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Pontificia Universidad Javeriana Facultad de ciencias basicas Departamento de Microbiologia Informe curvas patron para la determinar azucares reductores (DNS), cuantificacion de proteinas (Bradford) y cuantificacion de almidon (yodatoyoduro) Viernes – Grupo 7 Nicolas Martinez Aldana, Luis miguel chaves

RESUMEN Objetivo: Realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS, Bradford y yodo-yoduro, para la cuantificación de azúcares reductores, proteínas totales y almidón, respectivamente. Materiales y métodos: Para la cuantificación de azúcares reductores se utilizaron soluciones de glucosa con concentraciones entre un rango de 0,5 a 1,7 g/L, y esto se realizó con la técnica del ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS), para la cuantificación de proteínas se utilizo la técnica de Bradford y solución de albúmina en un rango de concentración de 100 a 700 μg/mL, para cuantificar la cantidad de almidón se utilizó una solución de este a concentraciones entre 300 y 1000 μg/mL, para esto se utilizó espectrofotometría, con los datos que se obtuvieron en cada etapa del procedimiento se realizo una regresión lineal donde se obtuvo una ecuación que describe la absorbancia en términos de la concentración. Resultados: La ecuación que describe la relación entre la absorbancia y la concentración de azucares reductores fueY= 0,5105x0,0149 con un r2 = 0,9982, la ecuación que describe esta relación con proteínas es Y=0,0953x+0,0439 con un r2 = 0,9952 yla que describe la concentración de almidón es Y=0,0004x+0,1251 con un r2= 0,9845. Conclusión: Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar ecuaciones que nos permiten identificar la concentración de proteínas extracelulares, azucares reductores y el almidón.

PALABRAS CLAVES: Curva Patrón, azucares reductores, ácido 3,5 dinitrosalicílico, proteínas, Bradford, almidón, yodato-yoduro, absorbancia

INTRODUCCION

Una curva patrón, o curva de calibración es una herramienta de la química analítica que se emplea para medir la concentración de una sustancia en una muestra, por asimilación de los elementos de una concentración conocida. Se basa principalmente en una relación lineal entre un carácter medible, por ejemplo para el desarrollo de este laboratorio se utilizaron dos variables como lo son la absorción que guiados por la teoría cuántica que dice que si hay una “colisión” entre un fotón y un receptor (átomo, ion o molécula), hay una probabilidad finita de que su energía pueda ser transferida al receptor en un proceso discontinuo, en términos simples el receptor puede absorber energía o no(1).La otra variable que se utilizo fue la concentración de la sustancia o elemento que se quería determinar. Para realizar la curva de calibración se realizo una serie de diluciones a partir de una muestra cuya concentración se conocía previamente, el siguiente paso es establecer una relación matemática con los datos obtenidos. Se dice que la respuesta de la muestra puede ser cuantificada y, si se emplea la curva de calibración, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del analito. Estos métodos suelen tener una respuesta lineal sobre la que se le realiza un análisis estadístico de regresión para evaluar la confiabilidad de los datos (2). En la practica de laboratorio se llevaron a cabo tres curvas patrón, azúcares reductores, proteínas y almidón. Cada sustancia, por su composición química, requiere de diferentes métodos para su cuantificación. Para cuantificar azúcares reductores se utiliza el método del ácido 3,5 di-nitrosalicílico o llamado también DNS, el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo), cuya presencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la longitud de onda de 540nm (3), por otro lado, existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas como reacciones de biuret, método de Lowry, del ácido bicincónico, entre otros, pero sin duda, uno de los más usuales es el método de Bradford, que se basa en un equilibrio entre las tres formas del azul de Commassie (colorante), en condiciones fuertemente ácidas el colorante suele ser más estable, tornando a un color rojo, tras la unión a las proteínas torna a color azul (4). Finalmente, para la cuantificación del almidón se utilizó la técnica yoduro – yodato esta prueba se basa en la reacción donde, en un medio débilmente ácido, ocurre rápidamente liberando yodo el cual se detecta fácilmente con almidón. El yodo por fuerzas de Van der vals se une a los enlace α 1-4 del almidón formando un complejo de inclusión que forman un color violeta (5). El objetivo de esta introducción es ilustrarnos para cumplir el objetivo de la practica el cual es realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS, Bradford y yodo-yoduro, para la cuantificación de azúcares reductores, proteínas totales y almidón, respectivamente.

MATERIALES Y METODOS:

CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de glucosa (0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 1.7) g/L. Para la determinación de la concentración de glucosa mediante la técnica de DNS se preparo un blanco con 0,25ml de reactivo DNS y 0,25ml de agua, con las concentraciones de glucosa (0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 1.7) g/L se preparo una solución que contenía 0,25ml de la dilución mas 0,25ml de DNS, al cabo de esto se llevaron estos tubos a una temperatura de ebullición por 5 minutos, al terminar este tiempo se pasaron los tubos a un recipiente que contenía hielo para frenar la reacción, Una vez que se enfriaron los tubos se les agregó 2,5ml de agua destilada y luego se realizó una medición en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm. CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de albumina 100, 200, 300,400, 600, 700 μg/ml. Para la determinación de la concentración de proteínas mediante la técnica de Bradford se preparo un blanco con 0,1ml de NaCl y 5ml de reactivo de Bradford y se prepararon soluciones que contenían 0,1ml de cada dilución con 5ml del reactivo de Bradford, se midió la absorbancia de estas soluciones a una longitud de onda de 595nm CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ALMIDON: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de almidón 300,400,500,600,700,800 y1000 μg/ml. Para la determinación de la concentración de almidón mediante la técnica de yodo-yoduro se preparo un blanco con 1ml de solución de sales, 1ml de solución de yodo-yoduro y 2 ml de agua destilada y a partir de las diluciones preparadas se preparan soluciones con 1ml de estas mas 1ml de reactivo yodo-yoduro y 2ml de gua destilada, se homogenizan y se leen en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 650nm.

RESULTADOS

1. Curva patrón para la determinación de azúcares reductores.

La curva patrón para cuantificación de azúcares reductores se obtuvo producto de los resultados del experimento llevados a cabo por las monitoras y por los estudiantes del laboratorio. Los resultados se consignan a continuación en la tabla número 1 y en la tabla número 2. Tabla 1. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (monitoría). Concentración de azúcar en g/L Vs. Abs a 540nm (monitoría) Réplica Concentraciones g/L 0,5 0,7 1 1,5 1,7 2 1 0,280 0,300 0,655 0,817 0,962 2 0,241 0,352 0,490 0,785 0,808 1,077 3 0,233 0,316 0,418 0,811 0,856 0,947 Promedio 0,251 0,323 0,454 0,750 0,827 0,995 DS 0,025 0,027 0,051 0,084 0,026 0,071 CV (%) 10,005 8,254 11,214 11,139 3,085 7,146 La tabla 1 muestra los resultados obtenidos por las monitoras al efectuar el ensayo de DNS sobre las muestras de glucosa, en la que se observa un aumento de las absorbancias conforme aumentan las concentraciones de azúcar, así como los coeficientes de variación, los cuales se encuentran fuera del rango de un estudio químico (máximo 5%). Tabla 2. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (estudiantes) Concentración de azúcar en g/L Vs. Abs a 540nm GRUPOS Concentraciones (g/L) 0,5 0,7 1 1,5 1,7 2 1 0,362 0,498 0,699 1,060 1,130 1,166 2 0,207 0,318 0,697 0,712 0,727 0,871 3 0,240 0,328 0,488 0,693 0,758 1,068 4 0,139 0,212 0,240 0,290 0,304 0,933 5 0,293 0,424 0,419 0,755 0,949 1,130 6 0,211 0,304 0,480 0,837 0,879 0,932 7 0,261 0,379 0,532 0,792 0,876 1,006 8 0,374 0,470 0,632 0,896 1,028 0,984 Promedio 0,261 0,367 0,523 0,754 0,831 1,011 DS 0,079942 0,094927 0,154546 0,221332 0,250809 0,102896 CV 30,64373 25,89211 29,52879 29,33974 30,16797 10,17516 En la tabla número 2 se registran los datos de los 8 grupos de laboratorio tomados para cada una de las concentraciones de glucosa. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto.

Tabla 2a. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS RECORTADO (autores) Concentración de azúcar en g/L Vs. Abs a 540nm (recortado) GRUPOS Concentraciones (g/L) 0,5 0,7 1 1,5 1,7 2 1 2 3 0,240 0,328 0,488 0,693 0,758 1,068 4 5 6 0,211 0,304 0,480 0,837 0,879 0,932 7 0,261 0,379 0,532 0,792 0,876 1,006 8 Promedio 0,237 0,337 0,500 0,774 0,838 1,002 DS 0,025 0,038 0,028 0,074 0,069 0,068 CV (%) 10,579 11,365 5,600 9,518 8,238 6,795 La tabla 2a registra las réplicas que más se acomodan a la tendencia de los datos de absorbancia, para cada una de las muestras, según lo obtenido por las monitoras del laboratorio. Se eliminaron grupos de datos para obtener un menor coeficiente de variación entre las absorbancias medidas, debido a que el mismo era demasiado alto y se encontraron réplicas que se encontraban demasiado desviadas de los datos experimentales de control interno. Figura 1. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (monitoría).

En la figura 1 se puede apreciar la relación casi lineal entre las concentraciones de glucosa y las absorbancias de cada una, y la regresión lineal de los datos con la ecuación de dicha regresión y su r2 de 0,9962. Figura 2. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (autores).

En la figura 2 se observa la representación gráfica de los datos obtenidos por los estudiantes, de absorbancias Vs. Concentraciones, de las 3 réplicas que más se ajustaron a los resultados del control.

2. Curva patrón para la cuantificación de proteínas. En las tablas 3 y 4 se registran los datos obtenidos de proteínas totales (albúmina de suero bovino) por el método de Bradford, realizado por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes, respectivamente. Tabla 3. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (monitoría) Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs. Abs a 595nm (monitoría) 100 200 300 400 600 700 Réplica µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 0,082 0,298 0,387 0,491 0,684 0,733 2 0,175 0,226 0,361 0,415 0,763 0,684 3 0,178 0,262 0,42 0,422 0,557 0,758 Promedi 0,389333 0,442666 o 0,145 0,262 33 67 0,668 0,725

DS CV (%)

0,054580 22 37,64152 84

0,036 13,7404 58

0,029569 13 7,594810 29

0,042003 97 9,488848 21

0,103927 86 15,55806 28

0,037643 06 5,192146 27

En la tabla 3 se consignan los resultados obtenidos por las monitoras del laboratorio en la prueba. Se pudo observar que al ser el coeficiente de variación tan alto, se encontraron problemas en el muestreo de uno o más puntos. Tabla 4. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (estudiantes). Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs. Abs a 595nm 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 0,035 0,082 0,147 0,207 0,374 0,467 2 0,045 0,124 0,266 0,399 0,558 3 0,041 0,115 0,221 0,265 0,426 0,523 4 0,112 0,216 0,318 0,399 0,532 0,555 5 0,141 0,237 0,282 0,401 0,514 0,585 6 0,112 0,208 0,342 0,410 0,609 0,530 7 0,165 0,239 0,377 0,485 0,579 0,658 8 0,082 0,170 0,280 0,339 0,528 0,609 Promedi o 0,092 0,174 0,279 0,363 0,515 0,561 DS 0,049 0,060 0,072 0,089 0,078 0,063 CV (%) 53,289 34,763 25,714 24,553 15,226 11,171 En la tabla 4 se consignan los resultados obtenidos por cada uno de los grupos de laboratorio en la prueba. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto. Tabla 4a. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (autores). Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs. Abs a 595nm (recortado) 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 2 3 4 0,112 0,216 0,318 0,399 0,532 0,555 5 0,141 0,237 0,282 0,401 0,514 0,585 6 7 0,165 0,239 0,377 0,485 0,579 0,658

8 Promedi o DS CV (%)

0,139 0,027 19,047

0,231 0,013 5,524

0,326 0,048 14,727

0,428 0,049 11,460

0,542 0,034 6,196

0,599 0,053 8,839

En la tabla 4a se consignan los resultados de las réplicas que presentaron mayor igualdad a los datos obtenidos por las monitoras en la prueba. Se puede apreciar que los coeficientes de variación son mucho más bajos que tomando todo el grupo de gatos completo. Figura 3. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (monitoría)

En la figura 3 se puede apreciar la relación de las absorbancias y las concentraciones de proteína de las muestras analizadas. En la figura se puede apreciar la ecuación de la linealización y el r 2 de 0,9768. Figura 4. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (autores).

En la figura 4 se puede apreciar la representación de los datos obtenidos y su relación casi lineal (Abs vs. Concentración), así como la ecuación de la linealización y el r2 de 0,9952.

3. Curva patrón para la cuantificación de almidón. En las tablas 5 y 6 se consignan los datos obtenidos experimentalmente por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes durante la práctica. Tabla 5. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (monitoría). Réplica 1 2 3 Promedio DS CV (%)

Concentración de almidón en µg/mL Vs. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0,246 0,310 0,357 0,420 0,452 0,492 0,245 0,284 0,336 0,398 0,429 0,467 0,248 0,309 0,354 0,390 0,436 0,465 0,246 0,301 0,349 0,403 0,439 0,475 0,002 0,015 0,011 0,016 0,012 0,015 0,620 4,894 3,254 3,858 2,686 3,169

1000 0,557 0,543 0,601 0,567 0,030 5,338

En la tabla 5 se consignan los datos experimentales obtenidos por las monitoras del laboratorio en la práctica. Se puede observar que el coeficiente de variación de dichos datos es relativamente bajo. Tabla 6. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (estudiantes). Concentración de almidón en µg/mL Vs. Abs a 650nm

Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 Promedio DS CV (%)

300 0,236 0,227 0,237 0,238 0,237 0,222 0,229 0,242 0,234 0,007 2,887

400 0,287 0,271 0,303 0,284 0,285 0,287 0,310 0,310 0,292 0,014 4,794

500 0,359 0,331 0,365 0,348 0,326 0,358 0,364 0,360 0,351 0,015 4,292

600 0,385 0,397 0,401 0,386 0,373 0,393 0,386 0,419 0,393 0,014 3,493

700 0,417 0,415 0,442 0,430 0,411 0,446 0,425 0,430 0,427 0,013 2,946

800 0,472 0,457 0,505 0,478 0,420 0,467 0,475 0,465 0,467 0,024 5,093

1000 0,499 0,522 0,548 0,535 0,500 0,559 0,534 0,577 0,534 0,027 5,099

En la tabla 6 se consignan los resultados obtenidos por los 8 grupos de laboratorio. Se puede apreciar que el coeficiente de variación no es muy alto.

Figura 5. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (monitoría).

En la figura 5 se pueda apreciar la representación de los datos en una gráfica, así como de la linealización de los mismos, incluyendo su ecuación de la recta y el r 2 de 0,9957. Figura 6. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (estudiantes).

En la figura 6 se puede apreciar la representación de los datos en un gráfico, así como de la linealización de los mismos, con la ecuación de la recta y el r 2 de 0,9845.

DISCUSIÓN

La elaboración de una curva patrón es un paso muy importante para la determinación de las concentraciones de una muestra a analizar, teniendo un parámetro con el que se relaciona dicha concentración por medio de la curva patrón. En general, para la construcción de curvas patrón, se utilizan soluciones de concentración conocida, a las que se les halla una determinada Absorbancia, por ejemplo u otro parámetro, como el diámetro, graficándose finalmente cada pareja de puntos en un sistema cartesiano y así lograr obtener una línea recta que relacione dichas concentraciones con el parámetro medido. En la práctica se construyeron 3 curvas patrón para distintos propósitos, tomando en base las mediciones de absorbancia realizadas a muestras de concentración conocida, empleando métodos colorimétricos (DNS, Bradford, Lugol), para luego obtener, mediante la ayuda de un programa de hoja de cálculo o CAS, una linealización de dichos puntos y poder así predecir qué concentración tendrá una muestra de determinada absorbancia. A la hora de trabajar con absorbancias, se debe tener en cuenta que, según la ley de Lambert-Beer, el comportamiento lineal de los datos de concentración, respecto a los datos de absorbancia solo se cumple desde 0,1 hasta 1 unidades de

absorbancia, más allá de éste rango, el comportamiento de los datos empieza a ser polinómico y por ende la relación 1 a 1 se pierde. La primera curva realizada fue la curva patrón para la determinación de azúcares reductores por el método de DNS, el cual es un método bastante fiable y preciso para la determinación de dichos azúcares (6). Dicho proceso es un método ampliamente utilizado en microbiología para la detección de sustratos iniciales de un medio específico, así como de sustratos residuales, que permiten hacer cálculos cinéticos para los microorganismos involucrados en un proceso fermentativo. La segunda curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de proteínas según el método de Bradford, el cual se basa en la interacción de ciertos aminoácidos como la Histidina y la arginina, con el colorante azul de Coomasie, para dar lugar a una reacción colorimétrica (7). La tercera curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de almidón según el método de Lugol, el cual se basa en la detección del almidón debido a la interacción del yodo con las hélices del almidón, formando un complejo yodoalmidón y rindiendo un color violeta que indica la presencia de almidón positiva (8). En los datos obtenidos en las 2 primeras practicas correspondientes a las curvas patrón de azúcares reductores y proteínas, se pudo observar que los datos de las réplicas, cada una correspondiente a un grupo de trabajo del laboratorio, se encontraban bastante dispersos, presentando un coeficiente de variación muy alto (mayor al 5%), por lo que se debió proceder a recortar el número de réplicas que se tomaron para efectuar dichas curvas patrón obteniendo al final, un mínimo de réplicas aceptable (3 réplicas), con las que se procedió a realizar cada una de las curvas. Estos resultados tan diferentes pueden deberse a la sensibilidad de los reactivos, a la calibración incorrecta de los equipos o a fallas de manejo de los grupos de laboratorio. Dicha situación no se presentó en los datos de la tercera curva, la de almidón, por lo que se empleó todo el conjunto de datos (8 réplicas) para hacer las mediciones de la curva patrón.

CONCLUSIONES

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De acuerdo al procedimiento de la práctica se pudo conocer los fundamentos químicos, el correcto procedimiento y la importancia de las técnicas de DNS, Bradford y yodo-yoduro.

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Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar y se hallaron ecuaciones que nos permiten saber o cuantificar las concentraciones de almidón, proteínas y azucares reductores.

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Mediante una previa investigación y en las practicas se identificaron los factores que pueden llegar a interrumpir o dar falsos positivos en las técnicas utilizadas.

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Utilizando el conocimiento aprendido en estas practicas se pueden hallar diferentes ecuaciones para cuantificar diferentes compuestos que están presentes en una gran cantidad de reacciones.

BIBLIOGRAFÍA 1- Alfonso Clavijo Diaz. Fundamentos de química analítica. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogota. Primera edición (2002). pg 805 2- Gonzales C. Introducción a los métodos instrumentales de análisis. Primera edición. Ed. McGraw-Hill. Madrid (2003) 3- Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem., 31, 426, 1959. 4- Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254. 5- Burns R. Fundamentos de química. Cuarta edición. PEARSON. México DF, México. 2003 6- Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem., 31, 426, 1959. 7- Ahmed H. Principles and reactions of protein extraction, purification and characterization. CRC Press, año 2005, 410p. 8- Harisha S. An introduction to practical biotechnology. Laxmi Publications, año 2006, 540p.