Diagnosticul De Laborator Al Infectiilor Produse De Streptococi.docx

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR PRODUSE DE STREPTOCOCI Manifestarile clinice determinate de streptococi includ: - infectii acute supurative (angina eritematoasa, sinuzite, otite, mastoidite, endocardite, pneumonii, bronhopneumonii etc.) si nesupurative (scarlatina); - complicatii: glomerulonefrita acuta difuza, reumatismul reumatismala, eritemul nodos, coreea Hungtington.

articular

acut, cardita

Diagnosticul de laborator este bacteriologic(izolarea si identificarea germenului) si imunobiologic (confirma diagnosticul etiologic, diagnosticheaza complicatiile poststreptococice, urmareste eficienta tratamentului). 1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE Produsele patologice recoltate pot fi: exudat faringian, exudat nazal, sputa, LCR, puroi, exudat pleural, secretie otica, secretie vaginala, secrcetie de col uterin, sange, urina, material necroptic.

Recoltarea produselor patologice trebuie sa se faca inainte de inceperea oricarui tratament cu antibiotice, inainte de toaleta de dimineata si inainte de masa. Insamantarea produselor patologice trebuie sa se faca in cel mult 1-2 ore de la recoltare. 2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC 2.1. Examen direct: Frotiul efectuat din produsul patologic, in scop orientativ, are importanta pentru produsele normal sterile; se efectueaza 2 frotiuri: unul colorat Gram si celalalt albastru de metilen, ultimul important pentru studiul elementelor celulare. Coloratia Gram evidentiaza: coci Gram pozitivi sferici, asezati in lanturi, nesporulati, flora de asociatie (alti coci sau

bacili), polimorfonucleare (PMN), celule epiteliale intregi sau detritusuri (urile 1, 2 si 3). In cazul exudatului faringian, frotiul serveste numai pentru diagnosticul diferential(pentru eliminarea altei etiologii microbiene). De remarcat faptul ca pe un astfel de frotiu nu se poate face diferentierea intre streptococii hemolitici si streptococul viridans, un comensal obligatoriu al cailor respiratorii superioare.

ura 1: Streptococi. Dupa Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

ura 2: Streptococi. Dupa Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

ura 3: Streptococi. Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

2.2. Izolare in vitro Se utilizeaza urmatoarele medii de cultura: medii de imbogatire mediul Picke(cristal violet si azida de sodiu), medii de izolare complexe (bulion glucozat, geloza sange). Insamantarea produsului patologic se face: fie in suprafata mediilor, fie in conditii de semianaerobioza pentru produsele patologice lichide din cavitati inchise (puroi otic, mastoidian, sinusal, LCR). Produsul patologic se depune la fundul unei placi goale, peste care se toarna sange sau se incubeaza in atmosfera de CO2 5%. Urmeaza incubarea la 370C 18-20 de ore si etapa de identificare. Tampoanele introduse in mediul de imbogatire se incubeaza 3-5 ore la dupa care se fac treceri pe geloza-sange, care se incubeaza 18-20 de ore la 370C. 370C,

2.3. Identificare 2.3.1. Caractere de cultura Medii lichide: tulbura usor mediul cu formarea unui depozit;

Pe medii solide: pe geloza sange streptococul de grup A poate sa determine: • colonii mucoide: colonii rotunde, cu suprafata convexa, lucioase, de consistenta mucoasa, filanta; sunt caracteristice streptococilor incapsulati, virulenti si cu proteina M; • colonii „mtt“: colonii turtite, apoase, cu suprafata neregulata, mamelonata, cu tendinta de confluare (aspect de harta geografica); • colonii „glossy“: colonii rotunde, bine delimitate, mici, lucioase, cu suprafata conica; corespund streptococilor neincapsulati, cu continut variabil de proteina M; • colonii „rough“: colonii turtite, uscate, cu margini dintate si cu suprafata rugoasa, care se detaseaza in totalitate de pe suprafata mediului, lasand pe locul respectiv o amprenta; Pe acelasi mediu (geloza singe) streptococii pot sa determine sau nu hemoliza, care poate fi (urile 4, 5, 6, 7, 8 si 9):

-

β hemoliza: coloniile sunt inconjurate de o zona completa, clara, de hemoliza, cu diametrul variabil in raport cu grupul antigenic;

-

α hemoliza: coloniile sunt inconjurate de o zona de hemoliza incompleta cu inverzirea mediului si a coloniei. Dupa mentinerea peste noapte la +40C poate sa mai apara la exterior un alt inel de hemoliza completa.

ura 4: Beta hemoliza. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

ura 5: Beta hemoliza. Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

ura 6: Streptococi beta hemolitici (http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

-

-

α’ hemoliza: colonii inconjurate de o zona de hemoliza incompleta cu aspect voalat, incetosat. Ii spune hemoliza incompleta pentru ca in zona de hemoliza din jurul coloniei se observa hematii intacte, nelizate. γ hemoliza: data de streptococi nehemolitici. Streptococii de grup A sunt streptococi β-hemolitici. ura 7: Streptococi beta hemolitici (http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

ura 8: Streptococi alfa-hemolitici (http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

2.3.2. Caractere morfologice Frotiul din cultura evidentiaza coci Gram pozitivi sferici, asezati in lanturi, capsulati, nesporulati (urile 10 si 11). 2.3.3. Caractere biochimice •

Testul sensibilitatii la bacitracina

Diferentiaza streptococii β-hemolitici de grup A de cei β-hemolitici nongrup A. Se preleva 3-4 colonii β-hemolitice sau o ansa din cultura in bulion. Se etaleaza inoculul pe placa cu agar-sange. Se plaseza apoi in centrul ariei insamantate un disc cu bacitracina. Se incubeaza 18-20 de ore la 370C (urile 12 si 13). ura 9: Tipuri de hemoliza (http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

ura 10: Frotiu din cultura - streptococi. Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

ura 11: Frotiu din cultura - streptococi. Dupa Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

Test pozitiv: zona de inhibitie cu diametrul de minim 11 mm in jurul discului. Test negativ: zona de inhibitie cu diametrul mai mic de 11 mm sau lipsa zonei de inhibitie in jurul microcomprimatului cu bacitracina.

Streptococii de grup A sunt sensibili la bacitracina.

ura 13: Testul la bacitracina. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

•

Testul CAMP

Se foloseste pentru identificarea streptococilor de grup B. Streptococii de grup Bproduc un factor difuzibil, factorul CAMP, care actioneaza sinergic cu β-lizina stafilococica, determinand liza completa a hematiilor de berbec sau de bou. Se insamanteaza un striu din tulpina indicatoare de stafilococ auriu pe un diametru al placii. Tulpinile de testat si tulpinile martor se insamanteaza in striuri fine, liniare, de cca 2 cm lungime, perpendicular pe striul tulpinii indicator, dar fara a o atinge. Se incubeaza placile la 370C peste noapte. Test pozitiv: largirea cuneiforma in varf de sageata sau in flacara a ariei de hemoliza produsa de cultura stafilococului (ura 14). Test negativ: nici o modificare a hemolizei. Testul poate fi pozitiv si pentru alte grupuri: E, P, U, V.

ura 14: Testul CAMP (http//www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p. 45)

•

Testul PYR (L-pyrrolidonyl-β-naphtylamida)

Diferentiaza streptococii de grup A , de cei β-hemolitici nongrup A. Este mai specific decat testul la Bacitracina. Streptococii β-hemolitici de grup A hidrolizeaza substratul PYR in Lpirolidona si β-naphtylamida, care prin reactie cu reactivul PYR (pdimetilamino-cinamaldehida) da culoare rosie. Se suspensioneaza o ansa incarcata cu cultura intr-un tub cu bulion PYR. Se incubeaza 4 ore la 370C, apoi se adauga o picatura de reactiv PYR. Test pozitiv: culoare rosie - purpurie dupa 2 minute de la adaugarea reactivului PYR. Test negativ: aparitia oricarei culori.

•

Testul SXT (sulfametoxazol-trimetoprim)

Este folosit pentru diferentierea streptococilor de grup A si B, de ceilalti streptococi β-hemolitici; majoritatea streptococilor de grup A si B sunt rezistenti la SXT atunci cand sunt incubati in atmosfera normala. Se preleva 2-3 colonii sau o ansa din cultura pura si se insamanteaza o placa cu agar-sange. Se depune in mijlocul ariei insamantate un disc cu SXT. Se incubeaza peste noapte in atmosfera normala la 370C.

Test pozitiv (germeni sensibli la SXT): orice zona de inhibitie in jurul discului cu SXT. Ex: streptococii de grup C ori G. Test negativ (rezistent la SXT): crestere pana la disc. Exemplu: streptococii de grup A ori B. •

Testul bila-esculina

Se foloseste pentru identificarea streptococilor de grup D si a enterococilor, fiind probabil testul cel mai fidel.

Enterococii si streptococii de grup D cresc pe mediul cu 40% bila si hidrolizeaza esculina cu eliberare de glucoza si un compus neglucidic (esculetina-dihidroxicumarina), care reactioneaza cu sarurile de fier dand nastere unui produs de culoare neagra. Se insamanteaza cu 1-3 colonii panta mediului agar-esculina sau jumatatea unei placi cu agar bila-esculina. Se incubeaza la 370C peste noapte si inca 24 de ore in cazul unui rezultat negativ. Test pozitiv: cresterea si inegrirea mediului din placa sau a cel putin ½ din panta. Test negativ: lipsa de inegrire a mediului din placa sau a pantei. •

Testul hipuratului de sodium

Diferentiaza streptococii de grup B de alti streptococi βhemolitici. Hipuricaza hidrolizeaza hipuratul de sodiu in benzoat de sodiu si glicina. Ninhidrina dezamineaza oxidativ glicina, rezultand aldehida corespunzatoare, CO2, NH3, hidrindantina (forma redusa a ninhidrinei). NH3 da cu ninhidrina si hidrindantina un complex colorat purpuriu. Se suspensioneaza cultura de testat in 0,4 ml solutie 1% hipurat de sodiu, pana se obtine o solutie laptoasa. Se incubeaza suspensia 2 ore la 370C. Apoi se adauga 0,2 ml din solutia de ninhidrina si se reincubeaza 10l50 minute la 370C. Se urmareste virajul culorii. Test pozitiv: culoare intens purpurie-hidroliza hipuratului.

Test negativ: culoare nemodificata. •

Testul sensibilitatii la vancomicina

Diferentiaza genurile Streptococcus si Enterococcus care sunt sensibile la vancomicina, de genurile Leuconostoc si Pediococus care sunt rezistente. Se preleva cu ansa 5-l0 colonii bine izolate sau un tampon bine scurs din cultura de bulion. Se insamanteaza ½ din placa de testare (placi cu agar Mueller-Hinton). Se plaseaza prin presare usoara, in centrul ariei insamantate, un disc cu vancomicina. Se incubeaza peste noapte la 37 0C in atmosfera cu 5% CO2. Test pozitiv (sensibilitate): aparitia oricarei zone de inhibitie in jurul microcomprimatului. Test negativ (rezistenta): crestere pana la discul cu vancomicina.

•

Testul tolerantei la sare

Este pozitiv pentru majoritatea speciilor de Enterococcus, care se dezvolta in bulion cu 6,5% NaCl in 24-72 ore la 370C, in timp ce tulpinile de Streptococcus nu se dezvolta. Tehnica: Pe un mediu cu 6,5% NaCl se insamanteaza 2-3 colonii de microorganism. Se incubeaza 3 zile la 370C, cu urmarire zilnica pentru turbiditate si virajul indicatorului (bromcrezol purpur). Test pozitiv: turbiditate cu sau fara virajul indicatorului de la purpuriu la galben. Ex. Enterococcus faecalis. Test negativ: absenta turbiditatii si modificarii de culoare. Ex: Streptococcus viridans. •

Cresterea la 100C si 450C

Enterococul se dezvolta la 100C si 450C, ceea ce-l diferentiaza de speciile de Pediococcus care se dezvolta numai la 450C sau de Leuconostoc care se dezvolta numai la 100C. 2.3.4. Caractere antigenice –

Identificarea grupului streptococic

Se face pe baza antigenului polizaharidic C, care imparte steptococii in streptococi grupabili: notati cu literele A-W (cu exceptia literelor I si J) si streptococi negrupabili, lipsiti de antigenul de grup.

Antigenul specific de grup (polizaharidul C sau acidul teichoic) poate fi identificat prin diferite reactii antigen-anticorp. Metode folosite: •

Reactia de precipitare in tuburi de precipitare

In mediu lichid seruri imune de referinta sunt puse sa reactioneze cu antigenul de testat, aflat tot in faza lichida. Extractul antigenic se poate obtine prin metoda Lancefield(extractie acida la 1000C), sau metoda Fuller (extractie cu formaldehida la 1600C) sau prin autoclavare (15 min. La 1210C). In tuburi de precipitare se pipeteaza extractul antigenic 0,1-0,2 ml intr-un numar de tuburi egal cu numarul antiserurilor de referinta. Se pipeteaza apoi o cantitate egala din fiecare antiser in tubul corespunzator, ci grija, astfel incat cei doi reactivi sa nu se amestece(se tine tubul inclinat si se lasa serul sa se prelinga pe peretele acestuia). Serul, cu o densitate mai mare decat a extractului antigenic, se va depune la fundul tubului fara ca cei doi reactivi sa se amestece. Dupa 15 min de incubare la temperatura camerei, se urmareste aparitia inelului de precipitare la interfata dintre cei doi reactivi. In caz de dubiu, se agita tuburile, se incubeaza 2 ore la 370C si se lasa apoi peste noapte la 40C. A doua zi se urmareste depunerea de precipitat la fundul tubului, si, in functie de cantitatea acestuia, se noteaza rezultatele pozitive semicantitativ (de la ++++ la +). Se recomanda pentru identificarea streptococilor β-hemolitici de grup A, B, C, F, G, dar si a celor non- β-hemolitici, de grup B si D. •

Teste de aglutinare pe lama

Sunt reactii antigen-anticorp, care folosesc drept suport pentru anticorpii specifici de grup fie stafilococi cu proteina A (reactie de coaglutinare), fie particule de latex(reactie de latex-aglutinare). Astfel: - Metoda coaglutinarii: reactia se efectueaza pe lama folosindu-se tulpina de identificat (antigenul) sub forma unei suspensii obtinuta prin cultivarea tulpinii de identificat in bulion glucozat si o trusa de antiseruri: A, B, C, F, G. Principiul metodei: cuplarea stafilococului Cowan cu proteina A cu anticorpii specifici antistreptococici de grup. Fragmentul Fc al anticorpilor se fixeaza de proteina stafilococica, iar fragmentul Fab ramas liber reactioneaza

cu polizaharidul specific de grup, dand o reactie vizibila macroscopic, sub forma unor grunji, cu clarificarea fazei lichide. - Metoda latex-aglutinarii: particularitatea reactiei este data de faptul ca anticorpii specifici antigrup sunt fixati pe un suport reprezentat de particule de latex. Reactia se desfasoara pe lama, rezultatul pozitiv (corespondenta imuna) insemnand aparitia grunjilor in faza lichida clarificata. Comparativ cu testul clasic al reactiei de precipitare, testele de aglutinare pe lama sunt mai rapide, mai economice, cu o sensibilitate si specificitate cel putin egale. –

Identificarea tipului M streptococic

Streptococcus pyogenes se clasifica, dupa proteina M, in 80 de serovaruri M, care pot fi identificate prin: •

Reactia de precipitare in tuburi capilare

Principiul reactiei este ca cel de mai sus, dar in locul tuburilor de precipitare se folosesc tuburi capilare cu diametrul de 0,7-l mm si lungimea de 75-90 mm. Se inmoaie extremitatea capilarului in antiserul de referinta si se aspira o coloana de 25-30 mm de ser. Se aspira in mod similar, peste antiserul de referinta, o coloana de extract antigenic cu inaltime egala cu a celei de ser, fara a interpune vreo bula de aer la interfata dintre cei doi reactivi. Se obtureaza orificiul inferior prin intarea verticala a tubului in blocul de plastilina.

Reactia se citeste dupa 5 min., urmarindu-se aparitia unui precipitat alburiu la limita de separare a celor doi reactivi, pe fond intunecat. –

Identificarea tipului T streptococic

Pe baza proteinei T, Streptococcus pyogenes este impartit in 28 serovaruri T, care se identifica prin : •

Reactia de aglutinare pe lama

Se efectueaza intre serurile anti-T adsorbite si suspensia tulpinii de identificat cultivata in bulion ( tehnicile de aglutinare de mai sus).

Observatie: Ultimele date de literatura fac diferentiere intre streptococii de grup D si enterococi, considerandu-se ca enterococii fac parte dintr-un gen separat de genul Streptococcus, si anume genul Enterococcus.

Alte metode de detectare rapida a antigenului streptococic: -

detectarea directa din exudatul faringian a streptococilor de grup A: exista truse comerciale cu reactivi care pot realiza extractia enzimatica sau chimica a polizaharidului specific de grup A si detectarea antigenului extras prin reactii de aglutinare sau reactii ELISA;

-

detectarea streptococului de grup B direct din prelevate placentare, uterine, cervicale;

-

detectarea antigenelor streptococice de grup A, B, C, D, F din hemoculturi;

-

detectarea directa a streptococilor de grup A din exudatul faringian sau a streptococilor de grup B din hemoculturi prin utilizarea de sonde nucleotidice (sonde ADN comercializate pentru acesti germeni).

2.4. Antibiograma Nu se efectueaza pentru ca, desi infectiile streptococice s-au tratat cu penicilina, pana acum nu s-au semnalat cazuri de rezestenta ale acestuia la penicilina. Antibiograma se efectueaza doar la persoanele alergice la penicilina. 3. DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGIC Are la baza investigarea raspunsului imun umoral si celular. Raspunsul imun umoral In vitro • Determinarea anticorpilor antistreptolizina O (ASLO) prin reactia ASLO Reactia ASLO Elementele reactiei -

ser de cercetat (anticorpi antistreptolizina O ?);

-

antigen standard - streptolizina S- (SLO);

-

suspensie de hematii de iepure.

Principiul reactiei: prezenta anticorpilor antistreptolizina O in serul de testat neutralizeaza antigenul standard (SLO), care nu-si mai manifesta efectul hemolitic asupra hematiilor (reactie de seroneutralizare). Titrul reactiei: cea mai mare dilutie de ser cu hemoliza absenta. Titrul ASLO normal: 250 unitati ASLO/ml. Titrul peste 250 unitati ASLO/ml semnifica infectie cu streptococ beta-hemolitic grup A, fie o infectie recenta (in urma cu 2-3 saptamani), fie repetate infectii streptococice in antecedente, netratate sau incorect tratate. •

Determinarea anticorpilor anti-MAP Se realizeaza prin reactia de latex-aglutinare.

Se fac dilutii binare ale serului de bolnav care se pun in contact cu antigenul latex-MAP. Se agita, se incubeaza acoperit la 370C 2 ore, apoi se lasa la temperatura camerei pana a doua zi. Reactie pozitiva inseamna aglutinare vizibila cu ochiul liber. Se considera titrul pozitiv peste 40 U. Anticorpii anti-MAP au o importanta deosebita, fiind singurii anticorpi capabili sa protejeze organismul de o noua infectie streptococica, dar numai fata de acelasi tip, imunitatea anti-M fiind specifica de tip. Anticorpii anti-MAP apar la 3-4 saptamani de la debutul infectiei acute si se mentin luni si chiar ani de zile. Anticorpii anti-MAP se gasesc la titruri foarte ridicate la cei cu RAA si cardita reumatismala, cat si in perioadele de acalmie, servind la diagnosticul acestor complicatii, in special in aceste perioade dintre pusee. •

Determinarea anticorpilor anticarbohidrat (anti-CHO)

Se efectueaza prin reactia de hemaglutinare pasiva (HAP). In aceasta reactie se pun in contact serul de bolnav diluat binar, cu antigenul standard reprezentat de antigen streptococic grup A extras prin metoda Fuller, antigen cu care se sensibilizeaza hematii de berbec. Reactia se icubeaza 1 ora la 370C. Reactie pozitiva inseamna aparitia unei hemaglutinari pe fundul godeului, hamaglutinare care apare sub forma de stea, fata de martor unde hematiile sunt dispuse omogen pe fundul godeului. Titrul pozitiv se consudera peste valoarea de 20 U.

Anticorpii anticarbohidrat au aceeati semnificatie si evolutie ca a anticorpilor anti-MAP. In vivo IDR Dick prin care se testeaza susceptibilitatea la scarlatina (prezenta sau absenta anticorpilor antitoxina eritrogena). Se injecteaza 0,1 ml de toxina eritrogena pe fata anterioara a antebratului. La 24-48 de ore se citeste reactia. Reactie pozitiva (prezenta unui eritem cu diametru mai mare de 10 mm) semnifica lipsa de anticorpi protectori anti-toxina eritrogena, deci susceptibilitatea de a face scarlatina. Reactie negativa (absenta eritemului la locul administrarii toxinei eritrogene) semnifica prezenta anticorpilor protectori anti-toxina eritrogena, deci un organism protejat fasa de o astfel de infectie. Fenomenul de stingere Schultz-Charlton: diferentiaza eruptia scarlatinoasa de alte eruptii, pe baza neutralizarii in vivo a toxinei eritrogene de catre serul de convalescent injectat intradermic in zona eruptiva a bolnavului suspect de scarlatina. Disparitia eruptiei de la locul administrarii serului semnifica eruptie scarlatiniforma; mentinerea eruptiei semnifica o alta etiologie a eruptiei decat cea scarlatiniforma. Raspunsul imun celular Se evidentiaza prin teste in vivo si in vitro, dar care vor constitui obiectul de studiu al imunologiei. ste d DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR PRODUSE DE PNEUMOCOC Streptococcus pneumonie este un germen conditionat patogen care determina: pneumonii sau bronhopneumonii (mai frecvent la copii si batrani), meningita, otita, sinuzita, pleurita, pericardita, infectii oculare, cutanate, abcese etc. Pneumococii sunt germeni frecvent intalniti in flora orofaringiana normala, purtatorii sanatosi reprezentand 30-70%. Diagnosticul de laborator este bacteriologic si consta din izolarea si identificarea germenului, ca si efectuarea antibiogramei.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE Se recolteaza sputa mucopurulenta, caramizie, cu striuri sanguinolente, aspirat traheal, exudat faringian sau nazal, singe, LCR, lichid pleural, sucul pulmonarextras prin punctie alba, fragmente tisulare prelevate prin punctii-biopsii. Sputa, recoltata in recipiente sterile, se spala de 2-3 ori cu ser fiziologic si se omogenizeaza prin agitare (dupa adaugarea a catorva perle de sticla sterile) in scopul indepartarii florei bacteriene ce provine din caile respiratorii superioare, dupa care este utilizata pentru efectuarea de frotiuri, insamantari si inoculari in soarece.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC 2.1. Examen direct Frotiul efectuat direct din produsul patologic evidentiaza: coci „in diplo”, lanceolatisau „in flacara de lumanare”, Gram pozitivi, capsulati, nesporulati, imobili. In functie de produs patologic (normal steril sau normal contaminat) se poate evidentia: flora de asociatie, polimorfonucleare (PMN), celule epiteliale intregi sau ratatinate (urile 1, 2, 3, 4 si 5). Frotiul efectuat direct din sputa evidentiaza pe langa coci „in diplo”, Gram pozitivi, capsulati, nesporulati, imobili si macrofage alveolare abundente, eritrocite care au transvazat la nivelul alveolelor. ura 1: Pneumococi evidentiati pe frotiu colorat Gram din lichid cefalorahidian. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

2.2. Izolare In vitro pneumococii nu se dezvolta pe medii simple. Ei necesita medii suplimentate cu ser, ascita, sange, incubate la 37C in atmosfera de CO2 5%(bulion cu infuzie proaspata de carne de bou, bulion glucozat cu thioglicolat ca agent reducator, geloza-sange, -ser, -ascita, iar pentru antibiograma Muller Hinton cu sange). ura 2: Frotiu colorat Gram din produs patologic - pneumococi. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

ura 3: Frotiu colorat Gram din produs - pneumococi. Dupa Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

ura 5: Pneumococi capsulati in produs patologic. Dupa Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993 In vivo pentru izolarea pneumococilor se utilizeaza soarecele alb. Dupa 24-48 de ore de la inocularea intraperitoneala, soarecele moare de septicemie, izolandu-se pneumococi in cultura pura din cord, exudatul peritoneal si splina. 2.3. Identificare a. Caractere cultura Pneumococii tulbura uniform mediile lichide; dupa mai mult de 3-4 ore are loc fenomenul de „autoliza”(sinuciderea corpilor bacterieni). Pe medii solide, de tip geloza sange, pneumococii determina colonii asemanatoare streptococului viridans: colonii de tip „S”, mici, punctiforme, cu zona de hemoliza (diametrul mai mare decat diametrul coloniei) de tip alfa (incompleta cu tenta verzuie) (ura 6 si 7). La pneumococi, daca initial coloniile sunt in „cupola de catedrala”, pe parcurs iau aspect de „strachina” sau „blid”(ura 8). Caracterele culturale mai sus mentionate sunt asemanatoare streptococului alfa-viridans, fata de care pneumococul trebuie diferentiat.

ura 6: Cultura de pneumococ pe geloza sange. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

ura 7: Cultura de pneumococ pe geloza sange. Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

ura 8: Geloza sange: colonii de pneumococ „in strachina”. Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

b. Caractere morfologice Frotiul din cultura (ura 9) evidentiaza coci „in diplo”, lanceolati sau „in flacara de lumanare”, Gram pozitivi, capsulati, nesporulati, uneori in lanturi scurte. Aparitia lanturilor si lungimea lor este corelata cu vechimea culturii, cu conditii nefavorabile de mediu), cu absenta ionilor de magneziu din mediu sau cu prezenta anticorpilor specifici de tip. c. Caractere biochimice Exista trei teste biochimice care diferentiaza pneumococii de streptococii viridans: fermentarea inulinei, biloliza, sensibilitatea la optochin. Toate aceste teste sunt pozitive la pneumococ si negative la streptococul viridans. Fermentarea inulinei este testata pe mediul Hiss cu inulina 1%, in prezenta unui indicator (rosu fenol). Se insamanteaza cultura din bulion glucozat cu thioglicolat. Reactia pozitiva, fermentarea inulinei, este evidentiata de virarea in galben a indicatorului, demonstrand prezenta pneumococului (ura 9).

ura 9: Frotiu efectuat din cultura de pneumococ. Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Reactie pozitiva

Reactie negativa

ura 10: Fermentarea inulinei. Dupa: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986 -

Biloliza sau fenomenul Neufeld consta in liza pneumococilor in prezenta bilei, sarurilor biliare sau acizilor biliari, substante care activeaza enzimele lipolitice ale pneumococului. Intr-o eprubeta se pune 1 ml de cultura (in bulion glucozat cu thioglicolat) cu 1 ml bila de bou (eprubeta din mijloc), in prezenta unui martor reprezentat de o alta eprubeta care contine 1 ml cultura cu 1 ml ser fiziologic (SF) (prima eprubeta din ura 11). Dupa 30 de minute, in eprubeta din mijloc cultura se clarifica, identificand pneumococul (enzimele lipolitice ale pneumococului lizeaza cultura, in timp ce in prima eprubeta continutul ramane tulbure.

-

Sensibilitatea la optochin. Testul este asemanator cu cel la bacitracina. Tulpina de identificat se insamanteaza, in striuri foarte dese „in panza” - pe geloza sange. In centrul zonei insamantate se aplica o rondea impregnata in solutie de optochin. Dupa termostatare, daca in jurul comprimatului apare o zona de inhibitie a cresterii germenului mai mare de 20 mm, testul este considerat pozitiv, fiind identificat pneumococul. Rezistenta sau zona de inhibitie mai mica, denota un test negativ, fiind cazul streptococului viridans (urile 12 si 13).

Cultura + bila continut tulbure streptococ viridans Cultura + bila  clarificar ea continutului p neumococ Martor: Cultura + SF tulbure

ura 11: Biloliza. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

ura 12: Sensibilitatea la optochin - test pozitiv (pneumococ). Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

ura 13: Sensibilitatea la optochin - test negativ (streptococ viridans). Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979 d. Caractere serologice (antigenice) Pentru identificarea serotipului se pot practica: reactia de umflare a capsulei si reactia de aglutinare pe lama cu seruri polivalente si monovalente, ultima fiind o metoda mai accesibila, in conditiile cresterii incidentei infectiilor pneumococice. Reactia de umflare a capsulei este folosita pentru identificarea polizaharidului capsular (substanta solubila specifica - SSS) care imparte pneumococii in peste 83 tipuri, cel mai agresiv fiind tipul 3, posesor al celei mai mari capsule. Tehnica: se amesteca pe o lama curata de sticla o picatura din cultura de pneumococ in bulion glucozat cu tioglicolat, sau din exudatul peritoneal de la soareci inoculati intraperitoneal, cu o picatura din serurile specifice de tip (preparate pe iepuri imunizati cu suspensii microbiene de pneumococ) si cu o picatura de colorant. Se acopera cu o lamela si se examineaza cu imersia. In cazul corespondentei imune intre cei doi reactanti, capsula isi mareste volumul de cateva ori (2-3 ori) ativ cu martorul (cultura de pneumococ + o picatura de ser fiziologic + o picatura de colorant) (urile 14 si 15).

Reactia de aglutinare pe lama se face cu serul polivalent (A+B+C) si serurile monovalente A (1, 2 si 3), B (4, 5 si 6) si C (8, 12, 14 si 19). Tehnica: o cultura de 24 de ore in bulion glucozat se centrifugheaza, sedimentul obtinut fiind suspensionat in 1 ml bulion. Pe o lama de sticla se pipeteaza patru picaturi din cultura de pneumococ, in care se adauga cate o

picatura din serul polivalent (A+B+C) si serurile monovalente A, Grunjii de aglutinare vor aparea la serul polivalent si de exemplu monovalent B. Ca urmare, pe o a doua lama se adauga, separat, componente ale monovalentului B, grunjii de aglutinare identificand pneumococ.

B si C. la serul serurile tipul de

ura 14: Reactia de umflare a capsulei. Dupa: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Coaglutinarea, ELISA, RIA sunt alte tehnici de identificare serologica, care urmaresc evidentierea polizaharizilor capsulari ai pneumococilor direct din produsele patologice: LCR, sputa, sange. d. Caractere de patogenitate Se poate efectua testul in vivo prin inoculare intraperitoneala sau subcutanata lasoarecele alb care moare prin septicemie in 24-48 de ore. ura 15: Reactia de umflare a capsulei. Dupa A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

2.4. Antibiograma Prin aparitia tulpinilor rezistente la antibiotice (exemplu penicilina) este obligatorie efectuarea antibiogramei.