Article 10 Presentation

SsrA-mediated peptide tagging caused by rare codons and tRNA scarcity.

Roche ED, Sauer RT

Модель SsrA-опосредованного мечения белков, синтезируемых с мРНК, не содержащих стопкодонов •

Рибосома останавливается на 3`-конце деградированной мРНК, т.к. не может связаться с факторами терминации.

•

Аланил -SsrA РНК связывается с остановившейся рибосомой, имитируя тРНК.

•

Реакция транспептидации – пептидная цепь переносится на аланил-SsrA.

•

Транслокация и замещение мРНК на SsrA РНК.

•

Трансляция продолжается по матричной части SsrA РНК, завершающейся стоп-кодоном

SsrA РНК кодирует пептид-маркер AANDENYALAA - данная последовательность на С-конце белка является сигналом к протеолизу.

В данной работе: •

описан чувствительный анализ SsrA-опосредованного мечения белков

•

показано, что мечение белков происходит по позициям, которые кодируются редкими аргининовыми кодонами AGA и CGA.

Основные этапы: 1. Анализ SsrA-опосредованного мечения белков 2. Кластер редких кодонов индуцирует DD-мечение 3. Определение минимального количества редких кодонов, необходимых для индукции DD-мечения 4. Сверхпродукция тРНКAGA супрессирует DD-мечение 5. Истощение пула тРНК индуцирует DD-мечение 6. Характеристика мРНК, содержащих редкие кодоны

Анализ SsrA-опосредованного мечения белков •Сконструировали мутант SsrA-DD, в котором 2 последних кодона заменены и кодируют аспартат, маркированные такой пептидной последовательностью белки устойчивы к деградации. •Получили и очистили поликлональные антитела к пептиду AANDENYALDD – для детекции меченых белков. •Активность SsrA-DD РНК изучали в клетках, не имеющих SsrA дикого типа и содержащих λN-trpAt мРНК – мРНК, не содержащая стоп-кодонов и кодирующая N-концевой домен λрепрессора.

Western-blot лизатов (С): а-b дорожки – отсутствует меченный продукт λN-trpAt при отсутствии генов SsrADD или λN-trpAt. c-e дорожки – присутствкет полоса, соответствующая DDмеченному λN-trpAt белку. Его уровень растет с увеличением времени после индукции гена λNtrpAt. b-c дорожки – присутствует полоса, соответствующая DD-меченным клеточным белкам с более высокой мол.массой. Вывод: SsrA-DD анализ позволяет обнаружить и изучать эндогенное мечение белков в E.coli.

Кластер редких кодонов индуцирует DD-мечение Сконструировали ген (λN-4AGA), кодирующий: • His6-таг, • N-концевой домен λ-репрессора, • сегмент, содержащий четыре последовательных аргинина (кодируются редкими AGA кодонами), • M2 Flag эпитоп • и кодон терминации трансляции. А. λN-4AGA ген, содержащий 4 последовательных AGA кодона и стоп-кодон внутри рамки считывания. В. Последовательности и ожидаемые мол.массы λN-4AGA белка нормальной длины и DD-меченный.

С.Western-blot лизатов D. MALDI-TOF масс-спектр полноразмерного белка λN4AGA и основного продукта DD-мечения. Основные меченные белки были очищены Ni –NTA хроматографией, ИОХ и хроматографией с обращенной фазой. Очищенный белок был проанализирован с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии.

•Масса исследуемого белка, соответствовала массе белка λN-4AGA, к которому присоединен DD-пептид сразу после первого аргинина (кодируемого первым из четырех AGA в кластере). •Белок содержал His6 и DD-пептид, но не содержал M2 Flag эпитоп.

Вывод: SsrA-опосредованное мечение индуцируется последовательно идущими редкими кодонами.

Определение минимального количества редких кодонов, необходимых для индукции мечения

Сконструировали гены, аналогичные λN-4AGA, содержащие один или два AGA кодона.

Western-blot лизатов: e-f дорожки (верхняя часть) – меченные белки наблюдаются только в случае λN4AGA и λN-2AGA, но не в случае λN-AGA.

Вывод: DD-мечение по редким AGA кодонам происходит после первого AGA, но требует присутствия последующего AGA.

Сверхпродукция тРНКAGA супрессирует DD-мечение Cконструировали плазмиду, экспрессирующую SsrA-DD и тРНКAGA. b-c дорожки (верхняя часть) - cверхэкспрессия предотвращает маркировку продуктов генов λN-2AGA и λN-4AGA.

Вывод: остановка рибосомы вызывается дефицитом свободных тРНКAGA и, как следствие, индуцирует SsrA-опосредованную маркировку белка.

Истощение пула тРНК индуцирует DD-мечение

Исследовали эффект индукции мРНК, кодирующей короткую рамку считывани с 8 последовательными AGA кодонами. Сконструировали плазмиду, экспрессирующую 8 AGA ORF под контролем арабинозы и вторую мРНК под контролем IPTG, кодирующую λN-0AGA, λN-1AGA или λN-2AGA белки.

Western-blot лизатов: е дорожка (верхняя часть) – индукция 8 AGA ORF приводит к DD-мечению λN-1AGA белка. a, b и d дорожки (верхняя часть) – DDмечение не наблюдалось в конструкциях, • не содержащие AGA кодонов • или содержащие один AGA, но в которых отсутствует 8 AGA ORF. DD-мечение белка λN-2AGA наблюдалось и в присутствии и в отсутствии 8 AGA ORF, но при экспрессии 8 AGA ORF степень DDмечения была выше.

Вывод: Появление меченного продукта λN-1AGA гена говорит о том, что единственным важным требованием для мечения по редким кодонам является дефицит соответствующих тРНК. Экспрессия мРНК, содержащих повторяющиеся AGA кодоны приводит к уменьшению количества свободных тРНК и вызывает увеличение уровня DD-мечения.

Характеристика мРНК, содержащих редкие кодоны Очистили тотальную РНК клеток, содержащих SsrA-DD РНК и λN-AGA ген (с одним, двумя или четырьмя AGA кодонами), с добавлением или без тРНКAGA. Мечение наблюдалось только в присутствии двух или четырех AGA кодонов и без добавления тРНКAGA.

Nothern-blot анализ λN-AGA мРНК проба – ДНК олигонуклеотид, комплементарный 5`- концевой части мРНК. • Разрезанной мРНК ожидаемого размера не наблюдалось во всех исследуемых условиях. • Наблюдали высокий постоянный уровень полноразмерной мРНК λN-2AGA и λN-4AGA. (d и e дорожки) Такое увеличение уровня мРНК может быть результатом остановки рибосомы на редких кодонах с последующей остановкой всех сотальных рибосом, что может служить защитой мРНК от деградации.

RNase protection анализ: Использовался как более чувствительный метод поиска мРНК, заканчивающихся на первом AGA кодоне. •РНК пробы комплементарны 3`-концевой части каждой λN-AGA мРНК. •Полноразмерная мРНК и разрезанная после первого AGA кодона. c, e и h дорожки – детекция в пробах контрольной разрезанной мРНК (2% по количеству от полноразмерной мРНК) f и i дорожки – пробы тотальной РНК из клеток, где происходило DD-мечение, содержали разрезанную РНК. Но ее уровень очень незначительно превышал значения в пробах из клеток, где DD-мечение не происходило (дорожки g и j).

Вывод: мечение по редким кодонам происходит на внутреннем участке, а не на 3`конце разрезанной мРНК.

Выводы: • Разработан простой и чувствительный метод анализа SsrA-опосредованного мечения белков • Используя данный метод,показали, что белки, синтезируемые с мРНК, которая содержит редкие кодоны, могут быть маркированы SsrA системой. • SsrA-опосредованное мечение белков происходит по редким AGA и CGA кодонам. • Дефицит тРНК является необходимым условием для мечения, индуцируемого редкими AGA кодонами. • Увеличение концентрации тРНК AGA приводило к исчезновению мечения по кластерам редких AGA кодонов. Уменьшение концентрации свободной тРНК AGA приводило к значительному увеличению мечения и так же к мечению по одиночным редким AGA кодонам. Повторяющиеся редкие AGA кодоны вызывают SsrA-опосредованное мечение, в результате истощения доступного пула тРНК.