Aula 16 Sebenta Bacteriologia

AULA Nº 16 – Taxonomia e métodos de identificação de bactérias Introdução à classificação e taxonomia Os microbiologistas viram-se confrontados com a tarefa de compreender a diversidade das formas vivas que não podem ser vistas a “olha nú” e que, aparentemente, vivem em todos os ambientes terrestres. Uma das primeiras ferramentas necessárias à pesquisa desta diversidade era um sistema de classificação fiável. Surge assim a Taxonomia (do grego táxis, arranjo ou ordem, e nomos, lei, ou nemein, para distribuir ou governar) que é definida como a ciência que se ocupa da classificação biológica. Consiste em três domínios separados mas não independentes: Classificação, nomenclatura e identificação. Uma vez escolhido um regime de classificação, ele é usado para organizar os organismos em grupos denominados Taxa (unidades) baseando-se nas semelhanças de diferentes organismos. -Nomenclatura: é o ramo da taxonomia que se ocupa da atribuição de nomes aos grupos taxonómicos de acordo com as regras estabelecidas e publicadas. -Identificação: é o lado prático da taxonomia, o processo de determinação de uma espécie isolada em pertencer a um taxon ( singular de taxa ) conhecido. O termo Sistemática é muitas vezes atribuído a esta ciência. No entanto, muitos taxonomistas definem a sistemática como a ciência que estuda os organismos com o propósito de os caracterizar e ordenar de uma forma exacta.

Como definir uma espécie bacteriana ? - Colecção de estirpes que partilham muitas características estáveis e diferem significativamente de outros grupos de estirpes? - Colecção de estirpes que têm uma composição de G+C semelhante e apresentam 80% ou mais de parentesco do seu genoma (hibridação)? - Colecção de estirpes que partilham as mesmas sequencias nos seus genes mais utilizados (genes que codificam produtos indispensáveis e que são expressos continuamente)?

1

As estirpes de uma espécie diferem em algumas características, tais como: características bioquímicas - Biovariâncias ; antigénicas - Serovariâncias; susceptibilidade a grupo de bacteriófagos (presença / ausência se receptores) -Lisotipos; marcas genéticas - Genótipos;

Classificação Um dos mais antigos sistemas de classificação, Classificação Natural, organiza os organismos em grupos cujos membros partilhavam características e reflecte a natureza biológica dos organismos (Carlos Lineu). Hoje em dia, a determinação de géneros e espécies de um novo organismo procariota é baseado numa taxonomia polifásica. Esta vertente de classificação inclui os ramos: fenotípico, filogenético e genotípico.

Classificação fenotípica Por muito tempo, taxonomistas microbiológicos basearam-se exclusivamente neste tipo de classificação, no qual os grupos eram organizados com base nas características fenotípicas apresentadas pelos organismos. Esta vertente de classificação foi bem sucedida uma vez que trouxe ordem à diversidade biológica e tornou claras as funções de algumas estruturas morfológicas (ex: flagelos). Estudos fenotípicos podem ainda revelar possíveis relações evolucionárias, que não são dependentes de análises filogenéticas. Por fim, torna-se claro que um sistema de classificação é tanto mais rigoroso quantas mais características forem analisadas. Organismos que partilhem um elevado número de características formam um único taxon.

Critérios Fenotípicos: Propriedades utilizadas na classificação fenotípica São critérios avaliados em laboratório e embora sejam úteis na classificação filogenética, não apresentam tanta utilidade a níveis menores de classificação, tal como o género, que necessita de métodos mais apurados.

2

Temos então critérios: a) Morfológicos ( estruturais ) - Forma celular - Tamanho - Tipo de agrupamento( staphylo, strepto ) - Reacção às colorações ( Gram +; Gram - ) - Tipo de flagelação - Presença de cápsula - Forma e localização dos esporos ( central, terminal) - Inclusões celulares - Morfologia das colónias b) Culturais c) Bioquímicos( e fisiológicos ) -Fontes de Carbono e azoto -Comportamento face ao Oxigénio -Tipo de metabolismo energético - Temperatura de crescimento óptimo - Mobilidade - Tolerância à pressão osmótica - Síntese de pigmentos - Pesquisa de enzimas respiratórias ( catalase e oxidase ) - Testes bioquímicos - Sensibilidade a inibidores e a antibióticos d) Serológicos e) Ecológicos Exemplo : família das Enterobactereaceae -Gram: Bacilos Gram negativo -Relação com o oxigénio: aeróbio anaeróbio facultativo - Mobilidade: móvel-mov. Perítrico ou imóvel - Modo de produção de energia : via oxidativa e fermentativa - Bioquímica: oxidase negativa ; nitrato redutase positiva

3

Fig. 16.1- Hierarquia do taxon Enterobactereacea

Limitações dos métodos fenotípicos de identificação microbiana - Alguns microrganismos patogénicos não são capazes de crescer com as metodologias correntes (nos meios de cultura normalmente utilizados em laboratório) - Os métodos dependentes da cultura por vezes são demasiado lentos ( ex:o crescimento bacilo da tuberculose necessita de 21 dias ) - Alguns fenótipos manifestados por um organismo podem variar em função das condições de cultura utilizada em laboratório (ex: meio que contenha lactose e glucose inibe produção de ß- galactosidase) - Um determinado fenótipo pode ser gerado por microrganismos muito distintos do ponto de vista genético (ex: ß-lactamases apresentam variabilidade do ponto de vista genético mas são iguais do ponto de vista fenotípico)

Classificação filogenética Com as publicações de Darwin, biólogos desenvolveram sistemas de classificação filogenética que procuraram comparar organismos tendo por base relações de evolução. O termo filogenia (do grego phylon, tribo, e genesis , geração) refere-se ao desenvolvimento evolucionário das espécies. Os cientistas aperceberam-se de que 4

quando observadas diferenças e semelhanças entre organismos como resultado de um processo evolutivo, estes poderiam também adquirir conhecimento sobre a história da Terra.

Classificação genotípica Existem inúmeras formas do genótipo de um micróbio poder ser avaliado em termos taxonómicos. Em geral, este tipo de classificação compara semelhanças genéticas entre organismos. Genes em particular, ou o próprio genoma, podem ser comparados. Desde os anos 70 que se aceita que procariotas cujos genomas são 70% homólogos pertencem a uma mesma espécie.

Nomenclatura Nomenclatura binomial, nomenclatura binominal ou nomenclatura binária, são termos que designam nas ciências biológicas o conjunto de normas que regulam a atribuição de nomes científicos às espécies de seres vivos. Chama-se binominal porque o nome de cada espécie é formado por duas palavras, o nome do género e o restritivo específico (espécie), normalmente um adjectivo que qualifica o género. A utilização do sistema de nomenclatura binomial é um dos pilares da classificação científica dos seres vivos sendo regulada pelos códigos específicos da nomenclatura botânica, zoológica e bacteriológica. Os nomes utilizados são em latim ou numa versão latinizada da palavra ou palavras que se pretendem utilizar. O nome genérico e o epíteto específico devem sempre ser escritos em itálico, ou na sua indisponibilidade ser sublinhados, sendo sempre que possível seguidos pelo autor ou autores da descrição (em geral referido como a autoridade). Acresce que o nome do género deve surgir com letra maiúscula, enquanto que o da espécie deve ser escrito com minúscula. Exemplos: género - Staphylococcus

espécie aureus

- Escherichia

coli

- Proteus

mirabili

5

Características moleculares usadas em taxonomia O estudo de muitos microrganismos é dificultado pela falta de marcas fósseis, pelo que análises moleculares são a única via que permite a colheita de um grande número de dados exactos sobre estes microrganismos. Para que os cientistas possam publicar apenas comparações válidas, inferências filogenéticas baseadas em abordagens moleculares fornecem a análise mais fiável da evolução microbiana. Temos como características moleculares : a) Composição das bases do DNA ( %G+C) b) Hibridação de ácidos nucleicos c) Sequenciação de DNA

Composição das bases do DNA Genomas microbianos podem ser directamente comparados, e semelhança taxonómica pode ser estimada de diferentes modos. A técnica mas simples é a de determinação da composição das bases do DNA através da seguinte fórmula:

Esta determinação pode ser feita de várias formas. Apesar da quantificação G+C poder ser feita após hidrólise de DNA e análise das bases por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), métodos físicos tornam-se mais fáceis e, por isso, mais utilizados. Assim, a %G+C é determinada com recurso à curva de fusão do DNA(Tm). Numa cadeia dupla de DNA 3 ligações de hidrogénio (H-H) ligam as bases GC, e 2 ligações idênticas ligam as bases AT. Como resultado, uma cadeia dupla com maior %G+C tem mais ligações de hidrogénio

e

separa-se

a

uma

temperatura mais elevada. O ponto de fusão do DNA pode ser facilmente Fig. 16.2-curva de fusão do DNA

6

identificado recorrendo a métodos espectrofotométricos uma vez que a absorvância do DNA a 260nm (UV visível) aumenta durante a separação das duas cadeias que formam a dupla hélice .Obtém-se um máximo aquando da completa separação das cadeias. O ponto médio da curva obtida informa sobre a temperatura a que ocorre a separação das cadeias, uma medida directa do conteúdo em G+C.

. Fig. 16.3 - %G +C de diferentes géneros

Hibridação de ácidos nucleicos O grau de semelhança entre genomas pode ser comparado mais directamente utilizando estudos de hibridação de ácidos nucleicos. Se uma mistura de ss-DNA (single strand DNA), formada a partir do aquecimento de duplas cadeias de DNA (double strand DNA, ds-DNA) , for arrefecida e mantida a

uma

temperatura

de

25ºC

abaixo

da

temperatura de fusão (Tm) , cadeias com bases complementares vão associar-se

para formar

uma cadeia de DNA estável. Cadeias não complementares vão permanecer não ligadas. Algumas cadeias semelhantes, mas não

Fig. 16.4 – Hibridação entre sondas e amostras de DNA

7

idênticas, podem ainda hibridar se a temperatura a que forem mantidas for inferior 30 a 50º C à sua temperatura de fusão. Assim, as condições de ensaio devem garantir que a temperatura de incubação está a cerca de 10-15ºC abaixo do ponto de fusão para que as formas híbridas sejam formadas apenas entre cadeias idênticas.

Fig. 16.5 – Comparação de espécies de Neisseria por hibridação de DNA total

Qual o alvo de análise para a classificação genética dos microrganismos? Apesar da utilidade da determinação da porção G+C e dos estudos de hibridação de ácidos nucleicos, rRNAs de pequenas unidades ribossomais (16S de procariotas) têm-se tornado as moléculas de escolha para inferir sobre a filogenia microbiana e atribuir uma classificação taxonómica a nível genético. A unidade 16S é considerada virtualmente ideal para estudos de evolução microbiana uma vez que desempenha o mesmo papel em todos os microrganismos. Sendo parte integrante do ribossoma, estrutura essencial à síntese proteica, logo, à sobrevivência celular, as unidades de rRNA (5S,16S, 23S) são codificadas por genes que não toleram grandes mutações. Os rRNA têm consideráveis vantagens como marcadores filogenéticos: - São de tamanho pequeno - Encontram-se em todas as células - Possuem regiões contínuas e sequências descontínuas - Possuem sequências variáveis entre organismos e outras conservadas bastante estáveis

8

- Existem muitas cópias de cada um por célula (para cada gene formam 500 cópias de rRNA.

As moléculas 16S e 23S rRNA possuem informação suficiente para permitir uma classificação filogenética

As sequências variáveis levam à comparação entre microrganismos com proximidade filogenética enquanto sequências mais estáveis permitem o estabelecimento de uma relação entre organismos distantes. A análise comparativa de sequências de nucleótidos de 16S rRNA (cerca de 1500 bases) de milhares de organismos demonstrou a presença de sequências assinatura de oligonucleótidos. Estas sequências são curtas e conservadas, específicas de um grupo filogenético.

pp pp As

Fig.6- alinhamento de sequências de 16S rRNA

9

sequências assinatura conservadas, encontradas nos Bactéria, nunca ou raramente são encontradas nos Archae e, para as sequências deste grupo filogenético, o mesmo acontece. Da mesma forma, o rRNA 18S dos eucariotas possui sequências específicas do domínio Eucarya. Assim, o alinhamento de sequências de nucleótidos permite a construção de árvores filogenéticas. Fig.7- árvores filogenética universal

Quer rRNA completo ou, mais frequentemente, fragmentos específicos de rRNA, podem ser comparados. O alinhamento adequado de sequências nucleotídicas de pequenas subunidades de rRNA e a aplicação computorizada de algoritmos permitem a comparação de sequências de rRNA entre dois ou mais microrganismos de forma a fazer uma avaliação filogenética.

Fig.8 – Arvore filogenética baseada na comparação do gene rRNA 16S

10

Sistemas de Classificação Em 1984, o professor David Bergey, professor de bacteriologia na universidade da Pennysilvania, publicou uma classificação das bactérias que podia ser usada para a identificação das diferentes espécies bacterianas, a primeira edição do Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, contendo descrições de todas as espécies procariotas então identificadas. Houve um enorme avanço na taxonomia procariótica desde então, em particular, na sequenciação de rRNA, DNA e análise proteica, tornando possível a avaliação filogenética. Enquanto a classificação microbiana na 1ª edição era fenética (baseada na caracterização fenotípica), a 2ª edição do Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology , seguida actualmente, é assumidamente filogenética. microrganismos. A segunda edição do Manual apresenta maior informação ecológica sobre os taxa individuais, não agrupando os procariotas com importância clínica como a primeira edição. Contrariamente, as espécies patogénicas são agrupadas filogeneticamente. É de notar que ambas as distinções, fenéticas e filogenéticas, conduzem à classificação da diversidade de organismos. Por exemplo, embora as propriedades da distinção Gram sejam geralmente consideradas características fenéticas, também desempenham um papel importante na classificação genética dos microrganismos. O processo de nomenclatura bacteriana não é estanque. Os nomes das famílias e géneros estão bem estabelecidos no novo sistema (pelo menos na ausência de novas descobertas) e, de facto, muitas famílias e géneros permanecem inalterados até hoje. Contudo, o nome de ordens e taxa mais elevados não são completamente imutáveis. Devido à alteração persistente de classes e ordens, o seu uso é reduzido.

Métodos de identificação bacteriana Para identificação de uma bactéria a nível laboratorial podemos recorrer a diferentes tipos de análise de forma a chegar a uma classificação taxonómica correcta. Podem então ser efectuados testes por métodos fenotípicos e moleculares MÉTODOS FENOTÍPICOS • Exame microscópico - reacção à coloração Gram - morfologia (bacilos, cocos) - mobilidade (movimento perítrico, imobiblidade) - existência de cápsula (meio de tinta da china

Fig.9- cryptococcus neoformans

• Testes fisiológicos - Teste de Hugh and Liefson (distinção da utilização de uma via oxidativa ou fermentativa pela bactéria)

11

•

Testes Serológicos

Também usada na imunologia clínica, a serotipagem pode ser usada para diferenciar variantes ou tipos de microrganismos que diferem na composição antigénica de uma estrutura ou produto. A identificação serológica de um agente patogénico tem um elevado valor no diagnóstico diferencial. São usados anticorpos para identificar outras moléculas como, por exemplo, as proteínas existentes ao nível da parede celular ou metabolitos libertados pelo microrganismo patogénico. Há 90 tipos diferentes de streptococcus pneumoniae, cada um deles único na natureza física da sua cápsula. Estas diferenças podem ser detectadas por análise laboratorial, com anticorpos específicos, quando usados antisoros apropriados para o tipo específico de cápsula do grupo de organismos a separar. •

Testes Bioquímicos

Fig 10- Api 20 E

O api20 é um conjunto de testes preparados que permite a identificação de membros da família enterobacteriaceae e outras bactérias Gram negativas. Consiste numa banda de plástico com 20 microtubos. Os substratos liofilizados são inoculados com a cultura pura de bactérias em suspensão, permitindo a identificação do género e espécie da bactéria através da análise das características bioquímicas da mesma. Com a atribuição de pontuações aos positivos/negativos é obtida uma valência em cada coluna, sendo feita uma determinação objectiva da espécie recorrendo ao uso de software informático adequado, nomeadamente, o Api Profile Índex.

MÉTODOS MOLECULARES A aplicação de tecnologia molecular permite a diferenciação e análise de bactérias de crescimento lento. Algumas das mais precisas técnicas de identificação microbiana recorrem à análise de proteínas e ácidos nucleicos.

12

Exemplos incluem a comparação de proteínas, propriedades físicas, regulatórias, cinéticas das enzimas bacterianas, composição ácida/básica no núcleo e a sequenciação de ácidos nucleicos. •

Sondas Genéticas

A tecnologia de hibridação de DNA pode identificar um microrganismo sondando a sua composição genética. O uso de DNA clonado como sonda é baseado na capacidade da cadeia simples DNA se ligar (hibridar) com uma sequência complementar de oligonucleótidos do organismo alvo para formar uma dupla hélice. Devido à marcação fluorescente ou radioactiva da sonda é possível a identificação do DNA alvo se houver complementaridade – hibridação. O método é aplicado na pesquisa de toxinas, genes de resistência aos antibióticos (presença de β-lactamase) ou mesmo na detecção de sequências assinatura rRNA de forma a aumentar a sensibilidade da identificação filogenética. Os testes utilizando rRNA são mais Fig.11- testes de hibridação sensíveis que as sondas de DNA convencionais, mais rápidos uma vez que se obtêm resultados em 2 horas ou menos e requerem menor número de microrganismos para análise. A sensibilidade da sonda de DNA pode ser aumentada cerca de 1milhão de vezes se for usada a técnica de PCR para amplificação do DNA alvo: O PCR (Polymerase Chain Reaction) Fig.12- Amplificação por PCR é uma técnica que permite amplificar regiões de genes rRNA (rDNA) e sequências de DNA, tecnologia automática que aumenta a eficiência do processo de sequênciação de nucleotidos de subunidades ribossomais de interesse filogenético. São usados primers de PCR, que podem estar previamente disponíveis ou podem ser produzidos para amplificar regiões conservadas de rDNA microbiano. O processo ocorre de 30 a 40 ciclos em 3 passos: 1) Desnaturação – abertura da dupla hélice com exposição a 94º C 2) Construção – Uso de sequências específicas de nucleótidos, primers, para iniciar a formação as novas cadeias com exposição diminuta a 54ºC

1)

2)

3)

3) Extensão – Prolongamento da cadeia usando dNTPs por 2 minutos a 72ºC. 13

Fig.13- esquema de amplificação cíclica por PCR

Habitualmente, o gene que codifica para o rRNA ou um fragmento desse gene é amplificado por PCR. Após sequenciação nucleotídica, o gene rRNA é comparado com a base de dados internacional (National Center for Biotechnology). Este método é baseado no alto nível de conservação da subunidade 16S do rRNA bacteriano, sendo de rápida e precisa utilização (3dias).

Fig.14- marcha geral de identificação bacteriana Para que sejam identificados microrganismos não cultiváveis através da sequenciação genómica, a marcha geral do processo é alterada sendo exigida, após amplificação da sequência nucleotídica, uma separação electroforética para posterior introdução numa base informática de busca para precisa identificação.

14

Fig.15- marcha geral de identificação bacteriana para organismos não cultiváveis

Incidentes como os ataques biológicos de 2001, tiveram um papel fulcral a busca por melhoramento tecnológico e métodos mais rápidos e precisos de detecção e identificação bacteriana. A comparação do rRNA de amostras, com sequências conservadas da espécie Bacillus anthracis permitiu uma rápida e eficaz identificação de eventuais ataques bioterroristas.

15

Bibliografia usada para a aula nº 16: Slides das Teóricas e Apontamentos Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY, de Joanne M. Willey, Linda M. Sherwood e Christopher J. Woolverton, Edição Internacional – 7ª edição, McGrawHill, Cap. 19 e 35

16