Biokat In Sek Metab _ Osnove Fb 2009_berlec

Biokataliza in pridobivanje sekundarnih metabolitov Aleš Berlec

Biokataliza

Definicija Biokataliza uporablja naravne katalizatorje, kot so encimi, za izvedbo kemijskih pretvorb na organskih spojinah. V ta namen se uporabljajo encimi, ki so delno ali popolno izolirani, ali pa se nahajajo v živih celicah. Nobelova nagrada za kemijo, 2001:

William S. Knowles St Louis, Missouri, USA, and Ryoji Noyori Nagoya University, Chikusa, Nagoya, Japan, "for their work on chirally catalysed hydrogenation reactions" and the other half to K. Barry Sharpless the Scripps Research Institute, La Jolla, California, USA, "for his work on chirally catalysed oxidation reactions".

Prednosti • Encimska selektivnost: – Kemijska selektivnost – Regioslektivnost – Enantioselektivnost (rutinsko > 99%)

• Encimska aktivnost v “milih” pogojih (pH, temperatura, vodni medij) – vidik okoljevarstva in “zelene” kemije. • Možnost katalize številnih reakcij. • Možnost kombiniranja s kemijsko katalizo. • Metabolni inženiring – uporaba reakcijske mreže.

Slabosti • Nezadostna stabilnost biokatalizatorjev v izbranem mediju. • Omejeno število biokatalizatorjev za želeno reakcijo. • Dolgi razvojni cikli za biokatalizni proces.

Interdisciplinarnost • • • • • • • • •

Mikrobiologija Molekularna biologija Encimologija Biokemija Organska kemija Procesna kemija Kinetika. Inženirstvo reakcij Na rtovanje reaktorjev

Reakcije • Primeri: – – – – – – –

oksidacije, redukcije, hidrolize, hidroksilacije, metilacije, tvorba C-C vezi, izomerizacije.

Uporabljeni encimi Tip encima

Tip reakcije

lipaze

Hidroliza estrov na lipidnih substratih

esteraze

Hidroliza estrov, tvorba estrov

proteaze

Cepitev peptidne vezi

nitrilaze

Hidroliza nitrilov (CN

epoksid hidrolaze

Hidroliza epoksidov

glikozidaze

Hidroliza glikozidne vezi

dehidrogenaze

Redukcija aldehidov, ketonov, dvojnih vezi

enolat reduktaze

Redukcija a, b-nenasi enih estrov

monooksigenaze

Hidroksilacija, epoksidacija

dioksigenaze

Oksidativna cepitev kateholov

peroksidaze

Peroksidacija, epoksidacija

aldolaze

Aldolna reakcija, cepitev aldola (RC(OH)CH2C(O)R)

transketolaze

Prenos keto skupine

hidroksinitril liaze

Tvorba cianohidrina R1R2CO + HCN R1R2C(OH)(NH2)

glikozil transferaze

Tvorba glikozidne vezi, sinteza oligosaharidov

COOH + NH3)

Encimski reaktorji

Konfiguracije encimskih reaktorjev

a) b) c) d) e) f)

Šaržni (batch) reaktor: najenostavnejši, najcenejši, kadar ni potrebe po recikliranju biokatalizatorja. Šaržni reaktor z ultrafiltracijo: recikliranje biokatalizatorja z ultrafiltracijo, omogo a ve ponovitev šarž. Reaktor s fiksnimi delci (fixed-bed): imobilizacija biokatalizatorja na sferi ne delce. Reaktor s fluidnimi delci (fluid bed): pove an pretok teko e faze, kar zmanjša lokalne gradiente v pH-ju in temperaturi. Membranski reaktor z enosmerno flitracijo: membrana prepre uje prehod biokatalizatorja, omogo a pa prehod substrata in produkta. Reciklirni reaktor ali reaktor z zanko: prehod teko e faze preko fiksnih delcev ali preko tangencialnega membranskega filtra.

Na ini zadrževanja biokatalizatorja

Viri biokatalizatorjev • Mikroorganizmi; živali in rastline le 10%. • Viri mikroorganizmov: naklju no iskanje, zbirke kultur (npr. ATCC). • Ekstremofili: – Temperatura – Koncentracija soli – pH – pritisk

Izboljšave biokatalizatorjev • Mikroorganizmi: – – – – –

Izboljšave sevov (spontane in inducirane mutacije). In vivo selekcijski pritisk. Vpliv na metabolne poti in metabolno neravnovesje. Pomen genomike. Visoko-zmogljivostno rešetanje (“high-throughput screening”) – uporaba robotov in ploš s 96 ali 384 reakcijskimi prostori.

• Encimi: – Proteinski inženiring. – Uporaba rekombinantne DNA tehnologije – ciljana evolucija.

Proteinski inženiring • • • • • •

Na rtna racionalna zamenjava posameznih aminokislin v encimu. Poznavanje nukleotidnega / aminokislinskega zaporedja. Poznavanje 3D strukture. Poznavanje mehanizma delovanja. Izbira potencialnih AK za zamenjavo. To kovna mutageneza na nivoju DNA. Pridobivanje in testiranje rekombinantnega proteina.

Usmerjena evolucija

Mutageneza (“error prone PCR”, premeš anje DNA)

Uporaba nekonvencionalnih topil • Encimi so aktivni tudi v nevodnih medijih. • Aktivnost je lahko celo boljša v hidrofobnih topilih kot v hidrofilnih. • Prednosti: – – – – –

Ve ja topnost reaktantov. Premik reakcijskega ravnotežja. Enostavnejše lo evanje organskih topil. Boljša stabilnost encimov. Spremenjena selektivnost (substratna, enantio-, kemo-, regio-)

Uporaba biokatalize v farmaciji

EFEDRIN

• • • •

Efedrin

PSEVDOEFEDRIN

Efedrin je alkaloid, ki ga skupaj z njegovim opti nim izomerom, psevdoefedrinom najdemo v rastlinah iz rodu Ephedra. Deluje simpatikomimeti no. Za razliko od psevdoefedrina mo neje deluje na CŽS. Uporablja se kot stimulant, zmanjšuje apetit, izboljšuje koncentracijo in deluje kot dekongestiv. Strukturno je soroden sinteti nima derivtoma amfetaminu in metamfetaminu. Uporaba piruvat dekarboksilaze (Saccharomyces cerevisiae) pri sintezi iz benzaldehida in piruvata.

Antihiperholesterolemiki – inhibitorji HMG-CoA reduktaze (3R, 5S)dihidroksiheksanoat

LOVASTATIN

PRAVASTATIN

V celoti produkta fermentacije.

Alkoholna dehidrogenaza iz Lactobacillus brevis

FLUVSTATIN

ATORVASTATIN

Sinteza klju nega intermediata

Izboljšana sintezna pot z nitrilazo.

Dorzolamid • Inhibitor karbonske anhidraze – uporaba proti glavkomu. • Stereospecifi na redukcija intermediata s kvasovkami Rhodotorula rubra MY2169.

Sekundarni metaboliti pridobivanje in pomen v farmaciji

Delitev metabolitov • Primarni: nujni za celi no rast, skupni številnim živim organizmom, nastajajo med normalno rastjo (aminokisline, proteini, ogljikovi hidrati, vitamini, polisaharidi, etanol...)

Delitev metabolitov • Sekundarni: pogrešljivi, niso vklju eni v celi ni metabolizem, omejeni na ozko skupino živih organizmov, nastajajo pod stresnimi pogoji npr. ob pomanjkanju hranil (antibiotiki, pigmenti, toksini, ekološki efektorji, feromoni, encimski inhibitorji, pesticidi, protitumorske u inkovine).

• Neustreznost izraza, umetna delitev: združevanje velikega števila kemijsko heterogenih spojin, meja med skupina ni lahko dolo iti, nakazuje manjši pomen.

Izvor • Rastline farmakognozija • Bakterije • Glive

Pomen v farmaciji • Antibiotiki • Steroli • Vitamini

Biosinteza antibiotikov

Protibakterijske u inkovine • Naravne – ve ina iz G+, filamentoznih bakterij iz rodu Streptomyces. • Polsintezne – sintezno pridobljeni derivati naravnih spojin • Sintezne – v celoti pridobljene z organsko sintezo.

Protibakterijske u inkovine

Glavni razredi antibiotikov •

• • • • • •

-laktamski antibiotiki – Penicilini – Cefalosporini Tetraciklini Makrolidni antibiotiki Aminoglikozidni antibiotiki Glikopeptidi Kinoloni Ostali

Prodaja antibiotikov v letu 1995, tipi ne u inkovine in uporaba:

Prodaja antibiotikov v letu 2006:

Mehanizem delovanja • • •

Bakteriostati no – mo no zavira rast bakterij. Baktericidno – ubije bakterije. Bakterijske tar e antibiotikov: – – – – –

•

Sinteza celi ne stene. Biosinteza proteinov. Podvojevanje in popravljanje DNA. Biosinteza folata. Ostalo (npr. tvorba por)

Selektivna toksi nost – uporabi se razlika med bakterijsko in sesalsko celico – zato ni toksi nosti za loveka.

SCAN3

Sinteza celi ne stene

Biosinteza proteinov

Podvojevanje in popravljanje DNA

Biosinteza folata in ostali mehanizmi

Tipi biosinteze antibiotikov • Poliketidna biosinteza. • Biosinteza neribosomskih peptidnih antibiotikov. • Biosinteza ostalih tipov.

Poliketidna biosinteza • Tetraciklini in makrolidni antibiotiki. • Encimi poliketidne sintaze: – Tip I: razli ne domene tvorijo velik, multidomenski kompleks (enoten protein) – eritromicin. – Tip II: domene (posamezni proteini) so povezane ohlapneje oz. se prehodno povezujejo pri posameznih katalitskih korakih – tetraciklin.

• Geni za encime se nahajajo v obliki klastrov pri evkariontih oz. operonov pri bakterijah. • Pretvorba kratkoverižnih acil-S-CoA tioestrov v dolgoverižne produkte v zaporedju ponavljajo ih korakov. • “Encimski teko i trak”

Kataliti ne domene • • • • • •

ACP – acil-nosilni protein AT – aciltransferazna domena KS – ketosintazna domena KR – ketoreduktazna domena DH – dehidratazna domena ER – enoilreduktazna domena

Biosinteza doksorubicina

Biosinteza 6-deoksieritronolida B (aglikona eritromicina)

Pretvorba 6-deoksieritronolida B v eritromicin B

Neribosomski peptidni antibiotiki -laktamski antibiotiki (penicilini (1), cefalosporini (2)) • Tirocidin in gramicidin S • Bacitracin • Vankomicin (po naknadni modifikaciji) •

( -laktamski obro rde e)

Biosinteza neribosomskih peptidnih antibiotikov • Neribosomske peptidne sintetaze – analogne poliketidnim sintazam tipa I • Multidomenski encimi, organizirani v module, ki tvorijo eno ali ve proteinskih podenot. • Primer: ciklosporin sintetaza: 1.5 MDa, 43 domen, 11 modulov (za vsako AK eden) • Tipi kataliti nih domen: PCP: peptidil-nosilni protein A: adenilacijska domena – izbor in aktivacija AK C: kondenzacijska domena – tvorba peptidne vezi TE: tioesterazna domena – zaklju itev verige (molekule) z deacilacijo – E: epimerizacijska domena – epimerizacija AK – – – –

Uvedba neproteinogenih aminokislin • Posledica široke specifi nosti adenilacijske domene. • Preko 100 razli nih aminokislin, med njimi tudi -, -, in -AK.

Biosinteza penicilinov in cefalosporinov • Tripeptidni prekurzor ACV (L-aminoadipil-L-cisteinil-D-valin) • Izopenicilin N sintaza (Fe2+ encim brez hema) • Tvorba izopenicilina N in deacetoksicefalosporina C

Pridobivanje polsinteznih derivatov penicilinov in cefalosporinov •

Intermediata, pridobljena iz produktov mikrobne fermentacije: – 6-aminopenicilanska kislina (6-APA) – 7-aminodeacetilcefalosporanska kislina (7-DACA)

• Encim penicilin amidaza

Pridobivanje polsinteznih derivatov penicilinov in cefalosporinov • Pridobivanje ampicilina, amoksicilina, cefaklora in ostalih derivatov iz intermediatov. • Encim penicilin acilaza.

Biosinteze ostalih tipov • Aminoglikozidni antibiotiki (streptomicin, kanamicin, gentamicin A) • Produkti sekundarnega metabolizma ogljikovih hidratov, pogosti pri aktinomicetah.

• Bakteriocini – peptidni antibiotiki – Lantibiotiki – postranslacijsko modificirani antibakterijski peptidi: • tvorba por v celi ni steni • ribosomsko sintetizirani • Lantionin: neproteinogena AK • Nisin: prehranski konzervans

Prekurzor nisina

Nisin

Biosinteza steroidov

Steroidi •

•

•

Steroidi so strukturno derivati ciklopentanoperhidrofenantrena (sterana). Delovanje: – – – – – – –

Protivnetno Imunosupresivno Progestacijsko Diureti no Anaboli no Kontraceptivno Zdravljenje raka prostate in raka na prsih – …

Mehanizem: vezava na znotrajceli ne receptorje, ki delujejo kot transkripcijski faktorji in regulirajo izražanje genov.

Steroidi • 1950: Odkritje 11 -hidroksilacijskega delovanja pri vrsti Rhizopus. • Danes: – Hidroksilacije (uvedba OH)

– 1-dehidrogenacije (tvorba dvojne vezi 4,5 na obro u A) – Cepitve na stranski verigi

• Kombiniranje kemijskega in biokataliznega pristopa. • Slaba topnost steroidov – uporaba nekonvencionalnih reakcijskih medijev pri biokatalizi – organska topila, površinsko-aktivne snovi, dodatki.

Steroidi • Izhodne spojine: – Fitosteroli (stigmasterol, -sitosterol, kampestrol) – Sapogenini (diosgenin, hekogenin, solasodin) – Holesterol iz živalskih maš ob.

Steroidi Splošna shema pretvorb: ------- kemijska pretvorba –––– biokataliza

6 -metil-prednizolon

Vitamini

Uvod • Vitamini so organske spojine, ki jih organizem sam ne more tvoriti in jih mora zato pridobiti iz okolja s prehrano. • Vitamini imajo razli ne biološke funkcije: – Hormoni (vitamin D) – Antioksidanti (vitamin E) – Prekurzorji za kofaktorje encimov – koencimi (vitamini B kompleksa).

Delitev • Vitamine delimo na vodotopne in topne v maš obah: – Vodotopni: • • • • • • • • •

Vitamin B1 (tiamin) Vitamin B2 (riboflavin) Vitamin B3 (niacin, niacinamid) Vitamin B5 (pantotenska kislina) Vitamin B6 (piridoksin, piridoksamin, piridoksal) Vitamin B7 (biotin) Vitamin B9 (folna kislina, folinska kislina) Vitamin B12 (cianokobalamin, hidroksikobalamin, metilkobalamin) Vitamin C (askorbinska kislina)

– Topni v maš obah: • • • •

Vitamin A (retinoidi - retinol, karotenoidi) Vitamin D (ergokalciferol, holekalciferol) Vitamin E (tokoferoli, tokotrienoli) Vitamin K (filokinon, menakinon)

Vitamin C • • • •

•

Pomanjkanje povzro a skorbut. Deluje kot antioksidant in zmanjšuje oksidativni stres. Deluje kot elektron-donor za razli ne encime. Sodeluje pri hidroksilaciji kolagena, sintezi karnitina, pretvorbi dopamina v noradrenalin, vpliva na stabilnost peptidnih hormonov in metabolizem tirozina. Sinteza askorbinske kisline je bila predstavljena l. 1934 in je vklju evala fermentacijsko stopnjo za pretvorbo D-sorbitola v Lsorbozo (“Reichsteinov proces”). Ta še danes predstavlja osnovo za industrijsko proizvodnjo (80 000 ton/leto).

askorbinska kislina

Biosinteza vitamina C

Vitamin B2 • Sestavina kofaktorjev FAD in FMN. • Pomemben pri številnih celi nih procesih, zlasti energetskem metabolizmu. FAD – flavin adenin dinukleotid – kofaktor številnih oksidoreduktaz.

riboflavin

FMN – flavin mononukleotid – kofaktor oksidoreduktaz, npr. NADH dehidrogenaze

Biosinteza riboflavina v bakteriji Bacillus subtilis in glivi Ashbya gossypii

Okrajšave:

Vitamin B12 • Pomanjkanje povzro a megaloblastno anemijo. • Kofaktor encimov metilmalonil koencim A mutaze (MUT) in 5metiltetrahidrofolate homocistein metiltransferaze (MTR), ki sodelujeta pri premestitvah na ogljikovem skeletu in prenosu metilne skupine.

Biosinteza vitamina B-12 • • • •

Omejena na mikroorganizme. Sodeluje ve kot 30 genov. Aerobna in anaerobna biosintezna pot. Sinteza tetrapirolnih derivatov iz C-5 skeleta glutamata ali iz C-4 skeleta sukcinil-CoA in glicina.