Diagnostico Molecular

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATOLOGÍAS VIRALES Y BACTERIANAS

PROF. DR. MARCELO BUSTAMANTE, Ph. D. FACULTAD DE MEDICINA, UCSC. [email protected]

Desarrollo de la Ingeniería Genética ­ 1953 James Watson y Francis Crick, doble hélice DNA ­ 1982 Insulina humana recombinante ­ 1985 Kary Mullis, creador de la técnica de PCR  1993 Nobel de Química ­ 1985 Alec Jeffreys (U. de Leicester, UK) huella génica ­ 1990 Inicio proyecto Genoma Humano            

Proyecto genoma patógenos humanos, animales y plantas

­ 1997 Secuencia completa bacteria E. coli Ian Wilmut­oveja Dolly ­ 2000 Primer borrador Genoma Humano (85%) Bancos de Datos­Internet­Acceso libre ­2003 Mapa completado en un 99% con 99% de precisión -Costo: US$ 2700 Mi -Intituciones participantes (18): USA, UK, Francia, Alemania, Japón y China.

Reverse Transcription

Código Genético

PROYECTO GENOMA

Diagnóstico Molecular • Diagnóstico basado en información molecular • Información genética de los individuos (virus, procariontes y eucariontes)

• ADN • ARN

Detección de Virus • Indicado para: – Detección de virus ADN – Detección de virus ARN (retrovirus) – Epidemiología: Identificación de cepas – Taxonomía: Identificación de especies • Ejemplos: – Herpes (Subtipos) Papiloma (Subtipos) – Citomegalovirus VIH (Carga Viral) – SARS Hepatitis A, B, C – Enterovirus Influenza aviar – Virus Sincicial Rotavirus

Detección de Bacterias • Indicado para: – Detección de bacterias de difícil cultivo: Chlamidia, Mycoplasma – Detección de bacterias de crecimiento lento: MTB – Detección de resistencias: β-lactamasas, Rifampicina – Epidemiología: Identificación de cepas – Taxonomía: Identificación de especies • Ejemplos: – – – – –

M. tuberculosis complex Treponema palidum Mycoplasma pneumoniae Helicobacter pylori Bordetella pertussis

M. Avium (Subesp. ParaTBC) Chlamidia Legionella pneumophila Leptospira sp

Detección de Parásitos • Indicado para: – Detección de parásitos de difícil cultivo – Detección de parásitos de crecimiento lento – Detección de resistencias a antiparasitarios – Epidemiología: Identificación de cepas – Taxonomía: Identificación de especies • Ejemplos: – Protozoos: Entamoeba sp – Helmintos: Nematelmintos (Enterobius, Trichinella) » Platelmintos: Céstodes: Hymenoleptis, Tenias » Tremátodes: Distoma Parásitos sánguíneos: Tripanosoma

Mutación del Gen de la protrombina Mutación del Factor V de Leyden

Optimización del PCR • Oligonucleótidos iniciadores – Secuencia: Tm, especificidad – Tamaño: Tm – Gen que se detecta: nº de copias iniciales • Temperatura de hibridación – Mayor temperatura = mayor especificidad = menor rendimiento • Condiciones de reacción – Concentración de Mg++ – Concentración de Taq polimerasa • Extracción del DNA • Elección del método de detección y análisis

Proceso de análisis

Toma de Muestra

Extracción ADN

Detección amplificado

Amplificación ADN

SYBR GREEN I

Micrografía de Célula infectada por virus Herpes

Micrografía de fase final de infección por virus Herpes

Virus Herpes Simplex

Subtipos de Virus Herpes

Mapa genético de Virus Herpes 1

Método de Detección de Virus Herpes 1 y 2 •Técnica: LightCycler® - HSV 1/2 Detection Kit •Flexible: Permite la detección de 2 subtipos de virus Herpes simultáneamente •Sensibilidad: 10 copias/muestra •Rapidez: 3 horas para entrega de resultados •Seguridad: Control interno para minimizar la posibilidad de falsos negativos y Control positivo para verificar efectividad del PCR

Peaks de Melting para la diferenciación de Virus Herpes 1 y 2

Herpes 1 (53,9°C)

Herpes 2 (67,1°C)

Mycoplasma pneumoniae

Método de Detección de Mycoplasma pneumoniae •Técnica: LightMix® for the Detection of Mycoplasma pneumoniae •Flexible: Permite la detección de Mycoplasma pneumoniae específicamente (fragmento de PCR de 342 bp) •Sensibilidad: 10 copias/muestra (Detección linear entre 10 y 107 copias) •Rapidez: 3 horas para entrega de resultados •Seguridad: Control interno para minimizar la posibilidad de falsos negativos y Control positivo para verificar efectividad del PCR

Resultados del PCR Light Cycler para Mycoplasma pneumoniae

Bordetella pertussis

Mecanismo de patogenicidad de B. pertussis

Método de Detección de Bordetella pertussis •Técnica: LightMix® for the Detection of Bordetella pertussis •Flexible: Permite la detección de Bordetella pertussis específicamente (fragmento de PCR de 181 bp correspondiente a IS 481) •Sensibilidad: 1-10 copias/muestra (Detección linear entre 10 y 107 copias) •Rapidez: 3 horas para entrega de resultados •Seguridad: Control interno para minimizar la posibilidad de falsos negativos y Control positivo para verificar efectividad del PCR

Tabla 1: Lista maestra de SeptiFast (SML) Gram (-) Gram (+) Escherichia coli Staphylococcus aureus Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) SCoN1 Serratia marcescens Streptococcus pneumoniae Enterobacter (cloacae/aerogenes) Streptococcus spp. Proteus mirabilis Enterococcus faecium Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Acinetobacter baumannii 3 Stenotrophomonas maltophilia Hongos Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida glabrata Candida krusei Aspergillus fumigatus

Ilustración 1: RC G-, CH 610 Gráfico 1

Gráfico 3

Gráfico 2

Gráfico 4

Termociclador Labnet (PCR convencional)

PCR de tiempo real (Light CyclerTM)

Laboratorio de Diagnóstico Molecular Universidad Católica de la Santísima Concepción Lista de Prestaciones-Mayo 2007

Identificación genómica de patógenos

Método

Mycobacterium spp.

Real-Time PCR (LC)

Mycobacterium tuberculosis complex

Real-Time PCR (LC)

Helicobacter pylori

Real-Time PCR (LC)

Virus Hepatitis C (HCV)

Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Hepatitis B (HBV)

Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus hepatitis A (HAV)

Real-Time PCR (LC-Roche)

Papilloma Virus Humano (PVH)

Real-Time PCR (LC-Roche)

Genotipificación PVH oncogénicos

Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Herpes Simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2)

Real-Time PCR (LC-Roche)

Mycoplasma pneumoniae

Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Varizella-Zoster (VZV)

Real-Time PCR (LC-Roche)

Citomegalovirus Humano (HCMV)

Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Epstein-Barr (EBV)

Real-Time PCR (LC-Roche)

Herpes virus Humano tipo 6 (HHV6)

NESTED - PCR

Bordetella pertussis

Real-Time PCR (LC-Roche)

Septifast

Real-Time PCR (LC-Roche)

Enterovirus

Real-Time PCR (LC-Roche)

Determinación de Carga Viral Virus de la Hepatitis B (HBV)

PCR-ELISA (Amplicor-Roche)

Virus de la Hepatitis C (HCV)

PCR-ELISA (Amplicor-Roche)

Virus Inmunodeficiencia Humana ( VIH)

NASBA BIOMERIEUX

Detección de Mutaciones Genéticas Humanas Gen Factor V de Leiden (G→ A) posición 1691

Real-Time PCR (LC-Roche)

Gen Protrombina (G→ A) posición 20210

Real-Time PCR (LC-Roche)

Prestaciones varias área Biología Molecular Inmunotipificación CD3/CD4/CD8

subpoblaciones

leucocitarias

Citometría de Flujo-FACS Scan

Inmunotipificación subpoblaciones linfocitarias CD3/CD4/CD8/CD14

Citometría de Flujo-FACS Scan

Inmunotipificación subpoblaciones linfocitarias

Citometría de Flujo-FACS Scan

MUCHAS GRACIAS