ENZIMI PLASMATICI § Catalizzatori di natura proteica sintetizzati dalle cellule § concentrazioni molto basse → attività enzimatica § Unità Internazionali
§ quantità di enzima che, in determinate condizioni (37°C), trasforma una micro-mole di substrato in 1 minuto
ENZIMI PLASMATICI determinazione
§ Test colorimetrici § UV test
§ trasformazione di un coenzima (NADH → NAD+)
§ Siero o plasma (eparina) § NON EMOLITICO § Eventualmente congelare -20°C
ENZIMI PLASMATICI § Enzimi plasma specifici § § §
enzimi della coagulazione, colinesterasi sintesi epatica danno cellule epatiche → diminuzione enzimi nel plasma
ENZIMI PLASMATICI § Enzimi non plasma specifici § danno → aumento enzimi
§ enzimi di secrezione § amilasi, lipasi, fosfatasi § eliminazione tramite vie biliari o urina § enzimi legati al metabolismo cellulare § e. ubiquitari (LDH, aldolasi…) § e. organo-specifici (GLDH, CK…)
Eritrociti: AST, ALT, LDH, CK Emolisi
ENZIMI PLASMATICI Localizzazione
§ Attività enzimatica nel citosol è nettamente superiore a quella plasmatica § Citoplasma
§ ALT in C e F § marker sensibile di danno cellulare
§ Organelli citoplasmatici (mitocondri, reticolo endoplasmatico) § GLDH
§ Citoplasma e organelli citoplasmatici § AST
§ Membrana cellulare
§ ALP (membrana canalicolare degli epatociti)
ENZIMI PLASMATICI
Attività enzimatica nel plasma L’entità dell’aumento dipende da: § Attività tissutale innata § Quantità di tessuto danneggiato § Tipo di insulto § Velocità rimozione dal plasma § Localizzazione cellulare § Velocità aumento produzione dal tessuto di localizzazione (ALP nella crescita, per attività asteoclastica)
ENZIMI PLASMATICI Passaggio nel sangue avviene per:
§ lesioni necrotiche o degenerative § alterazione permeabilità della membrana cellulare
ENZIMI PLASMATICI Eliminazione
§ Degradazione dalle cellule del sistema reticolo endoteliale § escrezione con le urine
§ amilasi nell’uomo, ALP nel gatto
§ escrezione con la bile § ALP
§ Emivita (specie) § modificazioni delle caratteristiche fisicochimiche
§ macroenzimi, isoenzima ALP (corticosteroidi)
ENZIMI PLASMATICI Aumento
§ Danno, rottura o necrosi cellulare
§ equilibrio tra estensione danno cellulare e velocità di eliminazione § danno lieve ma acuto: elevati livelli § danno esteso ma cronico: aumenti scarsi o nulli § emivita
§ (proliferazione cellulare) § alterata escrezione enzimatica § ALP, amilasi e lipasi
§ aumenti non specifici
§ età § induzione enzimatica (farmaci) § emolisi
ENZIMI PLASMATICI Diminuzioni
§ Scarso significato clinico § cattiva conservazione
§ ipoplasia, atrofia o distruzione di organo § TLI
ENZIMI PLASMATICI § SENSIBILITA’: risultato positivo (aumento
concentrazione) in un soggetto patologico § SPECIFICITA’: in un soggetto sano rimane nel range di normalit à § VALORE PREDITTIVO: capacità di riconoscere in una popolazione mista (sanimalati) quali fra essi siano malati o quanti no. Parametro relativo a sensibilità, specificità, prevalenza della malattia nella popolazione
ENZIMI PLASMATICI Localizzazione del danno
§ Enzimi organo-specifici - enzimi ubiquitari ↓
§ profilo enzimatico (determinazione di più enzimi)
§ Permette di indagare: § gravità lesione § localizzazione cellulare § monitoraggio nel tempo § NB: variazione di specie nella distribuzione tissutale di un enzima (ALT)
§ determinazione degli isoenzimi
ENZIMI PLASMATICI Isoenzimi
§ Proteine a struttura diversa ma con stessa attività catalitica § LDH, ALP, CK § tessuti diversi
§ LDH1: miocardio § LDH5: fegato, muscolo scheletrico
§ inibizione selettiva di una frazione (ALP ossea termolabile) § frazionamento elettroforetico
ENZIMI EPATICI
Alanina amino transferasi (ALT/GPT)
§ Cane, gatto, ratto, primati § Aumento § Danno epatocellulare § Epatite acuta, epatopatia steroidea § Epatite cronica, cirrosi, neoplasie, epatopatia parassitaria
§ Grave danno muscolare § Rabdomiolisi nei levrieri, trombosi iliaca nel Gt § Ipertiroidismo nel Gt (lieve) § Enzima muscolare in Bv e Cv, ubiquitario in Su § scarsa importanza diagnostica •Bv, Cv e Su: gli enzimi epatospecifici sono GLDH, SDH, OCT e arg inasi
Aspartato amino transferasi (AST/GOT) § Ubiquitario, ma ++ mm, miocardio, fegato, RBC § Patologie epatiche del Cn e Gt, meno specifico di ALT
§ AST + ALT § Emivita (cane: 61 h ALT, 12 h AST) à danno epatocell attivo § Determinazioni ogni 2-5 giorni § Legg. ↑ AST e ALT: epatite cronica
§ Cv e Bv: marker comune di danno epatocellulare (MA in Cv: meglio GDH o SDH)
Aspartato amino transferasi (AST) § Danno muscolare (tutte le specie)
§ ? + lento di CK; poss elevato per + gg dopo cessazione danno § emivita a metà tra CK e LDH
§ CK e AST ? à lesione mm (ma non entità) § dopo 24-48h: AST ? e CK ? à lieve danno mm § Cv e Bv: ↑AST e CK ?
à SDH, GLDH
Falsi ?: siero emolitico, trasporto o esercizio fisico, iniezioni IM nei gg precedenti
Sorbitol deidrogenasi (SDH) § Fegato (cavallo, ruminanti) § danno epatocellulare acuto
§ emivita breve (↑ rapido 24 h, durata limitata 72 h)
§ molto labile
Glutamato deidrogenasi (GLDH) § § §
Fegato (cavallo, ruminanti) Danno epatico, ++ necrosi epatica Meno labile di SDH
Fosfatasi alcalina (ALP) § Enzima di secrezione, non plasma-specifico § osso, fegato, dotti biliari, mucosa int, cells tubuli renali
§ Valori > nei giovani § (Gravidanza) Isoenzimi: § Hu: epatico-osseo / placentare / intest § Cn: epatico-osseo / corticosteroideo § Bv: epatico-osseo
Fosfatasi alcalina (ALP) § ALP
§ importanza diagnostica: isoenzimi osseo e epatico (meno i. intestinale) § ↑ ALP: origine epatobiliare § eccezione: animali giovani o animali con patologie ossee § variazioni di specie § cavallo e ruminanti: range ampio à limitata sensibilità § gatto: emivita 6 ore e limitata capacità di produzione § §
enzimatica da parte del tessuto epatobiliare → scarsa sensibilità diagnostica cane: emivita 66 ore e elevata capacità di produzione enzimatica → importanza diagnostica ratto: influenza dieta (lipidi). ALP in fegato e intestino
Fosfatasi alcalina (ALP) § ↑ ALP
§ ostruzione dei dotti biliari § < ↑ delle amino transferasi (acidi biliari: permeabilizzazione membrane) § ↑ bilirubina Danno acuto § glucocorticoidi (iperadrenocorticismo) e anticonvulsivanti § no iperbilirubinemia, lieve ↑ amino transferasi § Patologie ossee § ↑ generalmente più lieve § Gt con ipertiroidismo § Danno epatocellulare: completa ostruzione dotto biliare § il tessuto danneggiato provoca alterazione flusso biliare
Differenze di specie § Cn:
Fosfatasi alcalina (ALP)
§ alta sensib diagnostica x colestasi. Pu ò essere ? prima che compaia ittero. Può variare da < 2xURL a > 20xURL § x corticost può essere x sintesi L-ALP e C-ALP. Poss da < 2xURL a > 20xURL § x fenobarbital, primidone e fenitoina: sono stati descritti indurre la sintesi di L-ALP o causare danno epatocell nel Cn § x ? attiv osteoblastica nei Cn in accrescim (B-ALP). Tipicam ? mild (<4xURL) § Gt: § scarsa sensib diagnostica x colestasi. I Gt tipicam diventano itterici prima di ? ALP. Poss da < 2xURL a > 10xURL § Riportato che 43-75%dei Gt ipertiroidei hanno ALP?; solitam è < 4xURL; dovuto a L-ALP e B-ALP, mentre attiv ALP in Gt adulti sani è dovuta a LALP. Alcuni Gt ipertiroidei hanno B-ALP sierica? senza concomitante ? ALPtot § Cv: § scarsa sensib diagnostica x colestasi. I Cv tipicam sono itterici prima di ? ALP. Poss da < 2xURL a > 10xURL § In coliche o lesioni intestinali ALP pu ò ? in liq peritoneale x ? ALP granulocitaria o intestinale. Cmq ALP granulocitaria o intestinale non determinano ? ALP sierica § Bv: moderata sensib diagn x colestasi, ma disordini di colestasi sono poco comuni in Bv
Gamma glutamil transferasi (GGT) § §
Nei canalicoli biliari, NO in tess scheletrici Bv, Ov, Cn, Gt: ? sierici per cause ~ quelle di ? ALP (eccetto lesioni ossee) § Colestasi § Lesione dotti biliari
§ No ? dopo necrosi cells epatiche
Gamma glutamil transferasi (GGT) § gli anticonvulsivanti non provocano ↑ della GGT § cavallo e ruminanti: marker di patologia biliare (danno non recente: ↑ quando SDH o GLDH ↓) § gatto: marker di colestasi più sensibile dell’ALP § osso: no GGT
Ornitina carbamil transferasi (OCT) § mitocondriale § fegato (cavallo, ruminanti, ratto) § danno epatico § emivita breve
Danno epatocellulare § ALT: acuto/medio termine. Cn e Gt § AST: acuto/medio termine. Tutte le specie (ma § § § § §
meno epato-specifico) SDH: acuto. Cv (e ruminanti) GDH: acuto. Cv e ruminanti LDH: molto poco specifico. Scarsa utilità diagnostica ALP: acuto/medio termine (? moderati). Tutte le specie, ma poco specifico. ostruz biliare: forti ? GGT: + cronico. Grossi animali (e piccoli animali)
ENZIMI MUSCOLARI •CK •AST •LDH
CK § 3 isoenzimi:
CK1 (BB) cervello CK2 (MB) miocardio (scarsa utilità) CK3 (MM) muscolo scheletrico
§ danno muscolare scheletrico § generalmente livelli tot riflettono variaz di MM; ? BB e MB apprezzabili solo con determinaz isoenz
§ molto sensibile, aumenta nel siero in seguito a lesioni anche lievi. (iniezioni, esercizio prolungato, trasporto) § attività plasmatica dipende da:
§ tipo di danno e estensione: ? drammatico in lesioni mm generalizzate (rabdomiolisi, trombosi iliaca del gatto). ? lieve è tipico in ipotiroidismo (catabolismo CK apparentem promosso dalla tiroxina) § variazioni di specie (scarsa attivit à nel gatto → lievi ↑ sono diagnostici)
Labile, ++ a t° amb o > à determinaz in giornata. Cong a -20° lo preserva
Lattato deidrogenasi (LDH) § Enzima ubiquitario, citoplasmatico; ? in mm
scheletrico, fegato, eritrociti. § Attività max dopo 48 -72h; ritorno a normalità + lento di CK (emivita > e grandi dimensioni) § Associare a CK, ALP o ALT LDH e/o AST ? + CK ? : § lesioni mm in gg precedenti § patol epatica § lesioni tiss non specifiche § tumori (occasionalm: ? LDH)
N.B. emolisi!!
Lattato deidrogenasi (LDH)
§ 5 isoenzimi § LDH1 (HBDH) e LDH2: miocardio, rene e eritrociti; fegato (bovino e ovino) § LDH5: muscolo scheletrico, eritrociti § differente distribuzione nelle diverse specie Hu, Bv, Cv: ++ LDH 1, 2, 3 Cn e Gt: ++ LDH 5 Ov: ++ LDH 1, 3
§ ↑ isoenzimi 2 e 3 nel linfoma del cane § ↑ LDH5: danno epatico nel ratto
Lattato deidrogenasi (LDH) Bv e Ov: ? in miopatie nutrizionali, con ? CK AST e aldolasi e ? glutatione px (ha Se!!). Somministraz Se: regress segni clinici e enzimi tornano a norma. Determinazione GSHpx è utile x indagini di massa per evidenziare carenze di Se in dieta. Patim mm in seguito a trasporto; decubito prolungato (à degeneraz e necrosi); mioglobinuria paralitica (Bv giovani con ipertrofia mm); paresi post-partum; collasso puerperale. Cv: mioglobinuria paralitica; tying up. ? LDH tot, LDH 4 e 5, aldolasi, MDH (malato deidrogenasi), GOT, CK Su: distrofia mm Se-dipendente
Danno muscolare CK, AST, LDH
? spettacolari sono confinati a condizioni con danno mm generaliz zato o al massimo molto esteso, come rabdomiolisi (Cv e Cn), distrofia mm (Bv) e trombosi iliaca (Gt). Comunque, danni più lievi o più localizzati (ferite, decubito - ++ in soggetti pesanti – e miosite eosinofilica) possono produrre ? dell’attività enzimatica. CK: ? molto rapidamente e in CK: ? molto rapidamente e in assenza di danno continuato può teornare a valori normali in meno di 48h
CK UI/L
AST: livelli molto alti in 1224h; torna a normalità in meno di 1 settimana
AST LDH
giorni
LDH: picco max diversi gg dopo il danno; ritorno a norma in più settimane ALT: simile a AST nei grossi animali; ? in modo significativo in gravi danni nei piccoli animali
•Tutti rimangono ? per periodo > se il danno è ricorrente o conti nuo
Enzimi § Cane e gatto
§ ALT >>> AST → danno epatico
§ AST >>> ALT ↑ CK
→ danno muscolare scheletrico
§ Cavallo e ruminanti
§ ↑ AST e CK norm → danno epatico → danno muscolare scheletrico § ↑ AST e ↑ CK o entrambi
§ Ratto
§ ALT + OCT/SDH
amilasi e lipasi § enzimi di secrezione, non pancreas-specifici § § § §
markers di pancreatite acuta determinazione contemporanea pancreatite acuta: notevole ↑ pancreatite cronica: valori normali
§ escrezione renale § Insufficienza renale cronica : ↑ § macroamilasemia § altri aumenti: § ostruzione dotti pancreatici, perforazione intestinale, glucocorticoidi (↑ solo lipasi)
TLI
(trypsin-like immunoreactivity) Tripsina: attività proteolitica / TLI: non attivo § elevata sensibilità e specificità § metodiche radioimmunologiche (Ac specie-specifici)
§ cane: V.N. 5-35 ng/ml ↓ <2.5 ng/ml: insufficienza pancreatica ? >35 ng/ml: pancreatite acuta § gatto: V.N. 8.5-82 ng/ml