, 6,4, 1H) 22,7 0,85 (d, 6,5, 6H) 16,2 1,65 (sl, 3H) 19,8 0,83 (d, 6,3, 6H) 13

1 2 3 4 5 6 7, 11 8, 10, 12 9 13 14 15 16, Me-15 Me-3 Me-7, Me-11

C

1

Toutes ces données comparées à celles de la littérature [Rasool 1991, Hasan 1991] permettent d’identifier Terp-1 au E-Phytol : 3

OH 11

7

1

15

Rappelons par ailleurs, qu’il a été caractérisé dans le distillat des feuilles avec son homologue l’isophytol. Il a été isolé pour la première fois en 1907 par Willstätter [Merck Index]. C’est un diterpène acyclique largement répandu dans le règne végétal qui provient de la décomposition de la chlorophylle. Il sert à la préparation des vitamines E et K1 [Harborne 1999]. Il est cependant recensé pour la première fois chez les Leeaceae.

101

II- Identification de Terp-2 Issue de l’extrait hexanique, cette huile incolore, réagit sur CCM comme un dérivé terpénique (25mg). Le spectre de masse en mode DCI révèle 2 pics caractéristiques à m/z 411 [M+H]+ et m/z 428 [M+NH4]+ qui conduisent à une formule brute de C30H50 (6 insaturations ou cycles). De plus, par clivage alpha-allylique, on identifie différents fragments caractéristiques de la perte du même motif en C5, à m/z 342 [M-C5H9+H]+, m/z 274 [M-C10H17+H]+, m/z 206 [MC15H25+H]+, m/z 138 [M-C20H33+H]+, m/z 70 [M-C25H41+H]+. Ce type de fragmentation est rencontré dans des structures de type squalène. PM = 410

m/z 341

m/z 273

m/z 205

m/z 137

m/z 69

Figure 28 : Fragmentation du squalène

L’allure générale du spectre RMN 1H présente 3 régions distinctes (Figure 29, Tableau 19 p 86) :

Figure 29 : Spectre 1H de Terp-2 (200 MHz, CDCl3)

- une zone de protons éthyléniques à 5,10 ppm (m) qui intègre pour 6H, 102

- une zone des CH2 à δ 2,10-1,90 (m) qui intègre pour 20H, - enfin, une zone pour les méthyles avec, à 1,66 ppm, un singulet large qui correspond aux méthyles trans en bout de chaîne C-1, C-24, intégrant pour 6H, et à 1,58 ppm un singulet qui intègre pour 18H correspondant aux méthyles Me-2, -6, -10, -15, -19 et -23. Sur le spectre 13C (J modulé), on observe 12 signaux qui laissent penser que les motifs en C5 intramoléculaires sont équivalents (Figure 30, Tableau 19 p 86). C-5, C-9, C-16, C-20 C-6, C-19 C-10, C-15

C-12C-4, C-21 C-13C-8, C-17

C-2 C-23

Me-6 Me-10 Me-15 Me-19

C-3, C-22 C-7, C-11, C-14, C-18

Me-2 C-1 Me-23 C-24

Figure 30 : Spectre 13C J modulé de Terp-2 (50 MHz, CDCl3)

On distingue : -trois carbones quaternaires oléfiniques à 135,1, 134,9 et 131,2 ppm correspondant à C-6, C-10 et C-2 respectivement, -deux signaux éthyléniques dont un à 124,4 ppm attribuable à C-3 et un à 124,3 ppm relatif à C-7 et C-11, -quatre CH2 à 39,7 ppm (C-5 et C-9), 28,3 ppm (C-12), 26,8 ppm (C-4) et 26,7 ppm (C-8), -trois signaux caractéristiques de carbones méthyliques : le premier à 25,7 ppm correspond aux méthyles trans (C-1 et C-24) en bout de chaîne qui sont les plus déblindés, le second à 17,7 ppm est attribuable au Me-2 et enfin celui à 16,0 ppm aux Me-6 et Me-10.

103

L’expérience XHCORR permet d’attribuer à partir des protons éthyléniques les carbones correspondant, et montre également l’existence de deux groupes de méthyles. Le premier correspondant à C-1 et C-24, le second aux méthyles en -2, -6, -10, -15, -19 et -23.

1.5 ppm

C-2 C-23 C-1 C-24

C-6 C-10 C-15 C-19

2.0 ppm

Figure 31 : XHCORR de Terp-2 (CDCl3)

Avec l’expérience COSY45, on ne peut pas attribuer de manière précise les corrélations observées du fait de la superposition des signaux. Cependant, des corrélations existent entre des protons éthyléniques et des CH2. On remarque également un couplage trans-allylique entre le méthyle en 1 et le proton éthylénique H-3 (4JH1-H3). Comme pour Terp-1, cela confirme la présence de fragments en C5, et l’enchaînement suivant :

H3C H

Tableau 19 : Données RMN de Terp-2 (200/50 MHz, CDCl3) :

104

Position 1, 24 2, 23 3, 22 4, 21 5, 9, 16, 20 6, 19 7, 11, 14, 18 8, 17 10, 15 12, 13 Me-2, 23

C 25,7 131,2 124,4 26,8 39,7 135,1 124,3 26,7 134,9 28,3 17,7 13

Me-6, 10, 15, 19

CH3 C CH CH2 CH2 C CH CH2 C CH2 CH3

1 H 1,66 (s, 6H)

5,10 (m) 2,0-2,1 (nd) 1,9-2,0 (nd) 5,10 (m) 2,0-2,1 (nd) 1,95-2,05 (nd) 1,58 (s, 18H)

16,0 CH3

Les différents éléments apportés par la RMN confirment les résultats de la spectrométrie de masse et permettent d’identifier Terp-2 au squalène qui de par son origine biosynthétique est la répétition d’un même motif isoprénoïde (6 unités). Ces données sont en accord avec la littérature [Breitmeier 1990] :

19

23

15 6

10

2

C’est un produit cité pour la première fois dans le genre et l’espèce, alors qu’il est présent dans tout le règne végétal. Il est le précurseur de tous les triterpènes via son époxydation, sa cyclisation et son réarrangement [Bruneton 1993]. Isolé en 1926 par Heilbron, il est utilisé dans la synthèse d’un grand nombre de composés pharmaceutiques [Merck Index]. Notons que le squalène est présent dans l’huile d’olive à 0,1­0,7% [Harborne 1999].

105

III- Identification de Terp-3 Il est isolé sous forme d’aiguilles blanches (10 mg) dans la phase hexanique. Sa coloration rose puis violette après acide sur CCM laisse penser qu’il s’agit d’un triterpénoïde. Le spectre de masse en DCI montre l’ion pseudo-moléculaire à m/z 427 [M+H]+ caractéristique de la formule brute C30H50O (6 insaturations ou cycles). Le pic m/z 444 [M+NH4]+ est l’adduit. La présence d’un hydroxyle est signalée par l’observation du pic dû à la perte d’un hydroxyle par α-clivage m/z 409 [M-H2O+H]+. Puis nous constatons la perte d’un méthyle grâce au pic à m/z 394 [M-H2O-Me+H]+. [M+H]+

[M-H2O+H]+

g

[a-OH+H]+

Figure 32 : Spectre DCI de Terp-3

Par ailleurs, le spectre montre les fragments classiques des squelettes du type lupane [Shiojima 1992] (Figure 33). Ainsi, le fragment « a » (m/z 207), par perte de l’hydroxyle conduit au fragment m/z 190 [a-OH+H]+ et le fragment « g » (m/z 218) perd à son tour un méthyle et donne le fragment « g-15 » à m/z 203. Nous rencontrons aussi la coupure au niveau du cycle D qui conduit à un fragment à m/z 136 qui perd un proton pour donner un fragment à m/z 135 qui perd lui-même un méthyle pour donner le fragment à m/z 121.

106

CH2

a m/z 207

a-OH m/z 190

- Me

m/z 394

m/z 121

m/z 409

-Me m/z 136 g m/z 218

HO

-H

m/z 135

g-15 m/z 203

Figure 33 : Fragmentations classiques d’un squelette de type lupane

Le spectre RMN 1H rappelle bien un squelette de nature triterpénique avec la particularité de présenter deux protons d’une double liaison disubstituée qui résonnent à 4,67 ppm (H-29a, dl, J = 2,5 Hz, 1H) et 4,55 ppm (H-29b, dd, J = 2,5 et 1,2 Hz, 1H). Notons que l’expérience COSY révèle un couplage trans-allylique entre le signal à 4,55 ppm et un méthyle à 1,66 ppm. Nous observons un proton en alpha d’un hydroxyle à δ 3,18 (H-3, dm, 10 Hz, 1H), un proton très déblindé à δ 2,34 (1H, m, H-19) et 7 méthyles dont un à δ 1,66 (Me-30, sl, 3H) déblindé du fait de la double liaison. Ils sont attribués grâce aux données de la littérature [Reynolds 1986]. Le spectre

13

C (J modulé) confirme le squelette triterpénique avec 30 carbones

correspondant à la série des lupanes avec deux carbones éthyléniques caractéristiques à 151,0 ppm (C-20, C) et à 109,3 ppm (C-29, CH), un carbone hydroxylé à 79,0 ppm (C-3 CHOH), 27 signaux entre 14 et 56 ppm correspondant à 6 C, 5 CH, 9 CH2 et 7 CH3 (Tableau 22 p 102). Ces données spectrales sont comparables avec celles de la littérature [Mahato 1994], et confirment ainsi les données 1H et SM. Ces résultats nous permettent d’identifier Terp-3 au lupéol : 29

CH2

30 20 19

21 22

25

3

26

28

27

HO 24

23

C’est un produit nouvellement cité dans le genre qui est très répandu dans le monde végétal. Il a été isolé la première fois par Cohen en 1909 [Merck Index].

107

IV- Identification de Terp-4 Ce sont des aiguilles blanches (20 mg) isolées de l’extrait hexanique, qui sur CCM présente toutes les caractéristiques d’un triterpène. Le spectre DCI montre l’ion pseudo-moléculaire à m/z 427 [M+H]+, qui correspond à une formule brute de C30H50O (6 insaturations ou cycles). Le fragment à m/z 409 [M-H2O+H]+ indique la perte d’un hydroxyle par α-clivage. De même, nous rencontrons la perte d’un méthyle à m/z 412 [M-CH3+H]+. De plus, nous observons les clivages classiques de triterpènes, caractéristiques d’une structure oléanène [Shiojima 1992] (Figure 34). Il y a cassure de la liaison C-8-C-14. Le C-14 voisin de la double liaison est alors chargé positivement. Puis il y a clivage allylique entre C-9-C-11. Cela conduit aux fragments « g’ » à m/z 218 et « a » à m/z 207. La double liaison semble se trouver en C-12-C-13 du fait de l’important fragment « g’ ».

a-18 m/z 189

a m/z 217

m/z 409 g' m/z 218

HO

g'-15 m/z 203

g'-29 m/z 189

- CH3 m/z 412

Figure 34 : Fragmentations classiques du squelette oléanène

Ce fragment « g’ » perd un groupe méthyle par migration d’un proton et conduit au fragment « g’-15 » à m/z 203, puis la migration d’un proton entraîne la perte de C-11 d’où le fragment « g’-29 » à m/z 189. Ce fragment est aussi dû à la perte d’un hydroxyle du fragment « a » d’où ce même fragment « a-18 » à m/z 189.

108

Le spectre RMN 1H suggère également une structure oléanène hydroxylée.

Me-26 Me-25 Me-23

Me-27

Me-29, Me-30 Me-28 Me-24

H-12 H-3

Figure 35 : Spectre 1H de Terp-4 (200 MHz, CDCl3)

En effet, le proton éthylénique à 5,17 ppm (H-12, t, J = 3,6 Hz, 1H) est très caractéristique ainsi que le proton porté par un carbone hydroxylé à 3,21 ppm (H-3, dd, J = 5,4 et 9,9 Hz, 1H). La présence de 7 signaux de méthyles angulaires est caractérisée par des singulets entre 1,15 et 0,75 ppm (Tableau ci-dessous). Tableau 20 : Données RMN 1H des méthyles de Terp-4 (200 MHz, CDCl3) Protons

δ ppm (M, I)

Me-23 Me-24 Me-25 Me-26 Me-27 Me-28 Me-29 Me-30

0,92 (s, 3H) 0,78 (s, 3H) 0,95 (s, 3H) 0,98 (s, 3H) 1,12 (s, 3H) 0,82 (s, 3H) 0,85 (s, 6H)

Le spectre 13C montre 30 carbones répartis dans des zones caractéristiques (Tableau p 102). Notamment nous avons à 145,2 ppm (C-13, C) et 121,7 ppm (C-12, CH) les déplacements chimiques des carbones éthyléniques qui correspondent à une structure de type oléan-12-ène, dont le carbone à 79,0 ppm (C-3, CHOH) est β-hydroxylé [Mahato 1994].

109

Tableau 21 : Différences essentielles entre le noyau oléan-12-ène et urs-12-ène Carbones 3β 3α 12 13

Oléan-12-ène 78,8 76,4 121,8 145,1

Urs-12-ène 78,8 76,0 124,3 139,3

Toutes ces données spectrales correspondent avec celles de la littérature et nous permettent d’identifier Terp-4 comme étant la β-amyrine : 30

29

12 25

3

26

28

27

HO 24

23

Bien que très largement répandue, la β-amyrine est citée pour la première fois dans le genre. Il semble qu’elle ait été isolée pour la première fois en 1835 de Manila elemi (Burseraceae) par Rose, et redécouverte par Tschirch en 1902 de Amyris elemi (Rutaceae) [Radt 1940].

V- Identification de Terp-5 Ce composé se présente sous forme de cristaux en feuillets blancs (+1 g). Produit très apolaire, il est isolé de l’extrait hexanique et présente sur CCM toutes les caractéristiques d’un triterpéne. Le spectre de masse en EI montre l’ion moléculaire à m/z 665 [M]+. Cette erreur de 1 uma est due à un problème de décalage en masse qui a été confirmé par le spectre effectué en FAB mode négatif où l’on obtient bien le fragment m/z 663 pour [M-H]-. De même, le spectre en DCI montre l’ion pseudo-moléculaire à m/z 665 [M+H]+ et l’adduit à m/z 682 [M+NH4]+. Ces données sont cohérentes pour une formule brute de C46H80O2 (7 insaturations ou cycles).

110

g’

Palm+

a-18 g’-29

[M]+ [M-Palm]

+

Figure 36 : Spectre EI de Terp-5

Nous observons la perte d’un méthyle grâce au fragment à m/z 650 [M-CH3+H]+. Le fragment à m/z 409 indique la perte de 255 uma correspondant à une chaîne hydrocarbonée en C16. De plus, nous observons les clivages classiques de la β-amyrine rencontrés précédemment, qui conduisent aux fragments « g’ » à m/z 218, « a » à m/z 207, « g’-15 » à m/z 203, et enfin « a-18 » et « g’-29 » à m/z 189. Notons que l’on observe bien la chaîne aliphatique avec les fragments à m/z 257 et 239 relatifs dans un premier temps à une chaîne palmitoyle qui perd un hydroxyle. De plus, on distingue les premiers fragments dus aux clivages successifs des liaisons C-C du côté Cterminal de C2H5+ à C10H41+.

a m/z 217

a-18 m/z 189 m/z 409

g' m/z 218

C15H31COO

g'-15 m/z 203

g'-29 m/z 189

m/z 256 -OH m/z 239

- CH3 m/z 650

Figure 37 : Fragmentations de Terp-5

Sur le spectre RMN 1H, nous observons les signaux obtenus pour la β-amyrine avec entre autres : 111

- le proton éthylénique H-12 à δ 5,16 (t, J = 3,5 Hz), - le proton en alpha d’un hydroxyle, H-3, à δ 4,49 (dd, J = 7,6 et 8,3 Hz), qui est plus déblindé que dans la β-amyrine. Ce déblindage est caractéristique d’une estérification de l’hydroxyle géminal.

Me-16’ Me-27

H-2’ H-12

H-3

Figure 38 : Spectre 1H de Terp-5 (200 MHz, CDCl3)

Par ailleurs, les déplacements chimiques des méthyles sont perturbés par cette chaîne. Nous avons un méthyle à δ 1,11 (s, Me-27), 2 méthyles à δ 0,95 (sl, Me-25 et Me-24 ou Me26), 5 méthyles à δ 0,85 (sl, Me-23, Me-24 ou Me-26, Me-28 , Me-29 et Me-30), et enfin le méthyle de fin de chaîne du palmitate à δ 0,81 ppm (Me-16’, s, 3H). La présence de cette chaîne est très bien indiquée par le triplet caractéristique H-2’ en α de l’ester bien déblindé (δ 2,27, t, J = 7,5 Hz, 2H) par rapport aux autres CH2 (δ 1,1-2,0, m). En ce qui concerne le spectre 13C, seuls les carbones du cycle A de la β-amyrine sont perturbés par la chaîne palmitoyle (Tableau 22 p 102). L’estérification est caractérisée par le C1’ à 173,5 ppm et le carbone C-3 qui est plus déblindé à 80,6 ppm que dans la β-amyrine.

112

C-12

C-3

C-5

C-16’

C-1’ C-13

Figure 39 : Spectre 13C de Terp-5 (50 MHz, CDCl3)

L’expérience XHCORR a permis de confirmer l’attribution de certains carbones comme par exemple C-2’ (JC2’-H2’). L’attribution des carbones quaternaires C-4, C-8, C-10, C-13, C-14, C-17, C-20 et C-1’ est en accord avec l’acétate de β-amyrine [Mahato 1994]. De plus, ces données de la littérature ont permis également, grâce aux déplacements des carbones méthyliques, d’attribuer les signaux correspondants sur le spectre 1H, CH3-27 à 1,1 ppm, CH325, CH3-24 ou CH3-26 à 0,95 ppm, CH3-16’ à 0,81 ppm et les autres à 0,85 ppm. Sur le spectre COSY 1H-1H, nous observons plusieurs systèmes de spins, H1-H2-H3, H5-H6-H7, H9-H11-H12, H15-H16, H18-H19, H21-H22. Ces corrélations confirment la structure de l’amyrine. Nous voyons aussi les premières corrélations (H2’-H3’-H4’-...) qui appartiennent au grand système de spin que constitue le reste palmitoyle. 21 12

18

1 15

H

CH3(CH2)12CH2CH2COO

3 5

2'

Figure 40 : Corrélations COSY de Terp-5

113

L’hydrolyse alcaline de Terp-5 a conduit à l’obtention de la β-amyrine et de l’acide palmitique (Annexe p 186) isolés et caractérisés par CCM comparative avec des témoins et les techniques spectrales RMN, SM. A la lumière de toutes ces données et par comparaison avec la littérature [Subarnas 1992], nous identifions Terp-5 comme étant le palmitate de β-amyrine. Ce composé majoritaire de l’extrait hexanique est un produit nouveau dans le genre bien qu’assez répandu dans le monde végétal. Il est aussi appelé balanophorine car il a été isolé du Balanophora elongata (Balanophoraceae) par Ultée en 1926. C’est un composé que l’on rencontre souvent dans les plantes à latex [Radt 1940].

VI- Identification de Terp-6 Ce composé très apolaire est isolé sous forme de poudre blanchâtre (10 mg) de l’extrait hexanique. Son comportement CCM rappelle les caractéristiques des triterpénes acylés. Terp-6 présente un maximum d’absorption à λ 236 nm dans le CHCl3. Cette absorbance est révélatrice d’un système diène conjugué [Tallent 1966]. L’ion pseudo-moléculaire à m/z 705 [M+H]+ et l’adduit à m/z 722 [M+NH4]+ sur le spectre DCI conduisent à la formule brute C48H80O3 (9 insaturations ou cycles). Nous rencontrons la perte d’un méthyle à m/z 690 [M-CH3+H]+ ainsi que probablement une déshydratation suivie d’un réarrangement à m/z 685 relative à un produit hydroxylé. Comme pour le palmitate de β-amyrine, nous observons les fragments m/z 409, « g’ » à m/z 218, « a » à m/z 207, « g’-15 » à m/z 203, et enfin « a-18 » et « g’-29 » à m/z 189 qui signent la présence d’une génine de type oléanène [Shiojima 1992].

114

M-Cor+

[M+H]+

C18H31O3+

[M+NH4]+

g’

Figure 41 : Spectre DCI de Terp-6

Les fragments à m/z 409 et 425 de la génine indiquent bien la perte d’une chaîne en C18. Cette chaîne est clivée au niveau de sa jonction avec la génine et conduit aux fragments à m/z 295 (C18H31O3+) et 279 (C18H31O2+) par coupure anté ou post-oxygène. L’α-clivage au niveau des doubles liaisons conduit à deux fragments m/z 167 pour la coupure du côté de la génine et m/z 71 pour celle du côté C-terminale. Ce dernier fragment à m/z 71 (C5H11+) implique une position Cterm de type CH3-(CH2)4-CHR’-R. De plus, on observe que les premiers fragments provenant de clivages successifs des liaisons carbone-carbone du côté Cterminal tels que C2H5+ à C5H11+. a-18 m/z 189

a m/z 207

m/z 409 m/z 279 OH

CH2(CH2)6CO-O m/z 295

CH3-(CH2)3-CH2

m/z = 71

m/z 167

g' m/z 218

g'-15 m/z 203

g'-29 m/z 189

Figure 42 : Fragmentations de Terp-6

115

La démarche et l’analyse des spectres 1H et 13C sont identiques à celles du palmitate de β-amyrine Terp-5. En effet, le spectre 1H a la même allure générale avec, H-12 à 5,16 ppm (t, J = 3,5 Hz, 1H), H-3 à 4,49 ppm (dd, J = 7,6 et 8,2 Hz, 1H) et H-2’ à 2,27 ppm (t, J = 7,3 Hz, 2H). Cependant, des signaux supplémentaires sont observés. Ainsi, entre 6,5 ppm et 5,6 ppm quatre protons éthyléniques révèlent la présence d’un système diénique conjugué sur cette chaîne latérale.

H-2’ H-11’

H-10’ H-12’ H-9’ H-12

H-3

H-13’

Figure 43 : Spectre 1H de Terp-6 (200 MHz, CDCl3)

H-11’ est le plus déblindé à 6,47 ppm (dd, 3J10’-11’ = 11,2 et 3J11’-12’ = 15,1 Hz, 1H). Ce couplage vicinal de 15 Hz est relatif à une configuration E [Stadler 1994]. H-10’ résonne à 5,95 ppm (dd, 3J10’-11’ = 11,1 et 3J10’-9’ = 11,4 Hz, 1H). Ce couplage vicinal de 11 Hz est relatif à une configuration Z [Stadler 1994]. H-12’ est à 5,65 ppm (dd, 3J11’-12’ = 15,2 et 3J12’-13’ = 8,2 Hz, 1H), H-9’ est à 5,48 ppm (dd, 3J9’-10’ = 11,5 et 3J8’-9’ = 7,5 Hz, 1H). Ces données 1H comparées au E, E coriolate de méthyle [Kann 1990] et au 9-hydroxy5(Z),7(E)-tridécadiènoate de méthyle [de Montarby 1988] suggèrent un diène conjugué de configuration Z, E.

116

H-12

H-3 H-11’

H-10’

H-12’

H-9’

H-11’

Figure 44 : Agrandissement du spectre 1H entre 4,0 et 6,7 ppm de Terp-6 (500 MHz, CDCl3) (Rem : à 500 MHz, on aperçoit des signaux indiquant que Terp-6 est en mélange avec d’autres composés !)

Parallèlement à ces protons éthyléniques, nous observons un proton à 4,11 ppm (H-13’, m, 1H) caractéristique d’un proton en alpha d’un hydroxyle. Le spectre COSY révèle un couplage entre ce dernier proton et un des protons du diène conjugué à δ 5,65 (H-12’) et des corrélations successives de H-8’ à H-14’, ce qui confirme l’enchaînement suivant : OH H

H H

H

Ce type de fragment est rencontré dans l’acide coriolique [Stadler 1994]. Le spectre COSY permet de mieux visualiser ces différents couplages ainsi que ceux déjà observés pour les amyrines acylées.

117

H-11’

H-10’ H-12’ H-9’ H-12

H-3

H-13’

H-8 H-11 H-2a H-2b H-14’

H-13’ H-3

H-12 H-9’ H-12’ H-10’ H-11’

Figure 45 : Agrandissement de la COSY de Terp-6 (200 MHz, CDCl3)

En ce qui concerne le spectre

13

C (J modulé), les déplacements chimiques sont

comparables à ceux du dérivé palmitoylé (Tableau 22 p 102). De plus, nous observons les carbones éthyléniques du système conjugué de configuration Z, E, à 135,8, 133,0, 127,7, et 125,8 ppm ainsi que celui du carbone hydroxylé CHOH (C-13’) à 72,9 ppm. Par comparaison, les déplacements chimiques des carbones éthyléniques du E, E coriolate de méthyle résonnent à 135,9, 133,7, 130,9, 129,5 ppm [Kann 1990]. C-13

C-19

C-1’

C-18’ C-13’ C-9’ C-5 C-12’

C-12

C-3

C-9 C-18

Figure 46 : Spectre 13C J modulé de Terp-6 (50 MHz, CDCl3)

118

Carbones

Z, E Z, E E, E # Terp-6 * 1 1 13 1 13 H H C H C 9’ 5,41 5,48 125,8 5,68 129,5° 10’ 6,02 5,95 127,7° 6,01 130,9° 11’ 6,46 6,47 133,0° 6,17 133,7° 12’ 5,69 5,65 135,8 5,57 135,9° 13’ 4,16 4,11 72,9 4,11 72,9° * [Kann 1990] 13-hydroxy-9(E),11(E)-octadecadiènoate de méthyle # [de Montarby 1988] 9-hydroxy-5(Z),7(E)-tridécadiènoate de méthyle ° interchangeable

Les attributions de la β-amyrine acylée comparées à Terp-5 ainsi que la présence d’une chaîne de type acide coriolique [Stadler 1994, Kann 1990, de Montarby 1988] nous permettent d’identifier Terp-6 au coriolate de β-amyrine. Il est, à notre connaissance, isolé pour la première fois du règne végétal : 30

29

12 25

1' 9'

3

26

28

27

COO

Z 13' 11'

E

18'

24

23

OH

VII- Identification de Terp-7 Isolé sous forme de cristaux blancs, ce composé est issu de l’extrait hexanique (6 mg). Très apolaire sur CCM, il possède un Rf comparable à celui des triterpènes acylés comme Terp-5 ou Terp-6. Le spectre de masse en DCI indique l’ion pseudomoléculaire à m/z 665 [M+H]+ qui est le même que Terp-5, d’où une formule brute de C46H80O2. On retrouve les mêmes fragments d’un triterpène acylé comme Terp-5 dont le pic à m/z 409 [M-palm+H]+.

119

Le spectre proton ressemble aussi à celui de Terp-5 avec les signaux du proton éthylénique H-12 à δ 5,11, du proton H-3 à δ 4,48 et le signal caractéristique de la chaîne en alpha de l’ester avec le CH2 à δ 2,27. La différence entre Terp-7 et Terp-5 se trouve dans le spectre 13C (Figure 47). En effet, les carbones de la double liaison C-12 à 124,4 ppm et C-13 à 139,6 ppm sont significatifs d’un noyau de type urs-12-ène (Tableau 21 p 91) [Mahato 1994]. Après comparaison avec les données de la littérature, nous pouvons attribuer tous les carbones de la génine, l’α-amyrine estérifiée et quelques carbones de la chaîne palmitoyle (Tableau 22 p 102).

C-1’

C-13

C-3

C-12

Figure 47 : Spectre 13C J modulé de Terp-7 (50 MHz, CDCl3)

Comparé avec les données de la littérature [Shankaranarayana 1980], Terp-7 est le palmitate d’α-amyrine. Ce composé est nouvellement recensé chez les Leea. Le palmitate d’α-amyrine et de β-amyrine sont souvent rencontrés chez les plantes à latex [Radt 1940].

12

3 1'

C15H31CO-O

Tableau 22 : Récapitulatif des données 13C des triterpènes et de leurs esters (50 MHz, CDCl3)

120

Carbones δ en ppm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 9’ 10’ 11’ 12’ 13’ 14’ 15’ 16’ 17’ 18’

Lupéol

β-amyrine

38,7 27,5 79,0 38,8 55,4 18,4 34,3 40,8 50,5 37,2 21,0 25,2 38,1 42,8 27,5 35,6 43,0 48,4 47,8 151,0 29,7 40,0 28,0 15,4 16,1 16,0 14,5 18,0 109,3 19,4

38,6 27,3 79,0 38,8 55,2 18,4 32,7 39,8 47,7 37,0 23,6 121,7 145,2 41,7 26,2 27,0 32,5 47,3 46,9 31,1 34,8 37,2 28,1 15,6 15,6 16,8 26,0 28,4 33,3 23,7

Palmitate de β-amyrine 38,3 23,5 80,6 37,7 55,3 18,3 32,6 39,8 47,6 36,9 23,6 121,7 145,2 41,7 26,2 26,9 32,5 47,3 46,8 31,1 34,8 37,2 28,1 16,8 15,5 16,8 25,9 28,4 33,3 23,7 173,5 34,8 25,2 29,7

29,6 31,9 22,7 14,1

Coriolate de β-amyrine 38,3 23,5 80,6 37,8 55,3 18,3 32,6 39,8 47,6 36,9 23,6 121,7 145,2 41,7 26,2 27,0 32,5 47,3 46,8 31,1 34,8 37,3 28,1 16,8 15,5 16,8 26,0 28,4 33,3 23,7 173,6 34,8 25,3

125,8 127,7* 133,0* 135,8 72,9

Palmitate d’ α-amyrine 38,5 23,7 80,6 37,8 55,3 18,3 32,9 40,1 47,7 36,8 23,4 124,4 139,8 42,1 29,3 26,6 33,8 59,1 39,6 39,6 31,3 41,6 28,7 16,8 15,7 16,8 23,3 28,1 17,5 21,4 173,6 34,9 25,2 29,7

29,2 31,9 22,7 14,1

22,6 14,0 * interchangeable

121

C- Etude des Flavonoïdes

I- Identification de Flav-1 Composé isolé sous forme de laque jaune (36 mg) de l’extrait à l’acétate d’éthyle. Sur CCM, l’apparence du spot présente toutes les caractéristiques d’un flavonol. En effet, ce composé est très jaune sous UV à 366 nm, révélateur d’un 3-OH libre [Mabry 1970]. Cela est confirmé par le spectre UV qui indique une absorbance à λmax 365 nm pour la bande I dans le MeOH (Tableau 28 p 124). De plus, le déplacement bathochromique de la bande II de 9 nm après l’ajout de NaOAc apporte la preuve d’un hydroxyle libre en 7. L’hydroxyle libre en 4’ est suggéré par le déplacement bathochromique de la bande I de 50 nm qui se décompose rapidement suite au système 3,4’-dihydroxylé [Mabry 1970]. L’ion pseudo-moléculaire à m/z 285 [M-H]- sur le spectre de masse en FAB mode négatif indique une formule brute de C15H10O6 (11 insaturations ou cycles). Le spectre 1H correspond à deux noyaux aromatiques différents (Tableau 26 p 123). Le cycle A avec deux protons aromatiques respectivement à 6,18 ppm (H-6, d, J = 1,9, 1H) et 6,43 (H-8, d, J = 2,0, 1H) ppm. La faible constante de couplage est due à un couplage meta entre ces deux protons. Quant au cycle B, on remarque deux signaux intégrant chacun pour deux protons identiques à 8,03 ppm (H-2’ et H-6’, dd, J = 8,9 et 2,6 Hz, 2H) et à 6,91 ppm (H-3’ et H-5’, dd, J = 8,9 et 2,7 Hz). La grande constante est un couplage ortho alors que la petite correspond à une constante meta. Au-delà de 9 ppm, on observe les protons des hydroxyles. La liaison hydrogène de OH-5 avec la cétone en 4 entraîne un fort déblindage caractéristique localiser à 12,46 ppm.

122

H-3’ H-5’

H-2’ H-6’

H-6 H-8

OH-5

OH

OH

OH-7

Figure 48 : Spectre 1H de Flav-1 (200 MHz, DMSO-d6)

Le spectre 13C montre 13 carbones. Ceci est dû à la symétrie du cycle B. Ainsi C-2’ et C-6’ sont à 129,4 ppm et C-3’ et C-5’ à 115,4 ppm. Les autres CH aromatiques résonnent à 98,1 ppm (C-6) et 93,4 ppm (C-8). Les carbones phénoliques, quaternaires résonnent entre 135 et 165 ppm, la fonction cétonique est à 175,9 ppm (C-4) (Tableau 27 p 123). Ces données sont en accord avec la littérature [Harborne 1982]. Ainsi, nous pouvons identifier Flav-1 comme étant le kaempferol : 4'

HO

OH

O

3 5

OH

OH

O

Flavonoïde très courant, isolé la première fois de Delphinium consolida (Renonculaceae) en 1902, il est déjà connu dans le genre [Umadevi 1991, Bates-Smith 1959].

123

II- Identification de Flav-2 Isolé sous forme de laque jaune (50 mg) de l’extrait à l’acétate d’éthyle, son comportement chromatographique révèle aussi une structure de type flavonol. La bande I du spectre UV, à 369 nm, dans le MeOH indique un flavonol polyhydroxylé. La

décomposition

rapide

après

addition

de

base

est

révélatrice

d’un

système

3,3’,4’-trihydroxylé. D’ailleurs, le retour de bande de 30 nm suite à l’ajout d’HCl dans AlCl3 indique bien le système ortho-dihydroxyl en 3’,4’ [Mabry 1970]. Le spectre de masse en FAB montre l’ion pseudo-moléculaire que ce soit en mode positif à m/z 303 [M+H]+ ou en mode négatif à m/z 301 [M-H]-. Cela correspond à une formule brute de C15H10O7 (11 insaturations ou cycles). Cette structure est vérifiée avec les données du spectres RMN 1H où l’on observe 2 protons aromatiques H-6 (δ 6,17, d, J = 1,6 Hz, 1H) couplant avec une constante meta à H-8 (δ 6,40, d, J = 1,7 Hz, 1H) sur le cycle A, ainsi que 3 protons aromatiques sur le cycle B, H-2’ (δ 7,66, d, J = 1,8 Hz, 1H) qui a un couplage meta avec H-6’ (δ 7,53, dd, J = 8,4 et 2 Hz, 1H), lui-même ayant un couplage ortho avec H-5’ (δ 6,87, d, J = 8,5 Hz, 1H) (Tableau 26 p 123).

124

OH-5 H-6

OH

H-2’

OH

OH-7

OH

H-5’

H-8

H-6’

Figure 49 : Spectre 1H de Flav-2 (200 MHz, DMSO-d6) C-6’

C-5’

C-2’

C-6

C-8

C-7 C-3

C-4’

C-5

C-3’ C-2

C-4 C-9

C-1’ C-10

Figure 50 : Spectre 13C de Flav-2 (50 MHz, DMSO-d6)

125

Tout comme Flav-1, le spectre 13C de Flav-2 est en accord avec la littérature [Harborne 1982, Agrawal 1989], et confirme la structure quercétine. OH 3'

HO

OH

O

3 5

OH

OH

O

Flavonol très commun, la quercétine est déjà connue dans le genre [Umadevi 1991, Bates-Smith 1959].

III- Identification de Flav-3 Issu de l’extrait à l’acétate d’éthyle sous forme de laque jaune (20 mg), son comportement chromatographique laisse supposer un flavonoïde glycosylé. La fluorescence sous UV à 366 nm en violet sombre suggère une position 3 substituée [Mabry 1970]. Le spectre de masse en DCI indique l’ion pseudo-moléculaire à m/z 449 [M+H]+. Ce pic, que l’on retrouve en FAB– à m/z 447 [M-H]– (ou FAB+ à m/z 449 [M+H]+) correspond à un PM de 448, pour une formule brute de C21H20O11 (12 insaturations ou cycles). Après perte d’un désoxyhexose, on obtient le fragment de la génine correspondante c’est-à-dire la quercétine à m/z 303 [M-146+H]+. En DCI, on observe également le pic à m/z 146 relatif au désoxyhexosyl et à son adduit à m/z 164 [M-H2O+NH4]+. L’analyse des spectres UV conduit à un flavonol tétrahydroxylé (Tableau 28 p 124). La bande I à λMeOH = 347,5 nm confirme la fixation d’un glycosyl en position 3. Les différences d’absorbance entre MeOH/NaOAc+H3BO3 et AlCl3/AlCl3+HCl certifient la présence du système 3’,4’-dihydroxylé [Mabry 1970]. Sur le spectre 1H dans le DMSO-d6, on retrouve les données spectrales relatives à la quercétine où l’on observe cependant que le proton H-2’ (δ 7,29 ppm, d, J = 1,9 Hz, 1H) est

126

moins déblindé et se retrouve plus proche de H-6’ (δ 7,24 ppm, dd, J = 8,4 et 2,2 Hz, 1H) (Tableau 26 p 123). OH-7

Rha-6

OH-5 H-2’ H-8 H-6’ H-6 OH OH

H-5’

Rha-1

Rha-4

Rha-5

Rha-3 Rha-2

Figure 51 : Spectre 1H de Flav-3 (200 MHz, DMSO-d6)

Cette perturbation est due à la fixation en 3 d’un glycosyle et, comme attendu, nous n’observons plus le proton de l’hydroxyle en 3. Cette unité osidique est confirmée par son proton anomérique à 5,24 ppm (Rha-1, d, J = 1,1 Hz, 1H), les protons osidiques entre 4 et 3 ppm et un méthyle doublet à 0,81 ppm (Rha-6, d, J = 5,5 Hz, 3H). Les différentes constantes de couplage indiquent qu’il s’agit de l’α-rhamnose (Tableau 26 p 123). Le spectre

13

C confirme, avec ses 21 carbones, le rhamnose et la présence de la

quercétine comme génine (Tableau 27 p 123). Les carbones C-2 et C-4 en alpha du C-3 sont plus déblindés que pour la quercétine, alors que ce dernier est plus blindé, indiquent la fixation en 3 du rhamnose sur une génine de type quercétine.

127

C-2’ C-5’

C-3’

Rha-2 Rha-3

C-4’

Rha-5

C-5 Rha-1 C-7 C-2

C-3

C-6’ C-1’

Rha-4

C-8 C-6 C-10

Rha-6

C-4 C-9

Figure 52 : Spectre 13C de Flav-3 (50 MHz, DMSO-d6)

Ces données spectrales sont en accord avec la littérature [Harborne 1982] et nous permette d’identifier Flav-3 comme étant la quercitrine : OH 3'

HO

OH

O

3

O

5

OH

O

1''

O

OH OH OH

CH3 6''

Ce composé est nouveau dans le genre bien que très répandu dans le règne végétal. C’est le deuxième flavonol glycosylé isolé des Leea après son homologue la myricitrine ou 3O-rhamnosyl-myricétine [Yem Yok Siv 1971]

IV- Identification de Flav-4 Plus polaire que Flav-3, ce composé isolé des extraits à l’acétate d’éthyle, et butanolique a été isolé sous forme de laque jaune (30 mg). Le spot de Flav-4 sur CCM a

128

tendance à « traîner ». Il est aussi violet foncé sous UV à 366 nm, ce qui est significatif d’une substitution en 3. Le spectre de masse haute résolution enregistré avec la technique FAB– sur le pic pseudo-moléculaire à m/z 527 [M-H]– a permis de déterminer la formule moléculaire comme étant C21H20O14S. Le fragment à m/z 447 correspond à la perte d’un groupe sulfate alors que le pic à m/z 300 indique les pertes d’un groupe sulfate et d’une unité desoxyhexosyl (Tableau 29 p 124). Il est bien établi qu’en technique FAB négative, nous observons ces fragmentations typiques des flavonoïdes sulfatés [Barron 1988a].

[M-SO3-Rha-H]-

[M-H]-

[M-SO3-H]-

Figure 53 : Spectre FAB- de Flav-4

L’analyse   des   spectres   UV   de   ce   flavonoïde   conduit   à   un   flavonol   substitué   en   3  [Mabry 1970] (Tableau 28 p 124). L’addition d’HCl entraîne un déplacement bathochromique  de   13   nm   de   la   bande   I   révélateur   d’une   position   3’­O­substituée   par   un   groupe   sulfate  [Barron 1988a, 1988b]. Par ailleurs, le fort effet bathochrome de 50 nm sur la bande I avec la base NaOMe indique clairement que l’hydroxyle en 4’ est libre. L’ajout de H3BO3 après NaOAc ne change rien et montre que la position 3’ est bien substituée [Mabry 1970].

129

Sur le spectre RMN 1H on observe les 5 protons aromatiques relatifs au flavonol tétrasubstitué entre 6 et 8 ppm, ainsi que les protons osidiques de 5,2 à 0,81 ppm avec, entre autres le proton anomérique Rha-1 à δ 5,2 et le groupe méthyle sous forme de doublet à δ 0,80 caractéristiques d’un α-rhamnopyranosyl (Tableau 26 p 123). Ceci est confirmé par l’expérience COSY qui attribue totalement les protons osidiques.

Rha-6

H-2’

Rha-3

H-5’ H-8 H-6

Rha-4 Rha-5

Rha-1

OH-5 H-6’

OH-7

Rha-2

OH-4’

Figure 54 : Spectre 1H de Flav-4 (200 MHz, DMSO-d6)

La présence du sulfate en 3’ influence les protons en ortho et meta, qui sont plus déblindés que dans la quercitrine. Notons qu’il y a aussi absence du signal du OH-3’ et que, par rapport à la quercitrine (Flav-3), les protons aromatiques du cycle A et les protons osidiques ne sont pas influencés. D’ailleurs, les déplacements chimiques en 13C des 6 carbones osidiques sont en accord avec ceux de Flav-3 : 1 carbone anomérique à δ 102,0, 4 carbones osidiques entre δ 71,4 et 70,1 et le méthyle à δ 17,4. Les 15 autres carbones sont comparables à ceux de la génine, avec pour seules différences significatives, les déplacements chimiques des carbones du noyau B (Tableau 27 p 123).

130

Rha-2 C-7

Rha-3

C-2’

C-5

C-1’

C-4’

C-6’ C-3’

C-5’

Rha-5

C-8 Rha-1 C-6

C-2

Rha-6 Rha-4

C-4 C-9

C-3 C-10

Figure 55 : Spectre 13C de Flav-4 (DMSO-d6, 50 MHz)

Ces variations sont connues, et sont attribuées à la présence du groupe sulfate qui provoque un blindage du carbone qui le porte (C-3’) et un déblindage des carbones ortho (C-2’ et C-4’). Cet effet étant moindre pour les carbones en meta (C-1’ et C-5’) [Barron 1986, 1987a et 1988a]. Tableau 23 : Effet de la sulfatation en 3’ Carbones cycle B 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’

∆ = δQuercitrine -δQuercitrine-3’-sulfate -2,3 -5,4 +4,4 -3,3 -1,2 -4,6

Les expériences RMN bidimensionnelles confirment les attributions des spectres 1H et 13

C. Ainsi, l’expérience XHCORR permet d’identifier tous les carbones porteurs de protons.

131

Rha-6

Rha-4, Rha-5 Rha-3 Rha-2 Rha-1

H-6-C-6 H-8-C-8 H-5’-C-5’ H-6’-C-6’ H-2’-C-2’

Figure 56 : Spectre XHCORR de Flav-4 (50 MHz, CD3OD)

L’expérience COLOC quant à elle avec ces couplages longues distances à travers 2 ou 3 liaisons, confirme l’attribution des carbones protonés et des carbones quaternaires, « noyaute » la structure, et surtout, précise la fixation d’un rhamnopyranosyl en position 3 par la tache de corrélation 3JH-1’’-C-3. L’expérience COSY comme nous l’avons dit, présente les trois systèmes de spins bien distincts de la molécule.

132

H-2’ H-6’ H-5’ H-8 H-6 Rha-1

Rha-2 Rha-3 Rha-4 Rha-5

Rha-6

Rha-6

Rha-4 Rha-5 Rha-3 Rha-2

Rha-1

H-6 H-8 H-5’ H-6’ H-2’

Figure 57 : Spectre COSY de Flav-4 (200 MHz, CD3OD)

La comparaison faite avec la quercétine 3-O-glucosyl-3’-sulfate [Sebra 1988] et la quercétine 3’-sulfate [Sebra 1991], toutes deux isolées chez Hypericum elodes (Guttiferae), confirme cette sulfatation en 3’ et permet de caractériser Flav-4 comme étant la quercitrine 3’-sulfate : OSO33'

HO

OH

O

3

O

5

OH

O

1''

O

OH OH OH

CH3 6''

Ce composé est isolé pour la première fois du règne végétal. C’est aussi la première fois que l’on rencontre des flavonoïdes sulfatés dans la famille des Leeaceae [Op de Beck 1998].

133

V- Identification de Flav-5 C’est une laque jaune (20 mg) isolée de l’extrait butanolique et retrouvée également dans l’extrait aqueux. Produit très polaire, il montre sur CCM toutes les caractéristiques d’un flavonoïde sulfaté. Il « traîne » sur CCM et semble sous UV être substitué en 3. De par le pic pseudo-moléculaire en FAB–, à m/z 461 [M-H]–, et comparativement aux spectres obtenus pour le premier flavonoïde sulfaté isolé (Flav-4), nous pouvons envisager la formule brute C15H10O13S2. La présence des deux atomes de soufre est suggérée par deux groupes sulfates qui, génèrent successivement les deux pics à m/z 381 [M-SO3-H]– et m/z 301 [M-2SO3-H]– (Tableau 29 p 124).

[M-SO3-H][M-2SO3-H]-

[M-SO3+Na-2H][M+Na-2H][M-H]-

Figure 58 : Spectre FAB- de Flav-5

Cette filiation est confirmer par une expérience SM/SM où l’on observe la cascade de désulfatation successive. Pour les spectres UV, l’addition des différents réactifs et l’analyse des résultats obtenus permettent de conclure à un flavonol tétrasubstitué [Mabry 1970] (Tableau 28 p 124). Le déplacement bathochromique de 7 nm par l’ajout d’une base faible (NaOAc) montre bien que l’hydroxyle en 7 est libre, alors qu’après l’addition d’une base forte (NaOMe) le déplacement 134

bathochromique de 56 nm indique que l’hydroxyle en 4’ est libre [Mabry 1970]. L’ajout d’HCl conduit à un déplacement bathochromique de 27 nm, significatif d’une substitution en 3 et 3’ par des groupements sulfates [Barron 1987b, 1988b]. Sur le spectre RMN 1H, les 5 protons aromatiques du noyau quercétine sont visibles (Tableau 26 p 123). Les protons H-6 et H-8 ont bien le même déplacement chimique que ceux de la quercétine alors que H-2’ et H-6’ sont déblindés. Cela est dû à la présence des groupes sulfates. H-5’ H-8 H-6

H-6’ H-2’

Figure 59 : Spectre 1H de Flav-5 (200 MHz, DMSO-d6)

De même, sur le spectre 13C, les 15 carbones du noyau quercétine sont identifiables, avec, comme pour Flav-4, des variations provoquées par les groupements sulfates en 3 et 3’.

135

C-1’ C-5’

C-3’

C-4

C-8

C-6’

C-5 C-7

C-6

C-9

C-2’

C-2

C-4’

C-10 C-3

Figure 60 : Spectre 13C de Flav-5 (50 MHz, DMSO-d6)

Tableau 24 : Effet de la sulfatation en 3,3’ Carbones cycle B 2 3 4 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’

∆ = δQuercétine -δQuercétine-3.3’-disulfate -9,0 +6,1 -1,8 -1,2 -1,1 -6,7 +4,5 -4,0 -1,3 -7,0

Ces différentes données spectrales, sont identiques à celle de la quercétine 3,3’-disulfate isolée en mélange avec de la patulétine 3,3’-disulfate chez Flaveria chloraefolia (Compositae) [Barron 1987b], et permettent d’identifier Flav-5 à la quercétine-3,3’-disulfate : OSO33'

HO

OH

O

3

5

OH

OSO3-

O

Ce composé rare est isolé pour la deuxième fois du règne végétal, puisque déjà isolé de Flaveria chloraefolia (Compositae) [Barron 1987b].

136

VI- Identification de Flav-6 Ce composé a été isolé sous forme d’une laque jaune (6 mg) à partir des extraits butanolique et aqueux. Tout comme Flav-5, il s’agit d’un flavonol polysulfaté, celui-ci étant plus polaire. Le pic pseudo-moléculaire en FAB– à m/z 541 [M-H]– conduit à la formule brute C15H10O16S3. Comme précédemment les trois groupes sulfates sont perdus successivement produisant les trois pics caractéristiques à m/z 461 [M-SO3-H]–, 381 [M-2SO3-H]– et 301 [M3SO3-H]– (Tableau 29 p 124). Cette filiation a été également validée par un couplage SM/SM.

[M-3SO3-H]-

[M+2Na-3H][M-2SO3-H]-

[M-SO3+K-2H]-

[M+Na-2H]-

[M+2K-4H][M-SO3-H]-

[M-H]

-

[M+3K-4H]-

Figure 61 : Spectre FAB- de Flav-6

Outre le fait que l’analyse des spectres UV de ce flavonoïde conduise à un flavonol tétrasubstitué [Mabry 1970], et que le déplacement bathochromique de 7 nm après addition de NaOAc montre bien que l’hydroxyle en 7 est libre, c’est la vérification de la trisulfatation qui est prépondérante (Tableau 28 p 124). En effet, l’ajout d’HCl conduit à un fort déplacement bathochromique de 57 nm, celui-ci est caractéristique d’une 3,3’,4’-trisulfatation [Barron 1988b]. Le spectre 1H montre aussi les 5 protons aromatiques de la quercétine. Les protons H-6 et H-8 ont sensiblement le même déplacement chimique que pour la quercétine alors que les 137

protons du noyau B (H-2’, H-5’ et H-6’) sont fortement déblindés par la présence des groupes sulfates tout comme Flav-5 (Tableau 26 p 123). H-6 H-2’

H-8

H-5’

H-6’

Figure 62 : Spectre 1H de Flav-6 (200 MHz, DMSO-d6)

Sur le spectre 13C, les 15 carbones du noyau quercétine sont identifiables (Tableau 27 p 123). Là aussi, les variations sont dues aux trois groupes sulfates en 3, 3’ et 4’, groupements électroattracteurs. Tableau 25 : Effet de la sulfatation en 3,3’,4’ Carbones cycle B 2 3 4 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’

∆ = δQuercétine -δQuercétine-3.3’, 4’-trisulfate -0,8 +6,5 -1,8 -0,1 -1,6 -3,6 +3,3 +2,5 -1,9 -2,6

138

C-5 C-7

C-1’ C-2’

C-9 C-4’

C-4

C-5’ C-3’ C-6’

C-2

C-10

C-6

C-8

C-3

Figure 63 : Spectre 13C de Flav-6 (100 MHz, DMSO-d6)

Ce composé, comparé à la rhamnétine 3,3’,4’-trisulfate issu de la synthèse chimique [Barron 1988c], a permis d’identifier Flav-6 comme étant la quercétine 3,3’,4’-trisulfate : OSO33'

HO

OSO3-

O

3

5

OH

OSO3-

O

Ce composé est isolé pour la première fois du règne végétal. Il est le troisième flavonoïde sulfaté isolé chez Leea.

VII- Identification de Flav-7 Ce composé a été isolé sous forme d’une laque jaune (3 mg) à partir de l’extrait dichlorométhane. Son comportement chromatographique rappelle un flavonol glycosylé comme Flav-3. Le spectre de masse en DCI confirme cette hypothèse. Nous avons en effet en plus du pic pseudomoléculaire à m/z 479 [M+H]+, un fragment dû à une perte d’un groupement desoxyhexosyl à m/z 333 [M-146+H]+. Ce glycosyl est aussi mis en évidence par le pic à m/z 164 [Rha-H2O+NH4]+. 139

L’analyse des spectres UV confirme le squelette de type flavonol hexahydroxylé (Tableau 28 p 124). La bande I à λMeOH à 337 nm confirme comme pour Flav-3, la fixation du glycosyl en position 3. Mais contrairement à celui-ci, l’ajout de base indique que l’hydroxyle en 4’ n’est pas libre. De plus, l’ajout de H3BO3 à NaOAc ne modifie pas le spectre et montre que nous n’avons pas de système ortho-dihydroxyl sur le cycle B [Mabry 1970]. Le spectre RMN 1H dans le DMSO-d6 est comparable une nouvelle fois à Flav-3 avec en plus, un méthoxy à 3,72 ppm (s, 3H, 4’-OMe). Les deux protons du cycle A à δ 6,20 (H-6, d, J=2 Hz) et δ 6,37 (H-8, d, J=2 Hz) sont identiques à ceux de Flav-3 (Tableau 26 p 123). Seuls changent les protons du cycle C. L’apparition du singulet à δ 6,82 (H-2’ et H-6’, 2H) montre la symétrie du cycle B et donc la fixation du méthoxy en position 4’. Notons qu’un méthoxy fixé en 3’ entraîne deux signaux bien distincts pour H-2’ et H-6’ comme dans la larycitrine par exemple [Hoffmann-Bohm 1992]. Le proton anomérique à 5,13 ppm (Rha-1, d, J=1,5 Hz, 1H), les protons osidiques entre 4,1-3,0 ppm et un méthyl doublet à 0,79 (d, J=5,4 Hz, 3H) sont comparables à ceux de Flav-3 et appartiennent à l’α-rhamnose. H-2’ H-6’

4’-OMe

Rha-3 Rha-4 Rha-5

OH-3’ OH-5’

OH-5

H-8 H-6

Rha-2

Rha-6

Rha-1

Figure 64 : Spectre 1H de Flav-7 (300 MHz, DMSO-d6)

OH-5

140

Le spectre 13C obtenu dans CD3OD permet d’attribuer notre produit à une génine myricétine qui a, en position 3, la fixation d’un rhamnose et en position 4’, la présence d’un méthoxy à δ 60,9 ppm [Noreen 1998] (Tableau 27 p 123). Ce déplacement est significatif d’une fixation en 4’ [Agrawal 1989], alors qu’une fixation en 3’ comme pour la larycitrine, aurait entraîné un signal plus blindé vers 56 ppm [Guo 1998]. Nos données spectrales sont comparables avec celles de la littérature (UV [Gabetta 1973, Jay 1978], RMN 1H [Hoffmann-Bohm 1992], RMN 13C [Noreen 1998]) aussi, nous pouvons conclure à l’identification de Flav-7 à la méarnsitrine ou 4’-méthoxy-myricétrine. OH OMe 4'

HO

O OH 3

O OH

O O

OH OH OH

CH3

Ce flavonol glycosylé et méthoxylé est rare dans le monde végétal, et est nouvellement identifié dans la famille Leeaceae. Il a été isolé la première fois de chez  Acacia mearnsii  (Fabaceae) [Mackenzie 1969].

141

Tableau 26 : RMN 1H des flavonoïdes (200 MHz, DMSO-d6) Protons

Kaempferol

Quercétine

Quercitrine

Méarnsitrine

H-6

6,18 d (1,9) 6,43 d (2,0) 8,03 dd (2,6, 8,9) 6,91 dd (2,7, 8,9) 6,9 dd (2,7, 8,9) 8,03 dd (2,6, 8,9) 10,06 12,46 10,73

6,17 d (1,6) 6,40 d (1,7) 7,66 d (1,8)

6,20 d (2,0) 6,38 d (2,0) 7,29 d (1,9)

6,87 d (8,5) 7,53 dd (8.4, 2,0) 9,55 12,46 10,76 9,26 9,30

6,86 d (8,3) 7,24 dd (2,2, 8,4)

H-8 H-2’ H-3’ H-5’ H-6’ OH-3 OH-5 OH-7 OH-3’ OH-4’ Rha-1

9,33

Rha-2 Rha-3 Rha-4 Rha-5 Rha-6

12,64 10,83 9,29 9,66 5,24 d (1,1) 3,96 sl 3,50 dd (3,1, 8,6) 3,29-3,21 nd 3,21-3,08 nd 0,81 d (5,5)

4’-OMe

6,20 d (2,0) 6,37 d (2,1) 6,82 s

Quercitrine -3’-sulfate 6,20 d (2,1) 6,39 d (2,0) 7,76 d (2,0)

Quercétine -3,3’-disulfate 6,16 d (2,1) 6,39 d (2,1) 7,85 d (2,1)

Quercétine -3,3’,4’-trisulfate 6,16 d (2,0) 6,33 d (2,0) 8,12 d (2,2)

6,82 s

6,96 d (8,1) 7,52 dd (2,3, 8,5)

6,87 d (8,7) 8,04 dd (2,3, 8,6)

7,59 d (8,9) 8,03 dd (2,2, 8,9)

12,56

12,59 10,83

9,46 5,13 d (1,5) 3,98 sl 3,5-3,0 nd 3,5-3,0 nd 3,5-3,0 nd 0,79 d (5,4) 3,72 s

9,62 5,20 sl 3,98 sl 3,55 m 3,1 nd 3,0-3,3 nd 0,80 d (5,7)

Tableau 27 : RMN 13C des flavonoïdes (50 MHz, DMSO-d6) Carbones

Kaempferol

Quercétine

Quercitrine

2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ Rha-1 Rha-2 Rha-3 Rha-4 Rha-5 Rha-6 4’-OMe

146,8 135,6 175,9 160,7 98,1 163,8 93,4 156,1 103,0 121,6 129,4 115,4 159,1 115,4 129,4

146,7 138,6 175,8 160,7 98,1 163,6 93,3 156,1 102,9 121,9 114,9 145,0 147,8 115,5 119,9

156,4 134,2 177,7 161,2 98,6 164,1 93,6 157,2 104,0 120,7 115,4 145,1 148,4 115,8 121,0 101,8 70,3 70,5 71,1 70,0 17,4

Méarnsitrine * 160,0 136,7 179,6 nd 100,0 166,2 94,9 158,7 nd 127,1 109,8 151,9 139,4 151,9 109,8 103,7 71,9° 72,1° 73,3 72,1° 17,8 60,9

Quercitrine -3’-sulfate 156,4 134,5 177,6 156,7 98,7 164,2 93,6 161,2 104,1 123,0 120,8 140,7 151,7 117,0 125,6 102,0 70,1 70,6 71,4 70,1 17,4

Quercétine -3,3’-disulfate 155,7 132,5 177,6 161,2 98,4 163,9 93,3 156,0 104,1 123,0 121,6 140,5 151,8 116,8 126,9

Quercétine -3,3’,4’-trisulfate 147,5 132,1 177,6 160,2 97,3 162,8 92,0 154,8 103,0 123,5 118,5 141,7 145,3 117,4 122,5

* dans CD3OD, ° interchangeable

142

Tableau 28 : UV des flavonoïdes avec λmax dans MeOH Flavonols

bande

MeOH

Kaempferol

II I

265 365

Quercétine

II I

255 369

Quercitrine

II I II I II I II I II I

255 347,5 263 337,5 265 342 268 342 268 311

Méarnsitrine Quercitrine -3’-sulfate Quercétine -3,3’-disulfate Quercétine -3,3’,4’-trisulfate

+NaOAc

+NaOAc +NaOMe +AlCl3 +AlCl3 +H3BO3 +HCl 274 269 278 268 268,5 302,5, 389 375 415 352, 427 350,5, 427 déc 267,5 259 252 271 268 322,5, 389,5 386 325 339, 456 365, 429 déc déc 270,5 259,5 269,5 273,5 270 369 365 388,5 383, 429,5 399,5 271,5 264 272 272,5 273 360 330 361 300s, 337, 391 338,5, 389 268 269 272 273 274 344 342 324, 392 357, 395 341, 389,5 275 268 275 276 277 307s, 387 349 328s, 398 308s, 364, 396s 349, 395s 275 268 276 279 277 356 313 360 307s, 389 337

+HCl -

255 350 256 355 255 369 325 368

déc=décomposition

Tableau 29 : SM des flavonoïdes en FAB (mode négatif, matrice glycérol) Composés Kaempferol Fragments 285 [M-H]–

Quercétine

Quercitrine

301

447

[M-SO3-H]– [M-2SO3-H]– [M-3SO3-H]–

Quercitrine -3’-sulfate 527

Quercétine -3,3’-disulfate 461

Quercétine -3,3’,4’-trisulfate 541

447

381 301

461 381 301

[M+K-2H]– [M+2K-3H]– [M+3K-4H]–

499

[M+Na-2H]– [M+2Na-3H]–

483

[M-Rha-H]– [M-SO3-Rha-H]– [M-SO3+K-2H]– [M-SO3+Na-2H]–

617 655 563 585

301 300 499 403

143

C- Etude de composés divers

I- Identification de Ac Ph-1 Ce composé a été isolé dans l’extrait à l’acétate d’éthyle sous forme d’aiguilles blanches. Sur CCM, après pulvérisation à l’acide, il développe une coloration bleue qui vire au violet. En DCI, l’adduit à m/z 188 [M+NH4]+ et le pic pseudo-moléculaire à m/z 171 [M+H]+ permettent de déduire un PM de 170 et par conséquent une formule brute de C7H6O5 (5 insaturations ou cycles). On retrouve aussi un pic dû la perte d’un hydroxyle à m/z 153 [MH2O+H]. Les absorbances UV à λ 271,5 et 215 nm sont significatives de l’acide gallique [Ribéreau-Gayon 1968]. Le spectre 1H révèle un seul singulet aromatique à 7,05 ppm (H-2 et H-5, s), révélateur de la symétrie de la molécule. Cette même symétrie entraîne sur le spectre 13C, l’apparition de 5 carbones seulement, dont la fonction acide libre à δ 170,4 (C-1’) et 4 carbones aromatiques à δ 146,4 (C-3 et C-5), δ 139,6 (C-4), à δ 122,0 (C-1, Q) et à δ 110,3 (C-2 et C-6, 2 CH). C-2 C-6

C-3 C-5 C-1’

C-1 C-4

Figure 65 : Spectre 13C de AC Ph-1 (50 MHz, CD3OD)

144

Ces données sont en accord avec la littérature [Aldrich 1993], et nous permettent d’identifier Ac Ph-1 à l’acide gallique : 1'

COOH 1

HO

4

OH

OH

Composé très courant, il est déjà répertorié dans le genre [Umadevi 1991, Bates-Smith 1959, Yem Yok Siv 1971, Hegnauer 1990].

II- Identification de Ac Ph-2 Isolé de l’extrait au dichlorométhane, sous forme d’aiguilles brunâtres, ce composé réagit sur CCM comme Ac Ph-1 tout en étant moins polaire. La formule brute de C9H10O5 est suggérée par l’ion moléculaire à m/z 198 [M]+ en EI (5 insaturations ou cycles). Le pic à m/z 170 est obtenu après la perte d’un radical éthoxy (C2H5+). Celui à m/z 153 correspond à la perte du groupe ester COOEt. Les absorbances UV à λ 273,5 et 215,5 nm rappellent celles rencontrées pour l’acide gallique. Par ailleurs, en plus du singulet aromatique caractéristique à δ 7,01 (H-2 et H-6, s, 2H), on retrouve sur le spectre 1H, le système classique d’un groupe éthoxy : un quadruplet à δ 4,24 (H-2’, q, J = 7 Hz, 2H) et un triplet à δ 1,31 (H-3’, t, J = 7 Hz, 3H).

145

H-2 H-6

H-3’

H-2’

Figure 66 : Spectre 1H de Ac Ph-2 (200 MHz, CD3OD)

Sur le spectre

13

C, hormis les signaux phénoliques du gallate (Tableau 30), nous

n’observons plus de fonction acide libre (170 ppm), mais plutôt un carbone caractéristique d’une fonction ester à δ 168,6 (C-1’) et les deux carbones de la chaîne éthoxy à δ 61,7 (C-2’) et δ 14,6 (C-3’). Ces données confirment que Ac Ph-2 est le gallate d’éthyle : 1'

COOCH2CH3 1

HO

4

OH

OH

Ce composé est nouveau dans le genre. Tableau 30 : Données RMN des acides phénols (200/50 MHz, CD3OD) Positions

1 2, 6 3, 5 4, 1’ 2’ 3’

Acide gallique Carbones Protons δ ppm δ ppm 122,0 110,3 7,05, s 146,4 139,6 170,4

Gallate d’éthyle Carbones Protons δ ppm δ ppm 121,8 110,0 7,01, s 146,5 139,7 168,6 61,7 4,24, q J = 7 Hz 14,6 1,31, t, J = 7 Hz

146

III- Identification de AG-1 Isolé sous forme d’huile blanche (50 mg), AG-1 est issu de l’extrait au dichlorométhane. Le spectre EI présente le pic moléculaire à m/z 256 [M]+ confirmant la formule brute C16H32O2 (1 insaturation ou cycle). On observe une cascade de coupures radicalaires dues à des pertes successives de 14 uma correspondant à un CH2 comme C3H7+, C4H9+, C5H11+, etc. Cela confirme par ailleurs la structure linéaire d’une chaîne grasse [McLafferty 1980].

[M]+

Figure 67 : Spectre EI de AG-1

Cette chaîne est de nouveau mise en évidence par l’allure générale du spectre 1H, où seuls les protons en alpha de la fonction acide à δ 2,33 (H-2, t, J = 7,3 Hz, 2H) sont bien distincts. Puis le groupe des CH2 et le méthyle de fin de chaîne sont observés respectivement entre 1,7-1,0 ppm et à δ 0,86 (H-16, t, J = 7 Hz, 3H).

147

Cette chaîne aliphatique entraîne une mauvaise résolution du spectre 13C, où les signaux de la plupart des carbones se trouvent concentrés entre 29,7 et 29,1 ppm. Néanmoins, le carbone quaternaire de la fonction acide résonne à δ 175,6 (C-1) ppm, le méthyle à δ 14,1 (C16), le CH2 en alpha de la fonction acide à δ 33,7 (C-2) et celui en alpha du méthyle à δ 24,7 (C-15). Ce composé, AG-1 est l’acide palmitique : OH

1 16

O

Cet acide gras fait partie des constituants les plus majoritaires obtenus par hydrodistillation.

148

Chapitre IV - Activités Biologiques Pour compléter l’étude phytochimique de L. guineensis, il semblait intéressant de pouvoir vérifier les données ethnopharmacologiques qui lui sont attribuées dans les domaines cardiovasculaire et anti-inflammatoire, afin d’apporter des éléments pour confirmer l’usage de la plante en médecine traditionnelle. Ainsi, nous avons eu l’opportunité de rechercher notamment, après une étude de cytotoxicité, une éventuelle activité anti-inflammatoire sur les kératinocytes. Précisons qu’il s’agit ici de résultats préliminaires.

A Evaluation des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la viabilité cellulaire

I Introduction L’effet d’un composé sur la viabilité cellulaire peut être étudié in vitro sur culture cellulaire à l’aide de plusieurs techniques comme l’inclusion de colorants vitaux ou la métabolisation de réactifs par les cellules vivantes. Parmi ces méthodes, nous avons employé la technique de métabolisation d’un sel de tétrazolium, le XTT. Le principe du test est basé sur la transformation enzymatique du XTT, en un produit coloré, le formazan. Le XTT est réduit par les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes en présence d’un agent couplant d’électrons, le coenzyme Q, en un composé hydrosoluble jaune/orangé, le formazan, dosable par spectrométrie à 450 nm. NO2 SO3 NO2

H N C O

H3CO N N N N H3CO

XTT

H3CO

SO3

SO3 NO2

Transformation par les cellules viables

NH N H N C C N N O H3CO

SO3 NO2

Formazan

Figure 68 : Métabolisation du XTT en formazan

149

Nous nous sommes proposés de tester les extraits EtOAc, BuOH et H2O à l’aide du test du XTT, sur une microplaque, afin d’estimer la population cellulaire vivante, après l’application durant 48 heures de diverses concentrations de produit.

II Résultats La métabolisation du XTT exprimée par la Densité Optique (DO) du formazan de chaque puits, est proportionnelle à la population cellulaire vivante. Le pourcentage de variation de DO du lot traité par les extraits, retrace les modifications de la population cellulaire, par rapport à la population cellulaire témoin. Le pourcentage de variation par rapport à la population témoin est ainsi calculé : DO témoin - DO traité X 100 DO témoin Tableau 31 : Taux de viabilité des kératinocytes en culture après 48H d’incubation avec les extraits

Viabilité cellulaire Concentrations Extrait Extrait EtOAc BuOH

Extrait H2 O

0,01 µg/ml

5,65

8,19

0,22

0,1 µg/ml

2,71

2,34

-1,07

1 µg/ml

-4,43

-2,95

-0,60

10 µg/ml

-32,39

-21,94

-10,38

100 µg/ml

-75,58

-61,19

-28,86

150

% d’activité

100 µg/ml

10 µg/ml

1 µg/ml

0.1 µg/ml

0.01 µg/ml

100 µg/ml

10 µg/ml

1 µg/ml

0.1 µg/ml

0.01 µg/ml

100 µg/ml

10 µg/ml

1 µg/ml

0.1 µg/ml

0.01 µg/ml

20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70 -80

EtOAc

BuOH

H2O

Figure 69 : Activité des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la viabilité des kératinocytes humains SVK14 en culture pendant 48H

III Conclusion

Les résultats relatifs à l’activité des trois extraits sont comparables. L’étude de la viabilité cellulaire effectuée sur les extraits EtOAc, BuOH et H2O révèle une activité prolifératrice très faible des kératinocytes humains SVK 14 aux concentrations de 0,01 à 1 µg/ml. Par contre, à 10 et 100 µg/ml, les extraits présentent une cytotoxicité. Cette évaluation de la viabilité des cellules est indispensable à toute étude ultérieure. Il est en effet nécessaire de connaître les concentrations cytotoxiques des échantillons, afin de travailler en dessous de ce seuil pour évaluer d’autres propriétés. De plus cette étude pourrait, en transposant la méthode sur des cellules tumorales, être la première étape vers la recherche de principes cytotoxiques [Scudiero 1988].

151

B Activité du palmitate de β-amyrine et des extraits EtOAc, BuOH, H2O sur la production de prostaglandines 6KF1α.

I Introduction Le kératinocyte est la cellule la plus représentée au niveau de l'épiderme. En réponse à de nombreux facteurs extracellulaires présents dans son environnement, il libère divers médiateurs biologiquement actifs, notamment les prostaglandines et les leucotriènes qui jouent un rôle important dans l'initiation et la modulation des réactions inflammatoires cutanées, et qui interviennent également dans la régulation de la réponse immune. Le kératinocyte se révèle être un bon modèle d'étude en pharmacologie cutanée ; ce modèle cellulaire permet de déterminer, in vitro, les capacités de diverses molécules à moduler la production de ces médiateurs issus du métabolisme de l'acide arachidonique. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à une prostaglandine particulière, la PG6KF1α qui est un des métabolites majeurs produits par le kératinocyte stimulé, et représentatif de la modulation de la production des métabolites de l'acide arachidonique issus de la voie de la cyclo-oxygénase. Nous avons ainsi évalué l'activité de trois extraits et d’un composé purifié majoritaire de l’extrait hexanique : -

l’extrait acétate d’éthyle

-

l’extrait butanolique

-

l’extrait aqueux

-

le palmitate de β-amyrine,

sur la production de PG6KF1α induite chez le kératinocyte par un stimulant de la cascade de l'acide arachidonique, l’ionophore calcique A23187.

152

II Résultats Les résultats sont exprimés en picogrammes de prostaglandine 6KF1α pour 1x106 kératinocytes et par ml de culture. L'analyse statistique des résultats est réalisée par une analyse de variance et par le test de Dunnett. Tableau 32 : Production de prostaglandines 6KF1α après 5 heures de culture avec le palmitate de β-amyrine TRAITEMENTS

pg PG6KF1α / 1x106 kératinocytes/ml 32 + 4 182 + 25 130 + 5 ***

% Activité/ A23187

Témoin n =3 A23187 5µM n =3 n =3 -28% Palmitate de β-amyrine 10µg/ml +A23187 5µM n =3 116 + 7 *** -36% Palmitate de β-amyrine 50µg/ml +A23187 5µM 96 + 3 *** -47% Palmitate de β-amyrine 100µg/ml n =3 +A23187 5µM *** = Valeurs significativement différentes, au seuil 0,05, du témoin A23187.

Tableau 33 : Production de prostaglandines 6KF1α après 5 heures de culture TRAITEMENTS

pg PG6KF1α / 1x106 kératinocytes/ml 33 + 5 138 + 6

% Activité/ A23187

Témoin n=3 A23187 5µM n=3 Extrait EtOAc 0,1 µg/ml n=3 -10% +A23187 5µM 125 + 8 Extrait EtOAc 1 µg/ml n=3 +A23187 5µM 162 + 19 17% Extrait EtOAc 5 µg/ml n=3 +A23187 5µM 168 + 7*** 22% Extrait BuOH 0,1 µg/ml n=3 +A23187 5µM 138 + 16 0% Extrait BuOH 1 µg/ml n=3 +A23187 5µM 151 + 4*** 9% Extrait BuOH 5 µg/ml n=3 +A23187 5µM 163 + 22 18% Extrait H2O 0,1 µg/ml n=3 +A23187 5µM 138 + 12 0% Extrait H2O 1 µg/ml n=3 +A23187 5µM 137 + 8 -1% Extrait H2O 5 µg/ml n=3 +A23187 5µM 137 + 14 -2% *** = Valeurs significativement différentes, au seuil 0,05, du témoin A23187.

153

Pg PG6KF1α/.106 kératinocytes/ml

A23187 5 µM

Témoin

10 µg/ml

100 µg/ml

50 µg/ml

Palmitate de β-amyrine Figure 70 : Activité du palmitate de β-amyrine sur la production de prostaglandine 6KPGF1α par les kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique 5 µM.

Pg PG6KF1α/.106 kératinocytes/ml

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 5 µg/ml

1 µg/ml

BuOH

0.1 µg/ml

5 µg/ml

1 µg/ml

0.1 µg/ml

5 µg/ml

1 µg/ml

0.1 µg/ml

A23187 5 µM

Témoin

EtOAc

H2O

Figure 71 : Activité des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la production de prostaglandine 6KPGF1α par les kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique 5 µM.

154

III Conclusion

Cette étude in vitro de la modulation de la libération de la prostaglandine 6KF1α par les kératinocytes stimulés, après exposition à chacun des 3 extraits et du palmitate de βamyrine, à des concentrations non cytotoxiques, montre que : - Les extraits EtOAc, BuOH et H2O ne présentent pas d’activité anti-inflammatoire significative sur ce modèle. Ce problème peut être dû à une concentration trop faible d’extraits testés, mais nous ne pouvons pas, comme nous l’avons vu, aller au-delà sans induire une cytotoxicité. Ce résultat peut paraître même étonnant quand on connaît les vertus anti-inflammatoires de la plante. L’activité soupçonnée pourrait utiliser un autre mécanisme, pour cela, il conviendrait d’envisager un modèle anti-inflammatoire plus global. - Le palmitate de β-amyrine présente une activité inhibitrice significative de la production de PG6KF1α ; cette activité est dose-dépendante : 28%, 36% et 47% d’inhibition à 10, 50 et 100 µg/ml respectivement ; soit une activité inhibitrice de 47% à 150 µM. Dans les mêmes conditions expérimentales, l’hydrocortisone présente 45% d’inhibition à 7,5 µ M. De plus, il est intéressant de remarquer que le palmitate de β-amyrine inhibe la libération de prostaglandines contrairement au palmitate d’α-amyrine, qui, lui, n’a pas d’activité anti-cyclooxygénase mais a une activité sur les collagénases et sur la prolifération des fibroblastes [Kweifio-Okai 1994b]. Il est d’ailleurs utilisé comme antiarthritique [Kweifio-Okai 1994a]. Cette activité sur les collagénases mérite d’être rechercher pour le palmitate de βamyrine.

155

C Activité du palmitate de β-amyrine sur l’expression de l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1

I Introduction Les métalloprotéinases (MMPs) sont des enzymes impliquées dans tout processus normal ou pathologique de remodelage de la matrice extracellulaire. Leurs principales fonctions concernent leur capacité à dégrader les composants de la matrice. Elles permettent aussi le détachement des cellules de leur support, la libération et l’activation de cytokines inflammatoires et de facteurs de croissance. Les métalloprotéinases de la matrice sont classées selon la nature de la matrice extracellulaire qu’elles dégradent, en collagénases, gélatinases ou stromélysines. Les collagènes fibrillaires sont dégradés, entre autres, par la collagénase interstitielle exprimée par les fibroblastes dermiques et sécrétés dans la matrice extracellulaire du derme. Dans le système cutané, l’expression basale des MMPs est relativement faible mais, est, par contre, induite à la suite d’exposition à divers stimuli comme certaines cytokines, certains facteurs de croissance (IL1, IL6, TNFα) ou une exposition UV. Dans la présente étude, nous avons suivi, par la technique de Reverse TranscriptasePolymerase Chain Reaction (RT-PCR) semi-quantitative, l’expression de l’ARN messager de la collagénase MMP-1, dans un modèle cellulaire in vitro de fibroblastes humains normaux, soumis à une stimulation inflammatoire chimique, au "Phorbol Meristate Acetate" (PMA). Nous avons montré précédemment que le palmitate de β-amyrine, présente une activité anti-inflammatoire significative, en régulant le métabolisme de l’acide arachidonique. Dans cette étude, nous avons évalué le pouvoir inhibiteur du palmitate de β-amyrine, sur l’induction de l’ARN messager de MMP-1, suite à une stimulation inflammatoire.

156

II Résultats

Figure 72 : Effet du palmitate de β-amyrine sur l’expression de l’ARNm de la MMP1 à la suite d’une stimulation inflammatoire

Les différents taux d’expression des ARNm de la MMP-1 selon les traitements, sont représentés sur la figure ci-dessus. Il s’agit d’une observation semi-quantitative. Le niveau basal d’expression de l’ARNm de la MMP-1 est relativement faible. Sous stimulation inflammatoire au PMA, nous pouvons observer une induction du taux d’ARNm. Dans ces conditions expérimentales de préincubation de 24 heures, le palmitate de βamyrine ne présente aucun effet.

III Conclusion Cette étude in vitro montre que le palmitate de β-amyrine ne semble pas agir significativement sur l’expression de l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1 à la suite d’une stimulation inflammatoire.

157

D Activité antiradicalaire des extraits EtOAc, BuOH et H2O et des composés phénoliques

I Introduction Les radicaux libres sont présents dans le monde vivant, où ils sont associés au métabolisme de l’oxygène et aux réactions d’oxydoréduction. En général, les radicaux sont piégés par des systèmes enzymatiques tels que superoxyde dismutase, catalase ou glutathion peroxidase.

O2 + O2 + 2H Superoxyde dismutase H2O2 + O2 H2O2 + H2O2

Catalase

H2O2 + GSH

Glutathion peroxidase 2 H O + GSSG 2

2 H 2 O + O2

Figure 73 : Principales réactions dans l’organisme

Des antioxydants non enzymatiques interviennent aussi dans la défense antiradicalaire comme la vitamine E, la vitamine C, la vitamine A ou le glutathion. Mais au cours du vieillissement, par suite d’une diminution de l’activité enzymatique, ou d’une production radicalaire exagérée par les rayonnements UV, les radiations ionisantes, les phénomènes de pollution, ou lors de situations pathologiques comme les ischémies, les cancers ou les inflammations, les systèmes de défenses de l’organisme contre le stress oxydatif sont débordés, ce qui entraîne les effets toxiques. Nous nous sommes proposés d’évaluer le pouvoir antiradicalaire de nos extraits et de composés polyphénoliques isolés. Pour cela, nous avons utilisé la méthode utilisant le DPPH (2-2-diphényl-1-picrylhydrazyl). C’est un test colorimétrique très utilisé [Blois 1958]. Le DPPH est un radical stable qui présente une absorbance caractéristique entre 500 et 560 nm (violet). Cette couleur violette, disparaît rapidement quand le DPPH rencontre un piégeur de radicaux libres et devient alors jaune.

158

O2N N

N NO2

O2N

Structure du DPPH

II Résultats L’activité antiradicalaire est exprimée par le pourcentage de DPPH dégradé. Celle-ci est évaluée par comparaison de la Densité Optique (DO) de l’échantillon avec celle de l’échantillon standard mesurée dans le MeOH : % de dégradation du DPPH =DO témoin - DO échantillon X 100 DO témoin

Tableau 34 : Pourcentage de dégradation du DPPH par les composés testés en microplaque 96 puits :

Composés Trolox (témoin positif) Kaempferol Quercétine Quercitrine Quercitrine 3’-sulfate Quercétine 3,3’-disulfate Quercétine 3,3’,4’-trisulfate Acide gallique Gallate d’éthyle

CI50 (µM) 100 120 49 88 >>200 >>200 150 35 67

2 µM 0 0 0 0 0 1 4 0

Concentrations 10 µM 50 µM 100 µM 0 7 7 0 0 2 16 7

19 51 29 0 0 20 67 39

41 91 57 2 2 30 90 72

200 µM 90 94 84 6 10 70 92 92

159

80

75

70

74 69

67

Rutine

% de dégradation du DPPH

60

Extrait EtOAc Extrait BuOH Extrait H2O

50

Acide gallique 40

30 20

20

10

0 Echantillons testés à 20mg/L

% de dégradation du DPPH

Figure 74 : Activité antiradicalaire des différents extraits à 20 mg/ml

Tro lox

100

Trolox Kaempferol

75

Quercétine Quercitrine Quercitrine 3'-sulfate

50

Quercétine 3,3'-disulfate Quercétine 3,3',4'-trisulfate

25

Acide gallique 0

Gallate d'éthyle 0

50

100

150

200

250

Concentration (µM)

Figure 75 : Activité antiradicalaire des composés isolés

160

La majorité des composés sont plus actifs que le Trolox. Le kaempferol, avec un hydroxyl en 4’ sur le cycle B, est moins actif que le Trolox alors qu’un système ortho-dihydroxyl sur le cycle B (la quercétine), permet une meilleure activité antiradicalaire. Mais la glycosylation sur la position 3 diminue cet effet (la quercitrine), et l’annule quand on perturbe le système ortho-dihydroxyl 3’,4’ (quercitrine 3’-sulfate, quercétine 3,3’-disulfate, quercétine 3,3’,4’-trisulfate). Notons que l’on retrouve une légère activité avec le flavonoïde trisulfaté. L’activité observée est un artefact. En effet, l’analyse sur CCM montre que le dérivé trisulfaté s’est hydrolysé en partie en quercétine. On retrouve donc le système ortho-dihydroxyl sur le cycle B responsable de cette activité. Cela tend donc à montrer que la présence du système ortho-dihydroxyl sur le cycle B et l’hydroxyle libre en 3 sont nécessaires pour avoir une forte activité antiradicalaire. Quant aux acides phénoliques, c’est l’acide gallique qui est le plus actif. La présence de la chaîne éthoxy dans le gallate d’éthyle réduit de moitié son activité antiradicalaire.

III Conclusion

L’étude montre que les trois extraits EtOAc, BuOH, H2O ont une activité antiradicalaire. Hormis les flavonoïdes sulfatés, cette activité se retrouve dans la plupart des composés isolés de ces mêmes extraits. Ainsi, l’acide gallique, la quercétine, le gallate d’éthyle, la quercitrine et le kaempferol ont une activité antiradicalaire. Cette activité est à rapprocher d’une éventuelle activité anti­inflammatoire. En effet,  l’activité   antiradicalaire, en  piégeant   les  radicaux  libres,  est  fortement   impliquée  dans  les  processus   anti­inflammatoires   au   même   titre   que   les   inhibitions   enzymatiques   des  lixopygénases,   des   cyclooxygénases   ou   de   la   xanthine   oxydase   par   exemple. Rappelons d’ailleurs que la xanthine oxydase qui génère des radicaux O2­, est inhibée par les flavonoïdes  sulfatés non actifs ici [Yagi 1994].

161

Discussion

162

DISCUSSION

Deux méthodes ont été utilisées pour l’étude phytochimique de Leea guineensis G. Don (Leeaceae). La première est l’hydrodistillation. Elle a permis d’identifier 47 composés des distillats de feuilles, et 43 composés des distillats de bois, ainsi que 4 acides gras, soit au total 73 composés. Nous avons montré que la classe la plus représentative des distillats de bois et de feuilles était celle des hydrocarbures (60% et 45 % respectivement) essentiellement dû au fort taux d’acides gras et d’esters. Pour les feuilles, la fraction la plus importante est tout de même celle des terpénoïdes (54%), où l’on rencontre un composé peu commun : le vitispirane. La seconde a consisté en l’extraction et en l’isolement des composés à partir des extraits héxanique, dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanolique et aqueux des feuilles. Elle a conduit après fractionnement sur différents supports chromatographiques à l’isolement de 17 composés qui se répartissent dans quatre classes que sont : les terpènoïdes (7), les flavonoïdes (7), les acides phénols (2) et les acides gras (1). Si un bon nombre de ces composés identifiés sont connus (kaempferol, quercétine, quercitrine, acide gallique, E-phytol, squalène, lupéol, β-amyrine), ceux-ci, du point de vue chimiotaxonomique, sont intéressants.

Chimiotaxonomie Quatre composés sont déjà connus chez les Rhamnaceae et les Vitaceae. Il s’agit du kaempferol, de la quercétine, de la quercitrine et de l’acide gallique. Le rapprochement des Leeaceae des Vitaceae semble justifier par l’existence de composés rares comme le vitispirane, provenant de l’hydrodistillation, et de raphides (oxalate de calcium). Quant à la distinction entre les Leeaceae et les Vitaceae, celle-ci pourrait s’expliquer par le fait que l’on retrouve chez les Leeaceae à la fois des triterpènes à noyaux lupanes, oléananes et ursanes et qu’ils peuvent être acylés. A notre connaissance, il n’est pas répertorié de noyau lupane chez les Vitaceae, ni de triterpène acylé. Les Rhamnaceae produisent pour leur part, des triterpènes majoritairement à noyaux lupanes et dammaranes [Hegnauer 1973]. La présence de flavonoïdes sulfatés est aussi un argument en faveur de la séparation actuelle des Leeaceae des Vitaceae, (même si, nous l’avons vu, leur répartition fait plus référence à la nature du biotope). 163

Pour répondre à cette hypothèse, une étude plus vaste, sur d’autres Leea d’Asie et d’Afrique semble indispensable. Elle permettrait de savoir si la famille possède ou non des flavonoïdes sulfatés, et si c’est le cas, on pourra peut-être parler de traceur chimiotaxonomique spécifique pour les Leeaceae. Tableau 35 : Différents composés rencontrés chez les Rhamnales Composés Acide gallique Kaempferol Quercétine Quercitrine α et β-amyrine Lupéol Vitispirane Triterpènes acylés Flavonoïdes sulfatés Oxalate de calcium

Leeaceae

Vitaceae

Rhamnaceae

Intérêt biologique des composés isolés Il nous paraît intéressant de recenser les activités des composés isolés au travers des publications de ces dernières années. Ceci pour deux raisons. La première permet en connaissant les activités biologiques des composés de comprendre les différentes utilisations de la plante en médecine traditionnelle. La seconde est de montrer que de petites biomolécules peuvent être douées de propriétés intéressantes (acide gallique par exemple). Il serait certes prématuré de relier les activités potentielles des extraits ou des métabolites purifiés à l’utilisation traditionnelle de Leea guineensis, mais bon nombre de ces composés ont des activités qui recoupent le champ d’application de cette plante en ethnopharmacologie, notamment dans les domaines anti-inflammatoire ou cardiovasculaire.

164

Tableau 36 : Liste des terpénoïdes et de leurs propriétés biologiques Composés E-phytol

Squalène

Lupéol

β-amyrine Palmitate de β-amyrine Palmitate d’α-amyrine Mélange de palmitate d’α et de β-amyrine Coriolate de β-amyrine

Nouveau dans Famille

Propriétés biologiques

Règne végétal

Antibactérienne [Rajab 1988] Anti-inflammatoire [Shimizu 1994] Antispasmodique [Pongprayon 1992] Hypolipémiante [Watanabe 1983] Antibactérienne, Antitumorale, Immunostimulante [Harborne 1999] Chimiopréventive (cancers du colon) [Rao 1998] Cytotoxique pour les cellules tumorales Hep­G2, A­431 et H­ 411E par inhibition de la topoisomérase II [Moriarity 1998] Antitumorale contre le carcinome de Walker, Antihypoglycémiante, Hypotensive [Harborne 1999] Inhibiteur de la protéine kinase [Hasmeda 1999] Anti-inflammatoire [Geetha 1998, Akihisa 1996] Aléxitérique [Pereira 1994] Anti-inflammatoire [Harborne 1999, Akihisa 1996] Antidépressive et sédative [Kitada 1981, Subarnas 1992, 1993a-b] Inhibiteur α1-adrénergique [Subarnas 1993c] Anti-inflammatoire et anti-arthritique [Kweifio-Okai 1993, 1994a-b, 1995] Pesticide inhibiteur de croissance [Shankaranarayana 1980] Inhibiteur de la protéine kinase [Hasmeda 1999] Protecteur hépatique [Lin 1988]

Non déterminées

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Tableau 37 : Liste des polyphénols et de leurs propriétés biologiques Composés

Nouveau dans Famille

Kaempferol

Quercétine

Quercitrine

Méarnsitrine Quercitrine 3’-sulfate Quercétine 3,3’-disulfate Quercétine 3,3’,4’-trisulfate Acide gallique

Gallate d’éthyle

Propriétés biologiques

Règne végétal Anti-inflammatoire, Antibactérienne, Antimutagène, Inhibiteur lipoxygénase, Antiradicalaire [Harborne 1999] Comme le kaempferol mais plus actif Antihépatotoxique, Antivirale [Harborne 1999] Aléxitérique [Pereira 1994] Anti-inflammatoire [Robak 1996] Vasorelaxante [Chen 1996] Comme la quercétine Inhibe l’aldose réductase (10-7M) Antimutagène, Anti-ulcéreuse [Harborne 1999] Antidiarrhéique [Gálvez 1995] Inhibe l’aldose réductase [Yoshikawa 1998] Non déterminées Non déterminées Non déterminées Antibactérienne, Antivirale, Antifongique, Antitumorale, Anti-anaphylactique, Antimutagène, Cholérétique, Bronchodilatatrice, Inhibe la dégradation de l’insuline, Relaxante du muscle lisse, Astringent [Harborne 1999] Anti-inflammatoire, Antimutagène, Anticarcinogène [Kroes 1992] Antiradicalaire [Masaki 1997] Antibactérienne [Kayser 1997, Sato 1997] Antitumorale [Serrano 1998] Antinociceptive [Filho 1996] Inhibiteur de la 12- et 15-lipoxygénase, ainsi que de la prostaglandine-synthase [Luther 1991, Christow 1991] Inhibiteur de la protéine tyrosine kinase [Serrano 1998] Anti-inflammatoire [Kroes 1992]

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Les terpénoïdes Tous les composés de cette classe sont nouvellement identifiés dans la famille Leeaceae. Nous avons isolé, entre autres, le E-phytol, le squalène, le lupéol et la β-amyrine. Ces composés sont très répandus dans le règne végétal. Pour cela, nous discuterons essentiellement des triterpènes acylés que nous avons isolés : le palmitate de β et d’α-amyrine et du coriolate de β-amyrine. On peut en effet se poser la question de l’origine des triterpènes acylés. Sont-ils naturels ? Pour certains auteurs, l’acylation d’alcools triterpéniques en présence de glycérides peut avoir lieu en milieu acide donnant ainsi à ces composés une origine artefactuelle [Massiot 1996]. Ce n’est pas le cas ici, car l’extraction à l’hexane ne fait pas intervenir d’acide. Par ailleurs, l’obtention de composés sensibles à l’acide (flavonoïdes sulfatés) nous laisse penser qu’une augmentation de l’acidité au cours du processus de séchage de la plante ou du mouillage de celle-ci avant extraction n’a pu avoir lieu. D’autre part, dans le latex de différentes espèces d’Euphorbia (Euphorbiaceae), la présence naturelle d’esters de triterpènes a été démontrée par une hypothèse biogénétique [Warnaar 1987]. Les dérivés palmitoylés d’amyrine ont deux propriétés principales : Le palmitate d’α-amyrine (Terp-7) présente une activité antiarthritique [KweifioOkai 1994a]. L’action antiarthritique est expliquée par une inhibition de la prolifération des fibroblastes et des collagénases. Cependant, elle n’est pas due à une activité anticyclooxygénase (car la production de prostaglandines par le test de l'oedème de la patte induite par la carragennine n'est pas affectée) [Kweifio-Okai 1994b]. De plus, l’examen histologique de l’articulation des interphalanges proximales de pieds de rats montre une diminution de la prolifération et de l’invasion synoviale du hyaluronate et des granulocytes [Kweifio-Okai 1995]. Cette activité anti-inflammatoire et plus particulièrement anti-arthritique du palmitate d’α-amyrine a fait l’objet d’un brevet international [Kweifio-Okai 1993]. Quant au palmitate de β-amyrine (Terp-5), il montre une activité antidépressive et sédative. Cette activité est montrée en mesurant la perte de la mobilité des souris ou des rats selon le test de la nage forcée [Subarnas 1992, 1993a]. D'après d’autres données pharmacologiques, le palmitate de β-amyrine est un antidépresseur au même titre que 167

l'imipramine et la mianserine [Kitada 1981, Subarnas 1993b]. Ce composé possède des propriétés sédatives justifiées par une action "mianserin-like" [Subarnas 1993b]. Pour préciser son mode d’action, le palmitate de β-Amyrine a été testé en association avec d’autres composés : - phényléphrine (agoniste α1) - clonidine (agoniste α2) - apomorphine (agoniste dopaminergique) - prazosine (antagoniste α1) - yohimbine (antagoniste α2) Il ressort de cette étude que le palmitate de β-amyrine se comporte comme un inhibiteur α1adrénergique [Subarnas 1993c]. Sachant que la β-amyrine et le palmitate d’α-amyrine possédaient une activité antiinflammatoire, nous avons voulu savoir si le palmitate de β-amyrine, isolé majoritairement de l’extrait hexanique dont nous disposions en grande quantité, possédait cette même activité antiinflammatoire. Nous avons ainsi pu montrer que le palmitate de β-amyrine possédait une activité anti-inflammatoire modérée et dose dépendante. En effet sur le modèle des kératinocytes stimulés par l’ionophore calcique, le palmitate de β-amyrine inhibe la production de prostaglandines PG6KF1α. Nous avons une réponse représentative à la modulation de la voie des cyclooxygénases qui métabolise l’acide arachidonique. De plus, le palmitate de β-amyrine peut être extrait d’une suspension de culture cellulaire, d’Apium graveolens (Umbelliferae) et Tabernaemontana divaricata (Apocynaceae) [Dyas 1994]. Une transposition de la méthode à l’échelle industrielle peut par conséquent être envisagée, puisque ce composé représente 33% des terpénoïdes totaux. Par ailleurs, dans ce groupe des triterpènes acylés, nous avons pu isoler le coriolate de β-amyrine (Terp-6). Ce composé est nouveau dans le règne végétal, il n’a par conséquent pas d’activité recensée. Cependant, l’acide coriolique isolé d’une culture de Pleurotus pulmonarius possède une activité nématicide contre Caenorhabditis elegans (DL50 de 5-10 ppm) et antibactérienne contre Bacillus brevis et B. subtilis (CMI de 50 µg/ml et 100 µg/ml

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respectivement) [Stadler 1994]. Il serait intéressant de savoir si le couplage β-amyrine et coriolate potentialise cet effet, ou fait apparaître d’autres propriétés ? Le coriolate ou acide (9Z, 11E)-13-hydroxy-9,11-octadécadiènoïque est un acide gras assez répandu dans le règne végétal au même titre que l’acide dimorphécolique (9Z, 11Z) [Rama Rao 1985, Tallent 1966]. Cependant, c’est la première fois que ce type d’acide gras est fixé à un triterpène.

Les flavonoïdes La classe des flavonoïdes, est une classe très importante dans la famille des Leeaceae. Le kaempferol et la quercétine que nous avons isolés sont déjà répertoriés dans la famille. Ils sont connus pour avoir sensiblement les mêmes activités. Bon nombre de publications font état de leur activité antiradicalaire. Nous avons montré cette même activité par le test au DPPH. Par ailleurs, ces composés sont impliqués dans les processus antimutagène et anticarcinogène. Aussi, il est bon de se rappeler qu’ils sont retrouvés dans notre alimentation, nous retrouvons par exemple la quercétine dans l’oignon (284-486 mg/kg), le chou (110 mg/kg), et le kaempferol dans le chou (211 mg/kg) … [Hertog 1992]. La quercitrine et la méarnsitrine sont deux flavonols 3-O-rhamnosylé isolés pour la première fois dans cette famille. La méarnsitrine est un flavonol rare dans le règne végétal. Isolée pour la première fois de Acacia mearnsii (Fabaceae) [Mackenzie 1969], nous l’avons recensé seulement dans 7 autres espèces : Landolphia kirkii (Apocynaceae) [Gabetta 1973], Doliocarpus spraguei (Dilleniaceae) [Gurni 1981], Flemingia stricta (Fabaceae) [Rao 1983], Lysimachia nummularia (Primulaceae) [Yasukawa 1990], Allophyllus edulis (Sapindaceae) [Hoffmann-Bohm 1992], Myrcia multiflora (Myrtaceae) [Yoshikawa 1998] et enfin Syzygium malaccense (Myrtaceae) [Noreen 1998]. Il n’est pas surprenant de trouver ce composé trisubstitué sur le noyau B, avec un méthoxy en 4’ et deux hydroxyles en 3’ et 5’. En effet, nous avons recensé sa génine, la myricétine, dans 5 Leea [Bates-Smith 1959, Umadevi 1991], et un dérivé de la myricétine rhamnosylé en position 3, la myricitrine, chez Leea rubra [Yem Yok Siv 1971].

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Toutefois, le groupe le plus intéressant que nous avons rencontré reste celui des flavonoïdes sulfatés. C’est la première fois que l’on rencontre des flavonoïdes sulfatés dans la famille des Leeaceae. Son biotope est un argument pour ce type de constituants. Rappelons que notre échantillon provient d’une espèce qui pousse dans une forêt à raphiales marécageuses ou périodiquement inondées du Cameroun. La quercitrine 3’-sulfate et la quercétine 3,3’,4’-trisulfate (Flav-4 et Flav-6) sont recensées pour la première fois dans le règne végétal. La quercitrine 3’-sulfate (Flav-4) a fait l’objet d’une publication [Op de Beck 1998]. Avec la 3-glucuronyl-3’-sulfate de quercétine isolé de Hypericum elodes (Guttifrae) [Seabra 1988], la quercitrine 3’-sulfate est le deuxième flavonoïde sulfaté en position 3’ et possédant une unité osidique en 3. On ne recense d’ailleurs que 9 flavonols qui sont à la fois sulfaté et glycosylé. C’est aussi la deuxième fois que l’on rencontre la quercétine 3,3’-disulfate (Flav-5). Celle-ci a été isolée de Flaveria chloraefolia (Compositae) [Barron 1987b]. Les génines disulfatées sont rares, on en dénombre 8, dont 3 sont sulfatées sur la quercétine en [3,7], [3,3’] et [3,4’]. En ce qui concerne la quercétine 3,3’,4’-trisulfate (Flav-6), son intérêt est lié à la position de ces groupements sulfates. En effet, d’après la littérature, on recense que 7 flavonols tri- ou tétra-sulfatés [Barron 1988a, Harborne 1994] (Tableau 10 p 45 ) : - le kaempferol 3,7,4’-trisulfate (Acrotema uniflorum (Dilleniaceae)), - la quercétine 3,7,3’ trisulfate (Flaveria bidentis (Compositae)), - la quercétine 3,7,4’ trisulfate (Flaveria bidentis (Compositae)), - la quercétine 3,7,3’,4’-tétrasulfate (Flaveria bidentis (Compositae)), - la quercétine 3-acétyl-7,3’,4’-trisulfate (Flaveria bidentis (Compositae)), - la rhamnétine 3’-glucuronique-3,5,4’-trisulfate (Tamarix aphylla (Tamaricaceae)), - l’isorhamnétine 3,7,4’-trisulfate (Acrotema uniflorum (Dilleniaceae)). Notre composé doit son originalité à la position des groupements sulfates (3, 3’ et 4’). Généralement, les flavonoïdes trisulfatés ont toujours la position 7 sulfatée et si ce n’est pas le cas, cette position n’est pas libre mais est le plus souvent méthoxylée (rhamnétine). La sulfatation s’effectuant dans l’ordre 3>>7>4’>3’pour les flavonols (et 7>>3’>4’>6>8 pour les flavones) (Varin 1992a). En terme d’activité biologique, nous avons pu voir que les substitutions en 3, 3’ et 4’ par des sulfates diminuent considérablement l’activité antiradicalaire mesurée par le test au 170

DPPH et sont en accord avec la littérature. Le système ortho-dihydroxyl libre sur le cycle B ainsi que l’hydroxyl libre en 3 sont indispensables pour l’activité anti-radicalaire. Cependant, ces flavonols sulfatés mériteraient d’être testés sur l’aldose réductase du cristallin ou sur la xanthine oxydase, qui rappelons-le, sont fortement inhibés par ce genre de composés. Il semblerait même que les données biologiques au sujet des flavonoïdes fassent plus référence à leurs dérivés sulfatés. De plus, l’hydrosolubilité des flavonoïdes sulfatés est d’un grand intérêt pour envisager des applications biologiques pour lesquelles le problème de solubilité est souvent une barrière importante. Il convient par contre d’être séléctif sur les positions à sulfater. L’intérêt général pour les flavonoïdes restent le domaine anti-inflammatoire. En effet, ces composés sont impliqués dans plusieurs processus [Robak 1996] : -

Ils sont inhibiteurs d’enzymes (comme la lipoxygénase, la cyclooxygénase) ce qui entraîne la diminution des produits de la cascade de l’acide arachidonique (prostaglandines, leucotriènes…),

-

Ils chélatent les ions métalliques, la chélation du Fe2+ empêche la réaction de Fenton qui génère les radicaux oxygénés extrêmement réactifs (OH, O2-),

-

Ils ont une action vitaminique P, veino-toniques, ils diminuent la perméabilité capillaire.

Ce sont ainsi des agents thérapeutiques connus pour palier les problèmes inflammatoires ou cardiovasculaires.

Les composés phénoliques On retrouve particulièrement ces composés chez les Leea (nous avons recensé dans la littérature les acides gentisique, p-hydroxybenzoïque, vanillique, syringique, protocatéchuique et gallique). De ce fait, l’acide gallique a déjà été trouvé dans la famille, ce qui n’est pas le cas pour le gallate d’éthyle. Nous pourrions nous poser la question de savoir si ce dernier ne pourrait pas être un artefact d’extraction ! En effet, l’extrait CH2Cl2 provient d’une extraction liquide-liquide contre l’extrait hydroalcoolique de départ et obtenu à température ambiante (sur les feuilles préalablement traitées à l’hexane et au dichlorométhane), puis concentré et lyophilisé.

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Des travaux antérieurs ont montré que la formation de différents esters galliques peut apparaître au cours du procédé d’extraction [Güven 1974]. Ainsi, en utilisant comme solvant d’extraction l’éthanol, il y a formation de gallate d’éthyle, avec le méthanol, de gallate de méthyle, et avec le propanol, de gallate de propyle. L’analyse d’un extrait en CLHP couplée à la SM d’un extrait préparé à partir des feuilles à l’aide d’un solvant approprié permettrait de lever ce doute. Rappelons aussi, que les esters galliques sont utilisés depuis longtemps comme additifs alimentaires. Ils servent d’agents antioxydants dans la prévention du rancissement des graisses, il s’agit des additifs E310, E311 et E312 qui correspondent aux gallates de propyle, octyle et lauryle respectivement.

Les extraits acétate d’éthyle, butanolique et aqueux n’ont pas montré d’activité antiinflammatoire sur la voie des prostaglandines libérées par les kératinocytes. Mais d’après l’usage en médecine traditionnelle et leurs fortes activités antiradicalaires, il serait intéressant de poursuivre cette voie avec un modèle d’évaluation plus global. De même, la recherche de l’activité cardiovasculaire est à rechercher. Il apparaît aussi que les composés isolés ont contribué à l’étude phytochimique de la famille. Il conviendrait cependant de faire une recherche plus large des constituants des différentes espèces et partie de plante dans la famille des Leeaceae. L’étude des baies et des fleurs pour rechercher la nature de leurs pigments ainsi que la recherche de flavonoïdes sulfatés sont notamment à étudier.

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Conclusion

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CONCLUSION Notre travail avait pour objet l’étude phytochimique et biologique de Leea guineensis G. Don (Leeaceae). Pour cela, un travail bibliographique a permis de situer la plante et la famille dans la systématique moderne. Nous avons montré que les Leeaceae bien qu’ayant de très fortes affinités avec les Vitaceae, ont suffisamment de caractères distinctifs pour être considérées comme une famille monogénérique à part entière, elle-même appartenant à l’ordre des Rhamnales. Nous avons aussi pu remarquer que cette famille a été très peu étudiée tant sur le plan chimique que biologique. Nous retiendrons cependant la présence dans cette famille de flavonoïdes, d’acides phénoliques et de tanins. L’utilisation en médecine traditionnelle montre que le genre a des propriétés essentiellement calmante, astringente, anti-infectieuse, antiinflammatoire, antidysentérique et cardiovasculaire. La découverte de flavonoïdes sulfatés dans Leea guineensis nous a conduit à effectuer une mise à jour, et nous a permis de recenser, à ce jour, 134 flavonoïdes sulfatés, dont 32 sont nouveaux dans le règne végétal, et d’ajouter 3 nouvelles familles renfermant ces produits. Nos travaux personnels qui ont porté sur l’étude phytochimique et biologique de Leea guineensis (Leeaceae) ont conduit à l’identification de 90 composés. 73 proviennent des distillats de bois et de feuilles et 17 composés ont été isolés à partir des extraits hexanique, dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanolique et aqueux des feuilles. Ceux-ci ont été caractérisé par des analyses spectrales faisant appel au pouvoir rotatoire, l’UV, la SM, et surtout la RMN 1D et 2D (COSY, COLOC, XHCORR). On recense 7 terpénoïdes, 1 diterpène acyclique (E-phytol), 1 triterpène acyclique (squalène), 2 triterpènes (lupéol et β-amyrine), 3 triterpènes acylés (palmitate et coriolate de βamyrine, palmitate d’α-amyrine), tous nouvellement recensés dans la famille. A ceux-ci, s’ajoute 9 polyphénols, dont 2 flavonols (kaempferol, quercétine) déjà connus dans la famille, 2 flavonols glycosilés (quercitrine, méarnsitrine) et 3 flavonoïdes sulfatés (quercétine 3,3’-disulfate, quercétine 3,3’,4’-trisulfate, quercitrine 3’-sulfate) nouveaux dans la famille ainsi que 2 acides phénols (acide gallique, gallate d’éthyle). Seul ce dernier est nouveau dans la famille avec l’acide gras (acide palmitique).

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3 composés sont isolés pour la première fois du règne végétal, ce sont le coriolate de βamyrine, la quercétine 3,3’,4’-trisulfate et la quercitrine 3’-sulfate. Ce dernier a fait l’objet d’une publication [Op de Beck 1998]. Du point de vue phytochimique, nos travaux confirment la présence d’acides phénoliques et de flavonols déjà rencontrés dans la famille des Leeaceae. Ceux-ci semblent être importants pour la cohésion du genre Leea. C’est aussi un argument qui montre l’étroite relation de cette famille avec les Vitaceae, et ce d’autant plus que nous avons caractérisé dans le distillat des feuilles le vitispirane. Ce composé est très rare et se retrouve essentiellement dans les composés volatils de jus de raisin et de distillat de vin. Par ailleurs, nous avons pu identifier pour la première fois des composés volatils chez les Leea par entraînement à la vapeur d’eau provenant des feuilles et du bois. La caractéristique principale est que les distillats sont constitués en grande partie d’hydrocarbures. Cette étude a fait l’objet d’une publication [Op de Beck soumis]. Mais c’est la première fois que l’on montre l’existence de terpénoïdes dans cette famille. C’est aussi la première fois que l’on met en évidence la présence de flavonoïdes sulfatés chez les Leeaceae. Ceci est un argument supplémentaire à l’heure actuelle pour séparer les Leeaceae des Vitaceae. En ce qui concerne les activités biologiques, nous avons montré que les extraits EtOAc, BuOH et H2O des feuilles présentent une cytotoxicité à partir de 10 µg/ml sur la viabilité des kératinocytes humains SVK14 en culture pendant 48H, une forte activité antiradicalaire, mais n’ont pas d’activité anti-inflammatoire significative sur la production de prostaglandines 6KF1 α par les kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique. En revanche, le palmitate de β-amyrine a, quant à lui, une activité anti-inflammatoire dose dépendante (47% d’inhibition à 100 µg/ml), il régule le métabolisme de l’acide arachidonique, mais il ne semble pas agir sur l’expression de l’ARNm de la collagénase MMP-1. D’autre part, les flavonoïdes non sulfatés et les acides phénols sont de très bons piégeurs de radicaux libres. Cette propriété en fait des candidats potentiels pour palier aux problèmes impliqués dans le stress oxydatif (peroxidations lipidiques, vieillissement, désordre cardiovasculaire, etc.).

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Aussi, nos résultats, associés aux recherches antérieures, et l’intérêt croissant pour les traitements utilisant la phytothérapie ces dernières années, ne peuvent qu’encourager à poursuivre les investigations dans cette famille Leeaceae. Cette famille mériterait bien de sortir des vrilles des Vitaceae !

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Bibliographie

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Annexe :

Matériels et méthodes Fiches produits Liste des noms usuels des flavones Liste des noms usuels des flavonols Liste des figures Liste des tableaux

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MATERIELS ET METHODES I Lyophilisation La lyophilisation a été effectuée sur les extraits aqueux, acétate d’éthyle et butanolique, ainsi que pour des fractions aqueuses. Cependant, les extraits EtOAc et BuOH ont été concentrés sous pression réduite, et repris progressivement à l’eau jusqu’à l’élimination des solvants organiques. Les phases aqueuses sont alors congelées à –50°C et lyophilisées sur les appareils USIFROID® et AIRLIQUID LY5®.

II Matériel Chromatographique A) Chromatographie analytique en couche mince (CCM) Les analyses sur plaque CCM sont réalisées en grande partie sur des plaques de silice 60 F254 (200x200x0,15 mm) sur feuilles aluminium (SDS). Plus rarement, nous avons utilisé des plaques en verre (10x10 cm nano) HPTLC Diol F254, et RP18 F254 (Merck). L’élution est adaptée en fonction des extraits ou composés analysés. La migration se faisant dans des cuves de type Desaga Heildelberg. Les révélateurs utilisés pour mettre en évidence les composés ont été la lumière UV (254 et 366 nm), l’acide sulfurique dilué à 50% dans du MeOH avec observation sous UV avant et après chauffage. B) Chromatographie préparative a) Chromatographie préparative sur couche mince (CCM prép) Elles sont réalisées sur des plaques de verre (200 X 200 mm) préparées au laboratoire avec de la silice 60 F254 (2,5-5 mm d’épaisseur) avec un dépôt d’échantillon inférieur de 10 mg à 30 mg selon l’épaisseur de la plaque.

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Les plaques sont lavées par élution successive dans du cHex, MeOH et solvant d’élution chromatographique avant de déposer l’échantillon. L’observation des bandes est fait sous lampe UV (parfois avec révélation à l’acide d’un coté de la plaque). b) Chromatographie sur colonne ouverte (CO) L’appareillage utilisé est classique, cependant nous avons fait en sorte d’utiliser des dimensions de colonne adéquate à la quantité d’échantillon à séparer (en général le poids de support sec est de 50 fois celui de l’échantillon). Plusieurs supports ont été utilisés Charbon végétal (SDS®) Silice 60 de granulométrie 63-200 µm (SDS®) Sephadex LH-20 (Pharmacia®) Les fractions sont collectées et rassemblées si nécessaire après visualisation CCM. c) Chromatographie sous vide (VLC) Les échantillons sont déposés après empattage sur un gel de silice 60 placé dans un verre fritté N°4. d) Chromatographie liquide de type SPE (Visiprep®) Ce sont des colonnes prête à l’emploi sous forme de seringue commercialisé sous le nom de Visiprep® et remplies par deux types de support différent : silice normale et en silice greffée C18. e) Chromatographie sur colonne moyenne pression (CLMP) Les purifications sont réalisées sur silice (35-70 µm) ou sur silice greffée RP-18 (40-63 µm) dans des colonnes Büchi®. La pression est fournie par une pompe moyenne pression de type Büchi 688. Les colonnes utilisées dépendent de la complexité et de la masse de la fraction à purifier. La sortie de colonne est couplée à un détecteur UV (Knauer ®). La détection se faisant pour la plupart du temps à λ 254 nm. Les solvants d’élution sont dégazés avant utilisation. 195

C) Chromatographie en phase gazeuse (CPG) Cette méthode a été utilisée avec un couplage à la spectrométrie de masse (SM) afin d’analyser les composés volatiles des feuilles et du bois. Ces analyses en CG/SM ont été réalisées à l’Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier par le Pr. J.M. BESSIERE. L’appareillage est constitué d’un chromatographe HP 5890 en phase gazeuse équipé d’un détecteur d’ionisation de flamme et d’une colonne Optima 1 (Macherey-Nagel®) 25 m X 0,20 mm X 0,25 µm, phase stationnaire polydiméthylsiloxane. Le gaz vecteur est l’hélium avec un débit constant de 0,6 ml/min. La température de l’injecteur est de 220°C, celle du détecteur de 250°C. La température de la colonne est programmée à 50°C pendant 3 min puis augmente jusqu’à 250°C à raison de 3 °C/min. Le volume d’injection est en général de 0,2 ml. Le spectromètre de masse couplé est un HP 5791 à potentiel d’ionisation de 75 eV, de vitesse de balayage de 1,1 s.décade-1 (réitérée dans tout le passage). Les composés détectés sont présentés dans un tableau en fonction de leurs indices de rétention de Kováts. Cet indice est établi en comparant le temps de rétention d’un composé à ceux des deux hydrocarbures les plus proches. I= 100 X lg[VI/VHi] / lg[VHi+1/VHi] + 100i I est l’indice de rétention du composé I Hi est le pic de l’hydrocarbure qui sort immédiatement avant celui du composé I et dont le nombre d’atomes de carbone est i, Hi+1 est le pic d’hydrocarbure qui sort immédiatement après celui du composé I.

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III Méthodes chromatographiques Toutes les fractions obtenues avec les différentes techniques chromatographiques, pour la séparation, les regroupements et l’isolement des composés ont été contrôlées par CCM. A) Extrait hexanique – Purification des triterpènes 20 g de l’extrait Hex sont déposés sur une colonne ouverte de charbon (260 X 80 mm) et élués au CH2Cl2 par fractions de 500 ml. Les 3 premiers litres sont regroupés dans la fraction A et les 4 autres dans la fraction B. Chromatographie de A (9,64g) sur CLMP Si (460 X 70 mm, fractions 500 ml) cHex 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Solvants CHCl3 MeOH 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Fractions 1-2 3-4 5-6 7-10 11-12 13-14 15-16 17-18 19-20 21-22 23-24

Après contrôle CCM et regroupement, la fraction [3] donne Terp-5 (1 g) ; les fractions [4-9] purifiées de nouveau sur CCMprép Si (cHex-EtOAc 9:1) conduisent à Terp-7 (6 mg) ; les fractions [11-15] donnent Aa et la fraction [16-19] Ab. Chromatographie de Aa (760 mg) sur CLMP Si (460 X 15 mm, fractions 20 ml) cHex 7 6

Solvants CHCl3 3 4

Fractions 1-20 21-40

Le regroupement de [16-20] conduit à Aaa. Chromatographie de Aaa (60 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 20 ml) Solvants MeOH CHCl3 9 1 8 2

Fractions 1-15 16-25

Les fractions [14-21] rassemblées conduisent à Aaaa. Chromatographie de Aaaa (30 mg) de nouveau sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 10 ml)

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Solvants MeOH CHCl3 90 10 85 15 80 20

Fractions 1-6 7-15 16-21

Les fractions [11-14] conduisent à Terp-6 (9 mg). Chromatographie de Ab (744 mg) sur CLMP Si (460 X 15 mm, fractions 20 ml) cHex 7 6 5

Solvants CHCl3 3 4 5

Fractions 1-10 11-20 21-40

La fraction [30] conduit à Aba. Chromatographie de Aba (45 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 20 ml) Solvants MeOH CHCl3 9 1 8 2

Fractions 1-10 11-30

La fraction [5] conduit à Terp-1 (20 mg) ; les fractions [9-10] à Terp-4 (20 mg) et les fractions [11-12] à Abaa. Chromatographie de Abaa (6 mg) sur CCMP Si (CHCl3-MeOH 9:1) qui conduit à Terp-3 (1mg). Chromatographie de B (3,5 g) sur CLMP Si (460 X 70 mm, fraction 40 ml jusqu'à la fraction 186, après fractions de 100 ml) cHex 100 95 90 80 70 65 60 50 40 20 0

Solvants CHCl3 MeOH 0 0 5 10 20 30 35 40 50 60 80 100 50 50

Fractions 1-36 37-55 56-75 76-94 95-113 114-174 175-186 187-191 192-196 197-201 202-205 206-209

Le regroupement, des fractions [86-119] conduit à Terp-5 (500 mg) et les fractions [206-207] à Ba. Chromatographie de Ba (200 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 10 ml) Solvants MeOH CHCl3

Fractions

198

9 8

1 2

1-16 17-27

La fraction [14-18] permet d’obtenir Baa. La chromatographie de Baa (11 mg) sur Visiprep Si avec un gradient cHex-EtOAc, conduit à Terp-3 (9 mg). 5 g d’extrait cHex sont déposés sur une CO Si (400 X 25 mm), et élué au CHCl3. Les 2 premières fractions de 15 ml conduisent à C. Chromatographie de C (250 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fraction 15 ml) Solvants MeOH CHCl3 70 30 65 35

Fractions 1-19 20-

Les fractions [6-7] sont rassemblées et donnent Ca et purifiées sur CCMprép Si (cHex) pour avoir Terp-2 (25 mg). B) Extrait dichlorométhane – Purification de polyphénols 6 g de l’extrait CH2Cl2 sont chromatographiés par VLC sur verre fritté (60 X 130 mm, fractions de 1 L). cHex 100 70 50 30 0

Solvants CH2Cl2 0 30 50 70 100 70 50 30

Fractions MeOH 0

30 50 70

1 2 3 4 5 6 7 8

La fraction [6] conduit à A et la fraction [7] à B. Chromatographie de A (850 mg) sur CO sephadex LH-20 (300 X 70 mm), éluée par CHCl3-MeOH (50:50), fractions de 20 ml. Les fractions [21-28] conduisent à Aa, et les fractions [34-41] à Ab. Chromatographie de Aa (530 mg) sur CO charbon (70 X 55 mm, fraction 50 ml) Solvants CHCl3 MeOH 10 0 9 1

Fractions 1-10 11-20

Après regroupement, les fractions [11-25] conduisent à Aaa. 199

Chromatographie de Aaa (460 mg) sur CLMP Si (460 X 15 mm, fractions de 20 ml) Solvants CH2Cl2 EtOAc 10 0 9 1 8 2 7 3

Fractions 1-10 11-20 21-30 31-40

Les fractions [9-10] correspond à AGr-1 (30 mg) ; les fractions [15-19] à Aaaa et les fractions [20-24] à Aaab. Chromatographie de Ab (30 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 20 ml) H2O 6 5

Solvants MeOH 4 5

Fractions 1-10 11-20

Les fractions [6-10] conduisent à AcPh-2 (4 mg) et la fraction [16] à Aba. Chromatographie de B (140 mg) sur CLMP Si (460 X 15 mm, fractions de 100 ml) Solvants CHCl3 MeOH 10 0 9 1

Fractions 1 2-4

La fraction [2] conduit à Ba, les fractions [3-4] à Bb. Chromatographie de Bb (60 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm), avec un mélange isocratique MeOH-H2O (50:50), fractions de 20 ml. Les fractions [7-9] conduisent à Bba. Chromatographie de Bba (20 mg) sur CO Sephadex LH-20 (320 X 50 mm), élué au MeOH, fraction de 50 ml. Les fractions [1-3] donnent Bbaa et [8-11] Bbab. Les fractions Aba et Bbab sont regroupées et chromatographiée sur CCMprép Si (EtOAc-MeOH-H2O 100:16,5:13,5) pour donner Flav-7 (5 mg). C) Extrait à l’acétate d’éthyle – Purification de polyphénols 10 g de l’extrait EtOAc sont chromatographiés sur CLMP Si (460 X 70 mm), fractions de 500 ml. Solvants EtOAc MeOH 100 0 90 10 80 20 70 30

Fractions 1-14 15-28 29-36 37-44

200

Les fractions [7-16] après regroupement mènent à A, la fraction [19] correspond à Flav-1 (36 mg), les fractions [23-28] à B et les fractions [29-37] à C. Chromatographie de A (420 mg), sur CLMP C-18 (460 X 15 mm, fractions 100 ml) H2O 100 90

Solvants MeOH 0 10

Fractions 1-5 6-9

Les fractions [5-6] conduisent à Aa ; Chromatographie de Aa (50 mg) sur CO Sephadex LH-20 (190 X 10 mm) et éluée dans un mélange isocratique CHCl3-MeOH (1:1 ), fractions de 10 ml. Les fractions [4-6] conduisent à Ac Ph-1 (25 mg). Chromatographie de B (580 mg) sur CLMP C-18 (460 X 15 mm, fractions 250 ml) H2O 100 90 80 70 65 60 50 45

Solvants MeOH 0 10 20 30 35 40 50 55

Fractions 1-3 4-6 7-11 12-14 15-17 18-24 25-31 32-35

La fraction [4] conduit à Ac Ph-1 (30 mg), les fractions [21-22] à Ba, les fractions [2930] à Bb et les fractions [31-35] à Bc. Chromatographie de Ba (70 mg) sur 2 CCMprép Si (EtOAc-MeOH-H2O 100:16,5:13,5 v:v:v), donne Flav-3 (20 mg) et Flav-4 (30 mg). Chromatographie de Bb (20 100:16,5:13,5), donne Flav-3 (6 mg) ;

mg)

sur

CCMprép

Si

(EtOAc-MeOH-H2O

Chromatographie de Bc (150 mg) sur CO Sephadex LH-20 (120 X 60 mm), élution MeOH, fractions de 20 ml. La fraction [3] donne Flav-3 (10 mg), et la fraction [4] Flav-2 (50 mg). Chromatographie de C (1 g) sur CLMP C-18 (460 X 70 mm, fractions 100 ml) H2O 60 50

Solvants MeOH 40 50

Fractions 1-9 10-15

Les fractions [6-11] conduisent à Ca (30 mg) qui donne après CCMprép Si (EtOAcMeOH-H2O 100:16,5:13,5), Caa qui est purifiée sur Visiprep C-18 pour donner Flav-4 (8 mg).

201

D) Extrait butanolique – Purification des flavonoïdes 2 g de l’extrait BuOH sont chromatographiés sur VLC Si (130 X 60 mm, fractions 500 ml) Solvants CH2Cl2 MeOH 80 20 60 40 50 50 40 60 20 80

Fractions 1 2-3 4 5-7 8

Les fractions [2-5] donnent A, et les fractions [6-9] donnent B. Chromatographie de A (500 mg) sur CO Sephadex LH-20 (120 x 60 mm), fractions 20 ml, élution MeOH. La fraction [3] conduit à Flav-4 (6 mg), la fraction [4] donne Flav-5 (20 mg) et les fractions [5-8] donnent Aa. Chromatographie de Aa sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fraction 20 ml) H2O 100 90 80 70

Solvants MeOH 0 10 20 30

Fractions 1-10 11-20 21-30 31-40

Les fractions [16-19] donnent Flav-6 (6 mg) et les fractions [22-38] donnent Flav-5 (3 mg). Chromatographie de B (800 mg) sur CO Sephadex LH-20 (120 X 60 mm) et éluée au MeOH, fractions 100 ml. Les fractions [5-7] conduisent à Ba.

202

Chromatographie de Ba (80 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 100 ml) H2O 100 90

Solvants MeOH 0 10

Fractions 1-3 4-7

Les fractions [3-5] donnent Baa. Chromatographie de Baa (15 mg) sur CLMP C-18 (230 X 15 mm, fractions 10 ml) Solvants MeOH 0 5

H2O 100 95

Fractions 1-13 14-17

Les fractions [7-9] conduisent à Flav-6 (3 mg). E) Extrait aqueux – Purification de flavonoïdes 4 g de l’extrait H2O sont chromatographiés sur VLC Si (130 X 60 mm), fractions de 500 ml. CH2Cl2 20 0

Solvants MeOH 80 100 80

Fractions H2O 0 20

1 2-3 4

La fraction [2] correspond à Flav-5 (6 mg), et les fractions [3-4] donnent A. Chromatographie de A (380 mg) sur CLMP C-18 (230 X15 mm, fractions 100 ml) H2O 100 95 90 80 70 60 40 20

Solvants MeOH 0 5 10 20 30 40 60 80

Fractions 1-4 5-10 1-17 18-23 24-28 29-33 34-42 43-48

Les fractions [24-29] donnent Aa, les fractions [31-37] conduisent à Flav-5 et les fractions [38-43] à Flav-2. Chromatographie de Aa (30 mg) sur CO Sephadex LH-20 (320 X 50 mm) et éluée au MeOH, fractions de 100 ml. Les fractions [20-22] correspondent à Flav-6 (11 mg).

203

IV Mesures spectrales A) Spectres UV Les spectres sont enregistrés sur un spectrophotomètre U-2000 (Hitachi®). En général les spectres sont enregistrés dans le MeOH avec ajout de réactifs spécifiques préparés selon Mabry [1970]. B) Spectres de masse (SM) Plusieurs techniques ont été employées : impact électronique (EI), désorption et ionisation chimique (DCI), matrice NH3+isobutane, bombardement par atomes accélérés (FAB), matrice glycérol. Les spectres sont enregistrés sur un spectromètre de masse quadripolaire R 210C couplé à un ordinateur IPC (P2A) MSCAN WALLIS. Les spectres sont réalisés par le Dr BOSSO (service de spectrométrie de masse du Centre d’Etude et de Recherche sur les Macromolécules Végétales CERMAV - Grenoble). C) Spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) Les spectres RMN sont enregistrés pour la plupart sur un appareil Bruker AC 200 de l’UFR de Pharmacie de Grenoble, dont la fréquence nominale du proton est de 200,13 MHz et celle du carbone 13 de 50,03 MHz. Quelques spectres ont été enregistrés sur un appareil Bruker AMX 400 (400,13 MHz proton 100,61 MHz carbone 13) (Laboratoire de biophysique du Centre de Recherche du Service de Santé des Armées CRSSA - Grenoble), sur unappareil Bruker 500 MHz à Reims, ou sur un 300 MHz (C.E.A. de Grenoble). Les mesures sont réalisées dans les solvants deutériés suivant : CDCl3, CD3OD, DMSO-d6 ou D2O. Les valeurs de déplacements chimiques, δ en ppm, sont exprimées par rapport au signal du tétraméthylsilane (TMS). D) Mesure du pouvoir rotatoire [α] 20 D ® Les [α] 20 D (c = 0,2) sont mesurés sur un polarimètre Perkin Elmer , de type PE-341,

contre la raie D du sodium à λ 589 nm à 20,0°C, dans une cuve de 1 ml et de 10 cm de longueur au laboratoire de Chimie organique de l’UFR de Pharmacie.

204

V Méthodes chimiques A) Recherche de tanins 50 mg d’extrait EtOAc, BuOH, H2O sont placés respectivement dans un ballon de 100 ml avec 15 ml H2O distillé et 7 ml du réactif de Stiasny (mélange formol-HCl 2:1 v:v). Les ballons sont portés à ébullition 30 min. L’apparition d’un précipité rouge indique la présence de tanins condensés. La solution refroidie est filtrée sur papier. Le filtrat recueilli est saturé en acétate de sodium. Par ajout de quelques gouttes de fer, la solution se colore en bleu-noir, indiquant la présence de tanins hydrosolubles. B) Recherche d’alcaloïdes 20g de feuilles sèches sont mouillées dans 25ml de NH4OH aqueux à 20%. Puis, on ajoute 200ml d’acétate d’éthyle et on laisse macérer 24H. Après lixiviation, les marcs sont épuisés par trois fois 100ml d’EtOAc. Cette phase EtOAc est extraite à trois reprises par H2SO4 à 5%. La phase acide est alors alcalinisée par NH4OH jusqu’à pH = 8 puis est extraite à trois reprise par du CHCl3. La phase chloroformique est rincée à l’eau distillée jusqu’à pH = 7, filtrée sur Na2SO4 et concentrée. De cet extrait (20mg), la mise en évidence des alcaloïdes par les réactifs classiques de Dragendorff et de Mayer s’avère négative. C) Recherche de saponines L’extrait butanolique a la propriété de former après agitation, une mousse persistante qui signe la présence de saponosides. Or, la présence de tanins et de polysaccharides dans cet extrait peut être à l’origine de faux positifs. Pour le vérifier, l’extrait butanolique sec a été repris dans 500ml d’eau distillée et épuisé, trois fois, par 1L de butanol saturé en H2O. Cette phase butanolique concentrée (4g) est reprise dans un minimum d’eau (30ml). Une précipitation est alors effectuée par ajout d’acétone (500ml). Sur CCM, la fraction soluble et le précipité ne montrent pas la présence de saponines, après révélation à l’acide (H 2SO4 50% dans EtOH). D) Hydrolyse du palmitate β-amyrine 50 mg de palmitate β-amyrine sont hydrolysés par une solution de KOH à 5% dans l’EtOH, à reflux pendant 2H. Une extraction au CHCl3 permet d’obtenir 9,4 mg β-amyrine. La phase alcaline est alors acidifiée par ajout de quelques gouttes d’HCl 1N. Une nouvelle extraction au CHCl3 conduit à l’obtention de 2,5 mg d’acide palmitique.

205

VI Tests biologiques A) Evaluation des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la viabilité cellulaire Test effectué à l’Institut de Recherche Pierre Fabre (Toulouse) Département Evaluation et Exploration Fonctionnelle et Cutanée Laboratoire de Biologie Cellulaire Par Mme M.-F. ARIES Matériel : Hotte à flux d’air laminaire vertical / GELAIRE® BSB 4A Labo FWW Incubateur à CO2 / Hereaus type B 5060 EK/CO2 Centrifugeuse CRKR BECKMAN® Microscope inversé Nikon® Microspectrophotomètre MULTISKAN® Flacons de culture CORNING® Plaques de culture 96 puits NUNCLON® Delta Pipettes automatiques de distribution (GILSON® - MICROMAN® / BIOHIT – PROLINE®) Pointes stériles (GILSON® – MICROMAN® Capillaires et Pistons / TREFF) Tubes à centrifuger 50ml : Réf 132593 – 73660 NUNC POLYLABO® Matériel biologique: Lignée cellulaire de kératinocytes humains SVK14 Réactifs : Milieu de culture MEM : Réf 041-01095 M / GIBCO BRL Milieu de culture DMEM sans rouge de phénol : Réf 041-01880M / GIBCO BRL SDS : Sodium dodécyl sulfate : Réf 13760-1000 / MERCK SVF : Sérum de veau fœtal : réf 013967 EUROBIO Tampon phosphate PBS sans Ca++ : réf 076-01300N / GIBCO BRL XTT : Sodium 3,3[1[(phenylamino)carbonyl]-3,4-tetrazolium bis(4-methoxy-6-nitro)] benzene sulfonic acid hydrate : Réf X4251 / SIGMA Coenzyme Q : Réf D9150 / SIGMA Trypsine EDTA : Réf 043.05300M / GIBCO BRL Produits testés : Extrait à l’acétate d’éthyle Extrait butanolique Extrait aqueux Les produits ont été testés aux concentrations suivantes : 0,01 µg/ml, 0,1 µg/ml, 1 µg/ml, 10 µ g/ml et 100 µg/ml. Selon les échantillons, une solution mère est préparée dans le DMSO à 1 g/ml ou directement dans le milieu de culture à 1 mg/ml. 206

Toutes les dilutions sont réalisées dans le milieu de culture à 1% de SVF. Protocole : Le protocole suivi est celui décrit par : Neal W. ROEHM et al., Journal of Immunological Methods, 142, (1991), 257-265. Le principe du test est basé sur la transformation enzymatique d’un sel de tétrazolium, le XTT, en un produit coloré, le formazan. Le XTT est réduit par les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes en présence d’un agent couplant d’électrons, le coenzyme Q, en un composé hydrosoluble jaune/orangé, le formazan dosable par spectrométrie à 450 nm. Protocole opératoire : La lignée cellulaire SVK 14 est cultivée dans du MEM avec 10% de SVF. t-18H : Ensemencement des cellules à raison de 1,5.104 cellules par puits sous un volume de 100 µl de milieu de culture à 10% de SVF. Incubation à 37°C durant 18H en présence d’une atmosphère saturée en H2O et à 5% de CO2. T=0 : Elimination du milieu de culture et rinçage des microplaques à l’aide de 100 µl de PBS par puits. Introduction des différentes concentrations d’échantillons sous un volume de 100 µl de milieu de culture avec 1% de SVF. Incubation à 37°C pendant 48H. T+48H : Révélation de la viabilité cellulaire, Elimination des surnageants de culture. Rinçage des microplaques à l’aide de 100 µl de PBS par puits. Introduction de 50 µl par puits d’une solution de XTT (0,5 mg/ml) en présence de coenzyme Q (40 µg/ml). Incubation de 3H à 37°C en atmosphère saturée en H2O et avec 5% de CO2. Arrêt de la métabolisation du XTT en ajoutant 100 µl par puits d’une solution de SDS à 10%. Lecture de la densité optique au spectrophotomètre Multiskan à 450 nm.

207

B) Activité du palmitate de β-amyrine et des extraits EtOAc, BuOH, H2O sur la production de prostaglandine 6KF1α par les kératinocytes humains Test effectué à l’Institut de Recherche Pierre Fabre (Toulouse) Département Evaluation et Exploration Fonctionnelle et Cutanée Laboratoire de Biologie Cellulaire Par Mmes M.-F. ARIES et C. VAISSIERE Matériel biologique : Lignée cellulaire : kératinocytes humains SVK14 Plaques de culture 6 puits : 30 mm de diamètre Réactifs : Milieu de culture MEM : Réf GIBCO 041-01095 M Tampon phosphate PBS pH 7,4 : réf GIBCO 076-01300 N Trypsine EDTA : réf GIBCO 043.05300 M Sérum de veau fœtal (SVF) : réf DUTSCHER 300121 Enzyme Immuno Assay (EIA) System :EUROMEDEX Ionophore calcique A23187 SIGMA : réf C7522 Produits testés : extrait à l’acétate d’éthyle extrait butanolique extrait aqueux palmitate de β-Amyrine (OPA 77C) Protocole : - La suspension de kératinocytes (1x106 cellules/2ml) dans le MEM 10% SVF est distribuée dans les plaques 6 puits (1x106 cellules/puits) et incubée pendant 16 heures à 37°C dans une atmosphère à 5% CO2. Les kératinocytes sont alors rincés avec du PBS pour éliminer les cellules non-adhérentes puis exposés aux produits à tester inclus dans du MEM sans SVF (qui pourrait interférer dans le dosage). - Selon les extraits, une solution mère à 1 g/ml d’échantillon est préparée dans le DMSO ou directement dans le milieu de culture à 1 mg/ml. Des dilutions sont réalisées dans du MEM sans SVF. Les extraits sont testés en culture aux concentrations 0,1, 1 et 5 µg/ml. - Le palmitate de β-Amyrine est solubilisé dans du DMSO à 200 mg/ml. Une solution mère à 500µg/ml est ensuite préparée dans le MEM sans SVF. L’échantillon est testé en culture aux concentrations de 10, 50 et 100 µg/ml. Ces concentrations ont été choisies après un test de cytotoxicité et qui n’a révélé aucune toxicité.

208

Pour chaque lot, 3 puits sont réalisés. Les cellules sont pré-incubées pendant 60 mn avec le produit à tester puis un agent stimulant de la cascade de l'acide arachidonique, l’ionophore calcique (A23187 à 5µM), est ajouté pendant 5 heures. Ce temps écoulé, les milieux de culture de chaque puits sont récupérés, centrifugés à 3000 tr/mn et conservés à -80°C. La production de prostaglandine 6KF1α pour chacun des essais est mesurée par le Kit Elisa EUROMEDEX. Les lots suivants ont été réalisés : - Lot témoin - Lot témoin stimulé A23187 5µM - Extrait acétate d’éthyle 0,1 µg/ml + A23187 5µM - Extrait acétate d’éthyle 1 µg/ml + A23187 5µM - Extrait acétate d’éthyle 5 µg/ml + A23187 5µM - Extrait butanolique 0,1 µg/ml + A23187 5µM - Extrait butanolique 1 µg/ml + A23187 5µM - Extrait butanolique 5 µg/ml + A23187 5µM - Extrait aqueux 0,1 µg/ml + A23187 5µM - Extrait aqueux 1 µg/ml + A23187 5µM - Extrait aqueux 5 µg/ml + A23187 5µM - palmitate de β-amyrine 10 µg/ml + A23187 5µM - palmitate de β-amyrine 50µg/ml + A23187 5µM - palmitate de β-amyrine 100µg/ml + A23187 5µM C) Activité du palmitate de β-amyrine sur l’expression de l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1 Test effectué à l’Institut de Recherche Pierre Fabre (Toulouse) Département Evaluation et Exploration Fonctionnelle et Cutanée Laboratoire de Biologie Cellulaire Par Mmes A. BEL et M. CHARVERON Cellules : Des fibroblastes humains normaux sont isolés à partir de biopsies cutanées issues de plasties mammaires et cultivés dans du milieu de culture DMEM (Gibco- Ref : 41965-039), supplémenté en sérum de nouveau-né (SNN) (10%) et en antibiotiques Pénicilline/Streptomycine (P/S) (1%).

209

Réactifs et Matériel: Milieu de culture DMEM (Gibco - Réf : 41965-039) Sérum de nouveau-né (Gibco - Réf : 16010084) Trypsine EDTA (Gibco - Réf : 043-05300) Tampon phosphate (PBS) pH 7,4 : (Gibco - Réf : 076-01300) Phorbol 12-Meristate 13-Acetate (PMA) (Sigma - Réf : P8139) Boîte de culture 60mm (Falcon - Réf : 3004) Kit extraction RNA-PLUS (Bioprobe - Réf : RNAPO2) Kit Access RT-PCR System (Promega - Réf : A1250) Agarose (Promega - Réf : V312A) Bromure d’ethidium (Sigma - Réf : E8751) Echantillon testé : palmitate de β-amyrine Protocole : A confluence, les fibroblastes humains normaux sont décollés à l’aide de la trypsine et sont réensemencés dans des boîtes de 60 mm à un taux d’ensemencement de 0,8x10 6 cellules dans du DMEM avec 10% SNN, 1% P/S. Les cellules sont incubées pendant 18 heures à 37°C, 5% CO2, atmosphère humide. Les cellules, ici à passage P4, sont ainsi prêtes pour les tests. Le palmitate de β-amyrine est testé à la concentration finale de 100µg/ml. Dans du DMEM, 1% SNN et 1% P/S, concentration déjà testée en activité anti-inflammatoire et présentant des propriétés anti-inflammatoires significatives. Les cellules sont préincubées avec les actifs pendant 24 heures. Un témoin est réalisé en parallèle ne contenant que du DMEM avec 1% SNN et 1% P/S. Au bout de 24 heures, les cellules sont rincées au PBS et sont alors mises en contact pendant 24 heures supplémentaires avec la stimulation inflammatoire chimique (PMA à 0,1µM), préparée dans du DMEM avec 1% SNN et 1% P/S. En parallèle, un témoin absolu est réalisé n’ayant reçu aucune stimulation inflammatoire. En fin de stimulation, les ARN totaux sont extraits. Extraction des ARN totaux : L’extraction se fait à l’aide du kit RNA PLUS suivant le protocole indiqué. Les cellules sont lysées par la solution d’extraction du kit, puis les ARN sont extraits par des traitements successifs au chloroforme, à l’éthanol 75% et l’isopropanol. L’ARN est récupéré et dosé par spectrométrie. RT-PCR : 1µg d’ARN totaux est utilisé pour la réaction de RT-PCR. A cet ARN est ajouté un mélange de dNTP, d’enzymes Reverse transcriptase et DNA Polymérase, de MgSO4 25mM, de tampon, issu du kit Access RT-PCR System (Promega) et les deux amorces. Celles-ci, issues de la séquence de la MMP-a pour la réaction d’hybridation, sont les suivantes : amorce 5’ : 5’ CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA 3’ amorce 3’ : 5’ AAGGTTAGCTTACTGTCACACGCTT 3’

210

Après amplification, les divers échantillons sont déposés dans un gel d’agarose 3% soumis à un champ électrique. En fin de migration, le gel préalablement coloré au bromure d’ethidium est observé sous UV. D) Mesure d’une activité antiradicalaire Matériel : Spectrophotomètre U-2000 (Hitachi) pour les extraits Lecteur de plaques 96 puits pour les composés Microplaque 96 puits Seroawe Réf : 612F96 Réactifs : DPPH (radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl) : Réf 43180 / Fluka® TROLOX (acide 6-hydroxy-2,5,8-tetramethylchromane-2-carboxylique, dérivé de la vitamine E) : Réf 56510 / Fluka® Produits testés : Extrait EtOAc Extrait BuOH Extrait H2O Acide gallique Gallate d’éthyle Kaempferol Quercétine Quercitrine Quercitrine 3’-sulfate Quercétine 3,3’-disulfate Quercétine 3,3’,4’-trisulfate Les extraits sont testés dans le MeOH à une concentration de 20 mg/L. Les composés quant à eux, ont été testés dans le MeOH aux concentrations suivantes : 200, 100, 50, 10 et 2 µM. Protocole : -Pour les extraits, le protocole suivi est celui de : Fourneau C. et al., Phytotherapy Research, 10, (1996), 529-530. L’évaluation de l’activité antioxydante est évaluée en ajoutant 2 ml d’une solution de DPPH (0,25 mmole/L dans MeOH) à 2 ml d’une solution de l’échantillon (20 mg/L dans MeOH). Après agitation, on laisse reposer 1H à l’obscurité puis on mesure à λ 521 nm contre le MeOH. La dégradation du DPPH est évaluée par comparaison avec l’échantillon standard (2ml de DPPH et 2 ml de MeOH). Il est procédé à trois mesures par échantillon. -Pour les composés testés, nous ajoutons dans les plaques 96 puits, 100 µl de la solution à analyser et 100 µl de solution de DPPH à 0,5 mM dans le MeOH (le témoin est effectuer avec 100 µl de MeOH et 100 µl de solution de DPPH). Après agitation, on place la plaque à 211

l’obscurité à TA pendant 30 min, puis on lit l’absorbance à λ 550 nm. Nous avons procédé à 3 mesures par échantillon. Les mesures sont effectuées après 30 min, temps au bout duquel l’activité est maximale et stable. Le résultat est exprimé en pourcentage de dégradation du DPPH : DO de la solution X % de dégradation du DPPH = 1X 100 DO dans le MeOH

212

VII FICHES

Terp-1 (E-phytol) 3

11

7

2

CH2OH 1

15

PM = 296 C20H40O Comportement chromatographique : CCM SiO2

cHex-EtOAc (9:1 v:v)

Rf=0,18

Données RMN en ppm dans CDCl3 à 200 (50) MHz : H: δ 5,39 (H-2, 1H, tq, J=1,2 et 6,9 Hz), 4,13 (H-1, 2H, d, J=6,9 Hz), 1,97 (H-4, 2H, t, J=7,4 Hz), 1,65 (Me-3, 3H, sl), 1,53 (H-15, 1H, hept, J=6,4 Hz), 0,85 (H-16 et Me-15, 6H, d, J=6,5 Hz), 0,83 (Me-7 et Me-11, 6H, d, J=6,3 Hz) 1

C: δ 140,3 (C-3), 123,1 (C-2), 59,5 (C-1), 39,9 (C-4), 39,4 (C-14), 37,4 (C-8, C10 et C-12), 36,7 (C-6), 32,8 (C-7 et C-11), 28,0 (C-15), 25,2 (C-5), 24,8 (C-13), 24,5 (C-9), 22,7 (C-16 et Me-15), 19,8 (Me-7 et Me-11), 16,2 (Me-3) 13

Données SM DCI (NH3+ isobutane), mode négatif m/z : 314 [M+NH4]+, 297 [M+H]+, 296 [M+NH4-H2O]+, 279 [M-H2O+H]+, 123 (C9H15+), 97 (C7H13+), 85 (C5H9O+), 83 (C6H11+), 81 (C6H9+)

213

Terp-2 (squalène) 19

23

15 6

10

2

PM = 410 C30H50 Comportement chromatographique : CCM SiO2 CCM C-18

cHexane MeOH-CHCl3 (70:30 v:v)

Rf=0,6 Rf=0,6

Données RMN en ppm dans CDCl3 à 200 (50) MHz : H: δ 5,10 (H-3, H-22, H-7, H-11, H-14, H-18, m), 2,1-2,0 (H-4, H-21, H-8, H-17), 2,05-1,95 (H-12, H-13), 2,0-1,9 (H-5, H-9, H-16, H-20), 1,66 (Me-1 et Me-24, s, 6H), 1,58 (Me-2, Me-23, Me-6, Me-10, Me-15 et Me-19, 18H, s) 1

C (J modulé): δ 135,10 (C, C-6, C-19), 134,89 (C, C-10, C-15), 131,22 (C, C-2,C23), 124,42 (CH, C-3, C-22), 124,31 (CH, C-7, C-11, C-14, C-18), 39,75 (CH2, C-5, C-9, C-16, C-20), 28,28 (CH2, C-12, C-13), 26,79 (CH2, C-4, C-21), 26,70 (CH2, C8, C-17), 25,67 (CH3, Me-1, Me-24), 17,66 (CH3, Me-2, Me-23), 16,03 (CH3, Me-6, Me-10, Me-15, Me-19) 13

Données SM DCI (NH3 + isobutane): m/z : 428 [M+NH4]+, 411 [M+H]+, 428 [M+H]+, 342 [M-C5H9+H]+, 274 [MC10H17+H]+, 206 [M-C15H25+H]+, 138 [M-C20H33+H]+, 70 [M-C25H41+H]+

214

Terp-3 (lupéol) 29

CH2

30 20 19

21 22

25

3

26

28

27

HO 24

23

PM = 426 C30H50O Comportement chromatographique : CCM SiO2

cHexane-EtOAc (70:30 v:v)

Rf=0,5

Données RMN en ppm dans CDCl3 à 200 (50) MHz : H: δ 4,67 (H-29a, 1H, dl, J=2,5 Hz), 4,55 (H-29b, 1H, dd, J=2,5 et 1,2 Hz), 3,18 (H-3, 1H, dm, J=10 Hz), 2,34 (H-19, 1H, m), 1,66 (Me-30, 3H, sl), 1,01 (Me-27, 3H, s), 0,95 (Me-25, 3H, s), 0,92 (Me-23, 3H, s), 0,89 (Me-28, 3H, s), 0,85 (Me-26, 3H, s), 0,74 (Me-24, 3H, s) 1

C (J modulé) : δ 151,0 (C-20), 109,3 (C-29), 79,0 (C-3), 55,4 (C-5), 50,5 (C-9), 48,4 (C-18), 47,8 (C-19), 43,0 (C-17), 42,8 (C-14), 40,8 (C-8), 40,0 (C-22), 38,8 (C-4), 38,7 (C-1), 38,1 (C-13), 37,2 (C-10), 35,6 (C-16), 34,3 (C-7), 29,7 (C-21), 28,0 (C-23), 27,5 (C-2, C-15), 25,2 (C-12), 21,0 (C-11), 19,4 (C-30), 18,4 (C-6), 18,0 (C-28), 16,1 (C-25), 16,0 (C-26), 15,4 (C-24), 14,5 (C-27) 13

Données SM DCI (NH3 + isobutane): m/z : 444 [M+NH4]+, 427 [M+H]+, 409 [M-H2O+H]+, 394 [M-H2O-Me+H]+, 218 (g), 207 (a), 203 (g-15), 190 [a-OH+H]+, 136, 135, 121

215

Terp-4 (β-amyrine) 29

12 25

24

H

26

28 27

3

HO

30

23

PM = 426 C30H50O Comportement chromatographique : CCM SiO2

cHexane - CHCl3 (5:5 v:v) cHexane - EtOAc (9:1 v:v)

Rf=0,08 Rf=0,22

Données RMN en ppm dans CDCl3 à 200 (50) MHz : H: δ 5,17 (H-12, 1H, t, J=3,6 Hz), 3,21 (H-3, 1H, dd, J=5,4 et 9,9 Hz), 2,1-1,0 nd, 1,12 (Me-27, 3H, s), 0,98 (Me-26, 3H, s), 0,95 (Me-25, 3H, s), 0,92 (Me-23, 3H, s), 0,85 (Me-29 et Me-30, 6H, s), 0,82 (Me-28, 3H, s), 0,78 (Me-24, 3H, s) 1

C (J modulé): δ 145,2 (Q C-13), 121,7 (CH C-12), 79,0 (CHOH C-3), 55,2 (CH C5), 47,7 (CH C-9), 47,3 (CH C-18), 46,9 (CH2 C-19), 41,7 (Q C-14), 39,8 (Q C-8), 38,8 (Q C-4), 38,6 (CH2 C-1), 37,2 (CH2 C-22), 37,0 (Q C-10), 34,8 (CH2 C-21), 33,3 (CH3 C-29), 32,7 (CH2 C-7), 32,5 (Q C-17), 31,1 (Q C-20), 28,4 (CH3 C-28), 28,1 (CH3 C-23), 27,3 (CH2 C-2), 27,0 (CH2 C-16), 26,2 (CH2 C-15), 26,0 (CH3 C27), 23,7 (CH3 C-30), 23,6 (CH2 C-11), 18,4 (CH2 C-6), 16,8 (CH3 C-26), 15,6 (CH3 C-24 et C-25) 13

Données SM DCI (NH3 + isobutane): m/z : 427 [M+H]+, 412 [M-CH3+H]+, 409 [M-H2O+H]+, 218 (g’), 207 (a), 203 (g’-15), 189 (g’-29, a-18)

216

Terp-5 (palmitate de β-amyrine) 29

12 25

30

H

26

28

27

3

C15 H31 COO 24

23

PM = 664 C46H80O2 Comportement chromatographique : CCM SiO2 CCM C-18

cHexane- CHCl3(50:50 v:v) cHexane-CH2Cl2-EtOAc (75:20:5 v:v:v) MeOH-CHCl3 (70:30 v:v)

Rf=0,6 Rf=0,45 Rf=0,63

Pouvoir rotatoire [α] 20 D = +58° (c 0,2, CHCl3)

Données RMN en ppm dans CDCl3 à 200 (50) MHz : H: δ 5,16 (H-12, 1H, t, J=3,5 Hz), 4,49 (H-3, 1H, dd, J=7,6 et 8,3 Hz), 2,27 (H-2’, 2H, t, J=7,5 Hz), 2,2-1,2 nd, 1,11 (Me-27, 3H, s), 0,95 (Me-25 et Me-24 ou Me-26, 6H, s), 0,85 (Me-23, Me-24 ou Me-26, Me-28, Me-29 et Me-30, 15H, sl), 0,81 (Me16’, 3H, s) 1

C (J modulé) : δ 173,5 (COO C-1’), 145,2 (C C-13), 121,7 (CH C-12), 80,6 (CHOO C-3), 55,3 (CH C-5), 47,6 (CH C-9), 47,3 (CH C-18), 46,8 (CH2 C-19), 41,7 (C C-14), 39,8 (C C-8), 38,3 (CH2 C-1), 37,7 (C C-4) 37,8, 37,2 (CH2 C-22), 36,9 (C C-10), 34,8 (CH2 C-21 et C-2’), 33,3 (CH3 C-29), 32,6 (CH2 C-7), 32,5 (C C-17), 31,9 (CH2 C-14’), 31,1 (C C-20), 29,7 (CH2 C-4’), 29,6 (CH2 C-13’), 29,4, 29,3, 29,2, 28,4 (CH3 C-28), 28,1 (CH3 C-23), 26,9 (CH2 C-16), 26,2 (CH2 C-15), 25,9 (CH3 C-27), 25,2 (CH2 C-3’), 23,7 (CH3 C-30), 23,6 (CH2 C-11), 23,5 (CH2 C2), 22,7 (CH2 C-15’), 18,3 (CH2 C-6), 16,8 (CH3 C-24 et C-26), 15,5 (CH3 C-25), 14,1 (CH3 C-16’) 13

Données SM DCI (NH3 + isobutane): m/z : 682 [M+NH4]+, 665 [M+H]+, 650 [M-CH3+H]+, 409 [M-palm+H]+, 256 (palmitoyl), 239 (palm-OH), 218 (g’), 207 (a), 203 (g’-15), 189 (a-18 et g’-29) EI m/z : 664 [M].+

217

Terp-6 (coriolate de β-amyrine) 30

29

12 25

1' 9'

26

3

28

27

COO

Z 13' 11'

E

18'

24

23

OH

PM = 704 C48H80O3 Comportement chromatographique : CCM SiO2

cHexane - EtOAc (9:1 v:v)

Rf=0,22

Données UV (CH2Cl2) et pouvoir rotatoire : λmax = 236 nm [α] 20 D = +32° (c 0,2, CHCl3)

Données RMN en ppm dans CDCl3 à 200 (50) MHz : H: δ 6,47 (H-11’, 1H, dd, J=11,2 et 15,1 Hz), 5,95 (H-10’, 1H, dd, J=11,1 et 11,4 Hz), 5,65 (H-12’, 1H, dd, J=15,2 et 8,2 Hz), 5,48 (H-9’, 1H, dd, J=11,5 et 7,5 Hz), 5,16 (H-12, 1H, t, J=3,5 Hz), 4,49 (H-3, 1H, dd, J=7,6 et 8,2 Hz), 4,11 (H-13’, 1H, m), 2,27 (H-2’, 2H, t, J=7,3 Hz), 2,1-1,0 nd, 1,12 (Me-27, 3H, s), 0,98 (Me-26, 3H, s), 0,95 (Me-25, 3H, s), 0,92 (Me-23, 3H, s), 0,85 (Me-29 et Me-30, 6H, s), 0,82 (Me-28, 3H, s), 0,78 (Me-24, 3H, s) 1

C (J modulé) : δ 173,6 (COO C-1’), 145,2 (C C-13), 135,8 (CH C-12’), 133,0 (CH C-11’)°, 127,7 (CH C-10’)°, 125,8 (CH C-9’), 121,7 (CH C-12), 80,6 (CHOO C-3), 72,9 (C C-13’), 55,3 (CH C-5), 47,6 (CH C-9), 47,3 (CH C-18), 46,8 (CH2 C-19), 41,7 (C C-14), 39,8 (C C-8), 38,3 (CH2, C-1), 37,8 (C C-4), 37,3 (CH2 C-22), 36,9 (C C-10), 34,8 (CH2 C-21 et C-2’), 33,3 (CH3 C-29), 32,6 (CH2 C-7), 32,5 (C C17), 31,1 (C C-20), 28,4 (CH3 C-28), 28,1 (CH3 C-23), 27,0 (CH2 C-16), 26,2 (CH2 C-15), 26,0 (CH3 C-27), 25,3 (CH2 C-3’), 23,7 (CH3 C-30), 23,6 (CH2 C-11), 23,5 (CH2 C-2), 22,6 (CH2 C-17’), 18,3 (CH2 C-6), 16,8 (CH3 C-24 et C-26), 15,5 (CH3 C-25), 14,0 (CH3 C-18’) ° interchangeable 13

Données SM DCI (NH3 + isobutane): m/z : 722 [M+NH4]+, 705 [M+H]+, 690 [M-CH3+H]+, 409 [M-H2O+H]+, 295 (C18H31O3+), 279 (C18H31O2+), 218 (g’), 207 (a), 203 (g’-15), 189 (g’-29, a-18), 167, 71 (C4H9+)

218

Terp-7 (palmitate d’α-amyrine) 30 29

19

12 25

26

28

3 27

C15H31COO 1' 24

23

PM = 664 C46H80O2 Comportement chromatographique : CCM SiO2 CCM C-18

cHexane- CHCl3(50:50 v:v) MeOH-CHCl3 (50:50 v:v)

Rf=0,6 Rf=0,5

Pouvoir rotatoire : [α] 20 D = +53° (c 0,2, CHCl3)

Données RMN en ppm dans CDCl3 à 200 (50) MHz : H: δ 5,11 (H-12, 1H, t, J=3,6 Hz), 4,48 (H-3, 1H, dd, J=7,6 et 9,6 Hz), 2,27 (H-2’, 2H, t, J=7,5 Hz), 2,2-0,80 nd 1

C (J modulé) : δ 173,6 (COO C-1’), 139,8 (C C-13), 124,4 (CH C-12), 80,6 (CHOO C-3), 59,1 (CH C-18), 55,3 (CH C-5), 47,7 (CH C-9), 42,1 (C C-14), 41,6 (CH2 C-22), 40,1 (C C-8), 39,6 (CH C-19 et C-20), 38,5 (CH 2 C-1), 37,7, 37,8 (C C-4), 36,8 (C C-10), 34,9 (CH2 C-2’), 33,8 (C C-17), 32,9 (CH2 C-7), 31,9 (CH2 C14’), 31,3 (CH2 C-21), 29,7 (CH2 C-4’), 29,6 (CH2 C-13’), 29,4, 29,3 (CH2 C-15), 29,2, 28,7 (CH3 C-23), 28,1 (CH3 C-28), 26,6 (CH2 C-16), 26,2, 25,2 (CH2 C-3’), 23,7 (CH2 C-2), 23,4 (CH2 C-11), 23,3 (CH3 C-27), 22,7 (CH2 C-15’), 21,4 (CH3 C30), 18,3 (CH2 C-6), 17,5 (CH3 C-29), 16,8 (CH3 C-24 et C-26), 15,7 (CH3 C-25), 14,1 (CH3 C-16’) 13

Données SM DCI (NH3 + isobutane): m/z : 682 [M+NH4]+, 665 [M+H]+, 409 [M-palm+H]+, 256 (palmitoyle), 218 (g’)

219

Flav-1 (kaempferol) 4'

HO

OH

O

3 5

OH

OH

O

PM = 286 C15H10O6 Comportement chromatographique : CCM SiO2

EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v)

Rf=0,8

Données UV (MeOH) : λ max = 265 et 365 nm respectivement bande II et I +NaOAc 274, 302,5, 389, +NaOAc+H3BO3 269, 375, +NaOMe 278, 415déc, +AlCl3 268, 352, 427, +AlCl3+HCl 268,5, 350,5, 427 Données RMN en ppm dans DMSO-d6 à 200 (50) MHz : H: δ 12,46 (OH-5, s), 10,73 (OH-7, s)°, 10,06 (OH-3, s)°, 9,33 (OH-4’, s)°, 8,03 (H-2’et H-6’, 2H, dd, J=2,6 et 8,9 Hz), 6,91 (H-3’ et H-5’, 2H, dd, J=2,7 et 8,9), 6,43 (H-8, d, J=2,0), 6,18 (H-6, d, J=1,9) 1

° interchangeable

C: δ 175,9 (C-4), 163,8 (C-7), 160,7 (C-5), 159,1 (C-4’), 156,1 (C-9), 146,8 (C-2), 135,6 (C-3), 129,4 (C-2’ et C-6’), 121,6 (C-1’), 115,4 (C-3’ et C-5’), 103,0 (C-10), 98,1 (C-6), 93,4 (C-8) 13

Données SM FAB: matrice glycérol, mode négatif m/z : 285 [M-H]-

220

Flav-2 (quercétine) OH 3'

OH 4'

HO

O 9 10

3

OH

5

OH

O

PM = 302 C15H10O7 Comportement chromatographique : CCM SiO2

EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v) EtOAc-AcCOOH-HCOOH-H2O (100:11:11:26 v:v:v:v) BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (4:1:5 v:v:v)

Rf=0,75 Rf=0,9 Rf=0,8

Données UV (MeOH) : λmax = 255 et 369 nm respectivement bande II et I +NaOAc 267,5, 322,5, 389,5 déc, +NaOAc+H3BO3 259, 386, +NaOMe 252, 325 déc, +AlCl3 271, 339, 456, +AlCl3+HCl 268,365, 429

Données RMN en ppm dans DMSO-d6 à 200 (50) MHz : H: δ 12,46 (OH-5), 10,76 (OH-7)°, 9,55 (OH-3)°, 9,30 (OH-4’)°, 9,26 (OH-3’)°, 7,66 (H-2’, d, J=1,8 Hz), 7,53 (H-6’, dd, J= 8,4 et 2,0 Hz), 6,87 (H-5’, d, J=8,5 Hz), 6,40 (H-8, d, J=1,7 Hz), 6,17 (H-6, d, 1,6 Hz) 1

° interchangeable

C: δ 175,8 (C-4), 163,6 (C-7), 160,7 (C-5), 156,1 (C-9), 147,8 (C-4’), 146,7 (C2), 145,0 (C-3’), 138,6 (C-3), 121,9 (C-1’), 119,9 (C-6’), 115,5 (C-5’), 114,9 (C-2’), 102,9 (C-10), 98,1 (C-6), 93,3 (C-8) 13

Données SM DCI (NH3+ isobutane), mode négatif m/z : 303 [M+H]+ FAB: matrice glycérol, mode négatif m/z : 301 [M-H]-

221

Flav-3 (quercitrine) OH OH 4'

HO

O

3

O OH

O

Rha-1

O

OH OH OH

CH3 Rha-6

PM = 448 C21H20O11 Comportement chromatographique : CCM SiO2

EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v) BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (40:10:50 v:v:v) EtOAc-HCOOH-AcCOOH-H2O (100:11:11:26 v:v:v:v)

Rf=0,65 Rf=0,75 Rf=0,75

Données UV (MeOH) : λmax = 255 et 347,5 nm respectivement bande II et I +NaOAc 270,5, 369, +NaOAc+H3BO3 259,5, 365, +NaOMe 269,5, 388,5, +AlCl3 273,5, 383, 429,5, +AlCl3+HCl 270, 399,5, HCl 255, 350

Pouvoir rotatoire : [α] 20 D = -158° (c 0,2, MeOH)

Données RMN en ppm dans DMSO-d6 à 200 (50) MHz : H: δ 12,64 (OH-5), 10,83 (OH-7)°, 9,66 (OH-4’)°, 9,29 (OH-3’)°, 7,29 (H-2’, d, J=1,9 Hz), 7,24 (H-6’, dd, J=2,2 et 8,4 Hz), 6,86 (H-5’, d, J=8,3 Hz), 6,38 (H-8, d, J=2,0 Hz), 6,20 (H-6, d, 2,0 Hz), 5,24 (Rha-1, d, 1,1 Hz), 3,96 (Rha-2, sl), 3,50 (Rha-3, dd, J=3,1 et 8,6 Hz), 3,29-3,21 (Rha-4, nd), 3,21-3,08 (Rha-5, nd), 0,81 (Rha-6, d, J=5,5 Hz) ° interchangeable 1

C: δ 177,7 (C-4), 164,1 (C-7), 161,2 (C-5), 157,2 (C-9), 156,4 (C-2), 148,4 (C4’), 145,1 (C-3’), 134,2 (C-3), 121,0 (C-6’), 120,7 (C-1’), 115,8 (C-5’), 115,4 (C2’), 104,0 (C-10), 101,8 (Rha-1), 98,6 (C-6), 93,6 (C-8), 71,1 (Rha-4), 70,5 (Rha3), 70,3 (Rha-2), 70,0 (Rha-5), 17,4 (Rha-6) 13

Données SM DCI (NH3+ isobutane), mode négatif m/z : 449 [M+H]+, 303 [M-Rha+H]+, 164 (Rha) FAB: matrice glycérol, mode négatif m/z : 447 [M-H]-, 301 [M-Rha-H]-

222

Flav-4 (quercitrine 3’-sulfate) OSO3-

OH 4'

HO

O

3

O OH

O

Rha-1

O

OH OH OH

CH3 Rha-6

PM = 527 C21H19O14S Comportement chromatographique : CCM SiO2

EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v) BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (40:10:50 v:v:v) EtOAc-HCOOH-AcCOOH-H2O (100:11:11:26 v:v:v:v)

Rf=0,4 Rf=0,6 Rf=0,5

Données UV (MeOH) : λmax = 265 et 342 nm respectivement bande II et I +NaOAc 268, 344, +NaOAc+H3BO3 269, 342, +NaOMe 272, 324, 392, +AlCl3 273, 357, 395, +AlCl3+HCl 274, 341, 389,5, HCl 256, 355 Pouvoir rotatoire : [α] 20 D = -10° (c 0,2, MeOH)

Données RMN en ppm dans DMSO-d6 à 200 (50) MHz : H: δ 12,59 (OH-5), 10,83 (OH-7), 9,62 (OH-4’), 7,76 (H-2’, d, J=2,0 Hz), 7,52 (H6’, dd, J=2,3 et 8,5 Hz), 6,96 (H-5’, d, J=8,1 Hz), 6,39 (H-8, d, J=2,0 Hz), 6,20 (H6, d, J=2,1 Hz), 5,20 (Rha-1, sl), 3,98 (Rha-2, sl), 3,55 (Rha-3, m), 3,1 (Rha-4, nd) 3,3-3,0 (Rha-5, nd), 0,80 (Rha-6, d, J=5,7 Hz) 1

C: δ 177,6 (C-4), 164,2 (C-7), 161,2 (C-9), 156,7 (C-5), 156,4 (C-2), 151,7 (C4’), 140,7 (C-3’), 134,5 (C-3), 125,6 (C-6’), 123,0 (C-1’), 120,8 (C-2’), 117,0 (C5’), 104,1 (C-10), 102,0 (Rha-1), 98,7 (C-6), 93,6 (C-8), 71,4 (Rha-4), 70,6 (Rha3), 70,1 (Rha-2 et Rha-5), 17,4 (Rha-6) 13

Données SM FAB: matrice glycérol, mode négatif m/z : 527 [M-H]-, 447 [M-SO3-H]-, 300 [M-SO3-Rha-H]-

223

Flav-5 (quercétine 3,3’-disulfate) OSO33' OH 4'

HO

O 9 10

3

OSO3-

5

OH

O

PM = 462 si 2H (506 si 2Na) C15H10O13S2 Comportement chromatographique : CCM SiO2

EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v) BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (4:1:5 v:v:v)

Rf=0,15 Rf=0,38

Données UV (MeOH) : λmax = 268 et 342 nm respectivement bande II et I +NaOAc 275, 307s, 387 +NaOAc+H3BO3 268, 349, +NaOMe 275, 328s, 398, +AlCl3 276, 308s, 364, 396s, +AlCl3+HCl 277, 349, 395s, HCl 255, 369 Données RMN en ppm dans DMSO-d6 à 200 (50) MHz : H: δ 8,04 (H-6’, dd, J=2,3 et 8,6 Hz), 7,85 (H-2’, d, J=2,1 Hz), 6,87 (H-5’, d, J=8,7 Hz), 6,39 (H-8, d, J=2,1 Hz), 6,16 (H-6, d, J=2,1 Hz) 1

C: δ 177,6 (C-4), 163,9 (C-7), 161,2 (C-5), 156,0 (C-9), 155,7 (C-2), 151,8 (C4’), 140,5 (C-3’), 132,5 (C-3), 126,9 (C-6’), 123,0 (C-1’), 121,6 (C-2’), 116,8 (C5’), 104,1 (C-10), 98,4 (C-6), 93,3 (C-8) 13

Données SM FAB: matrice glycérol, mode négatif m/z : 499 [M+K-2H]-, 483 [M+Na-2H]-, 461 [M-H]-, 403 [M-SO3+Na-2H]-, 381 [M-SO3-H]-, 301 [M-2SO3-H]-

224

Flav-6 (quercétine 3,3’,4’-trisulfate) OSO 3 3' 4'

HO

OSO 3-

O 7 3 5

OH

OSO 3-

O

PM = 542 (si 3H) C15H10O16S3 Comportement chromatographique : CCM SiO2

BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (4:1:5 v:v:v)

Rf=0,1

Données UV (MeOH) : λmax = 268 et 311 nm respectivement bande II et I +NaOAc 275, 356 +NaOAc+H3BO3 268, 313, +NaOMe 276, 360, +AlCl3 279, 307s, 389, +AlCl3+HCl 277, 337, HCl 325, 368 Données RMN en ppm dans DMSO-d6 à 200 (50) MHz : H: δ 8,12 (H-2’, d, J=2,2 Hz), 8,03 (H-6’, dd, J=2,2 et 8,9 Hz), 7,59 (H-5’, d, J=8,9 Hz), 6,33 (H-8, d, J=2,0 Hz), 6,16 (H-6, d, J=2,0 Hz) 1

C: δ 177,6 (C-4), 162,8 (C-7), 160,2 (C-5), 154,8 (C-9), 147,5 (C-2), 145,3 (C4’), 141,7 (C-3’), 132,1 (C-3), 123,5 (C-1’), 122,5 (C-6’), 118,5 (C-2’), 117,4 (C5’), 103,0 (C-10), 97,3 (C-6), 92,0 (C-8) 13

Données SM FAB: matrice glycérol, mode négatif m/z : 655 [M+3K-4H]-, 617 [M+2K-3H]-, 585 [M+2Na-3H]-, 563 [M+Na-2H]-, 541 [M-H]-, 499 [M-SO3+K-2H]-, 461 [M-SO3-H]-, 381 [M-2SO3-H]-, 301 [M-3SO3-H]-

225

Flav-7 (méarnsitrine) OH OMe 4'

HO

O OH 3

O OH

O

Rha-1

O

OH OH OH

CH3 Rha-6

PM = 478 C22H22O12 Comportement chromatographique : CCM SiO2

BAW : BuOH-AcCOOH-H2O (40:10:50 v:v:v) EtOAc-HCOOH-AcCOOH-H2O (100:11:11:26 v:v:v:v)

Rf=0,80 Rf=0,75

Données UV (MeOH) : λmax = 263 et 337,5 nm respectivement bande II et I +NaOAc 271,5, 360, +NaOAc+H3BO3 264, 330, +NaOMe 272, 361, +AlCl3 272,5, 300s, 337, 391, +AlCl3+HCl 273, 338,5, 389 Données RMN en ppm dans DMSO-d6 à 200 (50) MHz : H: δ 12,56 (OH-5), 11,9 (OH-7), 9,46 (OH-3’, OH-5’), 6,82 (H-2’ et H-6’, s, 2H), 6,37 (H-8, d, J=2,1 Hz), 6,20 (H-6, d, 2,0 Hz), 5,13 (Rha-1, d, 1,5 Hz), 3,98 (Rha-2, sl), 3,72 (4’-OMe, s, 3H), 3,5-3,0 (Rha-3, Rha-4 et Rha-5, nd), 0,79 (Rha-6, d, J=5,4 Hz) 1

C: δ 150,7 (C-4’), 108,1 (C-2’ et C-6’), 102,1 (Rha-1), 98,2 (C-6), 93,2 (C-8), 71,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-3), 70,3 (Rha-2), 70,1 (Rha-5), 59,8 (4’-OMe), 17,5 (Rha6) 13

Données RMN en ppm dans CD3OD C: δ 179,6 (C-4), 166,2 (C-7), 160,0 (C-2), 158,7 (C-9), 151,9 (C-3’ et C-5’), 139,4 (C-4’), 136,7 (C-3), 127,1 (C-1’), 109,8 (C-2’ et C-6’), 103,7 (Rha-1), 100,0 (C-6), 94,9 (C-8), 73,3 (Rha-4), 72,1 (Rha-5° et Rha-3°), 71,9 (Rha-2°), 60,9 (4’-OMe), 17,8 (Rha-6) 13

°

interchangeable, C-5 et C-10 non déterminé

Données SM DCI (NH3+ isobutane), mode négatif m/z : 479 [M+H]+, 333 [M-Rha+H]+, 180, 164 (Rha), 152

226

Ac Ph-1 (Acide gallique) COOH

HO

OH OH

PM = 170 C7H6O5 Comportement chromatographique : CCM SiO2

EtOAc-MeOH-H2O (100:16,5:13,5 v:v:v) CHCl3-MeOH-H2O (60:40:3 v:v:v) BAW (4:1:5 v:v:v) DIOL Hexane-EtOAc (30:70 v:v) C-18 H2O (100 v)

Rf=0,7 Rf=0,6 Rf=0,8 Rf=0,4 Rf=0,7

Données UV (MeOH) : λmax = 271,5 et 215,0 nm

Données RMN en ppm dans CD3OD à 200 (50) MHz : 1

H: δ 7,05 (H-2 et H-6, s)

C : δ 170,4 (C-1’), 146,4 (C-3 et C-5), 139,6 (C-4), 122,0 (C-1), 110,3 (C-2 et C6) 13

Données SM DCI (NH3+ isobutane) m/z : 188 [M+NH4]+, 171 [M+H]+, 153 [M-H2O+H]+

227

Ac Ph-2 (gallate d’éthyle) COOCH 2CH 3

1

HO

OH OH

PM = 198 C9H10O5 Comportement chromatographique : CCM SiO2

CHCl3-MeOH (9:1 v:v:)

Rf=0,3

Données UV (MeOH) : λmax = 273,5 et 215,5

Données RMN en ppm dans DMSO-d6 à 200 (50) MHz : H: δ 7,01 (H-2 et H-6, 2H, s), 4,24 (H-2’, 2H, q, J=7 Hz), 1,31 (H-3’, 3H, t, J=7 Hz) 1

C: δ 168,6 (C-1’), 146,5 (C-3 et C-5), 139,7 (C-4), 121,8 (C-1), 110,0 (C-2 et C6), 61,7 (C-2’), 14,6 (C-3’) 13

Données SM EI m/z : 198 [M].+, 170 (M-C2H5)+, 153 (M-COOEt)+

228

AG-1 (acide palmitique) OH

1 16

O

PM = 256 C16H32O2 Comportement chromatographique : CCM SiO2

CHCl3-MeOH (9:1 v:v:)

Rf=0,8

Données RMN en ppm dans DMSO-d6 à 200 (50) MHz : 1

H: δ 2,33 (H-2, 2H, t, J=7,3 Hz), 1,7-1,0 (CH2, nd), 0,86 (H-16, 3H, t, J=7 Hz)

C: δ 175,6 (C-1), 33,7 (C-2), 32,0 (C-3 ou C-14), 29,7-29,1 nd, 24,7 (C-15), 22,7, 14,1 (C-16) 13

Données SM EI m/z : 256 [M].+, et pertes successives de 14 uma

229

VIII Liste des noms usuels pour les flavones Nom Apigénine Hispiduline Lutéoline Chrysoériol Diosmétine 6-hydroxylutéoline Népétine Nodiflorétine Jaceosidine Hypolaétine Tricétine Tricine Vitexine Isovitexine Orientine Iso-orientine Isoscutellaréine

OH 5,7,4’ 5,7,4’ 5,7,3’,4’ 5,7,4’ 5,7,3’ 5,6,7,3’,4’ 5,7,3’,4’ 5,6,7,4’ 5,7,4’ 5,7,8,3’,4’ 5,7,3’,4’,5’ 5,7,4’ 5,7,4’ 5,7,4’ 5,7,3’,4’ 5,7,3’,4’ 5,7,8,4’

OMe

C-Gluc

6 3’ 4’ 6 3’ 6,3’ 3’,5’ 8 6 8 6

IX Liste des noms usuels pour les flavonols Nom Kaempferol Kaempferide Rhamnocitrine 6-hydroxykaempferol Quercétine Rhamnétine Isorhamnétine Tamarixétine Rhamnazine Ombuine Myricétine Patulétine Eupatolitine Spinacétine Jacéidine Véronicafoline Eupatine Quercétagétine Gossypétine

OH 3,5,7,4’ 3,5,7 3,5,4’ 3,5,6,7,4’ 3,5,7,3’,4’ 3,5,3’,4’ 3,5,7,4’ 3,5,7,3’ 3,5,4’ 3,5,3’ 3,5,7,3’,4’,5’ 3,5,7,3’,4’ 3,5,3’,4’ 3,5,7,4’ 5,7,4 3,5,4’ 3,5,3’ 3,5,6,7,3’,4’ 3,5,7,8,3’,4’

OMe 4’ 3’ 7 3’ 4’ 7,3’ 7,4’ 6 6,7 6,3’ 3,6,3’ 6,7,3’ 6,7,4’

230

X Liste des figures Page Figure 1 : Différents types de graines de Vitaceae et Leeaceae Figure 2 : Situation dans la systématique de Leea guineensis G. Don Figure 3 : Répartition géographique des Leea Figure 4 : Représentation de Leea guineensis Figure 5 : Feuille de L. guineensis provenant du Cameroun Figure 6 : Répartition géographique de L. guineensis Figure 7 : Schéma d’une stipule de L. guineensis Figure 8 : Représentation de L. guineensis Figure 9 : Diagramme floral Figure 10 : Les structures chimiques identifiées chez différentes Leea Figure 11 : Anthocyanes sulfatées isolées de Badiana stricta (Iridaceae) Figure 12 : Dihydroflavonol sulfaté isolé de Myrica rubra (Myricaceae) Figure 13 : Structure des nouvelles flavones sulfatées Figure 14 : Structure des nouveaux flavonols sulfatés Figure 15 : Modèle biosynthétique pour les flavonoïdes sulfatés chez Flaveria Figure 16 : Métabolisation des polyols Figure 17 : Extraction solide – liquide des feuilles Figure 18 : Extraction liquide – liquide Figure 19 : Isolement des composés de l’extrait hexanique Figure 20 : Isolement des composés de l’extrait dichlorométhane Figure 21 : Isolement des composés de l’extrait acétate d’éthyle Figure 22 : Isolement des composés de l’extrait butanolique Figure 23 : Isolement des composés de l’extrait aqueux Figure 24 : Profils chromatographiques des composés volatiles de bois et de feuilles Figure 25 : Répartition des différentes classes de constituants des distillats Figure 26 : Quelques exemples de spectres SM obtenus Figure 27 : Spectre 1H de Terp-1(200 MHz, CDCl3) Figure 28 : Fragmentation du squalène Figure 29 : Spectre 1H de Terp-2 (200 MHz, CDCl3) Figure 30 : Spectre 13C J modulé de Terp-2 (50 MHz, CDCl3) Figure 31 : XHCORR de Terp-2 (CDCl3) Figure 32 : Spectre DCI de Terp-3 Figure 33 : Fragmentations classiques d’un squelette de type lupane Figure 34 : Fragmentations classiques du squelette oléanène Figure 35 : Spectre 1H de Terp-4 (200 MHz, CDCl3) Figure 36 : Spectre EI de Terp-5 Figure 37 : Fragmentations de Terp-5 Figure 38 : Spectre 1H de Terp-5 (200 MHz, CDCl3) Figure 39 : Spectre 13C de Terp-5 (50 MHz, CDCl3) Figure 40 : Corrélations COSY de Terp-5 Figure 41 : Spectre DCI de Terp-6 Figure 42 : Fragmentations de Terp-6 Figure 43 : Spectre 1H de Terp-6 (200 MHz, CDCl3) Figure 44 : Agrandissement du spectre 1H de Terp-6 (500 MHz, CDCl3) Figure 45 : Agrandissement de la COSY de Terp-6 Figure 46 : Spectre 13C J modulé de Terp-6 (50 MHz, CDCl3)

9 10 16 17 20 21 22 23 25 30 41 41 44 47,48 53 58 67 67 68 69 70 71 72 73 76 78,79 80 83 83 84 85 87 88 89 90 92 92 93 94 94 96 96 97 98 99 99 231

Figure 47 : Spectre 13C J modulé de Terp-7 (50 MHz, CDCl3) 101 Figure 48 : Spectre 1H de Flav-1 (200 MHz, DMSO-d6) 104 1 Figure 49 : Spectre H de Flav-2 (200 MHz, DMSO-d6) 106 Figure 50 : Spectre 13C de Flav-2 (50 MHz, DMSO-d6) 106 Figure 51 : Spectre 1H de Flav-3 (200 MHz, DMSO-d6) 108 13 Figure 52 : Spectre C de Flav-3 (50 MHz, DMSO-d6) 109 Figure 53 : Spectre FAB- de Flav-4 110 Figure 54 : Spectre 1H de Flav-4 (200 MHz, DMSO-d6) 111 13 Figure 55 : Spectre C de Flav-4 (50 MHz, DMSO-d6) 112 Figure 56 : Spectre XHCORR de Flav-4 (200 MHz, DMSO-d6) 113 Figure 57 : Spectre COSY de Flav-4 (DMSO-d6) 114 Figure 58 : Spectre FAB- de Flav-5 115 Figure 59 : Spectre 1H de Flav-5 (200 MHz, DMSO-d6) 116 13 Figure 60 : Spectre C de Flav-5 (50 MHz, DMSO-d6) 117 Figure 61 : Spectre FAB- de Flav-6 118 Figure 62 : Spectre 1H de Flav-6 (200 MHz, DMSO-d6) 119 13 Figure 63 : Spectre C de Flav-6 (100 MHz, DMSO-d6) 120 Figure 64 : Spectre 1H de Flav-7 (300 MHz, DMSO-d6) 121 Figure 65 : Spectre 13C de Ac Ph-1 (50 MHz, CD3OD) 125 1 Figure 66 : Spectre H de Ac Ph-2 (200 MHz, CD3OD) 127 Figure 67 : Spectre EI de AG-1 128 Figure 68 : Métabolisation du XTT en formazan 130 Figure 69 : Activité des extraits EtOAc, BuOH et H2O sur la viabilité des kératinocytes humains SVK14 en culture pendant 48H 132 Figure 70 : Activité du palmitate de β-amyrine sur la production de prostaglandine 6KPGF1α par les kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique 5 µM 135 Figure 71 : Activité des extraits sur la production de prostaglandine 6KPGF1α par les kératinocytes humains SVK14 stimulés par l’ionophore calcique 5 µM 135 Figure 72 : Effet du palmitate de β-amyrine sur l’expression de l’ARNm de la MMP1 à la suite d’une stimulation inflammatoire 138 Figure 73 : Principales réactions dans l’organisme 139 Figure 74 : Activité antiradicalaire des différents extraits à 20 mg/ml 141 Figure 75 : Activité antiradicalaire des composés isolés 141

232

XI Liste des tableaux Page Tableau 1 : Classement taxonomique du genre Leea Tableau 2 : Situation des Leeaceae dans la systématique moderne Tableau 3 : Différences essentielles entre les Leeaceae et les Vitaceae Tableau 4 : Classification selon Clarke (1881) Tableau 5 : Classification selon Kirtikar et Basu (1975) Tableau 6 : Criblage de quelques Leea Tableau 7 : Principaux métabolites secondaires identifiés des différentes Leea Tableau 8 : Différentes activités biologiques décrites pour le genre Leea Tableau 9 : Les flavones sulfatées Tableau 10 : les flavonols sulfatés Tableau 11 : Répartition des flavonoïdes sulfatés chez les Magnoliophyta 50 Tableau 12 : Caractéristiques des flavonols sulfotransférases (F-ST) de Flaveria Tableau 13 : Flavonoïdes sulfatés inhibiteurs l’aldose réductase du cristallin obtenus Par synthèse Tableau 14 : Flavonoïdes sulfatés inhibiteurs de l’aldose réductase du cristallin isolé de Polygonum hydropiper Tableau 15 : Activité comparée de la rutine et de la rutine sulfate Tableau 16 : Rendements d’extraction Tableau 17 : Composés volatils de bois et de feuilles de L. guineensis Tableau 18 : données RMN de Terp-1 (200/50 MHz, CDCl3) Tableau 19 : données RMN de Terp-2 (200/50 MHz, CDCl3) Tableau 20 : Données RMN 1H des méthyles de Terp-4 (200 MHz, CDCl3) Tableau 21 : Différences essentielles entre le noyau oléan-12-ène et urs-12-ène Tableau 22 : Récapitulatif des données 13C des triterpènes et de leurs esters Tableau 23 : Effet de la sulfatation en 3’ sur Flav-4 112 Tableau 24 : Effet de la sulfatation en 3,3’ de Flav-5 Tableau 25 : Effet de la sulfatation en 3,3’,4’ de Flav-6 Tableau 26 : RMN 1H des flavonoïdes (200 MHz, DMSO-d6) Tableau 27 : RMN 13C des flavonoïdes (50 MHz, DMSO-d6) Tableau 28 : UV des flavonoïdes (λmax dans MeOH) Tableau 29 : SM des flavonoïdes en FAB (mode négatif, matrice glycérol) Tableau 30 : Données RMN des Acides Phénols (200/50 MHz, CD3OD) Tableau 31 : Taux de viabilité des kératinocytes en culture après 48H d’incubation avec les extraits Tableau 32 : Production de prostaglandines 6KF1α avec Terp-5 Tableau 33 : Production de prostaglandines 6KF1α avec les extraits Tableau 34 : Pourcentage de dégradation du DPPH par les composés testés Tableau 35 : Différents composés rencontrés chez les Rhamnales Tableau 36 : Liste des terpénoïdes isolés et de leurs propriétés biologiques Tableau 37 : Liste des polyphénols isolés et de leurs propriétés biologiques

6 7 8 11 12 27 29 38 42 45 53 58 59 60 66 75 82 86 90 91 102 117 119 123 123 124 124 127 131 134 134 140 145 146 147

233