Efecto De La Dexametasona Sobre La Actividad De Fenoloxidasa En La Respuesta Inmune De Aedes Aegypti

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Efecto de la dexametasona sobre la actividad de fenoloxidasa en la respuesta inmune de Aedes aegypti Ana Beatriz Celma,1 Carlos G. García,1 Lilia A. González,1 Fernando García,1 y 2 Humberto Lanz3 y Fidel Hernández1 y 2 1

Universidad Simón Bolívar, 2Cinvestav-Instituto Politécnico Nacional,3CISEI-Instituto Nacional de Salud Pública

Resumen Aedes aegypti es un díptero (Culicidae) vector de enfermedades como el dengue y la fiebre amarilla. El conocimiento de los mecanismos de la respuesta inmune de estos mosquitos resulta fundamental para, en un futuro, diseñar estrategias en el control biológico de estas enfermedades. El sistema de la profenoloxidasa (proFO) es un mecanismo inmune enzimático en cascada activado por moléculas de la superficie de microorganismos. El objetivo fue evaluar la actividad de la proFO en presencia de dexametasona (inhibidor de síntesis de prostaglandinas) a diferentes concentraciones.

Abstract Aedes aegypti is a dipterous (Culicidae) vector of diseases such as dengue and yellow fever. The knowledge of the mechanisms of the immune response of these mosquitoes is relevant and can be helpful in the design of strategies for biological control. The system prophenoloxidase (proFO) is an enzimatic mechanism in cascades wich is activated by molecules found in the surface of microorganisms. The objective was to evaluate the proFO activity in presence of dexametasone (prostaglandin synthesis inhibitor) at different concentrations.

Introducción Los invertebrados no tienen inmunoglobulinas ni linfocitos. Algunos de sus mecanismos de defensa para evitar el establecimiento de patógenos son: el endurecimiento de la exocutícula, proceso donde se añaden moléculas de quitina y melanina al patógeno (Ashida y Brey, 1995); encapsulación (Pech y Strand, 2000); melanización del agente extraño para inmovilizarlo; fagocitosis; formación de nódulos (Stanley, 1998), y producción de quinonas citotóxicas. Estas funciones son llevadas a cabo por los hemocitos (Gillespie, Kanost y Trenczek, 1997), en respuesta a la presencia de componentes micóticos y bacterianos en ausencia de especificidad y de memoria inmunológica (Nation, 2002). Algunos componentes de la respuesta inmune se encuentran integrados en cascadas de reacciones como la coagulación y la activación de la proFO (Hernández, Gollas y Vargas, 2000). 18

La melanización consiste en una serie de reacciones que comienzan con la hidroxilación de tirosina para formar L-DOPA (L-hidroxifenilalanina), la cual sufre oxidación y da lugar a los dopacromos que producen inolquinonas que se polimerizan y forman la melanina (Söderhall e Iwanaga, 1996). Las prostaglandinas (PGs) son eicosanoides cíclicos y derivan de ácidos grasos monocarboxílicos insaturados de 20 carbonos, los cuales están formados por dos cadenas y un anillo de cinco carbonos, y están relacionadas con la estimulación de la adenil ciclasa. La dexametasona es un glucocorticoide que induce la síntesis de lipocortina, la cual bloquea las primeras reacciones enzimáticas involucradas en la síntesis de protaglandinas (PGs) (Funk, 2001), inhibiendo la fosfolipasa A2, por lo tanto, se frena la síntesis de ácido araquidónico y de los derivados de éste, como son las PGs (García, Lanz, Rojas y Hernández, 2002).

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La activación del sistema de la proFO se presenta gracias a la transformación de esta proteína a Fenoloxidasa (FO), dicho proceso se da por hidrólisis, mediada por una proteasa de tipo serina que recibe el nombre de enzima activadora de la proFO (EAproFO). Esta reacción se inicia gracias a la unión de los componentes estructurales de la membrana de agentes micóticos y bacterianos, como los lipopolisacáridos (LPS) y ß-1-3 glucanos (Laminarina), a un receptor de membrana. Una vez activada la FO, comienzan las reacciones de reducción de óxido que permiten que los difenoles se transformen en quinonas, moléculas precursoras de la melanización. El conocimiento actual del sistema inmune de los hexápodos deriva en su mayoría de los estudios genéticos y moleculares en Drosophila (Zdobnov et al., 2002). Sin embargo, al comparar otros organismos, como el mosquito Anopheles, que responde a las infecciones por Plasmodium, encontraron que los genes en A. gambiae están asociados con la inmunidad del insecto, y se demostró que ellos divergen ampliamente de los de Drosophila (Christophides et al., 2002). Buenos ejemplos son las enzimas proFO (nueve en el mosquito, tres en la mosca de la fruta); ya que estas enzimas catalizan la síntesis de melanina, la cual está asociada con varias reacciones de defensa entre los insectos. García Gil et al. (2002) realizaron un estudio sobre el efecto de los inhibidores de la síntesis de prostaglandinas sobre la coagulación en el homóptero Dactylopius coccus (cochinilla del nopal). Aedes aegypti es un díptero de la familia Culicidae, y la importancia de su estudio radica en que es un vector de enfermedades como el dengue, la fiebre amarilla y varios virus, entre ellos, el transmisor de la encefalitis. Por tal motivo, el conocimiento del sistema inmunológico de esta especie permitiría crear estrategias para el control biológico, por ejemplo, mediante una inmunodepresión específica para dicho organismo (Söderhäll e Iwanaga, 1996). Las hembras representan el factor de riesgo dentro de este género, por ser hematófagas, hábito que las hace susceptibles a adquirir el arbovirus (dengue o fiebre amarilla) (Söderhäll e Iwanaga, 1996). El estudio de los hexápodos vectores cobra mayor relevancia debido a que tienen una distribución mundial, que abarca desde regiones tropicales, hasta templadas.

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Objetivo El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la dexametasona sobre la actividad de la proFO en la hemolinfa de mosquitos de la especie Aedes aegypti, con el propósito de, en un futuro, proponer estrategias en el control de estos vectores dentro de sus poblaciones naturales.

Metodología Reactivos. Los reactivos utilizados en este trabajo fueron de la más alta calidad y se obtuvieron de las compañías Sigma Chem (St. Louis Missouri), Invitrogen y PE Applied Biosystems. Para la realización de este proyecto, se obtuvieron mosquitos A. aegypti cultivados en el insectario del Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas (CISEI) de Cuernavaca, Morelos, bajo condiciones estándar (Chan et al., 1994) (Castex, Fachado y Fonte, 1997). Obtención de la hemolinfa. Para la manipulación de A. aegypti, los ejemplares se sometieron a bajas temperaturas para inducir un estado de letargo. Se separaron en grupos experimentales de 15 hembras cada uno, la extracción de la hemolinfa se hizo mediante una incisión en el abdomen y un centrifugado de 15 min, dejando caer la hemolinfa en 50 µl de NaCl (cloruro de sodio) al 0.8% para el grupo control. Para los grupos experimentales, se agregaron concentraciones de 12.5, 25 y 50 µg/µl de dexametasona y se incubaron durante 30 min. Electroforesis de proteínas. Para su análisis, se extrajeron proteínas, las cuales fueron obtenidas en presencia de inhibidores de proteasas (minicomplete TM protease inhibitor Amersham Inc.), preparados en amortiguador PBS (19 mM NaH2 PO4, 8.1 mM Na2 HPO4, 154mM NaCl, pH 7.4). Esto se corrió en un gel de acrilamida (PAGE-SDS) al 10%, 100-110 Volts/2 h, colocando 17 µg de proteína. Se realizó la cuantificación proteica por medio del método de Bradford. La actividad enzimática se analizó mediante un método espectrofotométrico en multiplaca ELISA. En los pozos de esta placa se agregó 30 µl de un sustrato, L-dopa (4 mg/ml) más el inhibidor, 12.5, 25 y 50 µl de hemolinfa y 30 µl del agente microbiano (LPS o Laminarina). Los cambios de tonalidad se analizaron

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mediante espectrofotometría a 420 nm. Para determinar de manera cuantitativa si existen diferencias significativas entre los grupos (p<0.05), se realizó la prueba estadística de Tukey (Sigma Stat 2.03).

Resultados Análisis espectrofotométrico en multiplaca ELISA. En todos los pozos se añadió L-dopa como sustrato, un componente de membrana de microorganismo (LPS o Laminarina) y hemolinfa. En los pozos experimentales se agregó un inhibidor de prostaglandinas (dexametasona) a diferentes concentraciones. En el grupo 1, que contenía LPS como activador de la reacción inmune, se observó una melanización que se consideró como testigo para comparar la concentración de melanina obtenida. El grupo 2 fungió como un segundo grupo control (sin dexametasona), en el cual se utilizó laminarina como activador. Al grupo 3 se le añadió dexametasona 12.5 µg/µl y LPS como activador. La melanización obtenida fue intensa, análoga a los grupos control. Al grupo 4 se le añadió dexametasona 25 µg/µl y LPS. Se observó una reducción en la melanización respecto al grupo 3, pero no en relación con los grupos control. El grupo 5 se trabajó con dexametasona 50 µg/µl y laminarina. La concentración de melanina disminuyó respecto a los grupos control y a los dos grupos experimentales anteriores.

Tabla 1. Cuantificación de la producción de melanina en multiplaca ELISA por espectrofotometría (ABS 420 nm)

Grupo

HL

Dexametasona

Laminarina

LPS

L-dopa

Absorbancia (420nm)

1 (Control)

+

-

-

+

+

0.000

2

+

-

+

-

+

0.036

3

+

+

-

+

+

0.290

4

+

+

-

+

+

0.055

5

+

+

+

-

+

0.001

Cuantificación de melanina (420 nm) en los diversos tratamientos de los pozos de la multiplaca ELISA.

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Figura 1. Efecto de la dosis de dexametasona sobre la producción de melanina

1 HLc+Lam+ L-dopa

2 HL+dexa 50µg+LPS+ L-dopa

Tratamientos (n=2)

3 HL+dexa 25µg+LPS+ L-dopa

4 HL+dexa 12.5µg+Lam+ L-dopa

Tukey: P< 0.05

Actividad protéica por electroforesis (PAGE-SDS). En el carril 1, se corrió el marcador de peso molecular; carril 2, la muestra del grupo control; carril 3, tratamiento con dexametasona 25 µg/µl; carril 4, tratamiento con dexametasona 50 µg/µl. No se apreció ningún cambio aparente en el patrón de bandas de proteínas en los diferentes tratamientos. En el grupo control, se observaron los patrones proteicos normales que posee el mosquito como respuesta ante un agente extraño. El tamaño y grosor de las bandas varió respecto a los otros dos carriles.

Figura 2. Análisis de proteínas de HL de A. aegypti por PAGE-SDS

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En el análisis espectrofotométrico de la melanización, se observa que la dexametasona, a una concentración de 25 µg/µl, tuvo el efecto más significativo. Esto se puede comprobar mediante el análisis a detalle del gel de proteínas, a través del cual se puede observar que el ancho de las bandas de los carriles tres y cuatro son distintas en cuanto a intensidad. Para el análisis cuantitativo de estos resultados, se aplicó la prueba estadística de Tukey, en donde la probabilidad es < 0.05. Se demostró que existe una diferencia significativa entre los tratamientos dexametasona 12.5 µg/µl vs. 50 µg/µl. Los tratamientos dexametasona 12.5 µg/µl vs. 25 µg/µl, dexa. 25 µg/µl vs. control y control vs. dexa. 50 µg/µl, no mostraron diferencia significativa. El gel de acrilamida mostró un aumento de la actividad proteica en las bandas correspondientes a 25 kDa, lo que podría significar la presencia de péptidos antimicrobianos caracterizados por un peso molecular similar (Müller, Dimopoulos, Blass y Kafatos, 1999).

Conclusiones Las prostaglandinas tienen efecto sobre la respuesta de melanización en Aedes aegypti y ésta puede ser inhibida por acción de la dexametasona a concentraciones de 12.5, 25 y 50 µg/µl.*

KDa Referencias Ashida, M. y Brey P. (1995). Role of the integument in insect defense: prophenoloxidase cascade in the cuticular matrix. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92: 10698-10702. Castex, M., Fachado, A. y Fonte, L. (1997). Identificación de una fuente humana de alimentación de mosquitos mediante la técnica de coaglutinación. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. Rev. cubana Med. Trop., 49 (2): 125-129.

Discusión La activación de ciertas moléculas de la respuesta inmune en invertebrados puede deberse a la presencia de los agentes patógenos. El análisis de nuestros resultados mostró que en todos los ensayos realizados existe un efecto del inhibidor de prostaglandina (dexametasona) sobre el inductor LPS y laminarina.

Chan, A. S. T., Rodríguez, M. H., Torres, J. A., Rodríguez, M. C. y Villareal, C. (1994). Susceptibility of three laboratory strains of Anopheles albimanus (Diptera: Culicidae) to coindigenous Plasmodium vivax in southern Mexico. J. Med. Entomol., 31: 400-428. Christophides, G. K., Zdobnov, E., Barillas Mury, C., Birney, E., Blandin, S., Blass, C., Brey, P. T., Collins, F. H., Danielli, A., Dimopoulos, G., Hetru, C., Hoa, N. T., Hoffmann, J. A., Kanzok, S. M., Letunic, I., Levashina, E. A., Loukeris, T. G.,

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Lycett, G., Meister, S., Michel, K., Moita, L. F., Muller, H. M., Osta, M. A., Paskewitz, S. M., Reichhart, J. M., Rzhetsky, A., Troxler, L., Vernick, K. D., Vlachou, D., Volz, J., Von Mering, C., Xu, J., Zheng, L., Bork, P. y Kafatos, F. C. (2002). Immunityrelated genes and gene families in Anopheles gambiae. Science, 4: 298 (5591): 159-65. Funk Colin, D. (2001). Prostaglandins and leukotrienes: Advances in eicosanoid biology. University of Pennsylvania, Philadelphia, USA. Science (vol. 294): 1871-1875. García Gil, F., Lanz, H., Rojas, A. y Hernández, F. (2002). Efecto de los inhibidores de la síntesis de prostaglandinas en la coagulación del homóptero Dactylopius coccus (cochinillas del nopal). Investigación Universitaria Multidisciplinaria, Universidad Simón Bolívar, 1: 15-19. Gillespie, J. P., Kanost, M. R. y Trenczek, T. (1997). Biological mediators of insect immunity. Ann. Rev. Entomol., 42: 611-643. Hernández López, J., Gollas, G. T. y Vargas Albores, F. (2000). El sistema de activación de la profenoloxidasa de crustáceos: un modelo de reconocimiento y defensa de los invertebrados. Revista de la Academia Mexicana de Ciencias, 51 (1): 21-26. Müller, M. H., Dimopoulos, G., Blass, C. y Kafatos, F. C. (1999). A hemocyte cell line established from the malaria vector Anopheles gambiae expresses six prophenoloxidase genes. J. Biol. Chem., 274: 11727-11735. Nation, J. L. (2002). Insect physiology and biochemistry. USA: Department of Entomology and Nematology-University of Florida Press. Pech, L. L. y Strand, M. R. (2000). Plasmatocytes from the moth Pseudoplusia includens induce apoptosis of granular cells. J. Insect Physiol., 46: 1565-1573. Söderhall, K. e Iwanaga, S. (1996). New directions in invertebrate immunology. USA: SOS Publications. Stanley, D. (1998). Eicosanoids mediate insect cellular inmune reactions to bacterial infections. New York: Insect Biochemical Physiology Laboratory-University of Nebraska Press. Sugumaran, M. y Nellaiappan, K. (1991). Lysolecithin a potent activator of prophenoloxidase from the hemolymph of the lobster, Homarus americanus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 176: 1371-1376. Zdobnov, E. M., Von Mering, C., Letunic, I., Torrents, D., Suyama, M., Copley, R. R., Christophides, G. K., Thomasova, D., Holt, R. A., Subramanian, G. M., Mueller, H. M., Dimopoulos, G., Law, J. H., Wells, M. A., Birney, E., Charlab, R., Halpern, A. L., Kokoza, E., Kraft, C. L., Lai, Z., Lewis, S., Louis, C., Barillas Mury, C., Nusskern, D., Rubin, G. M., Salzberg, S. L., Sutton, G. G., Topalis, P., Wides, R., Wincker, P., Yandell, M., Collins, F. H., Ribeiro, J., Gelbart, W. M., Kafatos, F.C . y Bork, P. (2002). Comparative genome and proteome analysis of Anopheles gambiae and Drosophila melanogaster. Science, 298 (5591): 149-59.

* Agradecemos el apoyo brindado por la Coordinación de Investigación de la Universidad Simón Bolívar y del laboratorio de Entomología Molecular del Cinvestav-IPN, así como al insectario del CISEI-INSP.

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