Cultivo De Bacillus Thuringiensis Y Su Uso Como Bioinsecticida

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Laboratorio de Microbiología Agrícola. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Prolongación de Carpio y Plan de Ayala, Col. Santo Tomás C.P. 11340. México D.F., México.

CULTIVO DE Bacillus thuringiensis Y SU USO COMO BIOINSECTICIDA Por:

Lara Vega Israel

Entrega: Noviembre 3, 2008.

Objetivo general El alumno desarrollara el cultivo de Bacillus thuringiensis para identificar y describir su morfología colonial y microscópica con sus esporas y cuerpos paraesporales. Evaluará su capacidad de bioinsecticida.

Objetivos particulares 1. Cultivar Bacillus thuringiensis y describir su morfología colonial. 2. Estimular la esporulación del Bacillus thuringiensis cultivado y describir la morfología de sus esporas y cuerpos paraesporales. 3. Evaluar su capacidad de bioinsecticida contra Tenebrios (Coleópteros).

Introducción Las plagas tanto urbanas como rurales son una amenaza constante para la salud y la calidad de vida humana (Dulmage, et al., l990), son también la causa de grandes pérdidas económicas en los cultivos (Kaelin , et al., l994). Hasta ahora la única forma eficaz de controlar estos insectos plaga se basa en la aplicación de pesticidas químicos, aunque ello trae en consecuencia problemas ecológicos; por tanto el uso irracional de los agroquímicos ha sido causa de contaminación ambiental, en especial a finales de la segunda guerra mundial con el surgimiento de plaguicidas de origen órgano-sintético, que al desequilibrar el balance ecológico, han disminuido la biodiversidad, mientras que sus residuos tóxicos han contaminado los alimentos e inducido resistencia en los insectos plaga (Dulmage. et al., l990 ; Karamanlidou, et al., l991 y Badii, et al., l996),en la actualidad 500 insectos son resistentes a uno o mas pesticidas y el numero puede aumentar notablemente en pocos años (Rowe y Margaritis, 1987 citados por Macías, 1995). Una posible alternativa para solucionar este problema es el control biológico, definido como el uso de un organismo natural o modificado genéticamente y/o sus productos para reducir los efectos de insectos plaga (Galán et al., l996). Ignoffo y Hink , citados por Badii en 1996 , reportan la existencia de más de 1500 especies de microorganismos entomopatógenos con potencial para el control microbiano de insectos, en relación a su diversidad se señalan: hongos, virus, protozoarios y bacterias, en donde las últimas son las de mayor importancia. De las bacterias la más sobresaliente pertenece al género Bacillus. Falcón citado por Badii en 1996, clasificó a las bacterias en dos grupos a) las esporuladas y b) las no esporuladas. En donde las bacterias entomotóxicas con mayor potencial para la producción de bioinsecticida es Bacillus thuringiensis (Bth), la que más se ha explotado comercialmente, mientras que en segundo lugar se ubica a B. popillae y más recientemente B. sphaericus y B. morati que tiene valor reconocido en el control de plagas urbanas como los mosquitos, vectores de paludismo, dengue, etc. (Badii, et al., 1996).

Bacillus thuringiensis La bacteria Bacillus thuringiensis (Bth) es un bacilo gram-positivo, flagelado y esporulado que se caracteriza por la formación de un cuerpo paraesporal o cristal de proteína, conocido como delta-endotoxina, estos cristales se forman durante la esporulación y tienen actividad tóxica para larvas de insectos (Shieh, l988). A Bth se le considera cosmopolita, pues sus esporas se han aislado de suelo (Meadows, et al., l992) , de larvas de insectos enfermos (Kaelin P., et al., 1994), de productos almacenados (Karamanlidou, et al., 1991), y hojas de árboles (Meadows, et al., 1992; Sánchez-Yáñez y Peña-Cabriales, 1995), aunque es más frecuente aislarla de productos almacenados, pues las condiciones ambientales del almacén permiten la persistencia de sus esporas (Martínez y Sánchez- Yáñez,1998) incluyendo la rizosfera de plantas (Medrano, et al., 1998).

La delta-endotoxina puede variar en tamaño y en forma, ya que según la variedad de Bth, pueden producir en el medio de cultivo más de una forma de cristales. B.thuringiensis var. Israelensis es efectiva frente a mosquitos chupadores de sangre transmisores de un amplio espectro de enfermedades animales causadas por virus, bacterias, helmintos o protozoos. B.thuringiensis var. Tenebrosis descubierta en 1983, posee un patotipo efectivo contra larvas de coleópteros. Puede infectar a la larva del escarabajo de la patata, causante de la mayor peste de las patatas en Europa y Norte América, que ha desarrollado resistencia a muchos insecticidas químicos. B.thuringiensis var. kurstaki cepa HD-1 es la cepa básica usada en muchas preparaciones para el control de orugas. Su gen de la proteína insecticida (Cry) fue el primero en clonarse. Kaelin et al., l994, mencionan que encontraron cristales de formas romboidal (de proteínas de 65 kDa), de tipo amorfo entre (130 y 140 kDa) y heterogéneo (de aproximadamente 63 kDa) y también de la clase bipiramidal (l30 y 65 kDa ) . Mientras Karamanlidou, et al., 1991, reportan el aislamiento de cristales irregulares, cuboidales, bipiramidales y esféricos, aunque Meadows, et al., 1992, señalan que la forma más común es la bipiramidal. Mientras que Kaelin, et al., l994, proponen una forma de clasificación de los cristales más práctica en base a su espectro de actividad insecticida, en donde los cristales tipo Cry I son tóxicos para lepidópteros, los Cry II para lepidópteros y dípteros, los tipo Cry III para coleópteros y los Cry IV para dípteros. Mecanismo de acción de la delta-endotoxina. Cuando el cristal es ingerido por un insecto susceptible en fase larvaria llega a su intestino medio, se disuelve por la acción de los jugos intestinales a pH alcalino, aquí la delta-endotoxina sufre una proteolisis enzimática y da origen a la toxina activa, la cual se une a un receptor específico de las membranas epiteliales de las células del intestino, lo que genera poros que desequilibran su balance osmótico y provocan la lisis celular de esta parte del aparato digestivo, posteriormente causa diarrea y vómitos en el insecto, lo que puede provocar eventualmente su muerte por una deshidratación severa (Hugutte,l989, citado por Leal 1995; Shieh, 1988).

Fig. 1. Mecanismo de acción de la delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis

Material Material biológico: • • • •

Cepa de Bacillus thuringiensis 250 larvas de Tenebrios (Coleópteros) 5 zanahorias 1 papa

Equipo: • • • •

Balanza analítica Microscopio Potenciómetro Centrifuga

Cristalería • • • •

Matraz erlenmeyer de 500 y 1000 mL Pipetas de 5 y 10 mL Vaso de precipitados de 250 y 1000 mL 20 tubos de vidrio con tapón de rosca

Utensilios: • • • • • • • •

Aguja de disección Asa y porta-asa microbiológica Espátula Mechero o lámpara de alcohol Barra magnética Pinzas de disección Porta y cubre objetos Bisturí y tijeras

Varios: • • • • • • •

Algodón Gasa Papel aluminio Papel estraza Atomizador 25 vasos de unisel Ligas

Reactivos: • •

Agar nutritivo Reactivo de Bradford

• • • • • • • • • • • • •

Colorantes para tinción de Gram Glucosa Extracto de levadura (NH4)2SO4 K2HPO4 FeSO47H2O H2O desionizada H2O2 MgSO47H2O MnSO4 CaCl2.2H2O ZnSO47H2O CuSO4

Procedimiento A. CULTIVO DE LA BACTERIA 1. A partir de la cepa tipo Bacillus thuringiensis, hacer su siembra en tubo con agar nutritivo e incubar a 28°C por 24 o 48 hor as. 2. Pasado el tiempo de incubación, observar las características morfológicas de las colonias desarrolladas. Tomar una muestra de estas para teñir con Gram y registrar sus características microscópicas.

B. OBTENCION DE ESPORAS 1. Cultivar B. thuringiensis en medio G para obtener endosporas. 2. Incubar durante 48 o 72 horas hasta lisis celular. 3. Hacer un frotis del cultivo lisado y teñir con el colorante de Bradford para observar las endosporas y los cuerpos paraesporales producidos por la bacteria. --CULTIVO DE MEDIO G (Bechtel y Bulla 1976) Nutriente Cantidad 1 Glucosa 1g 2 Extracto de levadura 2g 3 (NH4)2SO4 2g 4 CuSO4 0.005g 5 MgSO47H2O 0.2g 6 FeSO47H2O 0.0005g 7 CaCl2.2H2O 0.025g 8 ZnSO47H2O 0.005g 9 MnSO4 0.05g 10 K2HPO4 0.5g 11 H2O 1L pH 7.0

--TINCIÓN DE LAS ESPORAS CON EL COLORANTE DE BRADFORD 1. 2. 3. 4.

Hacer una preparación fija con una gota del medio de cultivo Colocar una gota del colorante durante 5 minutos. Lavar la preparación y dejar secar al aire. Observar al microscopio los cristales paraesporales de color azul.

NOTA: Con las endosporas se llevará a cabo un bioensayo en el que se pondrán en contacto con larvas de Tenebrios que son plagas de plantas.

C. BIOENSAYO 1. Comprobar la existencia de esporas y cuerpos paraesporales en el frotis del cultivo de la bacteria en medio G. 2. Realizar 5 diluciones (10-1, 10-2,…,10-5) del cultivo de la bacteria en medio G. 3. Cortar las zanahorias y la papa en piezas pequeñas suficientes para colocar 1 pieza de cada una por vaso. 4. Colocar 10 larvas de Tenebrios por vaso. 5. Etiquetar los vasos de unisel como sigue: -- 3 como Testigo Negativo (agua) -- 3 como Testigo Positivo (cultivo bacteria original) -- 3 como Dilución 10-1 -- 4 como Dilución 10-2 -- 4 como Dilución 10-3 -- 4 como Dilución 10-4 -- 4 como Dilución 10-5

6. Separar las piezas cortadas de verdura por tratamiento y colocarlos sobre papel estraza. 7. Con ayuda del atomizador bañar las piezas con la solución correspondiente a cada tratamiento de forma que queden totalmente bañadas.

8. Colocar las piezas en los vasos correspondientes.

9. Cortar gasas para cubrir todos los vasos y cerrar con ligas. 10. Dejar los vasos en lugar fresco por 5 días y observar resultados.

Resultados A. CULTIVO DE LA BACTERIA.

Figura 2. Cultivo de la cepa de Bacillus thuringiensis utilizada.

Como puede observase en la Fig. 2. B. thuringiensis presenta una morfología colonial cremosa con bordes aserrados, las colonias son planas y de color blanquesino.

Bacilos

Figura 3a y b. Tinción de Gram de Bacillus Thuringiensis tras cultivar en agar nutritivo. Al realizar la tinción de Gram a la bacteria podemos observar su morfología microscopica (Fig. 3). Los bacilos se tiñen de color violeta lo que indica que B. thuringiensis es Gram+, ademas el bacilo presenta bordes rectos y se observan en general formando cadenas largas de varios bacilos.

B. OBTENCIÓN DE ESPORAS.

Bacilo Endospora

Cuerpos paraesporales

Figura 4. Tinción de Gram de B. thuringiensis durante esporulación tras cultivar en medio G.

Con la tinción de Gram realizada a la bacteria después de cultivar en medio G (Fig. 4) podemos observar como se ha inducido la esporulación del bacilo Gram +, pues se observan endosporas de color rosa en bacilos aun no lisados y cuerpos paraesporales igualmente de color rosa, los cuales presentan en su mayoría una forma bipiramidal.

Bacilo

Figura 5. Tinción con el colorante de Bradford de B. thuringiensis durante esporulación tras cultivar en medio G. En la Fig. 5 observamos como los bacilos que aun no se han lisado durante la esporualción se tiñen de color azul marino utilizando el colorante de Bradford.

Espora

Cuerpos paraesporales

Figura 6. Tinción con el colorante de Bradford de B. thuringiensis durante esporulación tras cultivar en medio G.

En la Fig. 6 observamos como el colorante de Bradford tiñe también de azul marino tanto las esporas como los cuerpos paraesporales, y a diferencia de la tinción de Gram, aquí, puede observarse con mas claridad la forma bipiramidal que la mayoría de los cuerpos paraesporales presentan.

C. BIOENSAYO

Tabla 1. Número de larvas de Tenebrios vivas y muertas 5 días después de suministrar B. thuringiensis. TENEBRIOS VIVOS

TENEBRIOS MUERTOS

Testigo (-) Testigo (+) D 10-1 D 10-2 D 10-3 D 10-4 D 10-5

TOTAL DE TENEBRIOS POR TRATAMIENTO (repeticiones) 10/10/10 10/10/10 10/10/10 10/10/10/10 10/10/10/10 10/10/10/10 10/10/10/10

10/10/10 10/10/9 10/10/9 10/10/10/9 10/10/10/8 10/10/10/10 10/10/10/9

0 1 1 1 2 0 1

TOTAL %

250 100

244 97.6%

6 2.4%

TRATAMIENTO

Alimento

Unisel rasgado Figura 7. Larvas vivas encontradas en el tratamiento Testigo +. Como lo muestra la tabla, solo 6 de las 250 larvas utilizadas murieron. Se observa en la Fig. 7 como las larvas han consumido gran parte del alimento suministrado y permanecen muy activas pues incluso han rasgado el vaso de unisel.

LARVA PUPA ADULTO

Figura 8. Larvas, pupas y 1 ejemplar adulto encontrados vivos tras observar resultados en todos los tratamiento.

Espora

Figura 9. Tinción de Bradford al macerado de intestino de una larva encontrada viva. Para comprobar que B. thuringiensis había sido suministrado correctamente se macero el intestino de una larva viva y se logro encontrar una espora.

Discusión Algunas especies de bacterias Gram positivas (principalmente de los géneros Bacillus, Clostridium, Sporosarcina y Thermoactinomyces), disponen de una notable estrategia adaptativa cuando se ven sometidas a privación de nutrientes en su medio ambiente: si los niveles de fuentes de C, N, o P caen por debajo de un umbral, esto constituye una señal a la célula de que se avecina un largo período de privación de nutrientes. Entonces, la célula se implica en una serie de complejos cambios genéticos, metabólicos y estructurales (proceso de esporulación o esporogénesis), que conducen a la diferenciación, en el interior de la célula vegetativa original, de una célula durmiente (la endospora). La célula-madre, la célula vegetativa original que generó la endospora finalmente se autolisa, liberando la espora, que es capaz

de permanecer en estado criptobiótico, durmiente, varios decenios, siglos.

incluso

En el laboratorio tras lograr el cultivo de Bacillus thuringiensis nosotros logramos inducir la esporulación de B. thuringiensis al cambiarla de un medio rico en nutrientes (Agar nutritivo) a un medio de cultivo pobre en nutrientes (medio G), además de que para asegurar que la mayoría de los bacilos lograran la esporulación y lisado celular, se mantuvieron en este medio durante 5 días. Tras comprobar la esporulación y la producción de cuerpos paraesporales mediante la técnica de tinción de Gram Y Bradford (Fig. 4, 5 y 6) se procedió a realizar un bioensayo con Tenebrios (Coleópteros) suministrándoles la solución que contenía las esporas y cuerpos paraesporales en diferentes concentraciones para comprobar la capacidad insecticida de éstos. Sin embargo, como podemos observar en la Tabla 1 los resultados tras 5 días de observación nos muestran que no hubo efecto significativo sobre la sobrevivencia de los tenebrios al suministrarle el B. thuringiensis. Los resultados nos muestran que a pesar de que hay 6 larvas muertas (2.4% del total) que corresponden a diferentes tratamientos, es muy probable que estas larvas hayan muerto por causas totalmente distintas a la suministración de B. thuringiensis. Además un dato mas importante es que no ninguna diferencia en cuanto al tratamiento Testigo (–) y Testigo (+), pues mientras en el Testigo (-) sobrevivieron las 30 larvas utilizadas, en el Testigo (+) donde se suministro el concentrado de B. thuringiensis a las zanahorias y papas, de los 30 tenebrios utilizados solo 1 murió. Durante el análisis de resultados surgió la posibilidad de que hubiese existido una falla en la suministración del bacilo al alimento sin embargo esta posibilidad se eliminó pues al decidir realizar una tinción con el colorante de Bradford al intestino de una larva sobreviviente se logro encontrar en su interior una espora, lo que nos comprueba que las larvas lograron consumir las esporas y por tanto los cuerpos paraesporales obtenidos durante la esporulación. Es importante mencionar que al inicio del bioensayo cuando recién suministramos el alimento con bacilos a los tenebrios la mayoría de éstos mostraron algunos síntomas típicos de larvas afectadas descritos por Lamborot y Araya (1986): en las larvas se percibió una disminución del apetito hasta dejar de alimentarse, permaneciendo inactivas e inmóviles. Sin embargo tras los 5 días de observación estos síntomas desaparecieron. La razón de esta observación pudo ser la siguiente: Casi todas las variedades de B. thuringiensis son capaces de formar mas de un tipo de cuerpos de inclusión distinto. Cada variedad de Bt puede tener un número variable de plásmidos responsables de la síntesis de diferentes dendotoxinas. Estos plásmidos portan varios genes de toxina (genes cry), a veces idénticos. Además, Bt puede tener diferentes transposones que contribuyen a aumentar la diversidad genética de estas toxinas. Las diferentes variedades de Bt pueden intercambiar fácilmente sus plásmidos mediante un proceso semejante a la conjugación, fenómeno que ha sido

demostrado en el intestino de larvas de mosquito. De este modo, las variedades de Bt pueden también intercambiar plásmidos que contienen genes de d-endotoxina (los genes cry), y así aumentar su espectro de acción contra más especies de insectos. Entonces es posible que la variedad de B. thuringiensis que utilizamos en el bioensayo, si bien no es específica para coleópteros, es decir, no es la variedad Tenebrosis, sea capaz de producir, aunque de forma mínima, el tipo de endotoxina especifica para los coleópteros lo que produjo los síntomas iniciales y posiblemente tras la adquisición de una inmunidad por parte de larva dada la baja densidad de la d-entoxina específica para coleopteros, se haya eliminado el efecto insecticida por completo. Las especies de insectos resistentes a varios tipos de B. thuringiensis ha sido demostrada (Rodcharoen J, Mulla MS.1994). Al termino de la práctica comprobamos que la variedad utilizada de B. thuringiensis no esa la Tenebronis, la variedad especifica para matar larvas de coleópteros lo que será de gran ayuda para posteriores prácticas pudiéndose así utilizar una larva distinta para realizar el bioensayo. Por último cabe mencionar que para obtener mejores resultados se sugiere que los vasos utilizados sean de plástico con tapa y no de unisel pues varias larvas lograron salirse de ellos.

Conclusiónes Se logró cultivar a Bacillus thuringiensis y describir su morfología colonial y microscópica. Su morfología colonial es blanca, cremosa y plana con bordes aserrados y su morfología microscópica corresponde a un bacilo de bordes rectos, Gram + y esporulado. B. thuringiensis lleva a cabo la esporogénesis al sembrarla en un medio pobre de nutrientes. Durante la esporogénesis, B. thuringiensis produce cuerpos paraesporales, la mayoría de éstos con forma bipiramidal. La variedad de B. thuringiensis utilizada en la práctica no era especifica para las larvas de Tenebrios (Coleópteros), es decir, no corresponde a la variedad Tenebrosis.

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