C8 Ung Dung Sk

5. øng dông s¾c kÝ

5. øng dông

(1) ĐÞnh tÝnh

(2) Thö t¹p chÊt

(3) ĐÞnh l­îng

5.1. §Þnh tÝnh

- SK khai triÓn:

Morfin chuÈn Papaverin chuÈn MÉu thö

So s¸nh vÞ trÝ trªn pha tÜnh cña chÊt thö vµ chÊt chuÈn trong cïng ®k s¾c kÝ.

5.1. §Þnh tÝnh

- S¾c KÝ röa gi¶i: So

s¸nh

gian

MÉu chuÈn

thêi

l­u cña

chÊt thö víi chÊt chuÈn trong cïng §k s¾c kÝ.

MÉu thö

5.1. §Þnh tÝnh - So s¸nh phæ UV-VIS cña chÊt thö víi chÊt chuÈn (Detector DAD).

- KÕt hîp s¾c ký - phæ IR hoÆc s¾c ký -

5.2. Thö tinh khiÕt chÊt ®èi chiÕu t¹p chÊt pha trong dung m«i cã nång ®é ë møc giíi h¹n cho phÐp trong mÉu

• Dïng

thö. • Ch¹y s¾c ký trong cïng ®iÒu kiÖn s¾c kÝ.

5.2. Thö tinh khiÕt Trªn SK ®å mÉu thö: S pic cña t¹p chÊt nhá h¬n S pic cña chÊt chuÈn t¹p chÊt. • Nång ®é t¹p chÊt trong mÉu thö < giíi h¹n cho phÐp.

MÉu thö

ChÊt chuÈn t¹p

5.3. ĐÞnh l­îng

Ph­¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i

Ph­¬ng ph¸p thªm chuÈn

Ph­ ¬ng ph¸p chuÈn néi

Ph­ ¬ng ph¸p chuÈn ho¸ diÖn tÝch.

5.3. §Þnh l­îng ChiÒu cao pic ChiÒu cao pic vµ diÖn tÝch pic tØ lÖ thuËn víi n«ng ®é cña chÊt ph©n tÝch.

DiÖn tÝch pic S=h. w S=h.w1/ 2

5.3.1. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i a. ChuÈn ho¸ 1 ®iÓm? - Chän nång ®é cña mÉu thö xÊp xØ nång ®é cña mÉu chuÈn. MÉu thö - Ch¹y SK trong cïng ®iÒu kiÖn. - TÝnh nång ®é chÊt thö: SX

SX CX =CS SS

víi

MÉu chuÈn

SC

5.3.1. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i b. ChuÈn ho¸ nhiÒu ®iÓm? - ChuÈn bÞ mét d·y chuÈn víi c¸c nång ®é t¨ng dÇn (th­êng 5-7 ®iÓm). TiÕn hµnh ch¹y s¾c kÝ.

S1

S2

S3

S4

S5

5.3.1. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i S

Y=aX+b

SX

0

1

2

3

4

CX

5

6

C

B¶ng Sè liÖu N§ C1 A mox S 1 3,9 A mox

C2

C3

C4

C5

C6

C7

Cx

29,0 77,4 135, 258, 433, 563, Sx 2 2 2 5

§å thÞ 600,000

y =35041x - 4542.2

500,000

2

R =0.9972

400,000 300,000 200,000 100,000 0 0

5

10

15

20

5.3.1. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i - ChÊt chuÈn ngo¹i lµ chÊt: + Cã b¶n chÊt lµ chÊt cÇn ph©n tÝch. + §¹t yªu cÇu chÊt chuÈn lµ tinh khiÕt. - Nh­îc ®iÓm khi ph©n tÝch: + C¸c mÉu ph¶i xö lý phøc t¹p (chiÕt t¸ch...) + C¸c mÉu cã hµm l­îng thÊp.

5.3.2. Ph­¬ng ph¸p thªm chuÈn (Standard addition) a. Kü thuËt thªm 1 ®iÓm: - ChuÈn bÞ mÉu thö. - Thªm vµo mÉu thö mét l­îng ®· biÕt cña chÊt chuÈn. - TiÕn hµnh xö lý mÉu vµ s¾c ký trong cïng ®iÒu kiÖn.

ΔC - Nång ®é ch­a biÕt CX =SX CX cña mÉu thö ®­îc ΔS tÝnh theo c«ng thøc:

5.3.2. Ph­¬ng ph¸p thªm chuÈn (Standard addition) b. Kü thuËt thªm ®­êng chuÈn: - ChuÈn bÞ mét d·y hçn hîp gåm c¸c l­ îng mÉu thö gièng nhau vµ c¸c chÊt chuÈn ngo¹i víi l­îng t¨ng dÇn. - Xö lý mÉu råi tiÕn hµnh s¾c ký. - Dùng ®­êng chuÈn t­¬ng quan gi÷a diÖn tÝch (chiÒu cao) pic tæng (thö+ chuÈn) víi l­îng hoÆc nång ®é cña chÊt chuÈn thªm (∆C). - Giao ®iÓm cña ®­êng chuÈn kÐo dµi

5.3.3. Ph­¬ng ph¸p chuÈn néi - Thªm vµo mÉu chuÈn vµ mÉu thö mét l­ îng nh­ nhau cña mét chÊt tinh khiÕt thø hai (chuÈn néi).

• ChÊt chuÈn néi? - Cã cÊu tróc ho¸ häc t­¬ng tù nh­ chÊt thö . - Cã nång ®é xÊp xØ víi nång ®é cña chÊt thö . - Kh«ng ph¶n øng víi bÊt kú thµnh phÇn

5.3.3. Ph­¬ng ph¸p chuÈn néi a. Ph­¬ng ph¸p chuÈn 1 ®iÓm: - ChuÈn néi ®­îc thªm 1 l­îng nh­ nhau vµo c¶ mÉu chuÈn vµ mÉu thö.

SES SX RS = RX = SIS SIS

MÉu chuÈn ChuÈn ngo¹i

- Nång ®é cña chÊt thö : CX =CS

RX RS

ChuÈn néi

MÉu thö ChuÈn néi ChÊt thö

5.3.3. Ph­¬ng ph¸p chuÈn néi

* Ph­¬ng ph¸p chuÈn hãa nhiÒu ®iÓm: - ChuÈn bÞ mét d·y chuÈn cã chøa nång ®é chÊt chuÈn tõ C1-C5 nh­ng chøa cïng mét l­îng chuÈn néi.

R

R

R

R

R

1

2

3

4

5

5.3.3. Ph­¬ng ph¸p chuÈn néi * S¾c ký mÉu thö ®­îc thªm chuÈn néi víi l­îng nh­ thang chuÈn. R

RX RX

0

1

2

3

CX

4

5

6

C

5.3.3. Ph­¬ng ph¸p chuÈn néi

* Yªu cÇu víi chÊt chuÈn néi:

- Trong cïng ®iÒu kiÖn s¾c ký: + ChÊt chuÈn néi t¸ch hoµn toµn khái chÊt thö (Rs>1,25) + ChÊt chuÈn néi cã tR gÇn víi tR cña chÊt thö .

N§ Amox

IS

0,5 5

1 5

S. 13,9 29,0 Amo x S. IS 381, 349, 1 2 R 0,03 0,08 6 3

2

4

8

12

16

Cx

5

5

5

5

5

5

258, 2 410, 4 0,62 9

433, 2 397, 5 1,08 9

563, 5 366, 3 1,53 8

Sx

77,4 135, 2 391, 335, 9 6 0,19 0,40 7 2

39 3 Rx

18000 16000

y =1122x - 2567 2 R =1

14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 -2000 -4000

0

5

10

15

20

3. Thö t¹p chÊt - Tr­êng hîp cã chuÈn cña t¹p chÊt, pha ®ung dÞch chuÈn vµ thö. Ch¹y Sk thu ®­îc diÖn tÝch chÊt chuÈn vµ chÊt thö. - Tr­êng hîp kh«ng cã chuÈn cña t¹p sÏ sö dông ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸ diÖn tÝch.

5.3.4. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸ diÖn tÝch * Nguyªn t¾c: + Hµm l­îng phÇn tr¨m cña mét chÊt trong hçn hîp b»ng tû lÖ phÇn tr¨m diÖn tÝch pic cña nã so víi tæng diÖn tÝch cña tÊt c¶ c¸c pic thµnh phÇn trªn s¾c ®å .

SA SA %A= ×100% = n x100% S1 + S2 +...+ Sn ∑ Si i=1

5.3.4. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸ diÖn tÝch • Yªu cÇu tÊt c¶ c¸c thµnh phÇn: + §­îc röa gi¶i + §­îc ph¸t hiÖn vµ cã hÖ sè ®¸p øng trªn detector nh­ nhau.

5.3.4. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸ diÖn tÝch * øng dông: - Sö dông nhiÒu trong s¾c ký khÝ v× th­êng cã ®¸p øng nh­ nhau ë detector ion ho¸ ngän löa (FID). - Trong HPLC bÞ h¹n chÕ v×: + §¸p øng cña Detector víi c¸c chÊt PT kh«ng gièng nhau.

5.3.4. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸ diÖn tÝch

• HÖ sè ®¸p øng cña detector ®èi víi tõng thµnh phÇn trong mÉu ®­îc x¸c ®Þnh b»ng c¸ch: • Ch¹y s¾c ký mét dung dÞch chuÈn cã nång ®é ®· biÕt (CC) vµ ®o diÖn tÝch cña nã (SC):

fi =

CC SC

C x = f i .Sx

SA .f A %A= .100% S1f1 + S2 f 2 +...+ Sn f n