Biologia Celular - Clase 03

Nucleótidos Las unidades de los ácidos nucleicos Base nitrogenada

Fosfato 5’

1’

Azúcar

Azúcares

Pentosa

un azúcar de 5 carbonos

Cada uno de los carbonos numerados del azúcar de un nucleótido se indica con una comilla tras el número; así, se habla del “carbono 5-prima”, etc.

La β-D-ribosa forma parte del ácido ribonucleico

La β-Ddesoxirribosa forma parte del ácido desoxirribonucleico

Bases Son compuestos que contienen anillos nitrogenados, tanto pirimidinas como purinas

uracilo adenina citosina

Pirimidina

Purina guanina

timina

Fosfatos

Se unen al hidroxilo del carbono 5’ de la ribosa o desoxirribosa. Existen los nucleótidos mono-, di- y trifosfato.

El fosfato hace que el nucleótido quede cargado negativamente

Nomenclatura

azúcar

azúcar

Base + azúcar = NucleóSido

Base + azúcar + fosfato = NucleóTido

Base

Nucleósido

Abreviatura

Adenina

adenosina

A

Guanina

guanosina

G

Citosina

citidina

C

Timina

timidina

T

uracilo

uridina

U

Los nucleótidos se abrevian con 3 letras mayúsculas, por ejemplo: AMP = adenosin monofosfato dAMP = desoxiadenosin monofosfato UDP = uridin difosfato ATP = adenosin trifosfato

Formación de la Cadena de Ácido Nucleico

Extremo 5’-PO4

Extremo 3’-OH

Formas alternativas de representar una cadena de ácidos nucleicos

El Ácido Desoxirribonucleico (ADN o DNA) Existe en la Célula como una Doble Hebra ANTIPARALELA

El Ácido Desoxirribonucleico (ADN o DNA) es una Doble Hélice

10 pares de bases por cada vuelta de hélice

Calor

Nativo

Renaturación

Denaturado, hebra simple

Renaturado

DENATURACIÓN Y RENATURACIÓN DE MOLÉCULAS DE DNA DE DOBLE HEBRA

Estructura del Ácido Ribonucleico (ARN o RNA) Bases nitrogenadas del RNA

Guanina

Citosina

Uracilo

Reemplaza timidina

Adenina

Estructura del RNA Apareamiento de adenina con uracilo

Estructura del RNA Cadena de RNA base

ribosa

Extremo 5’5’-P

Unión 3’

Unión 5’

enlace fosfodiester Extremo 3’3’-OH

Estructura del RNA Estructura secundaria del RNA

El RNA puede formar pares de bases intramoleculares; es un ácido nucleico de hebra simple, pero contiene regiones de apareamiento de bases que pueden resultar de una complementariedad azarosa.

Diferencias Entre RNA y DNA • El esqueleto de azúcar y fosfato del RNA contiene ribosa en lugar de desoxirribosa • El RNA contiene la base Uracilo (U) en lugar de Timina (T) • El DNA existe como una doble hélice, mientras que el RNA existe como una molécula de hebra simple con algunas regiones de apareamiento

Identificación y localización de Componentes Biológicos.

1.- Cultivo celular 2.- Microscopia 3.- Fraccionamiento subcelular

CULTIVO CELULAR

Terminologia Clon • Una población derivada de una única célula Sub-cultivo • Traslado de células de un frasco a otro Linea celular establecida • Un cultivo primario que se ha vuelto inmortal debido a algunas transformaciones • Comunmente derivadas de un tumor o transformada con un virus tal como Epstein-Barr • Una de las clásicas es las células Chinese Hamster Ovary (CHO) • Las células SH-SY-5Y derivadas de un neuroblastoma Número de pasaje • Numero de sucesivos sub-cultivos desde el cultivo primario

Terminologia Cultivo de organo (organotipico) • Un cultivo tridimensional de tejido no disgregado que retiene algo de las características del tejido in vivo Cultivo celular Células individuales, no organizadas en tejidos. Derivadas desde células disgregadas del tejido original Cultivo primario de células • Derivado desde un explante, directamente desde el animal • Usualmente sólo sobreviven por un periodo corto de tiempo • Involucra disgregación enzimática y/o mecanica del tejido de interes y pasos de selección para aislar las células a estudiar

Biopsia de cuello de útero

Cervix

raft

Ventajas y desventajas del cultivo celular

Control de las variables físico-químicas: Temperatura, pH, osmosis, presión de O2 y CO2. Estrictas condiciones asépticas, se debe además agregar a los medios de cultivo suplementos como suero, plasma, fluidos intersticiales para dar a las células un medio semejante al in vivo. Problemas de inestabilidad genética, dificultad de relacionar lo que sucede in vitro con in vivo.

Enemigos del cultivo celular Micro-organismos crecen ~10-50 veces más rápido que las células de mamíferos, a las cuales les toma ~8-16 horas para dividirse. Las bacterias son más tolerantes a las variaciones de temperatura, pH y nutrientes que las células. Celulas son más vulnerables a la contaminación cuando la asespsia es mala Esto puede conllevar al desarrollo de micro-organismos resistentes a antibioticos.

MICROSCOPIA

Se define como microscopio cualquiera de los distintos tipos de instrumentos que se utilizan para obtener una imagen aumentada de objetos minúsculos o detalles muy pequeños de los mismos. El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto.

El microscopio compuesto de Hooke

Óptica de un microscopio de luz transmitida

HL60 AntiS

HeLa AntiS

HepG2 AntiS

HL60 Sense

HeLa Sense

HepG2 Sense

MEB

MET

El microscopio electrónico de barrido (MEB) es similar al microscopio electrónico de transmisión (MET). Ambos tienen ciertas características comunes tales como un cañón de electrones donde se genera el haz de electrones, lentes condensadoras y objetivo, sistema de vacío. La diferencia principal entre ellos es la manera en que forman y magnifican la imagen. Esto hace que la información que se obtenga de cada uno sea distinta. Mientras el MET permite el estudio de la ultraestructura de muestras delgadas, el MEB posibilita conocer la morfología superficial.

Microscopio de fluorescencia

En la microscopia de fluorescencia los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos

RNAmtnc

RNAmtnc

PCNA

Ki67

Merge

Merge

Microscopio Confocal

Un microscopio confocal es un microscopio capaz de obtener imágenes tridimensionales de la célula. Se basa en un principio similar al de un microscopio de fluorescencia, pero se utilizan dos diafragmas confocales (uno antes de la muestra y otro después) capaces de enfocar la iluminación en un único punto de la muestra. Se utiliza un láser como fuente luminosa, y con él se va barriendo la muestra por todo su volumen, plano a plano, creando muchas imágenes bidimensionales que un ordenador interpreta, generando finalmente una imagen tridimensional del objeto.

Superposición de imágenes

Galería de imágenes

Imagen 3D

Colocalización

FRACCIONAMIENTO CELULAR

Es en donde la solución de una muestra contiene partículas para ser separadas en capas o zonas (zonal) en una columna de gradiente de densidad elaborado. Las moléculas y organelos son separados de acuerdo a su masa y forma.

Diagrama de la Técnica de Centrifugación Zonal

Comparación de los métodos de centrifugación mas usados

Identificación y localización de Componentes Biológicos.

¿ donde están ?