C15
This document was uploaded by user and they confirmed that they have the permission to share it. If you are author or own the copyright of this book, please report to us by using this DMCA report form. Report DMCA
Overview
Download & View C15 as PDF for free.
More details
- Words: 3,961
- Pages: 11
Chæång 15
MAÏY ÂIÃÛN DI Maïy âiãûn di duìng âãø phaït hiãûn vaì xaïc âënh ADN trong tãú baìo vi sinh váût, thæûc váût vaì âäüng váût. 15.1. AXIT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) VAÌ NGUYÃN TÀÕC XAÏC ÂËNH Gen laì âån vë di truyãön cå baín. Noï laì mäüt âoaûn ADN (âäi khi ARN) maî hoaï thäng tin cho viãûc täøng håüp saín pháøm sinh hoüc xaïc âënh (chuí yãúu laì protein). Nhæîng nghiãn cæïu hiãûn âaûi vãö cáúu truïc vaì chæïc nàng cuía nguyãn sinh cháút âaî måí ra nhæîng hiãøu biãút måïi vãö cáúu taûo vaì chæïc nàng hoaût âäüng cuía tãú baìo. Cáúu truïc ADN cho pheïp giaíi thêch taûi sao laûi coï khaí nàng taìng træî vaì di truyãön thäng tin tæì thãú hãû naìy sang thãú hãû khaïc mäüt caïch äøn âënh vaì bàòng caïch naìo noï thäng tin di tuyãön åí daûng thæï tæû sàõp xãúp caïc gäúc nucleotit laûi chuyãøn hoaï thaình phán tæí protein chæïc nàng. Näüi dung nãu trãn liãn quan âãún giaïo lyï trung tám cuía di truyãön phán tæí gäöm 3 âiãøm chênh: sao cheïp thäng tin di truyãön tæì ADN bäú meû sang ADN con caïi, chuyãøn âäøi maî di truyãön tæì ADN sang ARN - quaï trçnh phiãn maî (transcription) vaì dëch maî di truyãön (translation) - thäng tin di truyãön tæì mARN âæåüc chuyãøn sang trçnh tæû sàõp xãúp âàûc hiãûu cuía axit amin trong phán tæí protein. Cäng nghãû ADN taïi täø håüp - hiãûn laì nãön taíng cho sæû phaït triãøn nhæ vuî baîo cuía ngaình cäng nghãû sinh hoüc hiãûn âaûi. Caïc phæång phaïp phán têch vaì täøng håüp hiãûn âaûi laì taïch DNA, xaïc âënh thæï tæû, täøng håüp, gàõn xen noï vaìo vë trê nháút âënh bãn trong såüi ADN khaïc âãø nhán lãn, vaì räöi laûi taïch ra. Hiãûn nay hoaìn toaìn coï thãø nháûn biãút chênh xaïc nhæîng âoaûn ADN âàûc hiãûu qua cháøn âoaïn caïc bãûnh âàûc biãût. Âäúi våïi caïc bãûnh khi caïc gel chæa âæåüc xaïc âënh thç viãûc cháøn âoaïn keïm chênh xaïc. Mäüt bäü doì tçm âån giaín chè laì mäüt khuïc ADN (hoàûc ARN) coï thãø tçm khuïc bäø sung våïi noï bàòng caïch lai (hybridization). Coï thãø phaït hiãûn sæû bàõt càûp naìy bàòng nhiãöu caïch, nhæng phäø biãún nháút laì sæí duûng phæång phaïp tæû chuûp phoïng xaû våïi bäü doì tçm coï 32p (hçnh 15.1).
321
Viãûc lai bäü doì tçm ADN våïi âoaûn ADN taïch råìi goüi laì Southern Blotting âæåüc mä taí trãn hçnh 15.1. Caïc âoaûn ADN hçnh thaình sau khi ADN bë endonucleaza restrictaza càõt seî âæåüc taïch råìi ra bàòng phæång phaïp âiãûn di trãn gel agaroza. Khoaíng caïch di chuyãøn phuû thuäüc vaìo kêch thæåïc âoaûn. Caìng nhoí chaûy caìng nhanh. Sau khi âaî taïch råìi, ngæåìi ta duìng kiãöm âãø laìm biãún tênh caïc âoaûn âoï vaì chuyãøn chuïng lãn maìng nylon. Táúm maìng naìy âæåüc uí våïi dung dëch coï cháút doì tçm cháút phoïng xaû, noï chè lai våïi caïc âoaûn ADN naìo chæïa thæï tæû bäø sung. Viãûc xaïc âënh thæï tæû ARN (vê duû mARN) cuîng coï thãø theo trçnh tæû taïch bàòng âiãûn di ARN trãn gel, chuyãøn lãn maìng nylon vaì cho lai våïi ADN probe âàûc hiãûu. Phæång phaïp naìy goüi laì Northern Blotting. Nhæîng âoaûn ADN sau khi càõt bàòng endonucleasa Taïch âiãûn di trãn gel agarosa Caïc âoaûn ADN taïch ra theo kêch thæåïc Biãún tênh bàòng kiãöm âãø taïch såüi trung hoaì
Âënh vë ADN bàòng tia UV Phuí bàòng maìng nylon
UÍ vãût coï ADN nhán doìng såüi âån vaì coï gàõn phoïng xaû
Ræía vaì sæû chuûp phoïng xaûû
Vë trê âoaûn ADN chæïa thæ tæû tæång âäöng probe nhán doìng
Hçnh 15.1. Lai “bäü doì tçm” våïi âoaûn ADN, taïch ra bàòng âiãûn di vaì chuyãøn sang táúm nylon (Southern blotting) 15.2. CÁÚU TRUÏC CUÍA MAÏY ÂIÃÛN DI Maïy âiãûn di gäöm ba bäü pháûn cå baín: khay váûn haình (hçnh 15.2), nàõp coï âiãûn thãú cao vaì buäöng giaím xäúc. 322
UV khay di âäüng trong suäút
Khuän âuïc gel
Miãúng boüt âãûm
Hçnh 15.2. Khay váûn haình
Khay váûn haình bao gäöm khuän âuïc gel, khay di âäüng trong suäút vaì boüt âãûm bàòng caosu. Chuáøn bë khuän gel nhæ sau: loït miãúng boüt âãûm vaìo âaïy khay di âäüng vaì sau âoï áún maûnh miãúng âãûm vaìo caûnh khay (eïp cho âaïy khay di âäüng loüt hoaìn toaìn vaìo khay khuän træåïc khi haìn kên vaìo miãúng boüt).
Trãn nàõp coï âáöu ra cuía maî maìu, âæåüc näúi våïi nguäön âiãûn qua âiãûn cæûc trãn âãú maïy (hçnh 15.3). Buäöng giaím xäúc coï äúng näúi âiãûn cæûc, buûc di chuyãøn vaì läù naûp etylen glycol / næåïc våïi tyí lãû 50/50 (hçnh 15.4). Maî maìu âáöu ra näúi âiãûn cæûc trãn âãú maïy våïi nguäön âiãûn
Nàõp thiãút bë
Hçnh 15.3. Nàõp coï âiãûn thãú cao
ÄÚng näúi âiãûn cæûc
Buûc di chuyãøn (häù tråü khay váûn haình)
Nåi (läù) naûp 50/50 etylen glycol / næåïc vaìo
Hçnh 15.4. Buäöng giaím xäúc 323
15.3. CÁÚU TRUÏC VÁÛN HAÌNH 15.3.1. Chuáøn bë dung dëch - Chuáøn bë 250 ml dung dëch âãûm. Hai dung dëch âãûm âæåüc sæí duûng phäø biãún cho âiãûn di ADN âæåüc chuáøn bë theo cäng thæïc pha chãú dæåïi âáy. 1. 10X Tris- borate-EDTA. Nguäön cung cáúp cháút âãûm: (0,89 M tris; 0,89 M axit boric; 20 mM EDTA; pH- 8,2; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,89 M 108, 0g Axit boric (FW61.8): 0,89M 55,0 g Dung dëch EDTA: (0,5M; pH 8,0) 0,02M 40,0 ml Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 1000,0 ml pH luän luän giæî åí 8,2 Træåïc khi sæí duûng våïi dung dëch loaîng 0,5 X våïi 45 mM base tris; 45 mM axit boric vaì 1 mM EDTA thæåìng duìng pha loaîng båíi vç næåïc coï nhiãût âäü tháúp 1X våïi 89 mM base tris; 89 mM axit boric vaì 2 mM EDTA. 2. 10X Tris- acetate -EDTA Cung cáúp cho cháút âãûm (0,4 M tris; 0,2 M axit axetic; 10 mM EDTA; pH- 8,4; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,40 M 48,8 g Axit axetic (99,5%): 0,20 M 114,1 ml Dung dëch EDTA (0,5M; pH 0,8): 0,01M 20,0 ml Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 1000,0 ml Khuáúy âãöu âæìng laìm giaím pH. Pha loaîng tåïi 1X træåïc khi sæí duûng tåïi 40 mM base tris; 20 mM axit axetic vaì 1 mM EDTA. 3. Dung dëch EDTA (etylen diamin tetraaxetic axit): (0,5M; pH 8,0; 100 ml) Na2EDTA.2H2O; (FW 372,2) 0,5 M 18,6 g Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 70,0 ml NaOH (10M) tåïi pH 8,0 5,0 ml Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 100,0 ml - Chuáøn bë bäü âãûm taíi máùu. Âãø chuáøn bë bäü âãûm máùu cáön chuáøn bë máùu âãûm thæí (dung dëch máùu) vaì bäü læåüc coï dung têch khaïc nhau. Máùu âãûm thæí Dung dëch máùu (5X; 25% ficoll 400; 25% phenol bromua xanh; 10 ml) 324
Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: Ficoll 400: Phenol bromua xanh (F 691,9): Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï:
7,0 ml 2,5 mg 25,0 mg 10,0 ml
Chuï yï 1: Sucroza vaì glyxerol coï thãø sæí duûng âãø thay thãú cho ficoll 400. Chuï yï 2: Xylen cyanol (0,25 %) maì di chuyãøn cháûm hån phenol bromua xanh, thç coï thãø tàng thãm mäüt læåüng nãúu mong muäún, sæû cä caûn dung dëch agaroza âæåüc xaïc âënh khi thãm vaìo coï liãn quan âãún polynucleotit. Thãø têch bãøø Baíng 15.1. Nhæîng loaûi læåüc Maî säú læåüc 80 - 6051 - 88 80 - 6052 - 07 80 - 6051 - 50 80 - 6051 - 69 80 - 6050 - 74 80 - 6050 - 93 80 - 6051 - 12 80 - 6050 - 31
1 prep/2 ref 1 prep/2 ref 8 8 12 12 16 16
Bãö daìy, mm 1,0 1,5 1,0 1,5 1,0 1,5 1,0 1,5
Âäü räüng, mm 44/6 44/6 6,5 6,5 3,9 3,9 2,6 2,6
Dung têch Âäü sáu 44/6* 66/9* 6,5 9,7 3,9 5,8 2,6 3,9
- Chuáøn bë khoaíng 7 ml dung dëch agaroza æïng våïi mäùi mililit chiãöu daìy gel (vê duû 1 gel 3 mm cáön 0,3×7×10 = 21 ml). Hoaì tan agaroza trong dung dëch âãûm , âiãöu chènh nhiãût âäü häùn håüp. Cho pheïp laìm maït dung dëch âãún 500C træåïc khi roït vaìo khuän. Âãø quan saït sæû phán ly trong hiãûn tæåüng âiãûn chuyãøn thæåìng thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vaìo dung dëch gel. 15.3.2. Âuïc gel - Thiãút bë âàût khay di âäüng: Mäüt tay giæî chàût khuän âuïc, tay kia âàût âáöu khay di âäüng aïp vaìo miãûng boüt âãûm vaì sau âoï haû tháúp räöi âàût lãn âoaûn cuäúi cuía khuän âuïc. Âàût âáöu coìn laûi cuía khay aïp saït miãûng boüt âãûm. - Chuáøn bë læåüc: Làõp hai raînh trong læåüc vaìo giæîa nhæîng âáöu äúc vaì màût sau læåüc. Siãút chàût äúc. Âàût læåüc vaìo meïp khuän vaì chènh pháön cuäúi cuía læåüc âãø caïch khay di âäüng khoaíng 1 mm. Siãút chàût äúc âãø giæî chàõc læåüc. - Di chuyãøn læåüc: Âàût khuän làõp raïp lãn màût phàóng nàòm ngang. Âàût äúng nivä lãn khay di âäüng, noï nhæ thiãút bë kiãøm tra xem khuän coï âuïng vë trê nàòm ngang khäng. 325
Hçnh 15.5. Màût sau læåüc, làõp trãn vaình cuía khuän âuïc, vë trê læåüc trong gel. Hai äúc hiãûu chènh læåüc. Læåüc Màût sau læåüc
Âãø taûo hai raînh, âàût læåüc thæï hai vaìo giæîa gel
ÄÚc (2)
- Âäø dung dëch agaroza (âæåüc laìm laûnh âãún 500C) vaìo khuän âuïc. Âënh hæåïng læåüc âãø caïc bãö màût læåüc gáön miãúng âãûm boüt nháút vaì âàût noï lãn caûnh khay. Læåüc luän luän åí vaìo vë trê thàóng âæïng âãø traïnh sæû vàûn veûo hçnh daûng. Âãø chaûy læåüng máùu gáúp 2 láön, âàût læåüc thæï hai vaìo chênh giæîa khay. Cho pheïp thåìi gian täúi thiãøu âãø gel âàûc laûi laì 30 phuït. - Khi gel âaî kãút laûi, láön læåüt thaïo læåüc cáøn tháûn. Nháúc mäüt pháön vaì nghiãng nheû mäüt âáöu cuía læåüc, sau âoï ruït tæì tæì ra khoíi gel (keïo thàóng læåüc, taûo ra mäüt khoaíng khäng âãø coï thãø nháúc gel ra khoíi khay). - Thaïo khay di âäüng vaì gel bàòng caïch nàõm láúy tay cáöm cuía khay, áún âáöu aïp vaìo miãúng boüt âãûm. Khi khay âaî saûch âãûm thç nháúc ra. Chuyãøn khay vaì gel tåïi chäù maït. 15.3.3. Váûn haình âiãûn di 1. Laìm laûnh nãön træåïc khi tiãún haình, âàûc biãût khi duìng âiãûn aïp cao hån hoàûc khi sæû phán ly quy âënh trãn 30 phuït. Chuï yïï: Âãø tiãún haình phán ly, hoàûc laì thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vaìo dung dëch âãûm hoàûc thãm 50 mg/ml etydi bromua vaìo bäü âãûm máùu. Âãø quan saït, haîy càõt âiãûn, thaïo pháön nàõp vaì giæî âeìn cæûc têm gáön gel. Thãm tæì tæì etydi bromua vaìo dung dëch âãûm hay âãûm máùu. Phaït hiãûn bàòng phæång phaïp naìy khäng nhaûy bàòng caïch nhuäüm maìu vaì nhçn qua thiãút bë soi. 2. Âäø dung dëch vaìo caïc khoang sao cho âãún khi âãûm cao hån gel khoaíng 1 mm (khoaíng 220 ml). 3. Naûp máùu. Thãm máùu vaìo 5X bäü âãûm taíi máùu vaì träün (1/5 thãø têch laì âãûm naûp vaìo). Sæí duûng micropipet âãø naûp máùu, chuï yï traïnh âám thuíng hoàûc taûo nãn nhiãöu bong boïng. 4. Âàût nàõp âãø catot (−, dáy âen) åí âoaûn cuäúi gáön máùu nháút. (Máùu axit nucleic di chuyãøn vãö phêa anät, +, dáy âoí). Näúi caïc dáy maìu (âoí våïi âoí, âen våïi âen) tåïi caïc nguäön âiãûn, nhæ laì ESP 2A200. Âàût mæïc âiãûn aïp vaì thiãút bë báúm giåì (nãúu coï sàôn) theo mæïc âäü phán ly. 326
Nhanh, âiãûn aïp cao Nhæîng æïng duûng naìo âoï, nhæ laì kiãøm tra caïc máùu, coï thãø thæûc hiãûn nhanh dæåïi âiãöu kiãûn âiãûn aïp cao. Laìm laûnh (−200C ) vaì giåïi haûn thåìi gian váûn haình 5 phuït hoàûc êt hån åí âiãûn aïp 500 V. Cháûm hån, âiãûn aïp cao hån Mäüt gradient âiãûn aïp 12V/cm (150V) trong 30 ÷ 40 phuït (sæí duûng dung dëch âãûm 1% gel agaroza vaì 0,5 X TBE) càõt Hind III cuía lamda ADN thaình caïc âoaûn 0,1 ÷ 23 kb. Hoàûc, duìng dung dëch nhæ váûy, máùu naìy coï thãø chaûy åí 24 V/cm (300V) thç coï thãø phán càõt trong 20 ÷ 30 phuït. Laìm laûnh thiãút bë træåïc khi tiãún haình. Chuï yï: - Nãúu khäng âäø thãm maìu vaìo cháút loíng laìm nguäüi thç âàût trãn nãön täúi âãø quan saït dãù daìng hån. - Âàût thiãút bë coìn noïng lãn nãön âæåüc laìm laûnh coï thãø aính hæåíng âãún nhiãût âäü xung quanh. Nãúu sæû quaï nhiãût khäng âæåüc kiãøm soaït, gel seî tan hoàûc thiãút bë seî cong. - Etydi bromua laì cháút àn da maûnh, nãn cáön mang bao tay. - Âeo kênh chàõn tia UV vaì baío vãû da khi sæí duûng âeìn UV. - Tênh gradient âiãûn aïp, chia âiãûn aïp âàût vaìo cho khoaíng caïch giæîa caïc cæûc 12,7 cm. Baíng 15.2. Âiãûn aïp âàût vaìo vaì thåìi gian âãö nghë
(1)
Âiãûn aïp, V
Gradient, V/cm
Thåìi gian, phuït
500
40
5 (1)
400
31
10 (1)
300
24
20 (1)
200
16
30 ÷ 40
150
12
30 ÷ 60
Ghi chuï: (1) Âãø thåìi gian chaûy êt hån hoàûc bàòng 20 phuït, sæí duûng 0,5X TBE vaì laìm laûnh nãön âãún −200C træåïc khi sæí duûng.
Sau khi phán ly 1- Ngàõt âiãûn, thaïo dáy dáùn, thaïo nàõp. 2- Nãúu khäng thãm etydi bromua vaìo gel hoàûc máùu træåïc khi chaûy, nhuäüm gel trong dung dëch 0,5 ÷ 1 mg/ml etydi bromua trong næåïc hoàûc âãûm. 3- Laìm saûch thiãút bë.
327
Váûn haình Caïc loaûi gel agaroza âæåüc chuáøn bë láön âáöu trong khuän âuïc gel. Nhæîng máùu âæåüc naûp vaìo trong caïc bãø chæïa vaì âæåüc phán ly. Thuäúc nhuäüm huyình quang C12H20BrN3 coï thãø âæåüc thãm vaìo cháút âãûm âiãûn di hoàûc gel hoàûc caí hai âãø tçm ra dáúu hiãûu cuía quaï trçnh phán ly. Sau khi âiãûn di, gel coï thãø cho maìu, ghi laûi maìu, tháúm maìu thãm hoàûc sáúy tæû âäüng. - Âäø âáöy läù våïi cháút taíi laûnh. Duì khäng laìm laûnh âi næîa thç âiãöu quan troüng laì phaíi âäø âáöy läù våïi dung dëch laìm laûnh âàûc træng træåïc khi sæí duûng vç dung dëch cung cáúp nguäön nhiãût cáön thiãút. Chuáøn bë 600 ml våïi 50/50 C2H2(OH)2/H2O - Âãø giuïp xem caïc bãø chæïa âæåüc roî raìng hån trong khi naûp máùu, thãm 1 hoàûc 2 gioüt thuäúc nhuäüm hoaì tan hoàûc maìu thæûc pháøm vaìo dung dëch laìm laûnh. Tçm ra hai läù hoíng naûp næåïc åí pháön trãn cuía läù. Âäø âáöy läù hoíng âãún mæïc coï thãø nhæ cháút laìm laûnh bàòng äúng phun hoàûc maïy båm våïi 50 ml. Báúm nuït caosu maìu náu vaìo mäùi läù. - Sàõp xãúp dung dëch âaî chuáøn bë trong thuìng âaï hoàûc bãn trong maïy laûnh hoàûc tuí laûnh âãø khäng dæåïi 200C trong khoaíng 1 giåì træåïc khi sæí duûng (hoaï cháút âæåüc dæû træî trong phoìng laûnh hay tuí laûnh). Chuï yï: - Khäng âäø âáöy läù våïi cháút chäúng âäng thæång maûi, dung mäi hæîu cå hoàûc næåïc cáút. - Khäng cáön thiãút thay thãú cháút laìm laûnh. 15.3.4. Tênh kãút quaí Hiãûn tæåüng âiãûn di cháút gel coï thãø sæí duûng nhæîng maính nhoí ADN khoaíng 0,1 kb hay nhoí hån loaûi gel polyacrylamit thæåìng sæí duûng nhæîng maính nhoí hån 1 kb. Tênh âiãûn di cuía ADN. Näöng âäü agaroza qui âënh cho quaï trçnh phán ly thaình nhæîng maính våî våïi nhæîng kêch thæåïc khaïc nhau âæåüc cho trong baíng 15.3. Baíng 15.3. Näöng âäü âãø âiãûn di cuía caïc maính våî ADN âäúi våïi caïc loaûi cháút khaïc
0,5 0,7
Hiãûu quaí cuía nhæîng âoaûn thàóng âäúi våïi sæû phán giaíi 1,0 ÷ 3,0 0,8 ÷ 12
1,0
0,5 ÷ 10
1,2
0,4 ÷ 7
1,5
0,2 ÷ 3
Âiãûn di, %
328
Nhæîng nhán täú khaïc aính hæåíng âãún kãút quaí quaï trçnh phán ly bao gäöm: cháút âãûm, âiãûn aïp âàût vaìo, nhiãût âäü , cáúu taûo vaì sæû coï màût cuía etydi brommua, caïc agaroza âàûc biãût coï sàôn. Tiãu chuáøn chung cho âoaûn Hind III phage λ. Loaûi cho 8 maính våî sàõp xãúp trong khoaíng tæì 0,1 âãún 23 kb cho mäùi càûp 2 såüi. Âãø phán giaíi täút, di chuyãøn trãn âoaûn 10 cm máút 45 phuït 1% gel agaroza trong gel 0,5 X TBE åí âiãûn aïp 150V. Tênh âiãûn di cuía ARN ARN coï thãø phán chia âæûa theo kêch thæåïc cå baín. Âãø traïnh taïc âäüng âãún thåìi kyì chuyãøn hoaï cáúu truïc ARN âæåüc biãún tênh træåïc hay suäút thåìi gian âiãûn di. Vê duû: âoaûn ARN âaî biãún tênh træåïc våïi glyoxal vaì âimetyl sunfoxit coï thãø gel agaroza âäüc láûp, hay ARN coï thãø bë càõt phán âoaûn. Gel agaroza chæïa hydroxyt thuyí ngán II metyl hay focmaldehyt. 15.3.5 Sæû phaït hiãûn ADN ADN coï thãø âæåüc phaït hiãûn nhåì sæû phaït huyình quang cuía liãn kãút etydi bromua (C2H10BrN3) hay nhåì phæång phaïp chuûp aính bàòng tia X cuía âäöng vë phoïng xaû ADN. Etydi bromua (0,5 µg/ml) coï thãø âæåüc thãm vaìo dung dëch âãûm di chuyãøn, âãø quan saït sæû biãún âäüng cuía máùu, vç sæû phaït huyình quang cuía thuäúc nhuäüm dæåïi taïc duûng cuía tia cæûc têm seî âæåüc biãøu hiãûn åí daûng daíi (âãø xaïc âënh âæåüc sæû biãún âäøi âoï; tàõt nguäön cung cáúp nàng læåüng vaì chuyãøn âäøi thaình pháön agaroza cuî ra nàõp thiãút bë âënh tia cæûc têm gáön khay váûn haình. Âàût nàõp laûi vaì báût âeìn âãø bàõt laûi sæû âiãûn di). Ngoaìi ra, sau khi âiãûn di, gel biãún maìu trong dung dëch hoaì tan (etydi bromua 10,5 µg/ml H2O) khoaíng tæì 10 âãún 60 phuït räöi quan saït vaì chuûp aính máùu bàòng phæång phaïp chiãúu tia cæûc têm. Âãø chuûp aính gel, duìng phæång phaïp chiãúu tia cæûc têm trãn bãö màût taûi mäùi vë trê åí âéa váûn haình hoàûc di chuyãøn nheû baín gel trãn bãö màût seî quan saït âæåüc täúi âa (Âéa váûn haình coï 95 % aïnh saïng tràõng våïi bæåïc soïng 254 nm vaì 40 % aïnh saïng tràõng våïi bæåïc soïng 254 nm). Quan saït máùu bàòng tia cæûc têm åí bæåïc soïng 366 nm hoàûc laìm giaím cæåìng âäü tia cæûc têm xuäúng 302 nm âãø giaím sæû phaït huyình quang cuía etydi bromua khäng liãn kãút, gel coï thãø bë máút maìu båíi sæû huït áøm cuía noï trong 5 phuït våïi MgCl2 0,01M hoàûc trong 1 giåì våïi MgSO4 0,001M. Sæû máút maìu âaî taûo âiãöu kiãûn dãù daìng âãø phaït hiãûn haìm læåüng ADN nhoí. 15.3.6. Nhæîng chuï yï cáön thiãút Nàõp an toaìn phaíi âæåüc làõp træåïc khi näúi nguäön âiãûn våïi nguäön cung cáúp nàng læåüng. 329
Tàõt táút caí caïc cäng tàõc âiãûn vaì ngàõt nguäön cung cáúp âiãûn træåïc khi thaïo nàõp an toaìn. Træåïc khi sæí duûng láön âáöu, laìm âáöy läù våïi 1 læåüng 600 ml 50/50 etylen glycol/ næåïc âãø ngàn chàûn sæû täøn tháút khäng thãø häöi phuûc cho thiãút bë. Läù chæïa læåüng trãn coï thãø âäø âáöy ngay caí khi khäng cáön laìm laûnh theo yãu cáöu. Khäng sæí duûng næåïc cáút, cháút chäúng âäng thæång maûi hoàûc báút kyì dung mäi hæîu cå naìo âãø âäø vaìo läù âoï. Næåïc âæåüc láúy ra khi âoïng bàng. Nãúu khäng noï bë huït vaìo bãn trong dung dëch vaì phaï våî liãn kãút. Dung mäi hæîu cå seî gáy ra sæû täøn tháút hoaï cháút khäng thãø häöi phuûc cho thiãút bë. Khäng laìm laûnh læåüng dung dëch cho vaìo läù âoï dæåïi −200C (−40F). Coï thãø laìm laûnh læåüng dung dëch âoï trong thuìng âaï, maïy laìm laûnh hoàûc trong tuí laûnh. Khäng âiãöu chènh nhiãût âäü dung dëch âãûm hoàûc gel trãn 500C. Ngàn chàûn sæû âun noïng quaï nhiãût bàòng caïch laìm laûnh læåüng dung dëch âoï træåïc khi sæí duûng. Âãø ngàn chàûn sæû âun noïng quaï nhiãût trong quaï trçnh keïo daìi chaûy âiãûn aïp cao, thay thãú læåüng dung dëch thæï nháút bàòng læåüng dung dëch thæï 2 âaî âæåüc laìm laûnh. Sæû âun noïng quaï nhiãût seî gáy ra sæû täøn tháút khäng thãø häöi phuûc cho thiãút bë Laìm saûch Sau mäùi láön sæí duûng, laìm saûch thiãút bë bàòng cháút táøy nheû vaì næåïc, suïc cáøn tháûn våïi næåïc cáút vaì laìm khä bàòng khäng khê. Khäng âæåüc âàût thiãút bë vaìo dung dëch hoàûc khê thåm hoàûc caïc hydrocacbon halogen hoaï, xeton, este, alcol (trãn 30%) hoàûc axit âàûc (trãn 25%). Âãø traïnh laìm báøn DNaza vaì ARNza, ngám caïc khoang chæïa âãûm hoàûc khuän âuïc khoaíng 10 phuït trong dung dëch H2O2 3%, sau âoï suïc cáøn tháûn våïi DEPC âæåüc xæí lyï räöi cho vaìo näöi háúp (duìng næåïc âaî âæåüc ion hoaï âãø háúp). Thay thãú miãúng boüt âãûm Thaïo nhæîng miãúng boüt âãûm moìn. Thaïo voí miãúng âãûm måïi. Sàõp âãûm cho thàóng vaì âãø noï vaìo vë trê cuäúi cuía khay doüc theo caûnh ngàõn (7 cm), màût sau cuía tæåìng vaì sau âoï eïp vaìo âuïng vë trê. Làûp laûi våïi miãúng âãûm thæï hai trãn tæåìng âäúi diãûn våïi miãúng âãûm thæï nháút. 15.3.7. Âiãöu chènh thiãút bë âiãûn di Bãø chàõn máùu. Âãø cho gel âàûc laûi täúi thiãøu laì 30 phuït vaì giæî åí nhiãût âäü phoìng træåïc khi thaïo læåüc. Khi thaïo læåüc giæî åí caûnh ngàõn vaì náng nheû âãø traïnh gáùy gel. Giæî âãø khäng hoíng bãø chæïa, duìng pipet âãø láúy máùu, cäú gàõng cho vaìo giæîa bãø vaì khäng laìm thuíng âaïy bãø. 330
Máùu thæí khäng chaûy doüc theo cäüt Nãúu chaíy thaình såüi trãn khay bë hoíng thç phaíi thay thãú. Giaím âiãûn aïp. Choün cháút âãûm våïi näöng âäü vaì haìm læåüng dung dëch âãûm thêch håüp (læåüng dung dëch âãûm TBE chæïa nhiãöu hån loaûi TAE). Nãúu cháút âãûm bë thaïo ra hãút thç ngæng hoaût âäüng, thaïo nàõp, duìng äúng huït láúy cháút âãûm tæì läù khaïc cho vaìo bãn trong läù âäúi diãûn âãún khi âáöy cháút âãûm. Nãúu cháút gel khäng âäöng nháút, âàût khuän âuïc nàòm ngang træåïc khi âäø däön gel (âãø laìm hoaì láùn vaìo nhau). Càûp khuän âuïc Læåüc phaíi âàût thàóng âæïng âãø traïnh laìm biãún daûng bãø chæïa. Giaím låïp âãûm 1 mm tæì bãö màût åí phêa trãn gel, giaím gradien nhiãût âäü. Taïi taûo gel khäng âuí cháút læåüng Thãm ficoll, glyxerol hay âæåìng (mêa) vaìo nhiãöu dung dëch láúy máùu âãø baío âaím máùu làõng xuäúng âaïy bãø (choün cháút ficoll) Chàõc chàõn máùu thæí âæåüc hoaì tan hoaìn toaìn. Giaím âiãûn thãú. Giaím näöng âäü máùu thæí. Giaím thãø têch máùu. Cáön êt nháút 1 mm gel dæåïi âaïy læåüc âãø traïnh máùu rè ra tæì âaïy bãø. Giaím näöng âäü muäúi trong máùu thæí. Kiãøm tra âäü enzim, máùu thæí coï thãø cáön taïc âäüng láu (xuïc taïc xaíy ra quaï trçnh) vaì mäüt loaûi cháút âãûm khaïc haûn chãú sæû di chuyãøn. Pha chãú máùu måïi nãúu nghi ngåì máùu bë nhiãùm báøn. Choün loaûi agaroza våïi täúc âäü tháøm tháúu cháûm. Âàût khay âuïng vë trê, khäng áún maûnh vaìo bãn trong.
331
MAÏY ÂIÃÛN DI Maïy âiãûn di duìng âãø phaït hiãûn vaì xaïc âënh ADN trong tãú baìo vi sinh váût, thæûc váût vaì âäüng váût. 15.1. AXIT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) VAÌ NGUYÃN TÀÕC XAÏC ÂËNH Gen laì âån vë di truyãön cå baín. Noï laì mäüt âoaûn ADN (âäi khi ARN) maî hoaï thäng tin cho viãûc täøng håüp saín pháøm sinh hoüc xaïc âënh (chuí yãúu laì protein). Nhæîng nghiãn cæïu hiãûn âaûi vãö cáúu truïc vaì chæïc nàng cuía nguyãn sinh cháút âaî måí ra nhæîng hiãøu biãút måïi vãö cáúu taûo vaì chæïc nàng hoaût âäüng cuía tãú baìo. Cáúu truïc ADN cho pheïp giaíi thêch taûi sao laûi coï khaí nàng taìng træî vaì di truyãön thäng tin tæì thãú hãû naìy sang thãú hãû khaïc mäüt caïch äøn âënh vaì bàòng caïch naìo noï thäng tin di tuyãön åí daûng thæï tæû sàõp xãúp caïc gäúc nucleotit laûi chuyãøn hoaï thaình phán tæí protein chæïc nàng. Näüi dung nãu trãn liãn quan âãún giaïo lyï trung tám cuía di truyãön phán tæí gäöm 3 âiãøm chênh: sao cheïp thäng tin di truyãön tæì ADN bäú meû sang ADN con caïi, chuyãøn âäøi maî di truyãön tæì ADN sang ARN - quaï trçnh phiãn maî (transcription) vaì dëch maî di truyãön (translation) - thäng tin di truyãön tæì mARN âæåüc chuyãøn sang trçnh tæû sàõp xãúp âàûc hiãûu cuía axit amin trong phán tæí protein. Cäng nghãû ADN taïi täø håüp - hiãûn laì nãön taíng cho sæû phaït triãøn nhæ vuî baîo cuía ngaình cäng nghãû sinh hoüc hiãûn âaûi. Caïc phæång phaïp phán têch vaì täøng håüp hiãûn âaûi laì taïch DNA, xaïc âënh thæï tæû, täøng håüp, gàõn xen noï vaìo vë trê nháút âënh bãn trong såüi ADN khaïc âãø nhán lãn, vaì räöi laûi taïch ra. Hiãûn nay hoaìn toaìn coï thãø nháûn biãút chênh xaïc nhæîng âoaûn ADN âàûc hiãûu qua cháøn âoaïn caïc bãûnh âàûc biãût. Âäúi våïi caïc bãûnh khi caïc gel chæa âæåüc xaïc âënh thç viãûc cháøn âoaïn keïm chênh xaïc. Mäüt bäü doì tçm âån giaín chè laì mäüt khuïc ADN (hoàûc ARN) coï thãø tçm khuïc bäø sung våïi noï bàòng caïch lai (hybridization). Coï thãø phaït hiãûn sæû bàõt càûp naìy bàòng nhiãöu caïch, nhæng phäø biãún nháút laì sæí duûng phæång phaïp tæû chuûp phoïng xaû våïi bäü doì tçm coï 32p (hçnh 15.1).
321
Viãûc lai bäü doì tçm ADN våïi âoaûn ADN taïch råìi goüi laì Southern Blotting âæåüc mä taí trãn hçnh 15.1. Caïc âoaûn ADN hçnh thaình sau khi ADN bë endonucleaza restrictaza càõt seî âæåüc taïch råìi ra bàòng phæång phaïp âiãûn di trãn gel agaroza. Khoaíng caïch di chuyãøn phuû thuäüc vaìo kêch thæåïc âoaûn. Caìng nhoí chaûy caìng nhanh. Sau khi âaî taïch råìi, ngæåìi ta duìng kiãöm âãø laìm biãún tênh caïc âoaûn âoï vaì chuyãøn chuïng lãn maìng nylon. Táúm maìng naìy âæåüc uí våïi dung dëch coï cháút doì tçm cháút phoïng xaû, noï chè lai våïi caïc âoaûn ADN naìo chæïa thæï tæû bäø sung. Viãûc xaïc âënh thæï tæû ARN (vê duû mARN) cuîng coï thãø theo trçnh tæû taïch bàòng âiãûn di ARN trãn gel, chuyãøn lãn maìng nylon vaì cho lai våïi ADN probe âàûc hiãûu. Phæång phaïp naìy goüi laì Northern Blotting. Nhæîng âoaûn ADN sau khi càõt bàòng endonucleasa Taïch âiãûn di trãn gel agarosa Caïc âoaûn ADN taïch ra theo kêch thæåïc Biãún tênh bàòng kiãöm âãø taïch såüi trung hoaì
Âënh vë ADN bàòng tia UV Phuí bàòng maìng nylon
UÍ vãût coï ADN nhán doìng såüi âån vaì coï gàõn phoïng xaû
Ræía vaì sæû chuûp phoïng xaûû
Vë trê âoaûn ADN chæïa thæ tæû tæång âäöng probe nhán doìng
Hçnh 15.1. Lai “bäü doì tçm” våïi âoaûn ADN, taïch ra bàòng âiãûn di vaì chuyãøn sang táúm nylon (Southern blotting) 15.2. CÁÚU TRUÏC CUÍA MAÏY ÂIÃÛN DI Maïy âiãûn di gäöm ba bäü pháûn cå baín: khay váûn haình (hçnh 15.2), nàõp coï âiãûn thãú cao vaì buäöng giaím xäúc. 322
UV khay di âäüng trong suäút
Khuän âuïc gel
Miãúng boüt âãûm
Hçnh 15.2. Khay váûn haình
Khay váûn haình bao gäöm khuän âuïc gel, khay di âäüng trong suäút vaì boüt âãûm bàòng caosu. Chuáøn bë khuän gel nhæ sau: loït miãúng boüt âãûm vaìo âaïy khay di âäüng vaì sau âoï áún maûnh miãúng âãûm vaìo caûnh khay (eïp cho âaïy khay di âäüng loüt hoaìn toaìn vaìo khay khuän træåïc khi haìn kên vaìo miãúng boüt).
Trãn nàõp coï âáöu ra cuía maî maìu, âæåüc näúi våïi nguäön âiãûn qua âiãûn cæûc trãn âãú maïy (hçnh 15.3). Buäöng giaím xäúc coï äúng näúi âiãûn cæûc, buûc di chuyãøn vaì läù naûp etylen glycol / næåïc våïi tyí lãû 50/50 (hçnh 15.4). Maî maìu âáöu ra näúi âiãûn cæûc trãn âãú maïy våïi nguäön âiãûn
Nàõp thiãút bë
Hçnh 15.3. Nàõp coï âiãûn thãú cao
ÄÚng näúi âiãûn cæûc
Buûc di chuyãøn (häù tråü khay váûn haình)
Nåi (läù) naûp 50/50 etylen glycol / næåïc vaìo
Hçnh 15.4. Buäöng giaím xäúc 323
15.3. CÁÚU TRUÏC VÁÛN HAÌNH 15.3.1. Chuáøn bë dung dëch - Chuáøn bë 250 ml dung dëch âãûm. Hai dung dëch âãûm âæåüc sæí duûng phäø biãún cho âiãûn di ADN âæåüc chuáøn bë theo cäng thæïc pha chãú dæåïi âáy. 1. 10X Tris- borate-EDTA. Nguäön cung cáúp cháút âãûm: (0,89 M tris; 0,89 M axit boric; 20 mM EDTA; pH- 8,2; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,89 M 108, 0g Axit boric (FW61.8): 0,89M 55,0 g Dung dëch EDTA: (0,5M; pH 8,0) 0,02M 40,0 ml Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 1000,0 ml pH luän luän giæî åí 8,2 Træåïc khi sæí duûng våïi dung dëch loaîng 0,5 X våïi 45 mM base tris; 45 mM axit boric vaì 1 mM EDTA thæåìng duìng pha loaîng båíi vç næåïc coï nhiãût âäü tháúp 1X våïi 89 mM base tris; 89 mM axit boric vaì 2 mM EDTA. 2. 10X Tris- acetate -EDTA Cung cáúp cho cháút âãûm (0,4 M tris; 0,2 M axit axetic; 10 mM EDTA; pH- 8,4; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,40 M 48,8 g Axit axetic (99,5%): 0,20 M 114,1 ml Dung dëch EDTA (0,5M; pH 0,8): 0,01M 20,0 ml Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 1000,0 ml Khuáúy âãöu âæìng laìm giaím pH. Pha loaîng tåïi 1X træåïc khi sæí duûng tåïi 40 mM base tris; 20 mM axit axetic vaì 1 mM EDTA. 3. Dung dëch EDTA (etylen diamin tetraaxetic axit): (0,5M; pH 8,0; 100 ml) Na2EDTA.2H2O; (FW 372,2) 0,5 M 18,6 g Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 70,0 ml NaOH (10M) tåïi pH 8,0 5,0 ml Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: 100,0 ml - Chuáøn bë bäü âãûm taíi máùu. Âãø chuáøn bë bäü âãûm máùu cáön chuáøn bë máùu âãûm thæí (dung dëch máùu) vaì bäü læåüc coï dung têch khaïc nhau. Máùu âãûm thæí Dung dëch máùu (5X; 25% ficoll 400; 25% phenol bromua xanh; 10 ml) 324
Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï: Ficoll 400: Phenol bromua xanh (F 691,9): Næåïc âaî âæåüc khæí ion hoaï:
7,0 ml 2,5 mg 25,0 mg 10,0 ml
Chuï yï 1: Sucroza vaì glyxerol coï thãø sæí duûng âãø thay thãú cho ficoll 400. Chuï yï 2: Xylen cyanol (0,25 %) maì di chuyãøn cháûm hån phenol bromua xanh, thç coï thãø tàng thãm mäüt læåüng nãúu mong muäún, sæû cä caûn dung dëch agaroza âæåüc xaïc âënh khi thãm vaìo coï liãn quan âãún polynucleotit. Thãø têch bãøø Baíng 15.1. Nhæîng loaûi læåüc Maî säú læåüc 80 - 6051 - 88 80 - 6052 - 07 80 - 6051 - 50 80 - 6051 - 69 80 - 6050 - 74 80 - 6050 - 93 80 - 6051 - 12 80 - 6050 - 31
1 prep/2 ref 1 prep/2 ref 8 8 12 12 16 16
Bãö daìy, mm 1,0 1,5 1,0 1,5 1,0 1,5 1,0 1,5
Âäü räüng, mm 44/6 44/6 6,5 6,5 3,9 3,9 2,6 2,6
Dung têch Âäü sáu 44/6* 66/9* 6,5 9,7 3,9 5,8 2,6 3,9
- Chuáøn bë khoaíng 7 ml dung dëch agaroza æïng våïi mäùi mililit chiãöu daìy gel (vê duû 1 gel 3 mm cáön 0,3×7×10 = 21 ml). Hoaì tan agaroza trong dung dëch âãûm , âiãöu chènh nhiãût âäü häùn håüp. Cho pheïp laìm maït dung dëch âãún 500C træåïc khi roït vaìo khuän. Âãø quan saït sæû phán ly trong hiãûn tæåüng âiãûn chuyãøn thæåìng thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vaìo dung dëch gel. 15.3.2. Âuïc gel - Thiãút bë âàût khay di âäüng: Mäüt tay giæî chàût khuän âuïc, tay kia âàût âáöu khay di âäüng aïp vaìo miãûng boüt âãûm vaì sau âoï haû tháúp räöi âàût lãn âoaûn cuäúi cuía khuän âuïc. Âàût âáöu coìn laûi cuía khay aïp saït miãûng boüt âãûm. - Chuáøn bë læåüc: Làõp hai raînh trong læåüc vaìo giæîa nhæîng âáöu äúc vaì màût sau læåüc. Siãút chàût äúc. Âàût læåüc vaìo meïp khuän vaì chènh pháön cuäúi cuía læåüc âãø caïch khay di âäüng khoaíng 1 mm. Siãút chàût äúc âãø giæî chàõc læåüc. - Di chuyãøn læåüc: Âàût khuän làõp raïp lãn màût phàóng nàòm ngang. Âàût äúng nivä lãn khay di âäüng, noï nhæ thiãút bë kiãøm tra xem khuän coï âuïng vë trê nàòm ngang khäng. 325
Hçnh 15.5. Màût sau læåüc, làõp trãn vaình cuía khuän âuïc, vë trê læåüc trong gel. Hai äúc hiãûu chènh læåüc. Læåüc Màût sau læåüc
Âãø taûo hai raînh, âàût læåüc thæï hai vaìo giæîa gel
ÄÚc (2)
- Âäø dung dëch agaroza (âæåüc laìm laûnh âãún 500C) vaìo khuän âuïc. Âënh hæåïng læåüc âãø caïc bãö màût læåüc gáön miãúng âãûm boüt nháút vaì âàût noï lãn caûnh khay. Læåüc luän luän åí vaìo vë trê thàóng âæïng âãø traïnh sæû vàûn veûo hçnh daûng. Âãø chaûy læåüng máùu gáúp 2 láön, âàût læåüc thæï hai vaìo chênh giæîa khay. Cho pheïp thåìi gian täúi thiãøu âãø gel âàûc laûi laì 30 phuït. - Khi gel âaî kãút laûi, láön læåüt thaïo læåüc cáøn tháûn. Nháúc mäüt pháön vaì nghiãng nheû mäüt âáöu cuía læåüc, sau âoï ruït tæì tæì ra khoíi gel (keïo thàóng læåüc, taûo ra mäüt khoaíng khäng âãø coï thãø nháúc gel ra khoíi khay). - Thaïo khay di âäüng vaì gel bàòng caïch nàõm láúy tay cáöm cuía khay, áún âáöu aïp vaìo miãúng boüt âãûm. Khi khay âaî saûch âãûm thç nháúc ra. Chuyãøn khay vaì gel tåïi chäù maït. 15.3.3. Váûn haình âiãûn di 1. Laìm laûnh nãön træåïc khi tiãún haình, âàûc biãût khi duìng âiãûn aïp cao hån hoàûc khi sæû phán ly quy âënh trãn 30 phuït. Chuï yïï: Âãø tiãún haình phán ly, hoàûc laì thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vaìo dung dëch âãûm hoàûc thãm 50 mg/ml etydi bromua vaìo bäü âãûm máùu. Âãø quan saït, haîy càõt âiãûn, thaïo pháön nàõp vaì giæî âeìn cæûc têm gáön gel. Thãm tæì tæì etydi bromua vaìo dung dëch âãûm hay âãûm máùu. Phaït hiãûn bàòng phæång phaïp naìy khäng nhaûy bàòng caïch nhuäüm maìu vaì nhçn qua thiãút bë soi. 2. Âäø dung dëch vaìo caïc khoang sao cho âãún khi âãûm cao hån gel khoaíng 1 mm (khoaíng 220 ml). 3. Naûp máùu. Thãm máùu vaìo 5X bäü âãûm taíi máùu vaì träün (1/5 thãø têch laì âãûm naûp vaìo). Sæí duûng micropipet âãø naûp máùu, chuï yï traïnh âám thuíng hoàûc taûo nãn nhiãöu bong boïng. 4. Âàût nàõp âãø catot (−, dáy âen) åí âoaûn cuäúi gáön máùu nháút. (Máùu axit nucleic di chuyãøn vãö phêa anät, +, dáy âoí). Näúi caïc dáy maìu (âoí våïi âoí, âen våïi âen) tåïi caïc nguäön âiãûn, nhæ laì ESP 2A200. Âàût mæïc âiãûn aïp vaì thiãút bë báúm giåì (nãúu coï sàôn) theo mæïc âäü phán ly. 326
Nhanh, âiãûn aïp cao Nhæîng æïng duûng naìo âoï, nhæ laì kiãøm tra caïc máùu, coï thãø thæûc hiãûn nhanh dæåïi âiãöu kiãûn âiãûn aïp cao. Laìm laûnh (−200C ) vaì giåïi haûn thåìi gian váûn haình 5 phuït hoàûc êt hån åí âiãûn aïp 500 V. Cháûm hån, âiãûn aïp cao hån Mäüt gradient âiãûn aïp 12V/cm (150V) trong 30 ÷ 40 phuït (sæí duûng dung dëch âãûm 1% gel agaroza vaì 0,5 X TBE) càõt Hind III cuía lamda ADN thaình caïc âoaûn 0,1 ÷ 23 kb. Hoàûc, duìng dung dëch nhæ váûy, máùu naìy coï thãø chaûy åí 24 V/cm (300V) thç coï thãø phán càõt trong 20 ÷ 30 phuït. Laìm laûnh thiãút bë træåïc khi tiãún haình. Chuï yï: - Nãúu khäng âäø thãm maìu vaìo cháút loíng laìm nguäüi thç âàût trãn nãön täúi âãø quan saït dãù daìng hån. - Âàût thiãút bë coìn noïng lãn nãön âæåüc laìm laûnh coï thãø aính hæåíng âãún nhiãût âäü xung quanh. Nãúu sæû quaï nhiãût khäng âæåüc kiãøm soaït, gel seî tan hoàûc thiãút bë seî cong. - Etydi bromua laì cháút àn da maûnh, nãn cáön mang bao tay. - Âeo kênh chàõn tia UV vaì baío vãû da khi sæí duûng âeìn UV. - Tênh gradient âiãûn aïp, chia âiãûn aïp âàût vaìo cho khoaíng caïch giæîa caïc cæûc 12,7 cm. Baíng 15.2. Âiãûn aïp âàût vaìo vaì thåìi gian âãö nghë
(1)
Âiãûn aïp, V
Gradient, V/cm
Thåìi gian, phuït
500
40
5 (1)
400
31
10 (1)
300
24
20 (1)
200
16
30 ÷ 40
150
12
30 ÷ 60
Ghi chuï: (1) Âãø thåìi gian chaûy êt hån hoàûc bàòng 20 phuït, sæí duûng 0,5X TBE vaì laìm laûnh nãön âãún −200C træåïc khi sæí duûng.
Sau khi phán ly 1- Ngàõt âiãûn, thaïo dáy dáùn, thaïo nàõp. 2- Nãúu khäng thãm etydi bromua vaìo gel hoàûc máùu træåïc khi chaûy, nhuäüm gel trong dung dëch 0,5 ÷ 1 mg/ml etydi bromua trong næåïc hoàûc âãûm. 3- Laìm saûch thiãút bë.
327
Váûn haình Caïc loaûi gel agaroza âæåüc chuáøn bë láön âáöu trong khuän âuïc gel. Nhæîng máùu âæåüc naûp vaìo trong caïc bãø chæïa vaì âæåüc phán ly. Thuäúc nhuäüm huyình quang C12H20BrN3 coï thãø âæåüc thãm vaìo cháút âãûm âiãûn di hoàûc gel hoàûc caí hai âãø tçm ra dáúu hiãûu cuía quaï trçnh phán ly. Sau khi âiãûn di, gel coï thãø cho maìu, ghi laûi maìu, tháúm maìu thãm hoàûc sáúy tæû âäüng. - Âäø âáöy läù våïi cháút taíi laûnh. Duì khäng laìm laûnh âi næîa thç âiãöu quan troüng laì phaíi âäø âáöy läù våïi dung dëch laìm laûnh âàûc træng træåïc khi sæí duûng vç dung dëch cung cáúp nguäön nhiãût cáön thiãút. Chuáøn bë 600 ml våïi 50/50 C2H2(OH)2/H2O - Âãø giuïp xem caïc bãø chæïa âæåüc roî raìng hån trong khi naûp máùu, thãm 1 hoàûc 2 gioüt thuäúc nhuäüm hoaì tan hoàûc maìu thæûc pháøm vaìo dung dëch laìm laûnh. Tçm ra hai läù hoíng naûp næåïc åí pháön trãn cuía läù. Âäø âáöy läù hoíng âãún mæïc coï thãø nhæ cháút laìm laûnh bàòng äúng phun hoàûc maïy båm våïi 50 ml. Báúm nuït caosu maìu náu vaìo mäùi läù. - Sàõp xãúp dung dëch âaî chuáøn bë trong thuìng âaï hoàûc bãn trong maïy laûnh hoàûc tuí laûnh âãø khäng dæåïi 200C trong khoaíng 1 giåì træåïc khi sæí duûng (hoaï cháút âæåüc dæû træî trong phoìng laûnh hay tuí laûnh). Chuï yï: - Khäng âäø âáöy läù våïi cháút chäúng âäng thæång maûi, dung mäi hæîu cå hoàûc næåïc cáút. - Khäng cáön thiãút thay thãú cháút laìm laûnh. 15.3.4. Tênh kãút quaí Hiãûn tæåüng âiãûn di cháút gel coï thãø sæí duûng nhæîng maính nhoí ADN khoaíng 0,1 kb hay nhoí hån loaûi gel polyacrylamit thæåìng sæí duûng nhæîng maính nhoí hån 1 kb. Tênh âiãûn di cuía ADN. Näöng âäü agaroza qui âënh cho quaï trçnh phán ly thaình nhæîng maính våî våïi nhæîng kêch thæåïc khaïc nhau âæåüc cho trong baíng 15.3. Baíng 15.3. Näöng âäü âãø âiãûn di cuía caïc maính våî ADN âäúi våïi caïc loaûi cháút khaïc
0,5 0,7
Hiãûu quaí cuía nhæîng âoaûn thàóng âäúi våïi sæû phán giaíi 1,0 ÷ 3,0 0,8 ÷ 12
1,0
0,5 ÷ 10
1,2
0,4 ÷ 7
1,5
0,2 ÷ 3
Âiãûn di, %
328
Nhæîng nhán täú khaïc aính hæåíng âãún kãút quaí quaï trçnh phán ly bao gäöm: cháút âãûm, âiãûn aïp âàût vaìo, nhiãût âäü , cáúu taûo vaì sæû coï màût cuía etydi brommua, caïc agaroza âàûc biãût coï sàôn. Tiãu chuáøn chung cho âoaûn Hind III phage λ. Loaûi cho 8 maính våî sàõp xãúp trong khoaíng tæì 0,1 âãún 23 kb cho mäùi càûp 2 såüi. Âãø phán giaíi täút, di chuyãøn trãn âoaûn 10 cm máút 45 phuït 1% gel agaroza trong gel 0,5 X TBE åí âiãûn aïp 150V. Tênh âiãûn di cuía ARN ARN coï thãø phán chia âæûa theo kêch thæåïc cå baín. Âãø traïnh taïc âäüng âãún thåìi kyì chuyãøn hoaï cáúu truïc ARN âæåüc biãún tênh træåïc hay suäút thåìi gian âiãûn di. Vê duû: âoaûn ARN âaî biãún tênh træåïc våïi glyoxal vaì âimetyl sunfoxit coï thãø gel agaroza âäüc láûp, hay ARN coï thãø bë càõt phán âoaûn. Gel agaroza chæïa hydroxyt thuyí ngán II metyl hay focmaldehyt. 15.3.5 Sæû phaït hiãûn ADN ADN coï thãø âæåüc phaït hiãûn nhåì sæû phaït huyình quang cuía liãn kãút etydi bromua (C2H10BrN3) hay nhåì phæång phaïp chuûp aính bàòng tia X cuía âäöng vë phoïng xaû ADN. Etydi bromua (0,5 µg/ml) coï thãø âæåüc thãm vaìo dung dëch âãûm di chuyãøn, âãø quan saït sæû biãún âäüng cuía máùu, vç sæû phaït huyình quang cuía thuäúc nhuäüm dæåïi taïc duûng cuía tia cæûc têm seî âæåüc biãøu hiãûn åí daûng daíi (âãø xaïc âënh âæåüc sæû biãún âäøi âoï; tàõt nguäön cung cáúp nàng læåüng vaì chuyãøn âäøi thaình pháön agaroza cuî ra nàõp thiãút bë âënh tia cæûc têm gáön khay váûn haình. Âàût nàõp laûi vaì báût âeìn âãø bàõt laûi sæû âiãûn di). Ngoaìi ra, sau khi âiãûn di, gel biãún maìu trong dung dëch hoaì tan (etydi bromua 10,5 µg/ml H2O) khoaíng tæì 10 âãún 60 phuït räöi quan saït vaì chuûp aính máùu bàòng phæång phaïp chiãúu tia cæûc têm. Âãø chuûp aính gel, duìng phæång phaïp chiãúu tia cæûc têm trãn bãö màût taûi mäùi vë trê åí âéa váûn haình hoàûc di chuyãøn nheû baín gel trãn bãö màût seî quan saït âæåüc täúi âa (Âéa váûn haình coï 95 % aïnh saïng tràõng våïi bæåïc soïng 254 nm vaì 40 % aïnh saïng tràõng våïi bæåïc soïng 254 nm). Quan saït máùu bàòng tia cæûc têm åí bæåïc soïng 366 nm hoàûc laìm giaím cæåìng âäü tia cæûc têm xuäúng 302 nm âãø giaím sæû phaït huyình quang cuía etydi bromua khäng liãn kãút, gel coï thãø bë máút maìu båíi sæû huït áøm cuía noï trong 5 phuït våïi MgCl2 0,01M hoàûc trong 1 giåì våïi MgSO4 0,001M. Sæû máút maìu âaî taûo âiãöu kiãûn dãù daìng âãø phaït hiãûn haìm læåüng ADN nhoí. 15.3.6. Nhæîng chuï yï cáön thiãút Nàõp an toaìn phaíi âæåüc làõp træåïc khi näúi nguäön âiãûn våïi nguäön cung cáúp nàng læåüng. 329
Tàõt táút caí caïc cäng tàõc âiãûn vaì ngàõt nguäön cung cáúp âiãûn træåïc khi thaïo nàõp an toaìn. Træåïc khi sæí duûng láön âáöu, laìm âáöy läù våïi 1 læåüng 600 ml 50/50 etylen glycol/ næåïc âãø ngàn chàûn sæû täøn tháút khäng thãø häöi phuûc cho thiãút bë. Läù chæïa læåüng trãn coï thãø âäø âáöy ngay caí khi khäng cáön laìm laûnh theo yãu cáöu. Khäng sæí duûng næåïc cáút, cháút chäúng âäng thæång maûi hoàûc báút kyì dung mäi hæîu cå naìo âãø âäø vaìo läù âoï. Næåïc âæåüc láúy ra khi âoïng bàng. Nãúu khäng noï bë huït vaìo bãn trong dung dëch vaì phaï våî liãn kãút. Dung mäi hæîu cå seî gáy ra sæû täøn tháút hoaï cháút khäng thãø häöi phuûc cho thiãút bë. Khäng laìm laûnh læåüng dung dëch cho vaìo läù âoï dæåïi −200C (−40F). Coï thãø laìm laûnh læåüng dung dëch âoï trong thuìng âaï, maïy laìm laûnh hoàûc trong tuí laûnh. Khäng âiãöu chènh nhiãût âäü dung dëch âãûm hoàûc gel trãn 500C. Ngàn chàûn sæû âun noïng quaï nhiãût bàòng caïch laìm laûnh læåüng dung dëch âoï træåïc khi sæí duûng. Âãø ngàn chàûn sæû âun noïng quaï nhiãût trong quaï trçnh keïo daìi chaûy âiãûn aïp cao, thay thãú læåüng dung dëch thæï nháút bàòng læåüng dung dëch thæï 2 âaî âæåüc laìm laûnh. Sæû âun noïng quaï nhiãût seî gáy ra sæû täøn tháút khäng thãø häöi phuûc cho thiãút bë Laìm saûch Sau mäùi láön sæí duûng, laìm saûch thiãút bë bàòng cháút táøy nheû vaì næåïc, suïc cáøn tháûn våïi næåïc cáút vaì laìm khä bàòng khäng khê. Khäng âæåüc âàût thiãút bë vaìo dung dëch hoàûc khê thåm hoàûc caïc hydrocacbon halogen hoaï, xeton, este, alcol (trãn 30%) hoàûc axit âàûc (trãn 25%). Âãø traïnh laìm báøn DNaza vaì ARNza, ngám caïc khoang chæïa âãûm hoàûc khuän âuïc khoaíng 10 phuït trong dung dëch H2O2 3%, sau âoï suïc cáøn tháûn våïi DEPC âæåüc xæí lyï räöi cho vaìo näöi háúp (duìng næåïc âaî âæåüc ion hoaï âãø háúp). Thay thãú miãúng boüt âãûm Thaïo nhæîng miãúng boüt âãûm moìn. Thaïo voí miãúng âãûm måïi. Sàõp âãûm cho thàóng vaì âãø noï vaìo vë trê cuäúi cuía khay doüc theo caûnh ngàõn (7 cm), màût sau cuía tæåìng vaì sau âoï eïp vaìo âuïng vë trê. Làûp laûi våïi miãúng âãûm thæï hai trãn tæåìng âäúi diãûn våïi miãúng âãûm thæï nháút. 15.3.7. Âiãöu chènh thiãút bë âiãûn di Bãø chàõn máùu. Âãø cho gel âàûc laûi täúi thiãøu laì 30 phuït vaì giæî åí nhiãût âäü phoìng træåïc khi thaïo læåüc. Khi thaïo læåüc giæî åí caûnh ngàõn vaì náng nheû âãø traïnh gáùy gel. Giæî âãø khäng hoíng bãø chæïa, duìng pipet âãø láúy máùu, cäú gàõng cho vaìo giæîa bãø vaì khäng laìm thuíng âaïy bãø. 330
Máùu thæí khäng chaûy doüc theo cäüt Nãúu chaíy thaình såüi trãn khay bë hoíng thç phaíi thay thãú. Giaím âiãûn aïp. Choün cháút âãûm våïi näöng âäü vaì haìm læåüng dung dëch âãûm thêch håüp (læåüng dung dëch âãûm TBE chæïa nhiãöu hån loaûi TAE). Nãúu cháút âãûm bë thaïo ra hãút thç ngæng hoaût âäüng, thaïo nàõp, duìng äúng huït láúy cháút âãûm tæì läù khaïc cho vaìo bãn trong läù âäúi diãûn âãún khi âáöy cháút âãûm. Nãúu cháút gel khäng âäöng nháút, âàût khuän âuïc nàòm ngang træåïc khi âäø däön gel (âãø laìm hoaì láùn vaìo nhau). Càûp khuän âuïc Læåüc phaíi âàût thàóng âæïng âãø traïnh laìm biãún daûng bãø chæïa. Giaím låïp âãûm 1 mm tæì bãö màût åí phêa trãn gel, giaím gradien nhiãût âäü. Taïi taûo gel khäng âuí cháút læåüng Thãm ficoll, glyxerol hay âæåìng (mêa) vaìo nhiãöu dung dëch láúy máùu âãø baío âaím máùu làõng xuäúng âaïy bãø (choün cháút ficoll) Chàõc chàõn máùu thæí âæåüc hoaì tan hoaìn toaìn. Giaím âiãûn thãú. Giaím näöng âäü máùu thæí. Giaím thãø têch máùu. Cáön êt nháút 1 mm gel dæåïi âaïy læåüc âãø traïnh máùu rè ra tæì âaïy bãø. Giaím näöng âäü muäúi trong máùu thæí. Kiãøm tra âäü enzim, máùu thæí coï thãø cáön taïc âäüng láu (xuïc taïc xaíy ra quaï trçnh) vaì mäüt loaûi cháút âãûm khaïc haûn chãú sæû di chuyãøn. Pha chãú máùu måïi nãúu nghi ngåì máùu bë nhiãùm báøn. Choün loaûi agaroza våïi täúc âäü tháøm tháúu cháûm. Âàût khay âuïng vë trê, khäng áún maûnh vaìo bãn trong.
331
