Centrifugacion

METODOS PARA DETERMINAR EL CRECIMIENTO MICROBIANO

DRA. JOSEFINA PEREZ

Tipo de nutrición

Fuente de energía

Fuente de electrones

Fuente de carbono

Ejemplo

quimiotrofos

química

-

-

-

fototrofo

luz

-

-

-

organotrofo

-

comp. orgánico

-

-

litotrofo

-

comp. inorgánico

-

-

autotrofo

-

-

inorgánico

-

heterotrofo

-

-

orgánico

-

quimioorgano(hetro)trofo

química

comp. orgánico

orgánico

bacterias, hongos, animales

quimioliot(auto)trofo

química

comp. inorgánico

inorgánico

algunas bacterias

fotolito(auto)trofo

luz

comp. inorgánico

inorgánico

bacterias, plantas, algas

fotoorgano(hetero)trofo

luz

comp. orgánico

orgánico

algunas bacterias, algas

Hay cuatro técnicas biológicas básicas técnicas de recuento de viables

1.- Conteo en Placa Standard (Standard Plate Count). 2.- Determinación del número más probable. 3.- Métodos basados en la reducción de colorantes por viables. 4.- Conteo microscópico directo.

Conteo en Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el método de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente más diluídas de la muestra.

Filtros de membrana Utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tiñe específicamente los ácidos nucleicos).

Microcolonias en DEFT DEFT son las iniciales en inglés de Direct Epifluorescence Filter Technique (técnica de epifluorescencia directa en filtro). En esta técnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teñir las células bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las células somáticas). La detección de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopía de fluorescencia o por cualquier otro método de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son más fácilmente detectables.

Conteo de microcolonias al microscopio: Se añade un pequeño volumen de agarcultivo a un porta y se incuba para seguir la formación de microcolonias al microscopio.

Gotitas de agar:

Se hacen diluciones de la muestra (solución madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubación.

Films secos (Petrifilm):

Son películas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubación se hace el recuento.

Método del número más probable:

Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El método es popular aunque poco exacto

Métodos basados en la reducción de colorantes: Usando azul resazurina.

de

metileno

o

Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios líquidos (lácteos).

Tubos rodantes: Son tubos herméticamente cerrados en los que haciéndolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios.

Conteo microscópico directo: Usando cámaras de Newbauer, se coloca un volumen determinado de acuerdo a las especificaciones de la cámara, se recuentan las bacterias de acuerdo a los campos que deben leerse al hacer la observación al microscopio.

- Además de las técnicas de recuento basadas en la formación de colonias observable (técnicas biológicas) hay una serie de procedimientos de recuento basado en técnicas químicas, físicas e inmunológicas.

Métodos físicos para la detención de microorganismos. A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad eléctrica y esto varía la impedancia. El método se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como función del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a 106 - 107 células por ml-1. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogéneo sin «escalones». B) Microcalorimetria: Estudio de los pequeños cambios de calor producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la microcalorimetría para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio de cultivo con una composición definida de azúcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lácticas mediante los termogramas de su metabolización de los azúcares presentes en el medio. C) Citometria de flujo: Método basado en hacer pasar una a una las células de una suspensión por un sistema de detección; este sistema puede contener un detector capaz de medir diferentes parámetros (diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersión de luz, etc.) lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector.

Métodos químicos de detección de microorganismos. A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicación. La endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un índice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina. B) Lisado de Limulus: Usado para detección de endotoxinas (derivadas del lipopolisacárido LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinación de extractos de amebocito de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede detectar 300 células de E. coli. El método detecta células viables y no-viables. Es muy rápido. C) Sondas de ácidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern. D) PCR: Método para detectar número extremadamente bajos de microorganismos con una cierta rapidez basado de la producción de copias de genes específicos de un microorganismo en cuestión. E) Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la técnica sea controvertida. F) Radiometria: Medida de la transformación de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente. G) Substratos Fluoro y Cromogénicos: Se añaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la detección de los microorganismos.

Métodos inmunológicos A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molécula fluorescente o un segundo anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden usar antisueros complejos en el primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. El método también se ha usado para Clostridios aunque su mayor aplicación ha sido en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez. B) Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para la detección de Salmonella, el antisuero no se añade al alimento sino que se efectúa un paso previo de enriquecimiento del cultivo y de selección para evitar falsos positivos. C) Test 1 - 2 de Salmonella: Sistema con dos cámaras de agar blando. Una de las cámaras (la de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias móviles de este género atraviesan la cámara selectiva y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo específico por lo que se forma una banda de aglutinación cuando entre Salmonella. D) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioisótopo de un antígeno determinado (toxina producida por una bactería patógena) y su posterior detección por anticuerpos específicos fijados sobre un soporte sólido. E) ELISA: El método es similar al radioinmunoensayo: el antígeno se fija en un soporte sólido, se trata con el antisuero correspondiente y la interacción se detecta mediante una actividad marcadora (peroxidasa) unida al anticuerpo en cuestión o a un segundo anticuerpo de revelado.

El método se ha usado para detección de Salmonellas. Toxinas de S aureus, micotoxinas, toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. coli.

F) Difusión en gel: Método de Ouchterlony para detección de antígenos.

5. Examen de superficies. - Métodos dirigidos a detectar y medir los números de microorganismos presentes en superficies contaminadas. - Algunas veces es necesario añadir agentes neutralizantes para eliminar el efecto de detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie. - El método más clásico de obtención de muestra es el uso de torundas de algodón o de alginato cálcico. Las muestras se recogen en seco o en húmedo y se depositan sobre medios de cultivo líquido (generales o de enriquecimiento). -En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o la jeringa de agar. 6. Recuento de mohos y levaduras. Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22ºC o bien mediante diluciones sucesivas y siembra en placa en superficie. Es necesario añadir agentes antibacterianos al medio de cultivo para evitar el crecimiento de las bacterias, que es más rápido que el de los mohos.

Tipo de microorganismo

Temp. mínima

Temp. óptima

Temp. máxima

Psicrófilo

-5 +5

12 - 15

15 - 20

Psicrótrofo

-5 +5

25 - 30

30 - 35

Mesófilo

5 - 15

30 - 45

35 - 47

Termófilo

40 - 45

55 - 75

60 - 90