Biochimica Avanzata

Il 99 % del calcio è presente nello scheletro e nei denti sottoforma di cristalli di idrossiapatite, cioè come calcio inorganico. È una riserva fondamentale ed è soggetta a fenomeni di rimodellamento. Il tessuto osseo, a differenza di quanto si pensi, è un tessuto altamente dinamico. Il calcio ha moltissime funzioni tra cui quella di neurotrasmetttore, contrattore muscolare, secondo messaggero intracellulare, necessario per molti enzimi, coinvolto nella cascata coagulativa. Le variazioni massime tollerate a livello sierico sono dell 1%. La concentrazione è di 2,2-2,6 mmoli/L. Il livello sierico di calcio è regolato da ormoni ed esistono 3 forme di calcio sierico: calcio ionizzato, circa il 45%, che è la forma fisiologicamente atti a, calcio complessato a proteine, 50% (per la maggior parte albumina) e calcio legato ad altre sostanze, 5%. Piccole oscillazioni di pH variano i livelli di calcio: con un abbassamento del pH, si alza il livello di calcio ionizzato e diminuisce quello di calcio legato con un alzamento del pH, si abbassa il livello di calcio ionizzato e si alza il livello di calcio legato (per poterlo ricordare, pensa che il pH è legato al calcio legato: se aumenta uno, aumenta l’altro, e viceversa). Nell’adulto il bilancio del calcio è in equilibrio, nel senso che ne assume e ne elimina ogni giorno la stessa quantità, cioè di 1g/die. Nel bambino il bilancio del calcio è in positivo (è ovvio: nei bambini ci sono le ossa in accrescimento continuo) Nell’anziano il bilancio del calcio è negativo (infatti molti anziani soffrono di osteoporosi). Cibi molto ricchi in calcio sono il latte e tutti i suoi derivati, ortaggi, pesci e frutta secca. Il calcio è introdotto sottoforma di Sali e l’assorbimento avviene a livello dell’intestino tenue prossimale. Un adulto assorbe meno del 50% del calcio introdotto con la dieta. L’assorbimento aumenta con un pH leggermente acido e diminuisce con un pH leggermente basico. Contemporaneamente l’assunzione di grassi e di fisfati fanno diminuire l’assorbimento di calcio perché si formano dei Sali insolubili. Esistono due tipi diversi di assorbimento: la diffusione passiva e l’assorbimento attivo: questo è regolato da CaATPasi e da CaBP (calcium binding protein).la vitamina D regola la sintesi di CaBP e controlla l’attività delle pompe CaATPasiche. Il livello di calcio è controllabile a livello dell’assorbimento, dell’escrezione e tramite manipolazione del rimodellamento osseo. I livelli di calcio sono controllati grazie all’attività di diversi ormoni: PTH: ipercalcemizzante, vitamina D dipendente, sintetizzato nelle paratiroidi Vitamina D: ipercalcemizzante, sintetizzata nell’intestino Calcitonina: ipocalcemizzante sintetizzata nel rene Il fosforo rappresenta l’1 % del peso corporeo l’85% è nello scheletro e nei denti, il 15% nei tessuti molli e lo 0,5% è nel sangue. Il livello sierico è di 2,5mg/dl È presente sottoforma di ortofosfati. I livelli di fosfato possono, a differenza di quelli del calcio variare significativamente all’interno del corpo. Fa parte dei sistemi tampone, dell’osso, ed è costituente di molte macromolecole biologiche, come le fosfoproteine, intermedi metabolici e gli acidi nucleici. Viene assorbito anch’esso a livello dell’intestino tenue prossimale. L’assorbimento è favorito dalla vitamina D ed è influenzato dall’assorbimento del calcio. I reni filtrano seii rammi al giorno di sosfato e il 10 % viene perso. Rapporto di concentrazione tra calcio e

fosfato nel sangue è di 1/1. Se aumenta la concentrazione di fosfato, quella di calcio scende, perché i fosfati si complessano al calcio. ORMONI Il paratormone è un polipeptide di 84 aa, prodotto a partire da un precursore, il preproPTH di 115 aa. I primi 34 aa sono essenziali per l’attività biologica dell’ormone e il legame al recettore. il gene codificante per questo ormone è sul cromosoma 11. il PTH circola libero nel sangue e viene definito un ormone calciotropo, ipercalcemizzante. Il preproPTH ha un sequenza segnale idrofobica all’aminoterminale di 25 aa, il proPTH conserva un esapeptide basico a funzione sconosciuta, che viene poi rimosso. Il PTH finale è costituito da 84 aminoacidi, ma di questi solamente i primi 34 sono quelli biologicamente attivi.. una volta prodotto il PTH può essere degradato, conservato in accumuli oppure messo in circolo. La vitamina D, insieme alla calcitonina e all’ipercalcemia inibisce la trascrizione di PTH, mentre la trascrizione è favorita da ipocalcemia, avvertita tramite il Calcium Sensing Receptor, dalla ritenzione di fosfati, glucocorticoidi ed estrogeni. Il recettore del calcio, definito “sensore” è un recettore a sette tratti transmembrana. Lega il calcio ed inibisce la sintesi di PTH. È accoppiato a proteine di tipo G-alpha-i. Nonostante questi fini meccanismi di regolazione, un livello basale di PTH viene sempre sintetizzato e degradato. La quota di ormone degradato diminuisce se diminuisce il livello di calcio sierico. La formazione del residuo attivo di 34 aminoacidi avviene a livello epatico e nella maturazione si formano dei segmenti carbossiterminali privi di ogni attività biologica. Esistono tre tipi di recettori (rene ed osteoblasti) PTH1-R: associato ad adenilato ciclasi, determina l’apertura dei canali del calcio. PTH2-R: “ “ “ “ “ CPTH-R: il funzionamento di questo recettore è ancora ignoto. A livello dei vari organi il PTH agisce in diversi modi: nel rene aumenta il riassorbimento nel tubulo distale, diminuisce l’assorbimento di fosfati, aumenta l’attività della vitamina D, incrementando l’attività dell 1alphaidrossilasi; nell’osso aumenta il riassorbimento di calcio e fosfato dall’osso ai liquidi extracellulari. Il fosfato viene per lo più escreto; nell’intestino aumenta indirettamente l’assorbimento di calcio e fosfato, agendo sulla sintesi di vitamina D. La vitamina D è un ormone steroideo e come tale si lega a un recettore intracitplasmatico chiamato VDR. Esistono due fonti di vitamina D. il D2ergocalciferolo (piante e lieviti) e il D3colecalciferolo. Deriva da 7 deidrocolesterolo. Si trova nel pesce e nel tuorlo dell’uovo. È sintetizzata a livello cutaneo. Il 7 deidrocolesterolo (provitamina) è convertito in D3colecalciferolo attraverso due reazioni che avvengono a livello della cute. C’è una rottura tra il C9 e il C10. Questa reazione viene catalizzata dalle radiazioni ultraviolette, ovvero il sole. D3 è convertito in 25OHcolecalciferolo nel fegato, a opera di una idrossilasi. A livello renale, una 1 alphaidrossilasi trasforma il 25OHcolecalciferolo in 1-25OH colecalciferolo, ovvero la vitamina D attiva. Si formano anche l’1, 24, 25OHcolecalciferolo e il 24, 25OHcolecalciferolo, molto poco biologicamente attive. La 25 idrossilasi epatica non è regolata, mentre l’attività della 1idrossilasi renale è finemente regolata- viene stimolata da bassi livelli sierici di calcio e di fosfato. L’attivita alpha 1 idrossilasica è stimolata da paratormone. È inibita dalla vitamina d attiva, che funziona con un feedback negativo.

Il recettore possiede un sito di legame per il ligando e un sito di legame per il DNA tramite il quale regola direttamente la trascrizione di moltissimi geni sia in maniera positiva che negativa. In maniera positiva regola i geni di: recettore per la vitamina D (feedback positivo), CaBP, pompa del calcio, osteocalcina, fosfatasi alcalina, 24 idrossilasi. A livello negativo regola la sintesi di paratormone, 1 idrossilasi, collageno, interleuchina due e interferone gamma. La vitamina D ha un effetto positivo sul riassorbimento dell’osso, è calciotropo positivo e aumenta la capacità del paratormone di assorbire il calcio a livello renale e reprime l’espressione del gene del paratormone. Ha un effetto netto positivo sull’osso perché aumenta il calcio e il fosfato liberi. La patologia che deriva dal deficit di vitamina d prende il nome di osteomalacia negli adulti e rachitismo nei bambini. In questa patologia aumenta la matrice ossea non mineralizzata (osteoide) il rachitismo e l’osteomalacia sono la stessa malattia, solo che il rachitismo interessa i bambini, in cui non è ancora avvenuta la saldatura dell’osso. Esistono due tipi di osteomalacia. Il tipo I è autosomica recessiva e manca la alpha1 idrossilasi renale. Può essere corretta somministrando vitamina D attiva dall’esterno. Il tipo II è sempre autosomica recessiva ma è più grave ed è determinata dal recettore inattivo, che si ottiene a causa di una singola mutazione aminoacidica in uno dei domini zinc finger, di legame al DNA del recettore. La calcitonina è un peptide di 32 aminoacidi, sintetizzato dalle cellule parafollicolari (cellule C) della tiroide. Il suo ruolo non è molto chiaro anche perché si è visto che in mancanza di questo ormone non si hanno delle gravi conseguenze sull’osso e sulla calcemia (esisteranno quindi adeguati meccanismi compensatori). A livello biologico, la sua attività è opposta a quella del paratormone della vitamina D. A differenza del paratormone, la calcitonina viene sintetizzata attiva, tranne che per una piccola sequenza segnale, che viene subito rimossa. Il gene subisce uno splicing alternativo: l’mRNA cerebrale funge da neurotrasmettitori. La calcitonina inibisce direttamente l’attività degli osteoclasti e quindi il riassorbimento osseo. Nel rene stimola la secrezione e abbassa il riassorbimento del calcio a livello dei tubili distali. I livelli plasmatici sono maggiori negli uomini da cui la predisposizione delle donne all’osteoporosi. Ha un’azione veloce ma breve nel tempo e abbassa spontaneamente la calcemia, se la concentrazione plasmatica di calcio aumenta. TESSUTO OSSEO È la forma più specializzata di tessuto connettivo con prevalenza della parte di matrice extracellulare rispetto alla parte cellulare. Ha funzione di movimento, sostegno, protezione e metabolismo. La matrice extracellulare è il 35%, il 60% è costituito da Sali e il 5% da cellule. La matrice iinorganica è formata da cristalli di idrossiapatite ed altri sali. La formula dell’idrossiapatite è la seguente:Ca2 (PO4)3OH. La componente organica è formata da collageno, acqua, proteoglicani, lipidi, osteopontina, osteonectina e fibronectina. La componente più abbondante è il collageno di tipo 1 costituito da due catena alpha2 e una catena alpha1, c’è anche il collageno di tipo 2, costituito da 3 catene alpha e il collageno di tipo, costituito alla stessa maniera di quello di tipo 1, ma con più residui glicosilati e maggiore prevalenza di OHLys. Ci sono anche proteoglicani e glicoproteine.

Il collageno è organizzato in fibre flessibili ma inestensibili che generano una forte resistenza alla trazione Le fibre sono a loro volta costituite da fibrille di 10-300 nm, e queste a loro volta,sono formate da molecole di tropocollageno.Ogni molecola di tropocollageno è formata da 3 catene di 1000 aa (1/3 glicina) L’unità tripeptidica ripetuta più spesso è GlyxPro o GlyxHyp. Prolina e lisina sono spesso idrossilate. Esistono diverse catene a che generano 20 tipi di fibre diverse. I legami che si formano sono chiamati legami covalenti insoliti e si formano tra residui di istidina. lisina e idrossilisina .la qualità è il tipo di legami che si formano cambiano con l’età (in generale aumentano i legami covalenti, ed è per questo che più si invecchia, più si perde agilità, mentre invece i bambini sembrano smontabili!). La sintesi del collageno è un processo multifasico. Nel reticolo endoplasmatico rugoso avvengono delle idrossilazioni in cui è coinvolta anche la vitamina C e si inizia ad avere glicosilazione. La tripla elica inizia ad assemblarsi grazie a cisteine poste sui terminali delle catene proteiche che con un processo definito autoassemblaggio ordinato formano dei ponti disolfuro tra loro e la conseguente tripla elica. La tripla elica passa nell’apparato di Golgi, dove viene ulteriormente glicosilata e viene trasportata nello spazio extracellulare, dove avviene il taglio delle estremità e l’assemblaggio in fibrille di collageno. Il 10-15% della parte organica è costituita da eteroproteine, che sono note per avere carica negativa e per associarsi all’idrossiapatite. Vi sono diverse glicoproteine tra cui le BSP (Bone SialoProtein), che interagiscono con le integrine di membrana. L’osteopontina lega li osteoclasti e l’idrossiapatite La trombospondina, invece, lega gli osteoblasti L’osteocalcina è sintetizzata dagli osteoblasti come precursore con molti residui di acido glutammico, che vengono carbossilati da un enzima vitamina K dipendente. I residui di Glutammico carbossilati legano il calcio. Queste modifiche diminuiscono negli anziani. La sintesi è stimolata dalla vitamina D che ha un ruolo, quindi, anche nella mineralizzazione dell’osso. Proteoglicani: sono proteine a cui sono legati covalentemente glicosaminoglicani, GAG. Interagiscono con le fibre di collageno tramite la parte zuccherina. I GAG sono costituiti da almeno un aminozicchero che viene ripetuto per molte volte, sono spesso solforati, sono molto idrofilici e legano cationi. Il collageno è una macromolecola che può ben essere usata per fare una correlazione tra struttura e funzione. Mutazioni geniche danno delle patologie molto gravi perché viene ad alterarsi la struttura propria della proteina. Alcune patologie sono l’osteogenesis imperfecta o la sindrome di Ehlers-Danlos, che determina la formazione di strutture poco salde. Altre patologie ossee, sia metaboliche che genetiche sono: Rachitismo e osteomalacia (deficit di Vit.D) Iperparatiroidismo (esteso riassorbimento osseo e calcolosi renale) Osteoporosi (riduzione della massa di tessuto osseo) Implicate citochine come interleuchina 1 e 6 e riduzione estrogeni. Rari casi dovuti a mutazioni nel gene per il recettore della Vit.D o mutazioni nei geni COL1A1 COL1A2 Osteopetrosi (aumento della densità del tessuto osseo) dovuta ad incapacità di riassorbire l’osso. Mutazioni nel gene che codifica anidrasi carbonica II Gli osteoblasti sono cellule mononucleate di origine mesenchimale. Hanno recettori per il paratormone e la vitamina D. Producono collageno I, osteocalcina e protoglicani.

Sindgizano la parte organica della matrice ossea. Gli Osteociti sono cellule che hanno perso la capacità di dividersi e derivano dagli osteoblasti rimasti “intrappolati” nella matrice ossea. Gli osteoclasti sono cellule giganti multinucleate, derivante da staminali ematopoietiche. Hanno la funzione di riassorbire l’osso. Il 10% del tessuto osseo viene sostituito ogni anno con questo meccanismo di riassorbimento e apposizione. Il processo di rimodellamento osseo permette la correlazione tra calcio e fosfati solubili del sangue e dell’osso. E quindi il comportamento dell’osso è fondamentale per regolare l’omeostasi di questi due minerali. Quando la concentrazione di calcio è extracellularmente di 1,4mM e di Pi è di 1,9 mM e il pH è a 7, 58 inizia l’apposizione di piccoli cristalli di fosfato di calcio. Dall’osteoblasto sono liberate vescicole membranose extracellulari, VME, che contengono calcio libero, legato a proteine, fosfato libero e legato a osteopontina ed altre proteine. Le vescicole si lisano a contatto con la matrice nella quale libereranno tutto il loro contenuto. La fosfatasi alcalina interviene disgregando derivati fosforilati legando il calcio e interagendo con il collageno. Gli osteoblasti hanno recettori per vitamina D e paratormone, glii osteoclasti sono sotto l’effetto della calcitonina. Gli osteoblasti sintetizzano citochine RANKL, che sono recepite dagli osteoclasti tramite il recettore RANK. Nell’osteoclasto si attivano così delle vie di trasduzione del segnale che portano alla maturazione di cellule multinucleate mature. Sull’osteoclasto è attiva una pompa H+ ATPasica che acidifica l’ambiente extracellulare e favorisce lo sfaldamento della matrice. Sono secreti anche enzimi lisosomiali che digeriscono la parte organica della matrice. Il pH può arrivare sino a 4! Anche l’anidrasi carbonica è coinvolta in questo processo in quanto favorisce l’acidificazione dell’ambiente extracellulare a partire dall’acido carbonico. L’osteoblasto può determinare anche lo stop dell’attività degli osteoclasti. L’osteoblasto ha recettori per gli estrogeni: sotto lo stimolo di questi sono prodotte osteoprotegerina, OPG e il fattore di crescita tumorale beta. L’osteoprotegerina antagonizza RANK, legando RANKL. TGFbeta ha peso molecolare 25 kDa e funziona come omodimero. Tutte le cellule umane hanno recettore per TGFbeta. Stimola la sintesi di collageno e osteopontina negli osteoblasti. La sua sintesi è favorita da leggeri abbassamenti di pH. In conclusione è possibile dire che gli estrogeni regolano la sintesi di enzimi, fattori di crescita, proteine della matrice e citochine. In circolo e nelle urine sono dosabili dei marker biochimici dell’attività degli osteoblasti: la fosfatasi alcalina, l’osteocalcina, il frammento amino e carbossiterminale del collageno immaturo. Marker dell’attività osteoclastica: sono residui della degradazione del collageno, come idrossilisina, idrossiprolina, piridolina e deossipiridolina. La piridolina deriva da 3 OHLys, mentre la deossipiridolina si forma dalla condensazione di due OHLys e una Lys. DPD ha una specificità ossea 50 volte superiore a qualunque altro tessuto, ed è per questo che viene definito come un marcatore elettivo dell’attività delle cellule ossee. BIOCHIMICA DENTALE I principali componenti del dente sono: Lo smalto, all’esterno della parte di dente che emerge dalla gengiva La dentina, rivestita di smalto nella parte di dente che emerge dalla gengiva, costituisce la parte ossea delle radici dentali La polpa, che sta all’interno della dentina. Lo smalto è per il 96% costituito da componente mineralizzata, per il 4% da acqua e matrice organica. Non contiene cellule. Le cellule che producono la matrice organica sono

gli ameloblasti che sintetizzano due tipi di proteine: l’amelogenina, ricca di prolina, leucina e glutamico e le enameline, glicoproteine fosforilate leganti il calcio. Nello smalto sono presenti cristalli di idrossiapatite e fluoruri. La dentina è meno mineralizzata dello smalto. Gli odontoblasti partecipano alla sintesi delle sue componenti strutturali. Nei denti non esiste il fenomeno del rimodellamento osseo. Gli odontoblasti non vengono però incorporati nella struttura quindi, anche la dentina così come lo smalto è un tessuto acellulare. La polpa è un tessuto connettivo particolare, gelatinoso, idratato. Ci sono esosamine, acido sialico, fuciosio e cellule tra cui alcune difendono il dente da infezioni. Ci sono anche vasi sanguigni e terminazioni nervose. La carie dentaria è un processo patologico ad eziologia multifattoriale. L’ospite deve essere suscettibile, la sua dieta deve essere ricca di carboidrati fermentabili, ci deve essere la presenza di microrganismi cariogeni come lo streptococco mutans che è capace di sintetizzare polisaccaridi ectracellulari a partire dal saccarosio. Sintetizza acido lipoteicoico che favorisce l’adesione al dente tramite cariche negative che interagiscono con le cariche positive degli aminoacidi delle proteine dello smalto. Produce anche acido lattico che erode lo smalto. Fluoruro è usato come antibatterico perché si puòsostituire al calcio diminuendo l’adesività. Biochimica recettoriale La maggior parte dei recettori sono a sette tratti transmembrana o a canali ionico. I recettori a sette tratti trasnmembrana sono pià di 2000 e sono presenti in tutti gli eucarioti. Hanno funzioni biologiche diverse come diverse sono le molecole segnalatrici, ovvero i loro ligandi.: proteine, peptidi, lipidi, e altre molecole. Tutti i recettori hanno una struttura simile tra loro. Il 50 % dei farmaci, e il 25% dei farmaci più conosciuti agiscono su recettori a sette tratti transmembrana, che da ora in poi chiameremo recettoti 7TM. Di questi sono sei le famiglie recettoriali individuate e di queste sono state studiate le prime tre. A: comprende i recettori visivi ed olfattivi , è la famiglia più vasta B: comprende il recettore del glucagone e di ormoni gastrointestinali, come la secretina, è costituita in toto da 25 recettori C: piccola famiglia che comprende i recettori per il gusto e il recettore metabotropico del glutamato (gusto umami) Esistono tutt’oggi, circa 200 recettori orfani, dei quali è ignoto il ligando. Della famiglia A è praticamente conosciuto tutto a livllo molecolare. Della famiglia B dsi sa che ha un dominio aminoterminale particolarmete lungo, mentre nella famiglia C sono estesi entrambi i domoini terminali. L’effettore a valle dei recettori è la proteina g trimerica, costituita dalle subunità alpha, beta e gamma. Ci sono 20 geni per alpha, 5 per beta e sei per gamma. In teoria sono dunque possibili sino a 1000 combinazioni diverse. Il loro ruolo è quello di amplificale e diversificare il segnale. Ci sono tre tipo di proteina G e differiscon tra loro in base alla subunità alpha. AlphaS: attiva l’adenilato ciclasi, AlphaI/0: inibisce l’adenilato ciclasi, apre i canali del potassio, chiude quelli del calcio, AlphaQ: attiva la fosfolipasi C. Le subunità alpha e gamma sono legate da parti lipidiche alla membrana. Alpha rilascia GDP, lega GTP e si attiva, staccandosi e transducendo il segnale a valle. Beta e gamma restano tra loro attaccate e possono anch’esse avere un ruolo nella trasduzione del segnale.

Un ligando può innescare reazioni diverse a seconda del recettore e quindi del tipo di proteina G attivata e quindi dai bersagli enzimatici attivati in risposta allo stimolo primario dalla cellula. Ad es. l’adrenalina sul recettore beta, accoppiato a una proteina GalphaS attiva l’adenilato ciclasi, sul recettore alpha, accoppiato a GalphaI la inibisce! Esistono proteine di supporto, dette di impalcatura (scaffold proteins) che facilitano l’interazione tra recettori ed effettori e limitano il processo di seganalazione a una singola zona della cellula, evitando la dispersione del segnale (AKAPS: A kinase anchoring, proteins), e ogni cellula ha le sue scaffold caratteristiche. Un’altra proteina fondamentale nella segnalazione dei recettori 7TM è la beta arrestina che disaccoppia il recettore dalla sua proteina G. Lega enzimi della cascata delle MAP chinasi facilitando alcuni processi di segnalazione. La beta arrestina funge quindi anche da proteina scaffold. La possibilità di spegnere una via di trasduzione è importante così come accenderla. Desensitizzazione o desensibilizzazione Si pensava che fosse un processo esclusivamente neuronale, ma è stato dimostrato che non è così: ci sono diversi meccanismi che portano alla desensibilizzazione, altrimenti detta desensitizzazione o adattamento della cellula bersaglio: abbassamento del numero di recettori disponibili (sia tramiteinternalizzazione e degradazione dei presenti, si aattravero un più raffinato meccanismo di controllo dell’espressione genica che ne riduce la velocità di sintesi ex novo), modificazioni nelle proteine G, fosforilazione del recettore. La fosforilazione avviene per 2 vie: omologa ed eterologa: Eterologa se il recettore viene fosforilato da PKA o PKC. Il recettore avvia una via di trasduzione che porta alla sua stessa fosforilazione. Nella omologa le subinità beta gamma attivano GRK (Gcoupled Receptor Kinase), una serin-treonin chinasi che fosforila il recettore. L’inattivazione completa richiede come componente addizionale la beta arrestina. GRK1 È conosciuta come rodopsina chinasi, mentre GRK2 è la chinasi del recettore beta adrenergico. Esistono 4 geni per l’arrestina: di questi due sono espressi esclusivamente nella retina, mentre altri due sono per lo più ubiquitari. La beta arrestina ha diverse funzioni, tra le quali quella del disaccoppiamento, dell’interazione con diverse proteine segnale, dell’internalizzazione del recettore mediante endocitosi clatrina-dipendente e ubiquitinazione del recettore ( e successiva internalizzazione, secondo un meccanismo scoperto di recente). Il distacco delle vescicole è diretto da dinamina. Un'altra tappa regolativa è lo spegnimento della subunità alpha che avviene tramite proteine RGS: regolatrici della segnalazione delle G proteins: Sono proteine che attivano la GTPasi , hanno un ruolo cruciale nello spegnimento di risposte mediate da proteine G. Ci sono circa 25 proteine RGS codificate nel genoma umano: ognuna interagisce con una serie di proteine G. BIOCHIMICA SENSORIALE I sensi più caratterizzati sono vista e olfatto; per l’udito si sa molto poco. I sistemi sensoriali si basano su neuroni sensoriali specializzati che usano meccanismi di traduzione del segnale per trasmettere impulsi al SNC. I recettori sensoriali sono:  FOTORECETTORI = rispondono alla luce(es. rodopsina)

 MECCANORECETTORI = rispondono a deformazioni meccaniche.  TERMORECETTORI = rispondono a variazioni di temperatura.  CHEMORECETTORI = rispondono alla presenza di diverse molecole; sono coinvolti nella trasmissione dei segnali gustativi ed olfattivi. Olfatto, vista e gusto dipendono da recettori a 7 tratti transmembrana legati a proteine G che regolano apertura/chiusura dei canali ionici tramite l’uso di molecole cicliche. Questi canali sono detti CNG e sono attivati da cAMP e cGMP a loro volta attivati da proteine G. cAMP e cGMP sono degradati da fosfodiesterasi che rompono il legame fosfodiesterico e liberano AMP e GMP nn ciclici. Quando i CNG sono attivati, si genera corrente ionica. La traduzione del segnale per la vista è ben noto. La rodopsina è il primo recettore sensoriale individuato ed il suo gene è stato il primo ad essere clonato e sequenziato. La parte dell’occhio coinvolta nella traduzione del segnale visivo è la retina che ricopre la parte posteriore dell’occhio. La retina possiede due tipi di cellule: i coni e i bastoncelli. I coni sono rotondi e sono responsabili della vista a colori; i bastoncelli hanno forma allungata e sono responsabile del contrasto fra chiaro e scuro e sono sensibili anche a bassi livelli di luce. Queste cellule trasformano i segnali chimici in segnali elettrici: il segnale si trasmette dai neuroni bipolari ai neuroni gangliari al nervo ottico. Quando la luce colpisce i coni o i bastoncelli, nella cellula si innescano reazioni chimiche che fanno rilasciare neurotrasmettitori che a loro volta stimolan neuroni bipolari e poi gangliari; questi neuroni integrano segnali che derivano da diversi fotorecettori e li inviano alla corteccia cerebrale tramite il nervo ottico. La prima parte della visione è detta FOTOTRASDUZIONE = il segnale chimico è trasformato in segnale elettrico tramite coni e bastoncelli. La retina ha 3 milioni di coni e 100 milioni di bastoncelli. Nei bastoncelli ci sono :  dischi che contengono rodopsina.  citoplasma ricco di mitocondri che producono ATP.  nucleo. RODOPSINA = ha una parte proteica(opsina) ed una parte non proteica (retinale = è una parte cromofora). L’opsina è costituita da 7 tratti transmembrana. Dopo la trascrizione, il suo messaggero è modificato nel Golgi e nel ER e poi viene portato ai dischi membranosi. I coni hanno i dischi membranosi contenenti rodopsina nella parte apicale. Coni e bastoncelli hanno un potenziale elettrico fatto da una pompa ATPasi NA/K nella parte esterna della membrana. In condizioni di buio nelle cellule è attiva la guanilato ciclasi ce produce cGMP che mantiene aperti i canali ionici determinando una corrente cationica; quando invece la rodopsina interagisce con la luce, viene attivata una fosfodiesterasi che fa diminuire i livelli di cGMP provocando la chiusura dei canali ionici.

VISTA I tipi cellulari coinvolti nel senso della vista sono i coni e i bastoncelli. Il potenziale di membrana viene prodotto da una pompa sodio/potassio ATPasi. Un canale ionico controllato da cGMP modifica il potenziale di membrana. Al buio aumenta cGMP, e i recettori di membrana si iperpolarizzano. Gli enzimi coinvolti prncipalmente sono la

guanilato ciclasi e la fosfodiesterasi. La rodopsina è il recettore a 7TM coinvolto nella visione. È stato il primo recettore che è stato purificato e cristallizzato. Il gene è stato clonato e sequenzaiato nel 1984. La rodopsina assorbe la luce molto efficacemente intorno ai 500 nm. Essa ha una parte non proteica, un cromoforo derivato dalla vitamina, cis11 retinale. È legato covalentemente, tramite una bse di schiff alla lisina 256, presente slla settima alpha elica. La luce cusa l’isomerizzazione dell 11 cis retinale a tutto trans retinale. L’atomo di azoto presente sulla bsse di schiff si sposta di 5 armstrong. Per aumentrare la concentrazione di rodopsina la membrana delle cellule visive è organizzata in dischi membranosi. La proteina g associata alla rodopsina è la trasducina, che con la sua attivazione attiva la fosfodiesterasi, normalmente legata ad un inibitore, il quale viene rimosso proprio dalla sub. alpha della trasducina. cGMP diminuisce e i canali ionici pesenti sulla membrana, normalmente aperti, vengono chiusi e come risultato si ha una iperpolarizzazione del bastoncello. C’è una grossa amplificazione del segnale, basti pensare che la fosfodiesterasi idrolizza 4200 molecole di cGMP al secondo. Ogni molecola di rodopsina eccitata attiva 500 molecole di trasducina. Il legame del cGMP al canale ionico è cooperativo e quindi anche una piccola variazione nella concentrazione di cGMP determina una considerevole variazione nella conduttanza ionicaIl risultato di questa amplificazione è la sensibilità alla luce. L’assorbimento di un singolo fotone chiude un migliaio di canali e cambia il potenziale di membrana di 1mV. Il sistema visivo risponde in pochi millisecondi a variazioni di luce e colore.Possiamo percepire movimenti continui a circa 1000 fotogrammi al secondo. Per ottenere una risposta rapida il segnale deve essere bloccato rapidamente ed il sistema deve tornare allo stato iniziale. Il sistema deve spegnersi altrettanto efficacemente. I coni adattano più in fretta del bastoncello e per intensità luminose più elevate. . Il recupero è legato alla concentrazione di calcio. Con il recupero si ripristinano l’attività gtpasica della subunità alpha della trasducina, il riassemblamento dell’inibitore della PDE a quest’ultima, l’attivazione della guanilato ciclasi, attivazione della rodopsina chinasi (inibita dalla proteina che lega il calcio se le concentrazioni di calcio sono molto alte). Per poter essere riutilizzato il retinale deve diventare nuovamente 11-cis. Questo avviene fuori dai recettori a livello dell’epitelio pigmentato attraverso un lungo processo ( che può durare da secondi a minuti) L’uomo non può sintetizzare il retinale da precursori semplici ma lo deve ottenere dalla dieta sotto forma di vitamina A Chi ha carenza di vitamina A, tipicamente ha un deficit nella risposta all’abbagliamento (non riesce a sostituire velocemente il retinale). La vitamina A è un alcol primario esterificato. Ne esistono 3 forme attive: l’acido retinoico, l’11 cis retinale e il beta carotene

Il retinolo può diventare acido retinoico per ossidazione del gruppo aldeidico a gruppo acido. È un ormone che agisce a livello epiteliale ed influenza crescita, differenziamento e trasformazione. Il beta carotene è un antiossidante. La vitamina A circola legata a retinol BP. La vitamina A è presente in prodotti alimentari di origine animale. Il beta carotene si trova nella frutta e nella verdure gialla e verdela risposta dei coni è sì più rapida, ma anche meno sensibile. I coni hanno diverse isoforme di pigmento, trasducina, PDE, arrestiina, RGS. Ci sono 3 proteine fototrcettrici diverse, 3 opsine, una sensibile al rosso, una al verde e una al blu. Il retinale, invece è sempre lo stesso. L’uomo distingue colori e sfumature integrando i segnali che provengono da questi tre tipi di coni. I 3 recettori sono tutti 7TM. Hanno il 40% di identità con la rodopsina. Fotorecettore del blu mostra una identità del 40% con i fotorecettori del verde e del rosso Fotorecettore del rosso e del verde sono identici per il 95%. Differiscono solo in 15 posizioni su 364. I geni per i pigmenti rosso e verde sono sul cromosoma X umano, adiacenti tra loro. La cecità per i colori è un fenomeno ereditabile abbastanza comune nell’uomo, dovuto a ricombinazione omologa ineguale tra queste regioni cromosomiche.

OLFATTO Il 4 % del genoma umano codifica per recettori olfattivi. L’uomo può riconoscere fino a 10000 odori diversi. I recettori, 7TM sono legati a proteine Golf. Gli odori sono molecole organiche di piccole dimensioni. Distinguiamo gli odori tra loro in base ai lori funzionali, alla lunghezza delle catene, alla stereoselettività e alla concentrazione: l’indolo a basse concentrazioni ha un odore floreale, mentre ad alte concentrazioni ha odore di putrido…. L’anosmia specifica è l’incapacità di riconoscere gli odori solo di alcuni composti causata da mutazioni nei geni che codificano per singoli recettori olfattivi. Studi su ciglia di epitelio olfattivo di ratto hanno dimostrato che cAMP aumentava solo se era presente cGMP. Il clonaggio e l’identificazione di una subunità alfa presente solo nell’epitelio olfattivo (Golf) ha portato i suoi scopritori, Buck e Axel, a vincere il Nobel.

Nel topo ci sono 1000 recettori olfattivi diversi, nell’uomo solo 350. La maggior parte dei geni OR (60%) sono, infatti, nell’uomo, degli pseudogeni. L’uo mo infatti non è capace di percepire tutti gli odori. Ogni neurone olfattivo esprime un unico OR. GOlf attiva la guanilato ciclasi, si aprono i canali del calcio, mentre esce il cloro e si ha depolarizzazione cellulare. I canali del cloro olfattivi sono molto presenti perché amplificano il segnale di depolarizzazione. Ogni neurone esprime un recettore ma le diverse sosanze stiolano pià recettori contemporaneamente, attivando una combinazione unica e caratteristica sia qualitativamente che quantitativamente (ogni odore stimola una combinazione di recettori specifica, con una sua propria intensità specifica). L’epitelio olfattivo è diviso in 3-4 zone di espressione e ciascun recettore è presente in una sola zona. Circa 5000 neuroni esprimono un recettore. I neuroni olfattivi formano glomeruli sinaptici. In ogni glomerulo sinaptico ci sono dai 5000 ai 20000 neuroni e circa 2000 glomeruli formano un bulbo olfattivo. Ogni glomerulo riceve imput da cellule che esprimono un unico recettore. Questo vuol dire che nel bulbo ci sono circa 2000 glomeruli ma ogni glomerulo raccoglierà tramite gli assoni i segnali provenienti da un determinato gruppo di cellule neurali.La figura esplica a pieno il concetto:

GUSTO Il gusto è il senso fratello dell’olfatto, sfrutta chemorecettori. Distinguiamo composti che non distinguiamo con l’olfatto. La capacità discriminante del gusto è molto più limitata di quella dell’olfatto. Amaro, salato, dolce, acido, umami. Amaro e acido sono i sapori di sostanze tossiche. Il gusto umami viene recept grqazie a dei recettori che sono stati identificati solo nel 2000, metabotropici del glutamato. Recepiamo ioni sodio (salato), H+ (acido) e chinino (amaro) che ha la soglia più bassa. Meccanismi biochimici diversi sono

coinvoli nella percezione dei gusti. Le papille gustative possono essere fungiformi, vallate, foliate. I bottoni gustativi sono cellule recettoriali organizzate in gruppi, e costituiscono l’uno per cento delle cellule dell’epitelio linguale. Le cellule gustative si rinnovano completamente ogni 20 giorni. Nella percezione sensoriale gustativa, composti con natura chimica diversa possono stimolare gli stessi recettori, attivando gli stessi pathway e dando la stessa sensazione gustativa. La differenza di espressione dei recettori olfattivi e guststivi spiegano la specificità maggiore della nostra percezione nei confronti degli odori rispetto ai sapori. Le trasduzioni del segnale sono mediate da secondi messaggeri e flussi ionici. Si usano recettori a serpentina e TRP (transmembran receptor of potential).La famiglia TRP è una grande superfamiglia di proteine, composte da 56 proteine raggruppate in 7 sottofamiglie). Sono espresse nei tessuti dei vertebrati e degli invertebrati e sono classificate in base ad omologie strutturali e non funzionali, perché svolgono moltissime funzioni diverse. Hanno sei domini transmembrana, tra questi i domini TM 5 e 6 sono fondamentali per la formazione del poro. Possono dimerizzare e sono caratterizzati, nella zona aminoterminale da un dominio di anchirina con una struttura helix-loop-helix che segue una forcina. Si ha una variazione dei livelli di calcio intracellulare e si ha rilascio di neurotrasmettitore. Nella percezione del dolce, dell’amaro e dell’umami i meccanismi sono simili e sfruttano recettori a sette tratti transmembrana, mentre per la percezione di salato e acido è guidata da ioni (sodio e idrogeno). Gli ioni sodio passano attraverso i canali dei bottoni gustativi e ciò crea una corrente transmembrana, con rilascio di calcio dalle vescicole che fa partire la via di trasduzione del segnale. Un canale del sodio è un tetramero. Ogni subunità ha due tratti transmembrana, ognuno dei quali ha tra 500 e 1000 aminoacidi. Aminoterminale e carbossiterminale sono all’interno mentre all’esterno ci sono due zone ricche di cisteina. Come già detto, anche la percezione del gusto acido è mediata da flussi ionici. Il dolce, l’amaro e l’umami sfruttano la percezione sensoriale mediata da recettori a 7TM. Molte volte funzionano come dimeri, sia omodimeri, che eterodimeri. T2R: percepisce diversi composti amari, T1R1+T1R3: percepisce l’umami, TIR2+T1R3: percepisce il dolce. Omodimeri T1R2 e T1R3 percepiscono il dolce, ma in modo meno sensibile perchè riconosce come dolce la saccarina ed il saccaroso ma non l’aspartame e il galattosio.La gustducina è la proteina G espressa nei bottoni gustativi di dolce e amaro. Per i sapori dolci possiamo avere due vie: sia l’innalzamento del cAMP e chiusura dei canali del potassio, e una trasduzione simile a quella dell’amaro. Per l’amaro ci sono sostanze molto eterogenee. Ha la soglia più bassa. La trasduzione ha varie vie: blocco di canali per il potassio Attivazione di recettori T2R accoppiati alla proteina Ggust Ggust: Ggust/G3/G13 Ggust: attiva una PDE G3/13: attivano la PLC2 Possibile trasmissione dovuta ad aumenti di Ca2+ da stores IP3-sensibili Nell’uomo: 26 recettori T2R per diverse classi di amaro Esistono nei mammiferi delle cellule definite dolceamaro, che esprimono entrambi i tipi di recettori. Le vie di segnalazione sono antagoniste (aumento del cAMP e attivazione della fosfodiesterasi). Si ha una disgeusia dolce-amara, ovvero le sostanze amare sono percepite come dolci. Umami è il gusto specifico del glutamato. Ha un recettore specifico, a 7TM, che lega il glutamato monosodico, un intensificatore di sapori molto utilizzato nella cucina orientale

(infatti un eccesso di glutamato da un’intossicazione che viene chiamata sindome da ristorante cinese). Il recettore gustativo è simile al recettore metabotropico del glutamato: nel 1980 è stato riconosciuto come gusto di base e solo nel 2000 come quinto gusto. Esistono due meccanismi di trasduzione: attivazione di un canale cationico specifico, attivazione dei recettori T1R1+T1R3. L’attivazione di T1R1/T1R3 segue le stesse vie dei recettori del dolce. Una forma troncata di mGluR4 viene espressa dalle cellule umami. mGluR4D ha una KD per il glutamato molto bassa (mM), confrontabile con le concentrazioni alimentari.Il recettore dell’umami è una variante del recettore cerebrale del glutammato.Nella forma espressa nella lingua viene a mancare quasi tutto il dominio ad alta affinità per il glutammato.La ridotta affinità per il glutammato è adeguata ai livelli di aminoacido nella dieta.Sono necessarie concentrazioni più elevate di glutammato monosodico (L-MGS) per ottenere attivazione dei recettori gustativi. UDITO Sono determinati dalla trasduzione di stimoli meccanici instimoli elettrici Benchè note da diverso tempo le diverse strutture cellulari coinvolte in questo tipo di percezione fino alla fine degli anni novanta ben poco si sapeva, e ancora si sa, delle diversecomponenti molecolari coinvolte. Orecchio esterno, raccoglie le vibrazioni sonore, medio,riceve e trasmette le vibrazioni prodotte dalle onde sonore, ed interno, trasmette al cervello gli stimoli ottenuti dalle onde sonore e presiede al senso dell’equilibrio. Ci sono cellule chiamate capellute, con un fascio esagonale di ciglia che le caratterizza. Hanno delle deformazioni meccaniche: meccanorecettori che fanno variare il potenziale di membrana. Le cellule hanno anche delle stereociglia, legate da filamenti apicali, i quali sono legati a canali ionici, pressione meccanica-dipendenti Quando le stereociglia si muovono in risposta a onde sonore si aprono o si chiudono canali cationici Il moto meccanico delle ciglia è trasformato in flusso di corrente e quindi in impulso nervoso. TRPA1 è uno dei candidati al ruolo di canale ionico coinvolto nella sensazione uditiva. La drosophila è un buon modello per lo studio e l’identificazione di molecole coinvolte nella percezione meccanica, perché si può eseguire associazione di studi di mutagenesi ad alterazioni elettrofisiologiche. Al fine di comprendere quali potessero essere componenti molecolari coinvolte nella percezione meccanica sono state prese in esame Drosophilae appartenenti a ceppi mutanti con diversi gradi di mancanza di coordinazione ed insicurezza nei movimenti. Nompc è il recettore scoperto essere, in Drosophila, alla base delle meccanopercezioni. È un canale ionico omologo alle proteine TRP, con sei domini transmembrana e 29 ripetizioni di anchirina. 20% d’identità con le proteine TRP,40% similarità con le proteine TRP La Drosophila possiede SETOLE (Bristle) sensoriali che usa per individuare piccole correnti d’aria. Analizzando le risposte elettro-fisiologiche ai diversispostamenti nello spazio è stato deteminato che questo tipo di struttura sensoriale (Bristle) è sensibile a specifici spostamentianche dell’ordine di pochi A°. Sono inoltre capaci di dare risposta elettrica in SUBMILLISECONDI (msec).

L’analisi di diversi ceppi mutanti ha messo in evidenza quattro ceppi di particolare interesse: nomp C1,C2,C3,C4 caratterzzati da diversi livelli di risposta elettro-fisiologica al tatto e comportamento anomalo nel volo. Analisi comparative di sequenze hanno permesso di identificare l’alto livello di omologia di nompC di Drosophila con un gene precedentemente identificato in C. Elegans (Ce-NompC). Al fine di determinare se il Ce-NompC fosse espresso in distretti sensoriali di C.Elegans è stato modificato il gene Ce-nompC creando una proteina di fusione con GFP. Nonostante la distanza evolutiva il gene nompC mantiene caratteristiche conservate. Sia nella struttura che nella funzione, quindi: La meccanocezione in Drosophila e C.Elegans dipende dalla presenza dei TRP NompC che è espresso in un singola copia nel genoma di moscerino, vermi e pesci TRPA1 è l’ortologo in uomo? Organizzazione strutturale del gene è conservata in Drosophila, C.Elegans e zebrafish Nompc è il primo meccanorecettore coinvolto con la percezione meccano-sonora trovato nei vertebrati. TATTO Come il gusto anche il tatto è una combinazione di sistemi sensoriali che vengono espressi in un organo comune Il tatto comprende sensibilità a pressione, temperatura, dolore. Una serie di sensori specializzati (recettori) traduce i diversi tipi di pressione e contatto in potenziali d'azione afferenti. Le cellule di Merkel sono i più semplici sensori di tatto localizzati nello strato basale dell'epidermide.sse registrano semplicemente la pressione esercitata sulla cute (sensori P). Al confine fra epidermide e derma sono situati i corpuscoli tattili di Meissner. Essi rispondono in modo particolarmente intenso alle variazioni di pressione sulla cute, ma reagiscono poco se questa rimane costante. Corpuscoli di Ruffini I corpuscoli di Ruffini sono situati nella profondità del derma. Essi misurano la tensione del derma e sono ancora più sensibili alle variazioni di tensione. Corpuscoli di Vater-Pacini Ancora più in profondità rispetto ai corpuscoli di Ruffini, precisamente nel tessuto adiposo ipodermico, è possibile notare, già a occhio nudo, i corpuscoli di Vater-Pacini. Essi rispondono solo a stimoli tattili che variano rapidamente, ma non a una pressione costante Su ogni centimetro quadarato di pelle si trovano mediamene 130 recettori tattili Il tatto, come il gusto è una combinazione di sistemi sensoriali espressi in un organo comune, la pelle Due componenti fondamentali sono la percezoione della temperatura e della pressione. Nella trasduzione del segnale sono probabilmente coinvolti canali ionici. Il senso del tatto è strettamente connesso alla sensazione di dolore E’ stato di recente isolato un recettore responsabile della percezione del dolore, che funziona come un canale cationico Recettore VR1 Calore ed acidità stimolano una classe di neuroni specializzati, detti nocicettori

Questi neuroni inviano segnali ai centri del midollo spinale e del cervello che elaborano il dolore.Quali sono le basi molecolari del dolore? Identificazione in eucarioti di canali ionici controllati da stimoli meccanici Il primo recettore espresso nei nocicettori identificato è VR1 Tale recettore è stato recentemente clonato, confermando la sua attitudine funzionale allo stimolo polimodale del dolore, ossia al calore, alle sostanze acide e alla capsaicina VR1 è stato isolato sfruttando la sua capacità di legare la capsaicina, molecola responsabile del sapore piccante dei cibi speziati La capsaicina è un acido gasso monoinsaturo presente in diverse concentrazioni in piante del genere Capsicum (ad esempio nel peperoncino piccante). È irritante nei mammiferi, incluso l'uomo, e produce una sensazione di bruciore nelle mucose, bocca inclusa, dove passa in soluzione e stimola i recettori del dolore. VR1 è un canale cationico che risponde a stimoli multipli (calore, basso pH e capsaicina ) La presenza dello stimolo causa l’apertura del canale ionico e l’ingresso di calcio nella cellula Si innesca così la cascata di eventi molecolari che conduce alla sensazione del dolore Il recettore VR1 è un membro della famiglia dei canali TRP Il recettore VR1 attivo è formato da 4 subunità L’apertura del canale ionico è causata anche da temperature superiori a 40°C e dall’acidità. Le risposte alla capsaicina e agli altri stimoli nocivi non sono indipendenti tra loro. Es: la risposta al calore è maggiore a valori di pH bassi Topi knock-out che non esprimono VR1non rifiutano cibo che contiene elevate concentrazioni di capsaicina e sono meno sensibili ad un livello di calore normalmente dannoso.