Biologia Celular - Clase 12

REPLICACIÓN DEL DNA

Generación de una copia exacta del genoma de una célula

Dogma Central de la Biología Molecular

Replicación

DNA

Transcripción Transcripción Reversa (Virus)

RNA

Traducción

Proteína

El DNA Actúa como Molde para su propia Síntesis

El nucleótido A sólo se apareará con éxito con T y G con C, por lo que cada cadena de DNA puede especificar la secuencia de nucleótidos de su cadena complementaria. Así, la doble hélice de DNA se puede copiar fielmente.

Modelos para la replicación del DNA

1) Modelo semi conservativo: Moleculas de DNA hijas contienen una hebra paterna y una nueva 2)Modelo conservativo: las hebras paternas transfieren información a un intermediario, el cual luego es copiado. La helice paterna se conserva y la hija es completamente nueva 3) Modelo Dispersivo: la helice paterna se rompe en fragmentos, se dispersa, copia y se ensambla en dos nuevas helices. El DNA nuevo y paterno estan completamente dispersos

MODELOS DE REPLICACION DE DNA (a) Hipotesis 1:

(b) Hipotesis 2:

(c) Hipotesis 3:

Semi-conservative replication

Conservative replication

Dispersive replication

Intermediate molecule

Meselson and Stahl Semi-conservative replication of DNA

Isotopes of nitrogen (non-radioactive) were used in this experiment

La Replicación del DNA es Semiconservativa Doble hélice parental

En cada ronda de replicación, cada una de las dos hebras es usada como templado (molde) para la formación de una hebra de DNA complementaria. Por lo tanto las hebras originales de DNA permanecen intactas durantes muchas duplicaciones celulares.

Dobles hélices de DNA hijas

No todas las polimerasas tienen igual función Pol

Polimerisa (5’-3’)

Exonucleasa (3’-5’)

Exonucleasa (5’-3’)

Nº Copias

I

Si

Si

Si

400

II

Si

Si

No

?

III

Si

Si

No

10-20

• Actividad exonucleasa 3’ to 5’ involucra la capacidad de remover nucleotidos desde el extremo 3’ terminal. •Importante para la capacidad de proofreading (corrección) • Sin Proofreading la proporción de error (mutation rate) es 1 x 10-6 • Con proofreading la proporción de error es 1 x 10-9 (1000 veces menos) • Actividad exonucleasa 5’ to 3’ en Replicación y Reparación del DNA.

Origen de replicación (procarionte): 9

Comienza con la denaturación de la doble helice (hebras simples).

9

Exposición de la burbuja de replicación desde la cual comienza la replicación en ambas direcciones. Primera cadena de DNA copiada

Origen de Replicación DNA Primer RNA

Progresión de orquilla ~245 de replicación moviendose en direcciones opuestas

Orquilla de replicación

Orquilla de replicación

bp in E. coli

PRINCIPALES ELEMENTOS INVOLUCRADOS EN LA INICIACIÓN: 9

Segmentos de ssDNA se denominan hebras templadas.

9

Girasa (una topoisomerasa) relaja el DNA sobrenrollado.

9Proteinas Iniciadoras y la DNA helicasa se unen al DNA en la orquilla de replicación y desenrollan el DNA (Hidrolisis de ATP causa cambios conformacionales en la DNA helicasa) 9DNA primasa se une a la helicasa produciendo un complejo denominado primosoma

9Primasa sintetiza un primer RNA pequeño de 10-12 nt, al cual la DNA pol III adiciona nucleotidos. 9Pol III adiciona nucleotidos 5’ to 3’ sobre ambas hebras. 9El primer RNA es removido y reemplazado por DNA por acción de la DNA pol I. El Gap es sellado por la DNA ligasa. 9Single-stranded DNAbinding (SSB) proteins (>200) estabilizan el DNA templado monohebra durante todo el proceso de replicación.

DNA Sobrenrollado es relajado por la Girasa:

5’

SSB Proteins Fragmentos de Okazaki ATP 1

DNA Pol III

2 3

Hebra Tardia

Helicasa + Proteinas Iniciadoras

3’ primasa DNA Pol III

5’

RNA Primer 3’

→

Pares de bases

5’ Primer de RNA reemplazado por la DNA pol I y el gap es sellado por la DNA ligasa

3’

Hebra lider

Reacción Catalizada por la DNA Polimerasa 5’ TRIFOSFATO

hebra de partidor (RNA)

dNTP entrante

hebra templado Pirofosfato

Crecimiento de la cadena en sentido 5’ Æ 3’

La DNA polimerasa requiere de un partidor de RNA. La enzima adiciona desoxirribonucleótidos al extremo 3’-OH de la hebra del partidor, la que está apareada a la hebra molde o templado. Por lo tanto, la nueva hebra crece en la dirección 5’ Æ 3’. Como cada desoxirribonucleósido trifosfato entrante debe aparearse con la hebra templado para poder ser reconocido por la polimerasa, esta hebra determina cuál de los cuatro posibles desoxirribonucleótidos (A, C, G, o T) serán adicionados.

LA REPLICACIÓN DEL DNA ES CONTINUA EN LA HEBRA LIDER Y SEMICONTINUA EN LA HEBRA TARDIA: El desenrollamiento de cada orquilla de replicación procede en una sola direción. Las dos hebras de DNA tienen polaridad opuesta y la DNA pol solo sintetiza DNA en dirrección 5’ a 3’. Solucion: DNA es copiado en dirección opuesta desde cada templado. •Leading strand (lider) sintesis 5’ a movimiento de la orquilla de replicación.

3’

en

dirección

del

continuo requiere un solo primer (RNA). •Lagging strand (tardia)

sintesis 5’ a 3’ en dirección opuesta.

semidiscontinuo requiere muchos primer RNA

MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL DNA ) Procariontes tienen un solo origen de replicación ) Replicación bidireccional con dos orquillas

Ambas hebras templadas son copiadas (orquilla de Replicación)

Hebra lider

Hebra tardía

Proteínas que Actúan en la Horquilla de Replicación hebra líder

DNA polimerasa III sobre hebra líder

Topoisomerasa templado de la hebra líder

templado de la hebra retrasada

helicasa primasa partidor RNA

DNA parental proteínas de unión a DNA de hebra simple

fragmento de Okazaki DNA polimerasa III sobre hebra retrasada

Se muestran dos moléculas de DNA polimerasa, una sobre la hebra líder y otra sobre la retrasada. La DNA helicasa va desenrollando y separando la doble hélice del DNA paterno delante de la DNA polimerasa. Las proteínas de unión a DNA de hebra simple mantienen las hebras separadas, permitiendo el acceso a la primasa y la polimerasa.

MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL DNA ) sintesis del primer ) Helicasa rompe los puentes de hidrogeno

DNA primasa sintetiza un primer RNA para iniciar la sintesis de DNA sobre la hebra tardia

MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL DNA ) Topoisomerasa desenrolla el DNA

REPRESENTACION DE LA DNA POL III Structure resembles a human right hand Template DNA thread through the palm; Thumb and fingers wrapped around the DNA

DNA Pol contiene una subunidad con actividad Proofreading

MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL DNA ) DNA pol cataliza la replicacion 5' x 3' ) Extiende pero no puede iniciar la replicación

MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL DNA

) DNA pol III sintetiza la mayor parte del DNA ) DNA pol I (rellena) los gaps de la hebra tardía ) DNA ligasa sella los gaps

MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL DNA ) Hebra tardía a) varios primer RNA b) la elongación del DNA genera los fragmentos de Okazaki c) primer RNA es removido por la DNA pol I d) ligación del DNA

DNA ligasa sella los nicks de la hebra tardía

MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL DNA ) Origen de replicación E. coli ) Secuencias consensos repetidas (tandem) ) Sitios de unión de proteinas

Origen de Replicación en Procariontes

iniciador

partidor de RNA helicasa

proteínas de unión a DNA de simple hebra

síntesis partidores RNA

unión proteína iniciadora

desenrollamiento del DNA por helicasa y proteínas de unión a DNA de simple hebra

formación de dos horquillas de replicación

MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL DNA Replicacion de DNA circular de E. coli (3.10): 1.

Dos orquillas que resultan en forma de estructura θ.

2.

La topoisomerasa permiten disminuir la tensión y permiten la separación del DNA

MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL DNA

Modelo de circulo rotatorio: 1.

Comienza con un nick en el Origen de Replicacion.

2.

El extremo 5’ de la molecula es desplazado

3.

Actua como templado para la síntesis del primer

MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL DNA Enzimas de Eucarionte: Existen cinco DNA polimerasas en mamíferos. 1.

Pol α (alpha): nuclear, DNA replication, no proofreading

2.

Pol β (beta): nuclear, DNA repair, no proofreading

3.

Pol γ (gamma): mitochondria, DNA replication, proofreading

4.

Pol δ (delta): nuclear, DNA replication, proofreading

5.

Pol ε (epsilon): nuclear, DNA repair (?), proofreading

1.

Si consideramos a cada cromosoma como una doble hebra lineal de DNA

2.

Cada cromosomas tiene ~108 pares de bases de largo

3.

Con replicación a razón de 2 kb/minuto, la replicación de un cromosoma humano tardaría ~35 dias.

4.

Solucion ---> la replicación del DNA se inicia desde diferentes sitios simultaneamente.

dsDNA parental

DnaB Helicasa

DNA primasa

core

SSBP

Hebra líder

primer

core

Hebra tardía

Distribución de los componentes proteicos en la orquilla de replicación

Actividad Correctora de Pruebas de la DNA Polimerasa Durante la Replicación del DNA (“Proofreading”)

Vista de la Orquilla de Replicación en “Tres Dimensiones”

• La DNA pol solo puede sintetizar DNA en dirección 5’ a 3’ y no puede iniciar la síntesis del DNA • Problemas para el extremo 3’ de los cromosomas

Problema en el extremo de los cromosomas eucariontes

• Si el problema no es solucionado los cromosomas se acortarían excesivamente con cada replicación. • La solución es agregar secuencias de DNA a los extremos de los cromosoma: telomeros – Pequeñas secuencias repetidas (100-1000’s) • La Reacción es catalizada por la telomerasa • Telomerasa contiene proteina y RNA – El RNA funciona como templado complementario a la secuencia de DNA presente en el repetido del telómero

Reparación del DNA Para corregir errores en la secuencia o MUTACIONES

MUTACIÓN = cambio heredable en el material genético de una célula. 2 Tipos Generales: - Mutaciones Cromosómicas (deleción o repetición de un trozo de cromosoma) - Mutaciones Puntuales

- Inserciones o Deleciones (cambio de marco de lectura) - Sustituciones - Formación de Dímeros de Pirimidina

Desapareamientos en el DNA y su reparación

Mecanismo de reparación de los desapareamientos del DNA en células eucariotas

Despurinación y desaminación

Las modificaciones químicas de los nucleotidos producen mutaciones

Alteraciones en el DNA causadas por la radiación UV

REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE BASES

REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDOS Dímero de pirimidinas

C desaminada

pares de bases

URACILO DNA GLICOSILASA

pares de bases

NUCLEASA

Hélice de DNA con una base menos ENDONUCLEASA Y FOSFODIESTERASA REMUEVEN EL AZÚCAR-FOSFATO

DNA HELICASA

Hélice de DNA con un espacio de 12 nucleótidos

Hélice de DNA con un nucleótido menos DNA POLIMERASA ADICIONA NUEVOS NUCLEÓTIDOS, DNA LIGASA SELLA EL ESPACIO

DNA POLIMERASA + DNA LIGASA

FIN