Cap 26 - Bacterias - Anaerobios

ANAEROBIOS ORIGEN Y DEFINICION La presencia de una atmósfera terrestre rica en O2 ha permitido que los seres vivos hayan evolucionado desarrollando un metabolismo aeróbico, el cual se caracteriza por ser una forma muy eficiente de obtención de energía. A nivel bacteriano las bacterias anaerobias precedieron largamente a las aeróbicas y sin duda predominaron largamente en un mundo vivo que comenzaba a desarrollarse. Los anaerobios generalmente poseen un metabolismo de tipo fermentativo en el cual sustancias orgánicas son los aceptores finales de electrones. Las formas vegetativas mueren cuando son expuestos al O2 molecular libre en la atmósfera, aunque el grado de resistencia bajo estas condiciones es variable (AEROTOLERANCIA); Los esporos bacterianos no son afectados por tratarse de formas biológicas metabólicamente inertes y con muy escasa proporción de agua en su composición. En consecuencia una definición simple de las bacterias anaerobias sería: anaerobios son aquellos gérmenes que sólo pueden desarrollarse en ausencia de cantidades significativas de Oxígeno (O2) y bajo condiciones de potenciales REDOX (Eh) muy reducidos. En el mundo microbiano existen especies capaces de alternar con sistemas metabólicos diferentes para crecer y multiplicarse en muy diferentes condiciones de aerobiosis, total, reducida o ausente. Son gérmenes facultativos. Otros solamente subsisten en rangos estrictos de gases tales como el O2 y el CO2 (microaerófilos). Los anaerobios son poseedores de sistemas enzimáticos que solamente funcionan en ausencia de O2 por tanto son estrictos en cuanto a sus exigencias de Medio Ambiente. De ahora en más el término Anaerobios se aplicará solamente para este tipo de gérmenes. El conocimiento de estas bacterias es poco y relativamente reciente ya que para poder lograr condiciones de anaerobiosis en el Laboratorio se necesitaban, hasta los años 60, equipos costosos y técnicas bacteriológicas muy dificultosas. A partir de la introducción de sistemas simples para producir anaerobiosis con equipos y reactivos de bajo costo el conocimiento de los anaerobios se desarrolla intensamente. Aun así, no hay un gran número de Microbiólogos que se dediquen al Tema, la taxonomía está en permanente revisión e infinidad de aspectos se mantienen oscuros. MORFOLOGIA Y TINCION Como en casi toda la bacteriología, la morfología de los anaerobios se basa en la tinción de Gram. Un

Rivas problema adicional se plantea por la tendencia a tornarse Gram negativos, sea por la poca estabilidad frente a la decoloración (se prefiere el uso de alcohol a la mezcla alcohol-acetona) lo que los convierte en Gram inestables al examen directo de los materiales, sea porque existe una variación tintorial en los cultivos bacteriológicos. Dos aspectos a tener en cuenta en la tinción de Gram son: a. efectuar la decoloración solamente con alcohol etílico prescindiendo de la acetona, y b. prolongar el tiempo de contacto con Lugol hasta 1 minuto. La morfología celular, sobre las bases del Gram, permite distinguir formas variadas que incluyen toda la gama: Cocos Gram positivos, cocos Gram negativos, diplococos, estreptococos; bacilos Gram negativos, cocobacilos, fusiformes, bacilos rectos o curvos; bacilos Gram positivos, esporulados o no esporulados, espiroquetas, etc. EL METABOLISMO DE LOS ANAEROBIOS OXIGENO SENSIBILIDAD Los anaerobios estrictos crecen y se multiplican en ausencia total de Oxígeno molecular (O2) logrando obtener energía libre y sintetizar todos sus componentes estructurales sin la ayuda del O2. Todos sabemos que la vía anaerobia posee un menor rendimiento energético y está sujeta a potenciales REDOX bajos (algunas enzimas solamente operan en estas condiciones) y sin la presencia de elementos que interfieran el flujo normal de electrones. Si bien el O2 es potencialmente tóxico para cualquier forma de vida, los anaerobios son intolerantes al mismo aunque en diferentes grados. Existe un espectro que va desde los extremadamente intolerantes (aerointolerantes) hasta los aerotolerantes moderados los cuales pueden sobrevivir a la presencia de O2 durante breves períodos. Varias son las causas de la Oxígeno toxicidad. En 1er lugar el Oxígeno es un poderoso oxidante, es decir, un ávido receptor de electrones, por lo tanto su presencia en solución es incompatible con potenciales REDOX bajos. En esta situación el flujo de electrones se ve interferido por un receptor extraño al usual de los gérmenes provocando shunts letales. En segundo lugar el Oxígeno puede interactuar directamente con enzimas o cofactores causando inactivaciones irreversibles. En tercer lugar y aparentemente, la causa más importante de la Ox. toxicidad se atribuye a la producción de sustancias tóxicas derivadas de la reducción parcial de la molécula O2. Simplificando se pueden dar las siguientes reacciones químicas:

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O2 + 4H + 4e- --> H2O (reducción completa) O2 + 2H + 2e- --> H2O2 (reducción parcial) O2 + e-

--> O2.-

antibioticoterapia empírica racional y al microbiólogo para seleccionar los Medios de Cultivo más apropiados al aislamiento e identificación bacterianos. La TABLA 1 muestra el predominio de las especies más comunes como flora normal humana según diferentes localizaciones.

La formación de Peróxidos de Hidrógeno (H2O2) puede ser catalizada por varias enzimas y su letalidad para las bacterias está fehacientemente comprobada. Por otra parte el anión Superóxido (O2.-) es altamente tóxico por su participación en la producción de hidroxilos libres (HO.-) agentes letales para los microorganismos. Aquellos anaerobios aerotolerantes poseen enzimas como Catalasas y peroxidasas que descomponen los H2O2 en H2O + O; otros poseen Superóxido-dismutasas (SOD) que actúan eliminando los O2.-; más aun las SOD han sido postuladas como factores de virulencia en los anaerobios ya que estas enzimas permitirían la sobrevida de las bacterias en tejidos oxigenados hasta que el consumo de Oxígeno creará el ambiente adecuado para la multiplicación y desarrollo. POTENCIALES REDOX El potencial de Oxido Reducción (Eh) de una pareja REDOX es la medida en VOLTIOS de la tendencia espontánea a donar o recibir electrones por parte de uno de los integrantes de la pareja (flujo de electrones). Una pareja REDOX posee una forma reducida (dador de electrones) y una forma oxidante (receptor de electrones) Reductor <---> oxidante + electrones. En consecuencia cuanto menor sea la cantidad de formas oxidantes menor o más bajo será el potencial REDOX. La presencia de O2 en los cultivos o en el medio natural debe ser eliminada imprescindiblemente del microclima de desarrollo (O2 atmosférico y en solución. Aún mas el descenso de los Eh debe afirmarse con la presencia en el medio de sustancias reductoras que superen en gran número a las oxidantes. FLORA NORMAL ANAEROBIA El hombre conjuntamente con los animales (mamíferos, aves, peces) es hospedero en sus epitelios, mucosas y aparatos de un gran número de Especies y de un gran número de individuos anaeróbicos. Estos son miembros de una FLORA NORMAL beneficiosa y hasta en algunos casos esencial para la vida. El conocimiento de esta flora normal es importante desde varios ángulos. Si pensamos que muchas infecciones anaeróbicas se desarrollan en la vecindad de las superficies mucosas en las cuales estos gérmenes predominan como flora autóctona, el conocimiento de la misma se presenta de gran utilidad para sospechar quienes estarían involucrados en los procesos infecciosos. Esta información ayuda al Clínico para establecer una

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TABLA 1 Piel

V.R.S.(#)

0

0

Boca

Intestino

Genitales externos

Uretra

Vagina

Bacilos Gram (+) esporulados Clostridia

1

3-4

0

1

1

Bacilos Gram (+) no esporulados 0 0 1 0 3-4

2 0 1 0 2

2 2 2 2 1

1 1 3-4 2 1

0 0 d 0 d

0 0 d 1 0

0 2 1 3-4 2

Bacteroides Fusobact.

0 0

2 2

3-4 3-4

2 2

2 2

2 2

2 1

Cocos G (+)

2

2

3-4

3-4

2

1

2

Cocos G (-)

0

2

3-4

2

0

d

2

Actinomyces Bifidobact. Eubacterium Lactobac. (*) Propionibact. Bacilos Gram (-) no esporulados

(#) Vías Respiratorias Superiores; incluye vías nasales, nasofaringe, orofaringe y amígdalas. (*) Incluye anaerobios, facultativos y microaerófilos. (d = desconocido) (0 = no encontrados o raros) (1 = hallazgo irregular) (2 = habitualmente presentes) (3-4 presentes en gran número).

ESPOROS Algunas especies de anaerobios (bacilos Gram positivos del Género Clostridium) poseen la capacidad de esporular, esto es, producir esporos. Se trata de estructuras biológicas genéticamente iguales a su antecesor vegetativo, metabólicamente inactivos y altamente resistentes a condiciones medioambientales adversas (Temperatura, humedad, radiaciones UV, agentes químicos). La germinación de los esporos conduce a la forma vegetativa de la bacteria y puede suceder, en algunos casos luego de varios años. La resistencia de los esporos a altas temperaturas -120ºC hasta 15 minutosdesecación, falta de nutrientes, presencia de sustancias químicas antisépticas, radiaciones. La resistencia al calor se explica por los escasos porcentajes de H2O en su constitución (proceso de desecación paulatino del esporo en la maduración) y la presencia de Calcio y ácido dipicolínico como agentes quelantes, mientras que la resistencia a los otros agentes físico/químicos estaría dada por lo menos en parte por la presencia de proteínas

de superficie ricas en cisteína. Esta propiedad de esporular le confiere a las especies que la poseen una singular resistencia frente los agentes físicos y químicos habitualmente usados para la desinfección y una permanencia prolongada en el medio ambiente. Sin duda la ubicuidad y la peligrosidad de estos gérmenes son resaltables y su permanencia en la ecología microbiana está por demás asegurada. El proceso de esporulación comienza durante la fase de desarrollo estacionario luego de la falta de ciertos nutrientes, una vez que se inicia el proceso este es irreversible y una enorme cantidad de cambios metabólicos comienzan dentro de la célula con la producción y almacenamiento de enzimas y proteínas distintas a las de la forma vegetativa, que luego formarán parte del esporo. El factor desencadenante está constituido por la carencia de fuentes de Carbono y Nitrógeno, concretamente la falta de concentraciones adecuadas de trifosfato de guanosina (GPT) intracelulares inicia la esporulación y se sabe que todas las deficiencias nutricionales que conducen a una disminución del pool

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de GPT desencadenan la esporulación. Dos tipos de carencias son conocidas como responsables de la disminución del GPT: 1. Disminución del precursor purínico Pribosil-PP, que ocurre cuando hay carencias de Carbono. 2. La carencia de aminoácidos la cual se relaciona con el aumento de nucleótidos fosforilados de guanina, ppGpp y pppGpp. La germinación de los esporos comprende 3 etapas: a. ACTIVACIÓN: La activación es esencial para el proceso de la germinación y un esporo activado germina en forma irreversible. Activan los esporos el calor y algunos estímulos químicos. b. GERMINACION: Esta etapa comienza cuando los esporos activados son estimulados por variados elementos nutritivos y no nutritivos (l-alanina, el más común,) glucosa, otros aminoácidos. Cambios morfológicos y fisiológicos muy interesantes se producen cuando finaliza el estado latente; el esporo se hincha, pierde su refringencia, pierde su resistencia a los agentes físico-químicos y comienza a observarse actividad metabólica. c. CRECIMIENTO: En esta etapa se produce la síntesis proteica y de los componentes estructurales de la futura forma vegetativa. La membrana del 'core' del esporo se irá convirtiendo en pared celular y la actividad proteica se irá intensificando. En este momento toda esta actividad puede anularse o interferirse por Antibióticos, o carencias de nutrientes. Por su especial constitución los esporos no se tiñen con el Gram aunque existen técnicas especiales que permiten ponerlos en evidencia. Si se tiñe una bacteria esporulando mostrará el esporo en su interior (debemos recordar que cuando el esporo finaliza su maduración la forma vegetativa se desintegra) como una imagen en negativo -ausencia de colorante-. La ubicación de los esporos dentro de los bacilos así como su tamaño contribuyen a la identificación bacteriana. De esta manera podemos distinguir a los esporulados según: Ubicación: esporos medianos, subterminales, terminales. Tamaño : con deformación o no del cuerpo bacteriano. FACTORES DE VIRULENCIA Se pueden separar en 2 categorías según su importancia. Por un lado existen las poderosas toxinas producidas por los Clostridios; por otro, una serie de estructuras y sustancias de mucho menor poder patógeno que se observan en varias especies de no esporulados. Se conocen los lipopolisacáridos de superficie en varias

especies de Fusobacterium, Veillonella y Bacteroides. Estas sustancias tienen una actividad "endotoxina" similar a las de los bacilos Gram negativos facultativos. Su actividad es algo menos potente pero se ha demostrado su capacidad (en Bacteroides) de participar en la producción de abscesos y de causar hipercoagulabilidad. El polisacárido capsular de los Bacteroides del grupo fragilis es otro factor de virulencia importante, ya que se comporta en forma similar a las Cápsulas de otras bacterias, es decir, le confiere al germen "la lanza y el escudo" en cuanto favorece su poder invasivo y dificulta la acción defensiva de los leucocitos polinucleares. Aun más, está claramente demostrada su participación en la formación de abscesos causados por Bacteroides. Diversas enzimas de los anaerobios deben considerarse como factores de virulencia: colagenasa, hialuronidasa, DNAsa, elastasa, heparinasa, son las principales. También deben incluirse aquellas enzimas que protegen contra la acción letal del O2 tales como Catalasa y Superóxidodismutasa en cuanto permiten la sobrevida del germen en ambiente no apropiado hasta que se presenten las condiciones favorables. Estos factores de virulencia no deben considerarse como "toxinas". LAS TOXINAS Corresponde a las potentes exotoxinas producidas por los Clostridios las cuales serán analizadas con estos microorganismos. GENETICA DE INTERES EN LOS ANAEROBIOS Elementos extra cromosómicos: Plásmidos. Los Plásmidos están ampliamente difundidos entre los anaerobios especialmente a nivel de especies de Clostridium y Bacteroides. Un muy buen porcentaje de estos elementos no han demostrado funciones específicas. Entre los Plásmidos funcionalmente conocidos encontramos: a. Plásmidos que codifican la produción de Bacteriocinas. Similares a las Colicinas estas sustancias las poseen especies de Clostridium y Bacteroides. b. Plásmidos toxigénicos. Ampliamente distribuidos entre las especies de Clostridium productoras de exotoxinas (toxigénicas). La correlación fehaciente entre plásmido y producción de toxina no se ha podido establecer en muchos casos. El caso con más evidencias de la relación plásmido-toxina para Clostridium tetanii donde puede afirmarse que la producción genética de toxina tetánica está codificada por un Plásmido.

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c. Plásmidos que codifican la resistencia a los ATB. Existen evidencias de que entre diferentes especies de Clostridium, Bacteroides y Cocos anaerobios existen plásmidos de diferente tamaño que codifican la resistencia a Macrólidos (Clindamicina, Eritromicina) Tetraciclinas y Cloramfenicol. RECOLECCION DE MUESTRAS Teniendo en cuenta que los anaerobios pueden causar o contribuir a la infección de cualquier tipo y en cualquier lugar del organismo, parece claro que se debe procurar siempre una muestra libre de contaminación con Flora Normal para tener resultados verdaderamente positivos. Las muestras siguientes habitualmente están contaminadas con anaerobios de la Flora Normal y por lo tanto no deben ser cultivadas en anaerobiosis. Exudados de garganta, nasofaríngeos, bucales. Esputo tosido o aspirado vía oral/nasal. Contenido gástrico e intestinal (salvo excepciones). Materias fecales (salvo excepciones). Orina obtenida por sonda o espontáneamente. Exudados vaginales y cervicales. Una recolección de muestra adecuada debe evitar siempre la más mínima contaminación con flora normal (donde en algunos casos la proporción de individuos anaerobios es de 1000 a 1 por aerobio). Los métodos de recolección más adecuados se pueden resumir de la siguiente manera:

EL POR QUE DE LA INUTILIDAD DE ALGUNAS MUESTRAS La expectoración no sirve porque el esputo se contamina con la flora anaerobia normal de la faringe y la boca en su pasaje al exterior; igualmente pasa con el esputo obtenido por fibroscopía o los aspirados nasotraqueales ya que el tubo arrastra en su introducción flora normal en su extremo distal. La orina emitida espontáneamente o con sonda se contamina por la colonización natural de la porción distal de la uretra y el meato o por la colonización de la sonda. Si existen catéteres suprapúbicos o renales pueden utilizarse para tomar la muestra con resultados aceptables. La endometritis presenta serias dificultades. En estos casos los anaerobios casi constantemente están involucrados en la etiología de estas infecciones y estos gérmenes como siempre sucede son los mismos de la flora normal (vaginal o cervical). Como la mayoría de las endometritis suceden al nacimiento o a los abortos se encuentran en el endometrio cantidades significativas de anaerobios.

PULMON

Punción Transtraqueal (PTT) percutánea. Punción Pulmonar Transparietal (PPTP). Lavado Bronquial con Cepillo Protegido.

PLEURA

Toracocentesis.

TRACTO URINARIO

Punción Suprapúbica (PSP) percutánea.

ABCESOS

Aspiración con aguja y jeringa en abs. cerrados. Igual en abiertos; evitar hisopados de material al aire, puncionar lateralmente.

GENITAL FEMENINO

Obtención por culdocentesis previa desifección vaginal con yodoforos. Cepillo protegido de uso bronquial.

TRANSPORTE DE MUESTRAS Otro factor crucial para el éxito en el aislamiento de anaerobios es el transporte de muestras. Se debe proteger a los microorganismos de los efectos del O2 durante el tiempo que transcurre entre la extracción y la siembra anaeróbica. El primer y más efectivo sistema es "correr" ya que en ninguna otra ocasión como esta el envío inmediato al Laboratorio es tan fundamental. Las muestras deben ser colocadas en un sistema de transporte que asegure la anaerobiosis. Existen tubos, comercialmente disponibles en los que se ha sustituido de aire por otro gas ("Tubos gaseados") y que contienen un indicador de anaerobiosis. En casos de extracción de material con aguja y jeringa, si la demora no supera los 30 minutos puede enviarse el material en la misma jeringa expulsando el aire residual y obturando la aguja con un tapón de goma. Existen para períodos prolongados tubos con medios de transporte adecuados o bolsas plásticas con sistemas de anaerobiosis química. Los líquidos purulentos espesos (Abscesos, Empiemas) se comportan como medios de transporte 'per se' por su propia constitución y hemos podido recuperar anaerobios hasta 24-48 después de realizada la extracción.

TRACTO SINUSAL

Aspiración con jeringas y catéter plástico previa desinfección, curetajes, biopsias.

METODOS DE CULTIVO Los cultivos incluyen el uso de Jarras anaeróbicas, bolsas plásticas, el método PRAS de Hungate y la

LUGAR

Procedimiento

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Cámara de anaerobiosis o "cámara de guantes". Los dos últimos métodos son muy caros, requieren equipamiento complejo, son lentos y se usan para estudios de Flora Normal y en laboratorios altamente especializados. Desde el punto de vista práctico las Jarras pequeñas y los sobres o bolsas son equiparables en rendimiento a los más sofisticados y son aceptables para los estudios de anaerobios de interés médico. Con estos sistemas son posibles los cultivos en medios sólidos para la obtención de aislamientos que permitan la identificación bacteriana. El uso de medios líquidos en forma exclusiva no es recomendable (salvo para hemocultivos) ya que la mayoría de las infecciones por anaerobios son polimicrobianas incluyendo facultativos o microaerófilos. Medios líquidos (sólo para hemocultivos) Existen varios medios comercialmente disponibles. Algunos contienen (SPS) sodium polyanetol sulfonate el cual estimula el desarrollo de los anaerobios, aunque al parecer sería inhibidor para Peptococcus anaerobius. Se trata de frascos de 100 ml, al vacío, con el agregado de CO2, una base nutritiva (digerido tríptico de soja o peptonas) y un agente reductor (thiol o thioglicolato). El por-centjae de sangre a inocular es del 5 al 10 % v/v. Los frascos se examinan diariamente buscando turbidez, hemólisis o gas; se consideran negativos definitivamente a los 10 días de incubación previos subcultivo final. Jarras de Anaerobiosis Existen varias marcas comerciales de jarras con performance aceptable para generar atmósfera de anaerobiosis. El fundamento del sistema más utilizado (Gas Pak)- se basa en: 1. La generación de H2 y CO2 por medio de una reacción química cuyos sustratos se encuentran separados en un sobre al cual se le agrega agua, desencadenando la reacción. 2. La combinación del H2 y el O del aire para formar agua generan la anaerobiosis, esta reacción se cataliza utilizando granallas de Zinc recubiertas de Paladio las cuales se encuentran depositadas en una canastilla dentro de la jarra. Una tirilla de papel impregnada en Azul de metileno (azul en presencia de O2, incoloro en ausencia) introducida en la Jarra es el indicador de Anaerobiosis. Sobres de Anaerobiosis El sistema BioBag consiste en una bolsa plástica transparente, gas impermeable, una ampolla de indicador de anaerobiosis (resarzurina) y una ampolla generadora de anaerobiosis. Una o 2 placas de Petri pueden introducirse antes de sellar la bolsa mediante un sellador plástico por calor. Luego se rompen las ampollas de indicador y generador. Los gérmenes crecen y se mantienen viables por lo menos una semana. Este sistema tiene las ventajas de su economía y practicidad,

además de poder observar directamente si existe crecimiento sin abrir el Sistema; también se puede utilizar para los sistemas de identificación tipo API-20A. SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS La antibioticoterapia de las infecciones por anaerobios es habitualmente empírica ya que los cultivos y el aislamiento son lentos y dificultosos. Por otra parte, las pruebas de sensibilidad realizadas en los laboratorios Clínicos no dan resultados confiables. De manera pues, que nos debemos guiar por las pruebas realizadas en los laboratorios de Referencia Internacionales que aportan datos sobre sensibilidad que permiten predecir con un nivel razonable de seguridad cuales son los Antibióticos de elección para cada germen. Las pruebas de sensibilidad se realizan de forma similar a las de gérmenes aerobios. Existe una prueba de dilución en Caldo que permite establecer CMI y CMB; el Test de Dilución en Agar (muy útil para realizar estudios de varias Cepas) en donde el Antibiótico se incorpora al Agar en diluciones sucesivas en placas de Petri. IDENTIFICACION DE LOS ANAEROBIOS Los anaerobios se presentan corrientemente en cultivos mixtos con otras especies sea anaerobias, micoraerófilas o facultativas. El primer paso es pues, la observación de las colonias y su correspondiente Gram para establecer distintas especies las cuales serán subcultivadas para establecer aerotolerancia "aire, CO2 y anaerobiosis". Información complementaria puede obtenerse observando las placas de Petri bajo luz UV para determinar la fluorescencia de las colonias. En las placas de Subcultivos (con medios ricos, selectivos y/o diferenciales) según la sospecha de Género pueden agregarse Discos de Vancomicina 5 µg, Kanamicina 1000 µg, Coilistin 10 µg , SPS y NO3, los cuales aportan datos para la identificación preliminar. En el diagrama siguiente se esquematizan los pasos a seguir:

Registrar: ! ! ! ! !

! !

Cultivo en placa Realizar:

Morfología de colonias ! ! Pigmento ! Hemólisis Fluorescencia ! Susceptibilidad a: Vancomicina Kanamicina Colistin SPS Actividad lipasa Actividad lecitinasa

Gram Indol Catalasa Test de NO3

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La mayoría de los Laboratorios deben conformarse con la realización de los Tests de Identificación preliminares. La identificación final queda reservada para los laboratorios de Referencia y comprende: Estudios de fermentación de azúcares y estudio de los productos finales del metabolismo los cuales pueden agruparse en: Ácidos grasos volátiles y alcoholes. Metabolitos no volátiles. Ácido fórmico. Producción de Hidrógeno. Estos estudios se realizan utilizando la Cromatografía Gas-líquida. ANAEROBIOS NO ESPORULADOS DE INTERES MEDICO Bacilos Gram negativos Bacteroides fragilis vulgatus ovatus thetaiotamicron distasonis ureolyticus gracilis Bacteroides Estas especies del género (fundamentalmente fragilis, de alta proporción en flora intestinal) se asocian con infecciones anaerobias subdiafragmáticas y genitales (por su vecindad con la porción final del aparato digestivo y región perineal), y con las sepsis al punto de partida de estas infecciones. Todos los miembros del género son resistentes a Penicilinas (por Betalactamasas) y Cefalosporinas -con alguna excepción-. La morfología es de coco-bacilos pleomórficos, pequeños, Gram negativos. En los cultivos se presentan como colonias pequeñas, bajas, brillantes. El desarrollo se estimula por la adición de Bilis a los medios, lo cual permite el aislamiento selectivo para estos gérmenes. Poseen antígenos proteicos y lipopolisacarídicos pero lo característico es la Cápsula. Su poder patógeno radica en la actividad endotoxina símil de sus Ag. de membrana y del polisacárido capsular. Existen descripciones de cepas productoras de enterotoxinas capaces de dar enfermedades diarreicas en el hombre y animales. Prevotella melaninogénica buccae oris bivia corporis dentícola intermedia Estos bacilos de similares características a los

Bacteroides se ha reclasificado, ya que anteriormente se agrupaban como Bacteroides y subespecies de los mismos. Las cepas con producción de pigmento negro a marrón en los medios de cultivo son fácilmente identificables y son miembros de flora normal de boca y vías respiratorias superiores y partes blandas subyacentes. Algunas cepas (menos del 20 %) son productoras de penicilinasas, pero en general son sensibles a este antibiótico. La Prevotella bivia prevalece en flora vaginal y produce vaginosis e infecciones de origen obstétrico. Porphiromonas asacarolítica gingivalis endodontalis Flora normal de boca y encías (gingivalis y endodontalis) y flora intestinal (asacarolítica) producen infecciones relacionadas con su habitat. Su morfología varía desde los cocobacilos hasta formas alargadas. Las colonias son convexas, lisas y pigmentan con el tiempo, algunas veces se observa beta hemólisis. La vitamina K estimula el desarrollo de estos gérmenes. Fusobacterium mortiferum nucleatum necrophorum Miembros de flora normal de bucofaringe (nucleatum) y flora intestinal su morfología es característica; bacilos largos con extremos acintados o filamentos delgados. Algunos (necrophorum) pueden ser más abultados en su sector medio. Producen alfa y beta hemólisis en los cultivos y las colonias son translúcidas de forma varias a veces irregulares. Fusobacterium nucleatum es el más común en infecciones del aparato respiratorio, mientras que necrophorum se lo aísla de infecciones subdiafragmáticas. Son habitualmente sensibles a las Penicilinas y su poder patógeno se establece por la presencia de lipasa y leucotoxinas. Bacilos Gram positivos Actinomyces israelii naeslundii bovis odontolyticus viscosus Se trata de bacilos Gram positivos largos y ramificados, delgados y delicados, bajo ciertas circunstancias, frotis o cultivos pueden fragmentarse simulando bacilos del tipo difteroides. De variada aerotolerancia, israelii (el patógeno de interés médico más importante) y bovis son los menos

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tolerantes al Oxígeno; aunque las cinco especies crecen mejor en presencia de CO2, las otras especies deben considerarse facultativos. Miembro de flora normal bucal (Actimomyces israelii) se relaciona con una entidad Clínica conocida como Actinomicosis la cual tiene varias manifestaciones clínicas que veremos más adelante. El poder patógeno no está determinado con claridad; las infecciones se ven favorecidas por un traumatismo o por alguna otra disminución de las barreras defensivas locales. ACTINOMICOSIS CERVICOFACIAL Constituye aproximadamente el 50% de los casos de actinomicosis. Secundario a caries o enfermedades odonto-periodontales el germen atraviesa (por traumatismo) la mucosa bucal intacta conduciendo en su forma típica a un proceso inflamatorio de región maxilar inferior con compromiso óseo (osteomielitis maxilar). Si la enfermedad progresa se abre una fístula al exterior evacuándose el pus al exterior. El diagnóstico etiológico se realiza evidenciando la presencia de "gránulos de azufre", material granulomatoso con colonias de microorganismos y filamentos ramificados al Gram. ACTINOMICOSIS TORACICA Por aspiración del agente o por extensión de lesiones cérvicofaciales puede producirse enfermedad pulmonar de tipo subagudo, febril, con tos y expectoración purulenta. La progresión de la enfermedad conduce a cavitación pulmonar, con fistulización al exterior a través de la pared torácica pudiendo interesar costillas y vértebras. ACTINOMICOSIS ABDOMINAL Como consecuencia de una perforación intestinal, la enfermedad se desarrolla lentamente generando signos y síntomas según el órgano abdominal afectado. Es posible la extensión vertebral y la fistulización al exterior. ACTIMOMICOSIS GENITAL Se ha descrito infección en mujeres que utilizan dispositivos intrauterinos con sintomatología escasa y sin presencia de gránulos. Principales características bioquímicas de Actinomyces israelii. Req. de Oxígeno: Anaerobio Eubacterium lentun nodatum timidum brachy De lento desarrollo en cultivos y aerotolerancia muy amplia, estos pequeños bacilos tienen su hábitat en boca

y vías respiratorias superiores, E. lentum forma parte de la flora intestinal. Las infecciones están relacionadas con la vecindad de su hábitat produciendo infecciones odontológicas, de cabeza y cuello, y aparato genital femenino. Propionobacterium acnes granulosum Integrantes de flora normal de piel, fundamentalmente, de escaso poder patógeno se los aísla como contaminantes de hemocultivos y procesos de piel. P. acnes deben su nombre al relacionarlo con el Acné. Bacilos, a veces ramificados, pueden confundirse con Actinomyces, a veces pleomórficos y cortos se los confunde con Difteroides. Lactobacillus Múltiples especies asociadas con la flora normal de boca y en gran cantidad en flora vaginal, poseen un poder patógeno mínimo; se trata de bacilos largos, Gram positivos netos, de bordes paralelos y extremos rectangulares. Mobiluncus mulieris curtisii Estas especies de bacilos Gram positivos inestables, eran conocidos como Bacilos Anaerobios curvos que se aíslan de vaginitis inespecífica; de lento crecimiento son difíciles de cultivar y su participación en infecciones se puede sospechar por una buena microscopía. Bifidobacterium Miembros de flora normal de boca y tractogastrointestinal, hay varias especies; de escaso poder patógeno deben su nombre a la morfología del Gram que les de su nombre. Cocos Gram positivos Peptoestreptococos anaerobius magnus asaccharoliticus tetradius prevotti A pesar del nombre del Género la morfología de estos gérmenes incluye formas en pares, tétradas, racimos, y cadenas. Un estudio microscópico cuidadoso muestra a estos cocos con tamaño irregular y alguna decoloración parcial, lo que permite diferenciarlos de sus similares aerobios. Forman parte de la flora de la boca, intestino y genitales. Se encuentran involucrados en infecciones pleuropulmonares, abscesos, infecciones ginecológicas, sinusitis. Casi constantemente son

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sensibles a los betalactámicos. Cocos Gram Negativos Veillonella parvula Pequeños cocos Gram negativos en diplos o cadenas cortas y racimos, miembros de flora bucal intestinal y genital, se aísla de materiales Clínicos, pero es dudoso y desconocido su poder patógeno. BACILOS GRAM POSTIVOS ESPORULADOS Los Clostridium son bacilos Gram positivos, esporulados, anaerobios estrictos, salvo alguna especie con mayor aerotolerancia. Los patógenos son productores de poderosas exotoxinas las cuales por sí mismas provocan todos los síntomas y signos de las infecciones. Dentro del Género podemos separar 4 grandes grupos. 1. Clostridios histotóxicos (especies más comunes) Clostridium perfringens septicum histoliticum novyi sordelli fallax bifermentans Dentro de este grupo la especie más importante es perfringens, (80 a 90%) por lo que nos referiremos fundamentalmente a esta especie. Este grupo de gérmenes causa infecciones muy severas caracterizada por una mionecrosis, infección clásicamente conocida como gangrena gaseosa; (debemos tener en cuenta que la presencia de gas en infecciones de partes blandas no siempre significa mionecrosis. Todos estos clostridios producen exotoxinas de diferente potencia que veremos más adelante. El clostridio más frecuente (C. perfringens) posee cinco tipos diferentes, del A al E, los cuales producen 4 tipos de toxinas letales clasificadas como: alfa, beta, epsilón y theta. El tipo más común de interés médico es el tipo A que produce la alfatoxina y algunas otras toxina de menor poder (omega, kappa, micrón). C. perfringens tipo A se halla como flora normal del hombre y los animales aunque en estos no es frecuente causa de enfermedad. Lo contrario sucede con los otros tipos de clostridios. Morfología y tinción Bacilo netamente Gram positivo corto y grueso de bordes redondeados, con formas hasta cocoides. De los frotis directos de muestras clínicas destacamos que no se observan esporos y que la células que componen un frotis de material clínico se encuentran ausentes (debido a la intensa citólisis tóxica). Cuando en cultivos vemos

formas esporulando, los esporos medianos o subterminales no deforman el soma vegetativo. Fisiología y cultivo Anaerobio aerotolerante, de fácil recuperación, de crecimiento rápido en Agar sangre, es el único inmóvil de los clostridios patógenos, no esporula en medios comunes, desarrolla en pH variable y temperaturas de 20 a 50 grados. En 24 horas de incubación produce colonias de 2 a 4 mm con formas lisas a rugosas. Se puede ver una hemólisis doble, una estrecha betahemólisis producida por la alfa toxina y una zona más amplia de hemólisis incompleta producida por la toxina omega. Desarrolla abundantemente en medios con glucosa y carne picada o medios con leche, produciendo abundante gas e intensa fermentación (ferment. lactosa >acidificación ->coagulación de la caseína ->rotura del coágulo por la producción de gas). La producción de alfa-toxina se puede realizar colocando suero humano en presencia de un sobrenadante de cultivo el cual produce una opalescencia clara del mismo (Reacción de Nagler), o alternativamente sembrando Agar con yema de huevo el cual se torna opalescente. La adición de la antitoxina específica se usa como contraprueba, sea en placas o en la prueba del suero. La siembra directa de materiales en Agar yema de huevo (media placa con antoxina) permite determinar en pocas horas la presencia de C. perfringens en muestras clínicas. La opalescencia del suero y la yema de huevo se deben a que la alfa-toxina es químicamente una lecitinasa. Estructura antigénica - Toxinas C. perfringens del tipo A produce por lo menos 12 sustancias de naturaleza proteica de poder antigénico, 4 de ellas toxinas, de las cuales la alfa es la más poderosa. Esta toxina se define como dermonecrótica-letal y hemolítica. Químicamente es una lecitinasa C - o fosfolipasa C- que degrada la lecitina. La activación de la toxina es dependiente de los iones Ca++ y Mg++. De alto poder antigénico, los Ac. antitoxina son los únicos que pueden neutralizar el efecto de la misma. La alfatoxina actúa sobre lipoproteínas que contienen lecitina en la membrana celular y en las mitocondrias. La acción necrótica tisular es evidente, no así las acciones a nivel sistémico. Otras sustancias antigénicas de menor poder tóxico son importantes auxiliares en la diseminación de la enfermedad. Clostridium septicum Flora normal intestinal de hombre y animales, móvil perítrico, es productor de alfa-toxina y se encuentra asociado en el 10% de los casos de mionecrosis o sepsis de origen endógeno. Clostridium histoliticum Flora normal del hombre y los animales, aerotolerante productor de alfa-toxina y beta-toxina. Esta última es una proteína con actividad enzimática (colagenasa) que destruye las fibras del colágeno.

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Clostridium novyi Existen tres tipos A B y C. Se trata de bacilos grandes, móviles perítricos con esporas subterminales. 2. Clostridios enterotoxigénicos C.perfringens tipo A. --> Intoxicación alimentaria Este germen productor de una enterotoxina (detallada en otro Capítulo) produce una intoxicación alimentaria de tipo leve. Los síntomas de la enfermedad dependen de la acción de la enterotoxina sobre la mucosa intestinal, la misma es producida cuando alimentos contaminados con esporos son calentados para su cocción y la germinación y posterior multiplicación acumula toxinas. C. prefringens tipo C. --> Enteritis necrotizante Se trata de una enfermedad mucho más severa que la anterior, pudiendo ser letal. Los síntomas de la enfermedad son ocasionados por la beta-toxina producida por estos gérmenes. C. difficile --> Enterocolitis seudomembranosa Se trata de una especie anaerobia estricta, miembro de flora normal intestinal humana, y se han descrito seis serogrupos en relación con su toxicidad. C. difficile produce 2 toxinas: una toxina B citotóxica y una toxina A, enterotoxina potente; ambas son las determinantes de la enfermedad. En ciertas circunstancias el origen de la enfermedad es endógeno y su causa es, por una intensa antibióticoterapia, en especial con Clindamicina. Al parecer los ATB al eliminar la flora normal permitirían un hiperdesarrollo de C. difficile. 3. Clostridium tetani TETANOS C. tetani es el agente productor del Tétanos, descubierto en 1889 por Kitasato. Morfología Bacilo Gram positivo, delgado, de 3 a 8 µm de longitud, móvil perítrico, posee tendencia al Gram negativo en cultivos viejos y materiales clínicos, con esporos terminales que deforman el soma bacteriano dándole una forma característica de raqueta o palillo de tambor. Cultivos Anaerobio obligado, algo exigente, temperatura óptima de crecimiento a 37ºC, pH óptimo 7.4. Las exigencias nutritivas son cubiertas por el agregado de sangre o carne cocida, produce una betahemólisis débil, no fermenta hidratos de carbono. Los esporos resisten 20 minutos a la ebullición y una esterilización segura requiere auto-clave (121ºC, 15 min.) Antígenos Posee antígenos H flagelares (10 tipos), O somáticos y en los esporos. Poder patógeno Todos los síntomas de la enfermedad son atribuibles

a la producción de una poderosa toxina: tétanoespasmina. La toxina, intracelular y liberada por autólisis, es una proteína TERMOLABIL que se inactiva por calentamiento -60ºC durante 20 minutos- o por formaldehído, esta propiedad es de extraordinaria importancia ya que si bien la toxina pierde su poder patógeno, no pierde su poder antigénico transformándose en toxoide, el cual confiere una excelente inmunidad a los sujetos inoculados. Químicamente es una cadena polipeptídica de pm 150 kdalton, que posee tres subunidades A, B y C. Al momento de su liberación existe un clivaje, al parecer por las proteasas bacterianas, quedando dos subunidades A y BC unidas por un puente disulfuro. La toxina tetánica es una de las toxinas más poderosas que existen, en especial para el hombre y los animales. Mecanismo de acción de la toxina tetánica Con exclusivo sitio de acción a nivel de Sistema Nervioso (regiones A y BC con afinidad para receptores gangliósidos) es capaz de actuar a distancia por el siguiente mecanismo. Una vez fijada al receptor celular la toxina ingresa a la célula por endocitosis y se mueve por vía retrógrada a través de los axones. Entonces la toxina interfiere la transmisión sináptica inhibiendo la liberación de neurotrasmisores inhibitorios tales como la Glicina, de las neuronas inhibitorias. Los efectos estímulo-inhibición de las neuronas motoras son desbalanceados causando una rigidez muscular. Esta se manifiesta en los músculos más fuertes: maseteros (trismus) flexores de extremidades superiores y extensores de extremidades inferiores y tronco (opsitótonos). La contaminación Los esporos de C. tetani se hallan ampliamente distribuidos en el suelo y medio ambiente, las formas vegetativas son flora normal de hombre y animales, especialmente equinos. Una herida contaminada con esporos de C. tetani es la puerta de entrada del germen. Estas heridas deben poseer un contexto especial de necrosis o de sustancias necrotizantes (bajos Eh.); en general se trata de heridas punzantes, cuerpos extraños como astillas, espinas, etc. Existe una forma muy temida de tétanos que es el tétanos neonatal, provocado por el corte del cordón umbilical con instrumentos contamindos. La Clínica Luego de un período de incubación variable 4 a 10 días se desarrolla la enfermedad que puede ser localizada, con espasmos musculares de músculos adyacentes a la herida o, con mayor frecuencia, generalizada. Los síntomas son todos aquellos provocados por la contracción espástica muscular con afectación de los músculos respiratorios, alteraciones cardiovasculares y muerte.

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El Diagnóstico El diagnóstico es Clínico ya que es muy difícil el aislamiento bacteriológico; apenas unos pocos gérmenes que produzcan ínfimas cantidades de toxina son suficientes para desencadenar el proceso. La inmunidad y la prevención La enfermedad no confiere inmunidad ya que la cantidad de toxina que desencadena los síntomas no es lo suficientemente grande como para activar el Sistema Inmunitario. La prevención se logra con la inmunización activa de toda la población a partir de los 3 meses de edad utilizando el Toxoide tetánico. Confiere una protección del 100% en inmunocompetentes y es inadmisible no estar correctamente inmunizado. La inmunización pasiva con gamma globulinas hiperinmunes de donantes se utiliza como coadyuvante en la enfermedad y como protección pasiva en sujetos no vacunados con heridas tetanígenas. 4. Clostridium Botulinum BOTULISMO La enfermedad del botulismo data desde 1870 para describir una intoxicación alimentaria mortal por ingestión de salchichas (latín, botulus = salchicha). En realidad múltiples alimentos conservados pueden provocar la intoxicación. En la época actual el empleo de autoclaves y métodos modernos de esterilización hacen que los productos comerciales enlatados hayan perdido el protagonismo quedando el riesgo reducido a la manufactura casera de enlatado de carnes, pescados y vegetales. Aun así la cocción de los enlatados destruye la toxina botulínica por lo cual sólo existe riesgo en aquellos alimentos a consumirse directo de la lata sin previa cocción. Morfología El C. botulinum es un bacilo Gram postivo recto, con extremos redondeados, móvil perítrico, produce esporos resitentes al calor, subterminales que deforman algo el soma bacteriano. Cultivos Anaerobio estricto, desarrolla en medios con sangre, produciendo colonias betahemolíticas, bastante exigente en cuanto a requerimientos nutritivos, fermentan la glucosa. Los esporos son muy resistentes al calor, a las radiaciones y a los agentes químicos. Estructura antigénica De composición compleja y bastante indefinida no existen antígenos en las células vegetativas que resulten de importancia. Según el tipo de exotoxina producida se han descrito 8 tipos serológicos A al G. Tienen importancia epidemiológica ya que, excepto los tipos C y D, el resto produce un solo tipo de toxina. El poder patógeno

La patogencidad está dada exclusivamente por la exotoxina que habitualmente es producida fuera del organismo, al punto que más que una infección se debería considerar como intoxicación o envenenamiento. La toxina botulínica y su mecanismo de acción La toxina se genera incubando los gérmenes entre 25 a 38ºC a un pH de aproximadamente 7. Si bien es considerada una exotoxina, se libera cuando se produce la lisis de la bacteria. Su dosis letal es tan poderosa que un µg (milésima de mg) contiene 200.000 dosis letales para un ratón de 20 gr y se acepta que apenas unos gramos serían capaces de eliminar toda la humanidad. De naturaleza proteica, al igual que la tetánica, se trata de una cadena polipeptídca de 150kda con tres regiones A, B, y C de baja toxicidad, que cuando son clivadas se forman dos cadenas, una pesada y una liviana unidas por puentes disulfuro y con marcada actividad tóxica. Existen 8 tipos de toxina antigénicamente distintos, genéticamente dirigidos por bacteriófagos. La toxina botulínica es ingerida y sortea la barrera digestiva aparentemente protegida por otras proteínas con las cuales forma complejos, más aun, de hecho las proteasas digestivas activan la toxina. A diferencia de la toxina tetánica, la toxina botulínica afecta las terminaciones nerviosas periféricas. Una vez que atravesó la barrera intestinal, llega vía hematógena a las uniones neuromusculares, provocando un bloqueo presináptico de la liberación de acetilcolina. La interrupción de la estimulación nerviosa provoca una parálisis fláccida irreversible conduciendo a la muerte por parálisis de los músculos respiratorios. Tipos de intoxicación botulínica Existen 4 formas de botulismo. a. Botulismo alimentario. Forma clásica letal por ingestión de la toxina producida en alimentos conservados mal esterilizados. b. Botulismo infantil. Se trata de la ingestión de esporos por los lactantes (clásico chupete con miel) con multiplicación de los Clostridios en el intestino con producción de toxina en la luz intestinal y posterior absorción. c. Botulismo de las heridas. Forma muy rara a partir de heridas infectadas. d. Botulismo no determinado. En mayores de un año que padecen la enfermedad sin hallarse ningún vehículo aparente. La Clínica Con un período de incubación corto (12 a 24 hs), dependiendo de la cantidad de toxina ingerida, se producen los signos toxo-dependientes: debilidad, lasitud, visión borrosa y doble, disfagia y disfonía. Con el progreso de la enfermedad otros grupos musculares son afectados entre ellos los respiratorios. El diagnóstico Es fundamentalmente Clínico, pudiendo confirmarse

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la intoxicación con el estudio de los alimentos o restos de alimentos ingeridos para buscar toxina botulínica. La prevención La prevención de esta enfermedad pasa por evitar la fabricación y consumo de alimentos "en forma Casera" si no existe seguridad de la perfecta esterilización. En cuanto a alimentos de origen comercial las severas normas bromatológicas hacen casi imposible la contaminación; si no existe esa certeza deberá siempre calentar los alimentos a la ebullición durante unos minutos. Respecto al botulismo del lactante se evitarán los alimentos posiblemente contaminados.

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