Article 9 Presentation

In Vitro Trans Translation Mediated by Alanine-charged 10Sa RNA H. Himeno et al, J. Mol.Biol. (1997)

Гипотеза транс-трансляции (Keller, 1996)

(малая стабильная бактериальная РНК)

Предпосылки к гипотезе транс-трансляции: 1.

5’ и 3’ концы всех бактериальных 10Sa РНК образуют тРНК-подобную вторичную структуру. A 10Sa РНК E.coli

B Каноническая дрожжевая тРНКPhe

(x1, x2 – места образования сшивок при облучении УФ)

Предпосылки к гипотезе транс-трансляции: 1.

5’ и 3’ концы всех бактериальных 10Sa РНК образуют тРНК-подобную вторичную структуру.

3’ ССA

Акцепторный стебелек

TψC петля

Предпосылки к гипотезе транс-трансляции: 1.

5’ и 3’ концы всех бактериальных 10Sa РНК образуют тРНК-подобную вторичную структуру. Эта укладка соответствует минимальным структурным требованиям для узнавания EF-Tu. Причем G*U пара в третьем положении характерна для аланиновых тРНК.

3’ ССA

Акцепторный стебелек

TψC петля

Предпосылки к гипотезе транс-трансляции: 2.

10Sa РНК содержит небольшую ORF.

Предпосылки к гипотезе транс-трансляции: 2.

10Sa РНК содержит небольшую ORF. У бактерий при трансляции с мРНК, не содержащих стоп-кодон, образуются белки, С-котерминальные по 11 аминокислотным остаткам (AANDENYALAA). И последние 10 аминокислот ORF 10Sa совпадают с десятью С-концевыми аминокислотами этой последовательности. Причем единственная несовпадающая аминокислота – аланин!

Гипотеза транс-трансляции: “гибридная” РНК – tmRNA – переключает рибосому на себя в качестве матрицы. Для этого tmRNA вначале выступает как tRNAAla.

Альтернативные гипотезы: белковый транс-сплайсинг:

N-extein

tag

protein

C-extein

dimerization Protein splicing

Tagged protein

Альтернативные гипотезы: белковый транс-сплайсинг Предсказание: при 10Sa РНК – зависимом синтезе белка будет происходить включение не только последних десяти аминокислот ORF, но и предыдущих.

Например, не только Ala, Tyr, Asp, Glu, но и Val, Ile, Arg. Отрицательным контролем будет аминокислота, вообще не встречающаяся в ORF, например, Ser. Внутренний контроль – молярное соотношение включающихся аминокислот. Включение меченой аминокислоты проверяют в бесклеточной системе трансляции на основе S-30 фракции, полученной из ΔssrA штамма E. coli (ssrA – это ген 10Sa РНК). Матрицей служит искусственная мРНК без стоп-кодонов (polyU). В систему добавляют 10Sa РНК, предварительно загруженную аланином.

Альтернативные гипотезы: белковый транс-сплайсинг Предсказание: при 10Sa РНК – зависимом синтезе белка будет происходить включение не только Ala, Tyr, Asp, Glu, но и Val, Ile, Arg. Отрицательным контролем будет Ser. Закрашенные кружочки соответствуют опытам без добавления polyU.

Ala

Val

Tyr

Ile

Asp

Arg

Glu

Ser

Альтернативные гипотезы: белковый транс-сплайсинг Предсказание: при 10Sa РНК – зависимом синтезе белка будет происходить включение не только Ala, Tyr, Asp, Glu, но и Val, Ile, Arg. Отрицательным контролем будет Ser. Закрашенные кружочки соответствуют опытам без добавления polyU. Результаты и выводы: ORF внутри 10Sa РНК служит матрицей для трансляции, но не вся, а последние 10 смысловых кодонов. Гипотеза белкового транс-сплайсинга неверна. Первая аминокислота – аланин, не кодируемый матрицей.

Ala

Val

Tyr

Ile

Asp

Arg

Glu

Ser

Проверка важности аланин-акцепторной способности 10Sa РНК для стимуляции трансляции Была получена мутантная 10Sa РНК, неспособная аминоацилироваться аланином in vitro (G*U заменен на A*U в третьем положении) Пустые кружочки – нормальная 10Sa РНК, заполненные – мутантная.

Проверка важности аланин-акцепторной способности 10Sa РНК для стимуляции трансляции Мутантная 10Sa РНК (квадратики) неспособна стимулировать включение кодируемых ею аминокислот. Кружочки соответствуют нормальной 10Sa РНК

Ala

Tyr

Альтернативные гипотезы: транс-сплайсинг РНК:

мРНК

10Sa РНК

Побочный продукт транс-сплайсинга

Альтернативные гипотезы: транс-сплайсинг РНК: Предсказание: нозерн-блот с зондами к некодирующей части 10Sa РНК позволит детектировать продукты иной длины, чем 10Sa РНК. Ассоциация 10Sa РНК с рибосомой в градиенте сахарозы не будет более существенной, чем для мРНК мРНК

10Sa РНК

Побочный продукт транс-сплайсинга

Альтернативные гипотезы: транс-сплайсинг РНК: Результаты и выводы: продукты транс-сплайсинга отсутствуют. Ассоциация с рибосомой кореллирует со способностью 10Sa РНК к аминоацилированию аланином. Гипотеза транс-сплайсинга неверна.

Нормальная 10Sa РНК

Мутантная 10Sa РНК

Вывод: Описанные эксперименты по 10Sa РНК -зависимой трансляции in vitro исключают возможности транссплайсинга на уровне белка или РНК. Опыты согласуются с гипотезой транс-трансляции. В пользу существования особого механизма транстрансляции также говорит наличие участка комплементарности между 10Sa РНК и 16S рибосомной РНК. Такое взаимодействие подтверждается результатами экспериментов со сшивками.

Согласно современным представлениям, транс-трансляция является системой контроля качества РНК (и в какой-то степени белка).