Dingyq Morphological

In situ hybridization 丁玉强 Lab of Neural Development  ION

E­mail: [email protected]              Phone: 5492­1773

Main contents • In situ hybridization (distribution of  mRNA) • Neural tracing (retrograde and  anterograde) • General approaches to analyses phenotype  in KO mice (CNS)

Main contents • In situ hybridization (distribution of mRNA) • Neural tracing (retrograde and anterograde) • General approaches to analyses phenotype  in KO mice (CNS)

Why do we need in situ  hybridization? Cellular localization of the interested genes  (Southern blot) Distributions of mRNA (ISH) and protein  (IHC) may differ

Advantages compared with IHC • Any interested genes, and save  time – Takes time to make specific antibody,  especially when you caught a new gene – Antibodies against mouse and other  species are very limited 

Disadvantages compared with  IHC • Keep in mind, localizations of mRNA and  functional sites (protein) may differ

– e.g. when study functional site of a receptor, you  need to get antibody

• Procedures are more complicated than IHC

– Two days vs 3­4 days – Making probes also takes time—but it is not hard 

Disadvantages compared with  IHC • It is not convenient to do double in situ,  or a combination with IHC, although it  is practicable.  – Note: in a combination with IHC, do ISH  first

Probes Two major: 

– RNA probe – DNA probe (Oligonucleiotide)

• Specificity­­­RNA • Sensitivity­­­RNA • S/N­­­RNA • Complexity­­­RNA (DNA is simple)

Labeling of probe:

Non­radioactive­­­ Digoxygenin ( 地高辛 )  Radioactive­­­35S

Probe sequence selection and  primer design ­­RNA probe­­ • Using the cDNA sequence not the genome  sequence • Blast the sequence and select the specific  region for the interested genes  • Length: 300­1000bp; >1kb need to hydrolyze • Design primers (> 19nt)

Procedure for construction of vectors Mouse Brain Total RNA extraction AAAAAAAAAA

mRNA

TTTTTTTTTTTT

1st Strand cDNA synthesis AAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTT

First Strand cDNA Specific Primer/F First Strand cDNA

PCR Specific Primer/R Specific Amplication

PCR product of specific gene

A

A

Oligo d(T)18

The features of PCR product and  subcloning • Taqase usually adds a A to 3’­end of PCR product  without DNA template, and this PCR product can  be ligated with the T Vector

A

T7

A

PCR product

SP6

Of course, you can use other vectors, such as pBluescrip

In vitro transcription Restriction site T7

Antisense

SP6

DNA construct

Cut with restriction enzyme T7

Antisense

RNA transcripts

In situ hybridization

SP6

Probe Preparation

Exactly follow the protocols unless you are  a superman in this!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 1. Cut between 20 µg of mini­prep quality  plasmid DNA with a five­fold excess of an  appropriate restriction enzyme for 2 hs.  Check digestion on mini­gel. 2. Extract cut template in an equal volume of 50  : 48 : 2 phenol : chloroform : isoamyl alcohol.  Spin down, transfer the upper layer to a fresh  tube and extract with chloroform : isoamyl  alcohol. 

3. Precipitate upper layer with 1/9 volume of  3M NaOAc and 2 volume ethanol at‑80°C.  Spin down at 4°C for 15 min. Wash pellet  with 70% EtOH and spin again. Resuspend  pellet in 20µl of RNAse­free TE, and store at  4°C until required. Write down the concentration, date, and  owner on the tube

4. Set up the following reaction in 50µl total volume: 5x Stratagene synthesis buffer 0.1M DTT (RNAase free) 10mM NTPs/digoxygenin­UTP RNAsin  RNA polymerase (T3, T7 or Sp6) units) DNA template RNAse free­water (Not DEPC water) Incubate at 37°C for 2 hours.

10µl 5µl 2.5µl 0.25µl (10 units)                4.5µl   (90  2.5µg to 50µl

5. Remove 2µl for mini­gel sample. Add 20  units of RNAse­free DNAse and continue  incubation for a further 10 min at 37°C.  Remove a second 2µl sample and check that  DNA has been degraded on a mini­gel 6. Add 52µl of 'Stop' buffer to the reaction 7. Transfer the purified probe to a clean tube.  Add 1/9 volume of 3M NaOAc, pH4.8 and 2  volumes of ethanol. Precipitate at ­80°C for  10 minutes. Spin down at 4°C for 15 min,  wash the pellet in 95% EtOH/5% DEPC­ water and spin again for 5 min 

8. Resuspend the pellet in 50µl of an RNAse­ free solution of 40mM NaHCO3 / 60mM  Na2CO3. Remove a 1µl sample for OD260  measurement. Incubate at 60°C for 35  minutes to hydrolyse the probe into small  fragments (between 200­300 bp). 35 minutes  works fine for a 1kb probe.   

The amount of time, t , for hydrolysis in 40mM NaHCO3 / 60mM  Na2CO3 at 60°C is given by:              (Starting length, kb) ­ (Desired length, kb) t =  —————————————————————           (0.11) (Starting length, kb) (Desired length, kb)

Principles of In situ  procedures • All reagents and mailers must be RNAse­ free during pre­ and hybridization – Treat all containers (forceps) with DEPC water – Wear gloves always

Again, please exactly follow the protocols THIS IS TO ALL FRESHMAN!!!!!!!!!!!!

Sections Tissues: Fresh tissue, fixed tissue or paraffin­ embedded Sections: (5­20 µm) are collected on Superfrost/Plus      slides (Fisher) and dried in air for 1 hour at RT,  stored at  ­20°C (for a long period, at 70°C).  – Alternatively, use RNAse­free slides coated with  TESTA. Details of how to prepare TESTA coated slides  are in the Appendix

A: Pre­Treatment of Sections • • • •

1. Warm slides to RT and dry at 50°C for 15 min. 2. Fix in 4% PFA in DEPC­PBS at RT for 20 min. 3. Wash twice in DEPC­PBS at RT for 5 min. 4. Treat slides with 50µg/ml Proteinase K in PK  buffer at RT for between 8­15 min depending on  the age of the embryo.

– Determine yourself­­­Concentration or digestion time

• 5. Wash once in DEPC­PBS at RT for 5 min.          Fix in 4% PFA in DEPC­PBS for 15 min •  6. Rinse once in DEPC­water • 7. Acetylation. Place slides in an RNAse­free  glass trough with a stir bar. Add 250ml 0.1M  RNAse­free triethanolamine( 三乙醇胺 )­HCl  pH 8.0. Add 0.625ml acetic anhydride with  constant stirring. Turn off stirrer when the  acetic anhydride ( 醋酸酐 ) is dispersed and  leave for a further 10 min. (Note: Most probes like  this, but some do not)

• 8. Wash slides in DEPC­PBS at RT for 5 min. • 9. Hybridization: Prehybridise for 3­4 hs at  60°C. Replace with 1­2µg/ml of probe and  continue incubation for a further 12­16 hs.   These steps should be performed in the  hybridization oven, not the regular 60°C  oven, as the latter does not maintain its  temperature well.

B: Washing Steps Note: 1. After hybridisation, it is not necessary  to use RNAse­free buffers and containers; 2.  Make sure real temperature of SSC solution  is 60°C  1. Place slides in a trough (a big container) with  a stir bar. Wash in 1xSSC at 60°C for 10 min 2. Wash in 1.5xSSC at 60°C for 10 min, and then  cool slides to 37°C 3. Wash twice in 2xSSC at 37°C for 20 min each. 4. Treat with 0.1µg/ml RNAse A in 2xSSC at  37°C for 30 min (remove unbound probe)

5. Wash in 2xSSC at RT for 10 min 6. Wash twice in 0.2xSSC at 60°C for 30 min each Note: 0.2xSSC is vital to reduce background  7. Wash once in 0.2xSSC at RT for 15 min 8. Wash once in PBT for 15 min 9. Incubate slides in 4% normal sheep serum in PBT  for several hr at RT (blocking)   

C: Antibody Visualisation of  Digoxygenin 1. Incubate slides with (pre­absorbed) anti­ digoxygenin antibody (alkaline phosphatase  (AP)­coupled; 1:2000) in 4% sheep serum in  PBT at 4°C overnight 2. Wash three times in PBT at RT for 30 min  each 3. Wash twice in Alkaline Phosphatase buffer at RT  for 5 minutes each. 

4. Visualization: For every ml of AP buffer, add  1µl of NBT and 3.5µl of BCIP, and develop in  the dark for between 2­20 hours Note: Since the AP enzyme is very stable, it is possible to  wash out the NBT/BCIP, replace with AP buffer, and to  continue the reaction at a later time

5. Wash twice in PBS to remove substrates

Note: many crystals may exist in the section, so check the  sections under microscopy

6. Fix slides in 4% PFA for at least 15 min at RT.  Mount slides in glycerol/PBS. Note: Fix NBT/BCIP precipitate, because background may  come dark

For

Whole Mount In Situ Hybridization In Situ Hybridization on Cultured Cells  Basically the same Please see the protocols in Word file

Main contents • In situ hybridization • Neural tracing (retrograde and anterograde) – A brief introduction

• General approaches to analyses phenotype  in KO mice (CNS)

Neural tracing Take the advantages of:

a. Axonal flows

Retrograde and anterograde

b. Membrane can take up (endocytosis)      tracers by receptors or by a non­specific      manner

Well­used tracers • HRP( 辣根过氧化物酶 ) and WGA­HRP Both antero­ and     retrograde manners Transganglionic labeling EM Combination with ISH

• BDA (Biotinylated Dextran Amine; 结合生物素的葡 聚糖胺 ) – Both anterograde     and retrograde – Easy to handle – Reveals fine axon     terminals and     dendrites – EM

•CTb (cholera toxin B subunit;  霍乱毒素 B 亚单位 ) –Visualization with antibody­­retrograde

• Fluorescent dyes — 荧光染料 (retrograde)  – – – –

Fluoro­Gold (FG) －紫外激发－黄色 Fast blue (FB) －紫外激发－蓝色 Nuclear yellow (NY)  －紫外激发－黄色 DiI (DiA, DiO)  －绿光激发－红色 • Physical diffusion along the membrane • Can be sued in fixed tissue • Label fine dendritic spine

DiI labeling in spinal cord

• PHA­L(phaseolus vulgaris agglutinin,  菜豆凝集素 )  – Anterograde – Visualization with IHC

Main contents • In situ hybridization • Neural tracing (retrograde and anterograde) – A brief introduction

• General approaches to analyse phenotypes  in KO mice (CNS)

Several aspects before you start – Possible categories of the genes  •Transcription factor? Receptor?  Intracelluar kinase?  – Possible functions of the genes •Axonal guidance cue? Migration?  Differentiation? cell fate determination?  Projection? 

Step 1 Temporospatial Expression  patters of the genes • Where: 

– Localization • Regions?

– Subpopulation

• Subtypes? • Neurons or glia? • Postmitotic vs  proliferating?

  

• When:

– Earliest stage? – Time point at which expression pattern  changes? – Transient or persistent?

One more example of further defining  subtypes of the interested genes

Step 2 Earliest stage detected  morphological changes Purpose of KO: Gene’s function Mechanisms Molecular events  occur earlier

Step 3 Possible causality  between inactivation of gene  and phenotype  • 1. Expression of genes that have possible association with the phenotype, and other approaches • 2. Think about how LOF makes the defects happens • 3. Test your hypothesis – GOF – In vitro assay

• 4. Make a story

Gene expression profiles in the mutant

GOF to test the hypothesis

• Collection of the data you got, and  draw a conclusion – DCC is essential for ventral  migration of early­born spinal  interneuron during spinal cord  development

• Submit your paper – Choose one you like most:  •Cell, Nature, Science, or…. • Wait for comments­­­revise (add more  data)­­­and send back­­­ • publish  • Get your degree • Continue your research career, go  abroad to learn more • A PI position is waiting for you