Baciloscopia

BACILOSCOPIA

ANGEL ROMERO IRENE ISABEL CONTRERAS RIOS TONY RAFAEL PUENTES LOPEZ SINDY PAOLA

MARÍA MARCELA MARTINEZ MIRANDA BACTERIOLOGA

UNIVERSIDAD DE SUCRE FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MEDICINA IV SEMESTRE SINCELEJO-SUCRE 2008

INTRODUCCIÓN

La tuberculosis es una enfermedad causada por un microorganismo denominado micobacterium tuberculosis un tipo de bacilo capaz de pasar de una persona a otra por medio de inhalación de aire contaminado con aerosoles de una persona infectada. Esta enfermedad causa con frecuencia necrosis de caseificación en los tejidos afectados, y se puede diseminar por via hematogena o linfoide, la tuberculosis puede pasar al medio extrapulmonar (tuberculosis miliar) esta patología causa muchas muertes en todo el mundo, las tasas de motalidad han venido en ascenso desde la aparición de la epidemia del sida y diversos problemas como desnutrición, pobreza, hacinamiento, más que todo en países subdesarrollados, es necesario la implementación de medidas de diagnóstico para todas aquellas personas llamadas sintomáticos respiratorios,las medidas que se han empleado para la detección de la TBC vienen dadas por el análisis de la muestra de esputo en el microscopio para evaluar la presencia del micobacterium, con la coloración de ziehl neelsen también llamada acido alcohol resistente, para luego hacer el recuento de los bacilos en el extendido y dar a conocer el informe con el número total de estos en los campos observados.

MARCO TEORICO

La tuberculosis es una enfermedad infectocontagiosa producida por agentes del grupo Mycobacterium tuberculosis complex, especialmente por el Mycobacterium tuberculosis o bacilo de Koch (BK). Es la infección crónica más importante del mundo en cuanto a morbilidad y mortalidad. La localización más frecuente es en el aparato respiratorio, seguida a gran distancia por la afectación de cualquier otro lugar. Anatomopatológicamente se caracteriza por la formación de granulomas.

M. tuberculosis es un patógeno intracelular capaz de producir infecciones de por vida. No se conoce aún la compleja existencia intracelular de esta bacteria, pero se está aclarando con lentitud. En el período de exposición, M. tuberculosis ingresa en las vías respiratorias y las diminutas partículas infecciosas alcanzan los alvéolos, y son digeridas por los macrófagos alveolares. A diferencia de la mayor parte de las bacterias fagocitadas, M. tuberculosis impide la fusión del fagosoma con los lisosomas (al inhibir la molécula de unión específica, el antígeno endosomal específico 1 [EEA1]). No obstante, el fagosoma es capaz de fusionarse a otras vesículas intracelulares para facilitar el acceso del patógeno a nutrientes y su proceso de replicación intravacuolar. Las bacterias fagocitadas también pueden eludir la destrucción mediada por los macrófagos con la formación de intermediarios reactivos del nitrógeno creados entre el óxido nítrico y los aniones superóxido al catabolizar catalíticamente los oxidantes generados. Fisiología y estructura: Bacilo aerobio, grampositivo débil y fuertemente acidorresistente Pared celular rica en lípidos, lo que hace al microorganismo resistente a desinfectantes, detergentes, antibióticos antibacterianos frecuentes y tinciones tradicionales Virulencia: Capaz de crecimiento intracelular en los macrófagos alveolares Inactivados ta enfermedad depende fundamentalmente de la respuesta del anfitrión frente a la infección Epidemiología:

Universal; un tercio de la población mundial está infectada por este microorganismo Hay 8,8 millones de casos cada año y 2 millones de muertes la enfermedad es más frecuente en el sudeste asiático, África subsahariana y el este de Europa Hubo alrededor de 15.000 nuevos casos en EE.UU. en 2003 la población con mayor riesgo de padecer la enfermedad son Los pacientes inmunodeprimidos (fundamentalmente los infectados por VIH), los alcohólicos y los adictos a drogas, los Vagabundosy aquellos que están expuestos a otros individuos infectados El hombre es el único reservorio natural la transmisión de una persona a otra ocurre a través de aerosoles infectados Tratamiento, prevención y control: Se necesitan pautas con múltiples fármacos y cursos de tratamiento prolongados para prevenir la aparición de cepas resistentes a fármacos Isoniacida (INH), etambutol, piracinamida y rifampicina durante 2 meses seguidos de 4 a 6 meses de INH y rifampicina u otras combinaciones alternativas de antimicrobianos ta profilaxis de la exposición a la tuberculosis puede incluir INH durante 9 meses, rifampicina durante 4 meses, o rifampicina y piracinamida durante 2 meses, ta piracinamida y el etambutol o el levofloxacino se utilizan durante 12 meses después de estar expuesto a M. tuberculosis multirresistente Se hace profilaxis con BCG en los países endémicos El control de la enfermedad se hace con vigilancia activa, medidas profilácticas y terapéuticas y un control exhaustivo de cada caso Mecanismo de contagio En más del 98% de los casos, la infección es causada por la inhalación de las secreciones respiratorias mitidas por un adulto con enfermedad tuberculosa pulmonar con esputo positivo a BK. No todos los casos desarrollaran la enfermedad. Existen dos factores que determinan esta evolución: a) la facilidad de exposición a un adulto enfermo; y b) las condiciones inmunológicas propias del huésped.Los niños menores de un año son los que tienen mas probabilidades de desarrollar formas graves de enfermedad, como la tuberculosis miliar o la meningitis tuberculosa. Patogenia Solamente las partículas inhaladas más pequeñas, las que contienen entre 1-3 bacilos, van a ser capaces de llegar al alveolo y ser fagocitados por los macrófagos alveolares. Unos bacilos son destruidos y otros, con mayor capacidad agresiva, tienen la facultad de resistir los mecanismos defensivos celulares y provocar una primoinfección tuberculosa. Se constituye el llamado complejo primario, formado por el chancro de inoculación o nódulo de Gohn, la linfangitis regional y la adenopatía satélite. La repercusión sobre el pulmón se traduce en dos situaciones patológicas distintas:

— Primo infección tuberculosa subclínica (primo infección latente, viraje tuberculínico o infección tuberculosa). Se caracteriza por la ausencia de síntomas y signos clínicos, radiológicos y bacteriológicos. Sólo la prueba de tuberculina es positiva. — Enfermedad tuberculosa. Presenta manifestaciones clínicas, radiológicas, bacteriológicas e inmunológicas. La enfermedad, que se manifiesta antes de los 5 años que siguen al contagio se cataloga como tuberculosis primaria, enfermedad tuberculosa o primoinfección patente, y aquella que se desarrolla más tarde se denomina tuberculosis posprimaria, secundaria o de tipo adulto. Síntomas La fase primaria de la enfermedad normalmente no tiene síntomas. Cuando los síntomas en verdad ocurren, pueden abarcar: •

Tos (algunas veces con flema)

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Expectoración con sangre

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Sudoración excesiva, especialmente en la noche

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Fatiga

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Fiebre

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Pérdida involuntaria de peso

Otros síntomas que pueden ocurrir con esta enfermedad: •

Dificultad respiratoria

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Dolor torácico

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Sibilancias LA TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, que se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido mi cólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos.

Por esto se denominan bacilos ácido-alcohol resistente o BAAR. La pared celular rica en lípidos y ácidos carboxílicos (ácido micólico) que tienen la propiedad de unirse excepcionalmente fuerte al colorante primario (fuscina de Ziehl) cuando se usa el calor como mordiente.

Una vez que se forma este complejo colorante-pared, ni siquiera la acción conjunta del ácido y del alcohol puede deshacerlo, ya que las paredes retienen el colorante en forma "resistente". Las mico bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. La tinción fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 to 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 a 1894), un patólogo.

MATERIALES Y METODOS

MATERIALES: • • •

Microscopio con objetivo de inmersión. Envases para recolección de muestras. Aplicadores.

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Láminas portaobjetos nuevas, limpiadas con alcohol y secadas al aire. Un soporte para sostener láminas portaobjetos durante la preparación de extendidos. Varillas de vidrio u otro soporte inoxidable, de dimensiones adecuadas para sostener láminas portaobjetos durante la tinción. Un mechero, preferentemente de gas aunque puede utilizarse uno de alcohol. Una pinza. Un hisopo. Aceite de inmersión. Etanol al 70% o xilol. carbolfucsina al 1% acido-alcohol al 1% azul de metileno al 0.2%

PREPARACIÓN Y FIJACIÓN DEL EXTENDIDO: • se Destapó con cuidado el envase. • Se Partió un aplicador en dos, y se obtuvieron puntas ásperas. • Tomar una parte del aplicador con la mano izquierda y la otra con la derecha, entre el pulgar y el índice, y con los extremos irregulares seleccionar la partícula más densa o purulenta de la muestra de esputo. Enrollarla en una de los dos partes del aplicador con la ayuda de la otra. • Se colocaron las partículas seleccionadas sobre el portaobjetos y se extendieron con el aplicador con movimientos suaves, circulares, dispersándolas de forma homogénea en el centro de la lámina.(a) • Se Dejó el extendido en un soporte ubicado al costado de la mesada para que se seque a temperatura ambiente. • Luego se Desecha el aplicador y guantes. • La lámina se deja secar al aire. • Se Toma el extendido con una pinza manteniendo la cara que contiene la muestra hacia arriba, y se pasa rápidamente sobre la llama de un mechero tres o cuatro veces cuidando que no se caliente demasiado. (b) • Se Colocó la lamina en el soporte destinado para la coloración.

B A

TINCIÓN DE ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENCIA (ZIEHL-NEELSEN)

Coloración •se Cubrió totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada. Y se dispersó el colorante todo el

con suavidad a lo largo de extendido (1) • Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No calentar con mechero. • En el término de aproximadamente cinco minutos se calentó tres veces hasta emisión de vapores; esto fue suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fijara a sus lípidos. Se tuvo cuidado de no hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal.(2) • Con una pinza, se levantó cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más cercano.Se Enjuagó con abundante agua a baja presión, con un frasco o un grifo. Y posteriormente se Lavó muy suave la superficie eliminando totalmente la solución de fucsina. Se Giró el extendido y se lavó con cuidado la parte posterior.(3)

• Se Inclinó el portaobjetos para eliminar el exceso de agua para evitar la dilución de los reactivos que se utilizados en el resto de la tinción.

Decoloración • Se Cubrió la totalidad del extendido con solución decolorante y se dejó actuar aproximadamente 3 minutos (4) • Inmediatamente se Enjuagó el extendido con abundante agua a baja presión.(5) • Verificar que el extendido se ha decolorado • Se inclino el portaobjetos para eliminar el exceso de agua.

Coloración de fondo • se Cubre todo el extendido con 6 solución de azul de metileno, Dejando actuar durante un minuto.(6) • se Enjuagaron las láminas en ambas caras con agua a baja presión.(7) • Luego se Dejaron secar las láminas a temperatura ambiente, apoyándolas en posición vertical en un soporte.(8)

Lectura de extendidos coloreados por Ziehl Neelsen • Se Depositó una gota de aceite de inmersión en un extremo del frotis, sin tocar el preparado con el gotero. • Se Enfocó el extendido donde ha colocado la gota de aceite, con la lente 100x de inmersión. • Se Observó cada campo microscópico en superficie y profundidad, moviendo permanentemente el tornillo micrométrico, antes de desplazarse al campo contiguo. • Luego se Siguió un recorrido en líneas rectas, sistemático para recorrer el extendido evitando repetir la lectura de algunos campos. de izquierda a derecha. • Se Contaron el número de campos y el número de BAAR que han identificado.

ANALISIS DE RESULTADOS

Al realizar la tinción de Ziehl Neelsen se observo una coloración azulada del fondo del extendido pero sin la presencia de microorganismos de coloración fucsiarojiza.

Coloración azul del medio debida al azul de metileno

Figura 1.

Esta coloración se debe a que el azul de metileno es un colorante básico metacromatico, la metacromasia es la capacidad de los colorantes que al reaccionar con un poli anión producen un viraje en la coloración por esta razón se usa como medio de contraste ya que reacciona con todos las sustancias que se encuentren en el extendido menos con los bacilos que han sido teñidos fucsina dando una coloración azulada (figura 1).

Mycobacterium tuberculosis (bacilosacido alcohol resistente)

Figura 2. Resultado de bacilos copia en caso de prueba positiva (presencia de BAARs ).

La coloración fucsia-rojiza de algunos microorganismos en esta prueba se debe a la fucsina un colorante básico que penetra todas las células dándoles una coloración fucsia-rojiza por esta razón la nuestra es sometida a decoloración dado que si el extendido en estas condiciones se coloca al microscopio todo se observaría de esta coloración por esta razón se usa el acido-alcohol dado a que esta sustancia remueve la coloración de todas las células menos los bacilos acido alcohol resistentes dado a que estos presentan ácidos grasos (por ejemplo, el ácido mi cólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con este alcohol-ácido, de esta manera retienen el colorante y al observarlo microscopio se pueden observar solo los microorganismos que tengan esta propiedad como son los bacilos del genero de las mycobacterias como lo son el M. Tuberculosis y el M. Leprae (figura 2.).

Resultados del conteo de los 100 campos por cuadricula: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

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Resultado obtenido luego de la observación de 100 campos al microscopio, el esputo observado es

Estos resultados se deben a que el paciente del cual se extrajo la muestra de esputo no presenta tuberculosis pulmonar dado a que si el presentara al enfermedad eliminaría por el esputo los microorganismos y al hacer el extendido se observaría estos bacilos en cantidades variables dependiendo delgrado de enfermedad.

CONCLUSIONES

De la anterior práctica de laboratorio es posible concluir que:

•

La bacilos copia es una técnica útily practica que permite detectar la presencia de mico bacterias como por ejemplo la causante de la tuberculosis (M. Tuberculosis).

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La bacilos copia es útil en la detección de bacilos expectorados por pacientes con tuberculosis pulmonar dado a que estos serán eliminados por vías respiratorias y pueden ser detectados por medio de esta técnica.

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Las carateristicas químicas de la pared célular de las micobactrias les otorga la capacidad de resistir la acción de los decolorantes como los alcocholes acidos.

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La bacilos copia no es solo útil para detectar los bacilos causantes de la tuberculosis sino para otros microorganismos que posean las características en la pared celular que los haga acido-alcohol resistentes

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La fucsina y el azul de metileno son colorantes básicos que pueden ser retenidos por las células y microorganismos.

•

El medio de contraste (azul de metileno) es fundamental para resaltar la presencia de los bacilos en el extendido.

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El lavado del portaobjetos después de cada tinción es fundamental para evitar excesos de colorantes que afecten la coloración con los reactivos subsecuentes.

BIBLIOGRAFIA

•

MANUAL PARA EL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE LA TUBERCULOSIS. NORMAS Y GUÍA TÉCNICA. PARTE I. Baciloscopia. ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD.

•

MURRAY PATRÍCK R. Microbiología medica. 5ta Edición, Elsiver, Madrid España. 597 págs.

•

MARTÍN LLACA DÍAZ JORGE. LA BACILOSCOPIA Y EL CULTIVO EN EL DIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSIS EXTRAPULMONAR. FACULTAD DE SALUD PÚBLICA Y NUTRICIÓN, UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN.

•

GUIA DE ATENCION DE LA TUBERCULOSIS PULMONAR Y EXTRAPULMONAR. MINISTERIO DE SALUD – DIRECCIÓN GENERAL DE PROMOCIÓN Y PREVENCIÓN