Enzimatica [plm]

Instituto Nacional de Salud Publica Escuela de Salud Publica de México

I

N S P

ENZIMAS

Biol. Luz Edith Ochoa Sánchez IB. Perla Tinoco Carrillo QC. Miguel Ángel Ortiz Gil.

11 DE NOVIEMBRE 2008

Es todo proceso químico en el que una o más sustancias (reactivos o reactantes) sufren un proceso de transformación o combinación para dar lugar a una serie de sustancias (elementos o compuestos) denominadas productos. A la representación simbólica de las reacciones se les denomina ecuaciones químicas.

Es la energía que necesita un sistema antes de poder iniciar un determinado proceso o es la energía mínima necesaria para que se produzca una reacción química dada. La energía de activación es inversamente proporcional a la velocidad de reacción.

Es una sustancia capaz de acelerar (catalizador positivo) o retardar (catalizador negativo o inhibidor) una reacción química, permaneciendo éste mismo inalterado (no se consume durante la reacción), proceso denominado catálisis. 

Los catalizadores disminuyen la Ea, que deben superar los reactivos para transformarse en productos, sin modificar la constante de equilibrio.

Sustancias de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sea termodinámicamente posible. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en diferentes moléculas, los productos. A las reacciones mediadas por enzimas se les denomina reacciones enzimáticas.

Las enzimas están constituidas por una proteína y un componente llamado cofactor, el cual puede estar ausente. En su estructura, se entrelazan y se pliegan una o más cadenas polipeptídicas, que aportan un pequeño grupo de aminoácidos para formar el sitio activo, una enzima y un sustrato no llegan a adherirse si sus formas no encajan con exactitud , su estructura depende de los aminoácidos que la conforman.

Las enzimas se componen de una cadena lineal de aminoácidos que se pliegan durante el proceso de traducción (mRNA) para dar lugar a la estructura terciaria de la enzima, el proceso se lleva a cabo en los ribosomas.

El sitio activo está formado por las cadenas laterales de residuos específicos y es al localización sobre la superficie de la enzima donde se une el sustrato estabilizada por medio de interacciones débiles y tiene lugar la reacción química. Sitio activo

Las reacciones químicas que se llevan acabo dentro de los organismos no ocurren espontáneamente, están catalizadas por enzimas, por lo que sin las enzimas las reacciones no se llevarían acabo.

1.-Óxido-reductasas reducción):

(reacciones

de

- Transferasas ( transferencia de grupos funcionales):

óxido

3.- Hidrolasas (reacciones de hidrólisis):

4.-Liasas (adición a los dobles enlaces):

5.-Isomerasas (reacciones de isomerización): :

6.- Ligasas (formación de enlaces con aporte de ATP)

• La actividad de algunas enzimas depende solamente de sus estructura como proteínas, mientras que otros necesitan, además uno o mas componente no proteicos llamados cofactores. El cofactor puede ser un ión metálico, o bien una molécula orgánica llamada coenzima los iones metálicos pueden ser: (Fe2+, Cu2+, K+, Mn2+, Mg2+, entre otros).

o

o o

o

El ion metálico puede actuar como: Centro catalítico primario Grupo puente para reunir el sustrato y la enzima, formando un complejo de coordinación Agente estabilizante de la conformación de la proteína enzimática en su forma catalíticamente activa.

Cuando el coenzima se halla unido íntimamente a la molécula del enzima recibe, normalmente el nombre de grupo prostético. Un grupo prostético es el componente no aminoacídico que forma parte de la estructura de algunas proteínas y que se halla fuertemente unido al resto de la molécula. Las proteínas con grupo prostético reciben el nombre de heteroproteínas (o proteínas conjugadas).

Grupo prostético

Función

Distribución

Flavín mononucleótido 1

Reacciones redox

Bacterias, Archaea y eucariotas

1

Reacciones redox

Bacterias, Archaea y eucariotas

Pirroloquinolina quinona 2

Reacciones Redox

Bacterias

Fosfato de piridoxal 3

Transaminación, descarboxilación y desaminación

Bacterias, Archaea y eucariotas

Biotina 4

Carboxilación

Bacterias, Archaea y eucariotas

Metilcobalamina 5

Metilación e isomerización

Bacterias, Archaea y eucariotas

Pirofosfato de tiamina 6

Descarboxilación

Bacterias, Archaea y eucariotas

Hemo 7

Reacciones redox

Bacterias, Archaea y eucariotas

Molibdopterina 8 9

Reacciones de oxigenación

Bacterias, Archaea y eucariotas

Ácido lipoico 10

Reacciones redox

Bacterias, Archaea y eucariotas

Flavín adenín dinucleótido

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola. La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reacción (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S]. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima (Vmax), que no sobrepasará en ningún caso, independientemente de la [S].

La unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml). Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). 1 katal equivale a 60 x 106 U.

La constante de Michaelis, KM, mide la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es Vmáx/2.Por lo tanto: es una magnitud determinada experimentalmente y definida operativamente; es la concentración del sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima.

Cuando se grafica la velocidad de la reacción, v0, contra la concentración de substrato, [S], no siempre es posible determinar la condición en que se ha llegado a la velocidad máxima, Vmax.

El inverso de la velocidad (1/v0) contra el inverso de la concentración de substrato (1/[S]), se obtiene una línea recta. El gráfico de Lineweaver-Burke. Se utiliza para calcular la Km y la Vmax así como para determinar el mecanismo de acción de los diversos tipos de inhibidores. Describe una recta en donde el intercepto con el eje de las abscisas es igual a –1/Km y el intercepto con el eje de las ordenadas es igual a 1 Km 1 1/Vmax.

v0

=

Vmax[ S ]

+

Vmax

El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo. El inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima en el que también se une el sustrato; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al sustrato verdadero.

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

1/v

0.07 0.06 0.05

1/Vmax

0.04 0.03

-1/Km

0.02 0.01

1/s

0.00 -0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

-1/(Km(1 + i/Ki))

0.3

0.4

0.5

0.6

El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva

19.- ¿Qué es una enzima alostérica y cómo es su curva de Vmax vs [S]? - Son proteínas con múltiples subunidades (múltiples centros activos y catalíticos) - Presentan una cinética sigmoidal, indicativa de efectos cooperativos en la unión del sustrato. - Su actividad está regulada por otras moléculas efectoras. - Pueden mantener las concentraciones de sus sustratos en valores bastante constantes: * Existe una concentración crítica de sustrato ([S]c) por debajo de la cuál la enzima es prácticamente inactiva * Un pequeño aumento de la concentración de sustrato, por encima de la ([S]c, da lugar a un notable aumento de la actividad enzimática

La inhibición alostérica ejerce su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.

La activación alosterica en los que el cambio en el sitio catalítico producido por el activador alosterico es positivo, de modo que facilita la entrada del sustrato y por tanto su conversión a los productos.

Las enzimas poseen una temperatura de actividad máxima, y al sobrepasarla hay una pérdida de la estructura terciaria lo que provoca la pérdida de su actividad catalítica de manera irreversible debido a que las fuerzas de unión débiles se rompen. Aumentos en la temperatura aumenta las interacciones cinéticas de las moléculas

Enzima

Vo

1

3

7

11

14

pH óptimo

Pepsina

1.5

Tripsina

7.7

Catalasa

7.6

Arginasa

9.7

Fumarasa

7.8

Ribonucleasa

7.8

pH

Vo

Vo

Vo

4

37 85 Temperatura oC)

Las enzimas presentan su máxima actividad a un valor dado de pH (normalmente entre 4 y 8). Si se someten a un cambio en el pH, los diversos grupos funcionales de las cadenas polipeptídicas pueden ionizarse o interactuar con otras cargas o grupos funcionales provocando un cambio en su estructura terciaria.

10

50 100 Coenzima

10

30 50 70 100 Tiempo (min)

Las β-lactamasas son enzimas que rompen el anillo β-lactámico que es una estructura de cuatro átomos presente en ciertos antibióticos que actúan inhibiendo la síntesis de peptidoglucanos de la pared celular bacteriana debido a que dicho anillo es análogo del aminoácido D-alanilD-alanina. Por tanto, al romperse el anillo β-lactámico, la moléculas pierde su actividad antimicrobiana. β-lactamasas son responsables de crear resistencia a los antibióticos.

Modo de acción de las β-lactamasas

E+I

1

EI

2

EI*

3

E’ + I*

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional 2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I* 3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

•Algunas moléculas de RNA puden actuar como enzimas. A estas moléculas se les denomina ribozimas. •Al igual que las enzimas proteícas poseen un centro activo que se une específicamente a un sustrato y que facilita su conversión en un producto. Las ribozimas son menos versátiles que las enzimas proteicas.

24.- SOLUCIÓN DE PROBLEMA DE CINETICA ENZIMATICA. Las cinéticas de una enzima se midieron en función de la concentración de sustrato tanto en ausencia como en presencia de 2X10-3 M de inhibidor (I). Los valores experimentales que se obtuvieron están dados en la siguiente diapositiva. a.- ¿Cuáles son los valores de Vmax y KM tanto en ausencia como en presencia del inhibidor? b.- ¿Qué tipo de inhibición es?

KM SIN INIHIBIDOR

0.001M

KM CON INHIBIDOR

0.002M

TIPO DE INHIBICIO:

COMPETITIVA.

VMAX CON O SIN INHIBIDOR:

(µmoles/min) 50

Inhibición competitiva PROBLEMA EQUIPO LUZ-PERLA-MIGUEL

Sustrato

Velocidad (µmoles/min) Sin inhibidor

Con Inhibidor

0.3 X 10-5

10.4

8.2

0.5 X 10-5

14.5

12.12

1.0 X 10-5

22.5

19.05

3.0 X 10-5

33.8

32.26

9.0 X 10-5

40.5

40

Concentración (M)

Inverso (1/M)

Inversos de la velocidad (min/µmoles) Sin inhibidor

Con Inhibidor

Sustrato

Velocidad (µmoles/min)

Con Concen- Inverso (1/M) Sin inhibidor Inhibidor tración (M)

Inversos de la velocidad (min/µmoles) Sin inhibidor

Con Inhibidor

0.0003

3333.33

10.4

8.2

0.0962

0.1220

0.0005

2000.00

14.5

12.12

0.0690

0.0825

0.001

1000.00

22.5

19.05

0.0444

0.0525

0.003

333.33

33.8

32.26

0.0296

0.0310

0.009

111.11

40.5

40

0.0247

0.0250

CALCULOS EN FORMATOS EXCEL HACER CLICK AQUÍ. 1/V

KM Vmax pendiente de la recta

-1 / KM

1/S

Las unidades de [S] es M. Las unidades de V son µmoles/min

1 ordenada Vmax al origen

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