Apostila Biotecnologia De Alimentos

UNIJUI – UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RS DBQ – DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA E QUÍMICA CURSO - QUÍMICA INDUSTRIAL DE ALIMENTOS

INDICE

APRESENTAÇÃO........................................................................................................................... 1 INTRODUÇÃO A TECNOLOGIA DE FERMENTAÇÕES........................................................... 2 MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL

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ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR.....................................

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CRESCIMENTO CELULAR ........................................................................................................... 27 CLASSIFICAÇÃO DOS PROCESSOS............................................................................................ 37 EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES – STARTERS........................................................... 40 SISTEMAS DE FERMENTAÇÃO.................................................................................................. 48 INTRODUÇÃO AO ESTUDO DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA........................................... 54 SEPARAÇÃO DOS PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO.............................................................. 66 SEPARAÇÃO DOS PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAÇÃO COM LEVEDURAS....... 73 PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAÇÃO COM BACTÉRIAS.......................................... 77 DIGESTÃO ANAERÓBICA (FERMENTAÇÃO METANOGÊNICA)......................................... 79 TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS.............................................. 89

APRESENTAÇÃO

A Biotecnologia é um ramo muito amplo da Tecnologia que se ocupa da transformação ou tratamento de materiais de origem biológica. Spinks (1980) define Biotecnologia como a utilização de organismos vivos ou sistemas biológicos para a produção industrial e seu uso em serviços de saneamento. A tendência atual de incluir no termo Biotecnologia, em seu aspecto mais essencial, a Microbiologia Industrial, que trata do aproveitamento dos microrganismos como agentes de degradação e síntese. Por semelhança dos conceitos fundamentais que regem o tratamento biológico de efluentes, o cultivo de células animais e vegetais e a produção de certos medicamentos. Assim, também devido ao seu amplo significado, pode englobar também aspecto igualmente importante da Ciência, Tecnologia e Engenharia de Alimentos. De certa forma, os processos de fermentação representa uma elo que liga as antigas artes de elaboração de alimentos (queijo, vinho, ...), mediante o uso de uma flora microbiana natural com a moderna industria de fermentação de alimentos que utilizava cultivos puros e sofisticados equipamentos de controle do processo. A produção em larga escala de proteínas de organismos unicelulares, produção de antibióticos, produção de células animais e vegetais e a produção compostos químicos a partir de matérias-primas renováveis em substituição aos combustíveis fósseis, são exemplos de outras áreas onde os processos fermentativos podem ser utilizados. O componente curricular Biotecnologia de Alimentos pretende tem como objetivo principal estudar alguns elementos essenciais e básicos dos processos fermentativos: introdução a microbiologia industrial, sistemas de fermentações, desenho de fermentadores, cinética de crescimento, metabolismo microbiano, esterilização na indústria fementativa, produção de enzimas, cultivos starters. Objetiva, também, abordar de forma mais detalhada alguns tipos de fermentação: alcoólica, láctica, acética, metanogênica.

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Introdução à biotecnologia de alimentos

INTRODUÇÃO A TECNOLOGIA DE FERMENTAÇÕES O termo Fermentação deriva do latim fervere (ferver), devido ao aparecimento das bolhas devido a produção de dióxido de carbono pela ação das leveduras sobre o extrato de frutas ou grãos de malte; ⇒

Significado bioquímico: relata a geração de energia pelo catabolismo de compostos orgânicos; ⇒ Produção de vinho: 10.000 a.C. - provavelmente o vinagre foi descoberto na mesma época e as bebidas alcoólicas destiladas surgiram a mais de 10.000 a.C. na China; ⇒ Cerveja: 5000 - 6000 a.C. - egípcios deixavam a cevada germinar em potes de barro, após estrusavam e amassavam os grãos lavando-os após para obter a bebida, ainda, utilizavam as leveduras da cerveja produzir CO2 para o crescimento de pães; ⇒ Leite e derivados lácteos: dados apontam que em 5000 a.C. se observou que o leite quando retido no estômago de terneiros jovens coagulava-se (ação enzimática); ⇒ Produtos cárneos: conforme Erichsen (1983), cerca de 1500 a.C. o homem já sabia que a carne finamente triturada e misturada com sal e especiarias poderia ser preservada, esta carne era seca e enrolada (rolos) mantendo suas principais qualidades, como um flavor agradável Este produto foi o precursor da lingüiça fermentada produzida atualmente. O nome salame provém da cidade de Salamis, destruída a mais de 2000 anos, situada na costa oeste da ilha Grega de Cypros. Exame microscópico do sedimento de cerveja escavado de urnas que datam de 3400 a 1440 a.C. demonstram claramente que na maioria das vezes continham leveduras, observando-se uma pureza maior nos sedimentos mais recentes. A necessidade de preservar a carne da caça e de animais domésticos abatidos durante o inverno e consumidos no verão (summer sausage), fizeram com que o homem procurasse soluções para a preservação do produto. Assim, os produtos cárneos fermentados tornaram-se de grande importância no mercado alimentar permitindo preservar a carne e atribuir a ela sabor e aroma característicos da tecnologia usada. Ø Antonie van Leeuwenhoek, um pioneiro no uso do microscópio, foi o primeiro a examinar em 1680 gotas de cerveja fermentada. Entretanto esta descoberta foi esquecida...... Ø 1856-1857: Louis Pasteur, após investigações detalhadas sobre as leveduras da cerveja e do vinho, concluiu finalmente que leveduras vivas fermentavam o açúcar em etanol e CO2 quando em anaerobiose. Ø Pateur também observou muitas outras fermentações: Ex.: observou provavelmente um Penicillium que fermentava D-tartarato de amônio em uma mistura racêmica de D e L-tartarato (tartarato de Na, K); Ø Observou também como uns microrganismos cilíndricos produziam ácido butírico somente em condições anaeróbias e investigou a produção de ácido acético por fermentação; Ø 1870 - Pasteur e outros pesquisadores observaram os efeitos antagonistas de um microrganismo frente a outros e previram suas aplicações terapêuticas; Prof. Raul Vicenzi

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1881 - Robert Kock estudou e desenvolveu técnicas de cultivo puro assim como outros métodos bacteriológicos clássicos utilizados até hoje; Ø Dois elementos vitais deram inicio a era moderna da tecnologia de fermentações industriais: • Emprego de fungos e leveduras na modificação de alimentos e bebidas e os estudos microbiológicos pioneiros de Pasteur e Kock. Ø Desenvolvimento de fermentações em superfície ou semi-sólidas surgiu com o desenvolvimento de alimentos orientais e durante as grandes navegações; • Capacidade hidrolítica de determinados fungos em hidrolisar o amido e proteínas na produção de molho de soja, este foi o inicio das fermentações industriais. Ø Cultivo de algas e fungos deu inicio ao processo industrial de obtenção de proteínas alimentícias microbianas (SCP - proteínas de organismos unicelulares) e de inóculos de microrganismos Ø Produção de vinagre e os estudos de Pasteur sobre a produção de ácidos prepararam o caminho para o desenvolvimento de fermentações que produzissem ácidos orgânicos; Ø O desenvolvimento da metodologia de cultivos puros por Kock proporcionou o surgimento de técnicas que permitiram estudar as aplicações industriais de espécies microbianas individuais, iniciando-se o emprego de cultivos puros, meios esterilizados e condições assépticas nas fermentações industriais. FERMENTAÇÃO DE ALIMENTOS Fermentação de pão, queijo e cerveja bem como bebidas alcoólicas desenvolveram-se para satisfazer as exigências comerciais modernas de produção em grande escala, com qualidade elevada e constante, custos competitivos e variedade de produtos. Ø Produção de cultivos “Starters” para produtos lácteos e o emprego de enzimas industriais melhoraram a eficiência dos processos, assim como a automação e controle da qualidade na produção de pão e produtos lácteos. • Fermentação de pão em temperaturas mais elevadas e com maior quantidade de inoculo; • Uso de amilases microbianas na produção de açúcares fermentescíveis a partir de grãos de amido, proporcionando açúcares as leveduras para que fermentem liberando CO2 (crescer a massa de pão e produzir textura característica). Técnicas de Pasteurização: permitiram a produção de cerveja em escala industrial fazendo com que industrias artesanais de cerveja, vinhos, licores passassem rapidamente a grandes complexos produzindo em grande escala. Técnicas de controle de processo como: (Para garantir maior vida-de-prateleira aos alimentos) Ø Controle da velocidade de inoculação; Ø Viabilidade e condições de armazenamento das leveduras; Ø Controle das condições de oxigênio dissolvido; Ø Controle da concentração de Nitrogênio solúvel e de açúcares fermentescíveis no álcool; Ø Controle da temperatura do processo; Ø Fermentação em processos contínuos; Prof. Raul Vicenzi

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Introdução de inovações tecnológicas como: Ø Obtenção de cerveja com elevadas concentrações de mosto; Ø Emprego de cereais não malteados e enzimas microbianas Ø Produção de cervejas com baixos níveis de carboidratos Ø Aplicação de técnicas genéticas convencionais para melhorar a qualidade das leveduras e eliminar características indesejáveis. LEVEDURAS DE PANIFICAÇÃO Ø Século XVII os padeiros obtinham suas leveduras nas cervejarias locais; • Devido ao seu sabor amargo e atividades de fermentação variáveis, foram gradualmente sendo substituídas por leveduras procedentes de fábricas de bebidas alcoólicas. Ø 1781 obtém-se as primeiras leveduras de panificação prensadas, obtidas através do processo “Holandês” e posteriormente em 1846 mediante o processo denominado “Viena” • Ambos obtinham rendimentos baixos, 5 a 14% respectivamente referente a matéria-prima e 30% de álcool. • 1879-1919 - avanços substanciais nos processos fermentativos com uso de biomassa permitindo a obtenção industrial de leveduras para panificação de forma independente de bebidas alcoólicas; • 1879 - Marquardt introduziu a aeração no processo fermentativo de cereais permitindo aumentar o rendimento e diminuindo a produção de álcool a 20%. INOVAÇÕES TECNOLÓGICAS: Adição gradual de açúcar Surge o primeiro processo de retro-alimentação

Permite elevar a eficiência do processo ate próximo do máximo teórico sem a formação conjunta de álcool.

Durante a Primeira Guerra Mundial a Alemanha desenvolve a produção de leveduras de panificação usando melaço (todo resíduo dos processos industriais da época) como substrato, com a finalidade de produzir proteína para o consumo humano - Primeiro processo moderno para produção de SCP. Durante a Segunda Guerra Mundial, também na Alemanha, inicia-se a produção de SCP para consumo humano e animal a partir de Candida utilis, utilizando melaço procedente da produção de papel e polpa de celulose, obtendo-se os açúcares (substrato) a partir da hidrólise ácida da madeira. USA, Suíça, Taiwan e Rússia passam também a utilizar este processo. ÁCIDOS ORGÂNICOS Ø 1881 inicia-se a produção comercial de ácidos orgânicos sendo que até hoje 50% do ácido láctico utilizado a nível industrial é produzido via fermentação usando Lactobacil1us delbrueckii. Prof. Raul Vicenzi

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Ácido Cítrico extraído inicialmente a partir do suco de limão e posteriormente sintetizado a partir do glicerol. Ø 1923 - inicia-se a produção de Citrato via fermentação industrial, atualmente estima-se uma demanda aproximada de 450.000 toneladas/mês produzidas exclusivamente por fermentação, inicialmente: • Empregava-se cultivo em superfície de Aspergilius niger como organismo produtor (citrato). • Após a 2ª Guerra Mundial introduziu-se o processo de cultivo submerso. Entretanto em 1977 desenvolve-se o processo que utiliza Candida, muito mais eficiente. Outros ácidos orgânicos são produzidos de forma econômica e rentável por fermentação: Ex.: produção de Acido Glucônico e Acido Acético, este obtido pela oxidação do etanol utilizando Acetobacter aceti. Entretanto, o Ácido Acético em escala industrial é produzido somente por via química. ÁLCOOL E CETONAS Ø Durante Primeira Guerra Mundial a Alemanha impedida de importar azeites vegetais utilizados na produção de glicerol, componente para produção de explosivos, desenvolve a primeiro processo fermentativo de produção de glicerol, produzido por leveduras a partir do etanol em presença de bissulfito de sódio; Ø Durante a Primeira Guerra na Inglaterra é desenvolvido o processo de fermentação acetonabutanol por via anaeróbia, utilizando Clostridium acetobutylicum, este foi o primeiro processo em grande escala que necessitava métodos de cultivos puros para prevenir a contaminação. • Após a Guerra a demanda deste produto diminuiu, entretanto aumentou a procura por n-butanol, produzido por fermentação até os anos 50, sendo substituído pelo n-butanol produzido a partir do petróleo, cujo preço era mais baixo que o preço do amido e dos substratos a base de açúcar utilizados no processo fermentativo. • 1941 - Inicia-se a implementação da indústria da fermentação alcoólica nos USA, após revogarse a proibição da produção de álcool por bioprocessos, sendo responsável então por 77% do álcool industrial produzido Ø 1973 - A crise do petróleo faz surgir projetos para produção de combustíveis alternativos. • Surge o PROÁLCCOL no Brasil, projeto que em 1987 chegou a produzir 3 bilhões de galões de etanol/ano, a partir da cana-de-açúcar. • Nos USA inicia-se o “Gasohol Program” que destinava-se a produzir álcool a partir do milho, adicionando cerca de 10% na gasolina. Este projeto fez surgir um número muito grande de plantas industriais de pequena e grande escala utilizando processos contínuos e descontínuos. AMINOÁCIDOS Glutamato Monosódico e a Lisina são os que se produzem em maiores quantidades, cerca de 500.000 e 80.000 toneladas/mês, respectivamente. A produção de aminoácidos é resultado do trabalho de pesquisa sobre os mecanismos bioquímicos que regulam a biosíntese destes compostos por microrganismos, obtendo-se superproduções a partir de mutações e do controle do processo de fermentação. Prof. Raul Vicenzi

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As novas técnicas passam a: Ø Estimular as células para que usem substratos alternativos; Ø Prevenção ou impedimento de reações laterais; Ø Indução e ativação de enzimas biosintéticas; Ø Redução ou inibição de atividades enzimáticas que poderiam degradar o produto e, finalmente facilitar a excreção do aminoácido pelo microrganismo. Ø As pesquisas que culminaram com o desenvolvimento do processo de fermentação para produção de ácido glutâmico foram as responsáveis pelo grande avanço na produção de aminoácidos por fermentação. • Hoje a maioria dos aminoácidos comerciais são produzidos por fermentação. Assim como a de monofosfatos de inosina e a guanosina utilizados como potencializadores de sabor. BIOPOLIMEROS Ø Goma Xantana - biopolímero mais importante atualmente em função do volume de produção, utilizada como gelificante ou estabilizante de suspensões. Produzido por fermentação utilizando a bactéria Xanthomonas campestris. Outras gomas: Ø Alginato produzido pelo Azetobacter vinelandii; Ø Pululano produzido pelo Aureobasidium pullulans; Ø Escleroglucana produzido pelo Sclerotinum; Ø Gelano produzido pela Pseudomonas elodea Gomas em geral possuem elevados pesos moleculares e altas viscosidades causando problemas nos processos de mistura, transferência de massa e calor em fermentadores. Estes aspectos devem ser levados em conta na hora de escolher ou desenhar um aparelho de fermentação. POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) : poliéster termoplástico acumulado intracelularmente em alguns tipos de bactérias (Bacillus subtilis, Pseudomonas oleovorans, Alcaligenes eutrophus, entre outras) até um nível de 80% da massa seca celular, sua produção permite a fabricação de plásticos biodegradáveis. VITAMINAS A maioria das vitaminas é produzida por métodos químicos. Entretanto algumas vitaminas podem ser produzidas por fermentação. Ex.: vitaminas do grupo B como a tiamina, biotina, ácido fólico, ácido pantotênico, piridoxamina, vitamina B12 e riboflavina. • A síntese química da vitamina B12 é muito complexa sendo que sua produção comercial só é viável por via fermentativa utilizando Pseudomonas. Ø Riboflavina: sua produção por fermentação compete eficazmente com os métodos de síntese e semi-síntese, sendo que 30% da demanda mundial é produzida por fermentação.

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Recentemente uma cepa recombinante de Bacillus subtilis foi patenteada, sendo capaz de produzir 4,5g de riboflavina em 24 horas de fermentação, período muito inferior aos 5 dias necessários quando se utiliza Ascomycetes.

ANTIBIÓTICOS Pasteur identificou efeitos antagonistas de alguns microrganismos frente a outros e julgou que poderiam ter efeito terapêutico. Ø 1928 - Alexander Fleming observou que Penicillium notatum, contaminante dos cultivos de Staphylococcus aureos, matava as bactérias, identificando o ingrediente ativo, a Penicilina, podia inibir outras bactérias. Ø Após a penicilina ter sido isolada na sua forma ativa, em 1940 nos USA, Florey e Chain demonstraram sua destacada atividade antibacteriana desenvolvendo-se então um processo fermentativo comercial para sua produção. Este fato marcou o início da indústria de antibióticos. Ø Seguiu-se então a descoberta de Ø Estreptomicina a partir de espécies de Streptomyces Ø Cefalosporinas a partir de Cephalosporium acremonium Com o desenvolvimento a partir de 1940 de técnicas de genética microbiana que implicaram em técnicas de mutação e seleção de microrganismos, permitiu aumentar muito o rendimento da produção de penicilina de poucas mg/L para até 20g/L de cultivo. Iniciam-se também, nesta época, os estudos sobre a produção de metabólitos secundários, pequenas moléculas como os antibióticos que não têm papel importante no crescimento e manutenção das células. TRANSFORMAÇÕES DE ESTERÓIDES O uso de microrganismo, o domínio das técnicas microbiológicas e fermentativas permitiu fazer transformações enzimáticas altamente seletivas e especificas, representando um grande avanço na produção de fármacos, como os hormônios esteróides. Ø 1940 - descobriu-se que a cortisona, esteróide secretado pela glândula adrenal, aliviava a dor de pacientes com artrite reumática, o que fez desenvolver-se um processo de síntese química para sua produção que requeria 37 etapas, a um custo de 200 U$/g; Ø 1952 - cientistas descobrem que uma cepa de Rhizopus arrhizus hidroxilava a progesterona, produzindo 11á-hidroxiprogesterona, permitindo que o custo da síntese de cortisona caísse para 11 etapas e o custo reduzisse para U$ 16/g. Ø 1980 - Introduziram-se modificações no processo e os custos foram diminuindo gradativamente de forma que hoje estes custos estão próximos de U$ 0,46/g. Técnicas semelhantes de biotransformação microbiana permitiram a síntese de outros esteróides como a aldosterona, prednisona e prednisolona, assim como de outros fármacos importantes na medicina.

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ETAPAS DO PROCESSO FERMENTATIVO 1) Formulação do meio de cultura a ser usado no processo; 2) Esterilização do meio de cultura, fermentadores e equipamentos auxiliares; 3) Produção de uma cultura pura e ativa em suficiente quantidade para inocular no fermentador; 4) Crescimento dos organismos no fermentador sob condições ótimas para a formação do produto 5) Extração do produto e sua purificação; 6) Disposição dos efluentes produzidos no processo. ÁREAS DE APLICAÇÃO DA FERMENTACÃO INDUSTRIAL A) ALIMENTOS v Massas fermentadas (pão, panetone); v Carnes fermentadas (salame, lingüiça); v Bebidas fermentadas (cerveja, vinho ...); v Bebidas destiladas (conhaque, aguardente ...); v Leite fermentado (iogurte, queijo ...); v Enzimas (proteases, amilases, glicose oxidase ...); v Condimentos (vinagre, glutamato...) v Aminoácidos (lisina, ácido glutâmico); v Polissacarídeos (dextrano) B) PRODUTOS AGROINDUSTRIAIS v Álcool (industrial e carburante); v Antibióticos de uso veterinário; v Biogás; v Hormônios de crescimento vegetal. C) MEDICAMENTOS v Antibióticos; v Vacinas; v Vitaminas; v Hormônios de consumo humano (insulina); v Aminoácidos. D) ÁCIDOS ORGÂNICOS E SOLVENTES v Ácido cítrico; v Ácido acético; v Etanol; v Propanol; v Butanol; v Ácido láctico. Prof. Raul Vicenzi

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INTER-RELAÇÕES ENTRE MICRORGANISMOS E ENZIMAS As relações existentes entre microrganismos e as enzimas neles contidos são muito importantes quando se deseja explorar as enzimas que levam a determinadas reações químicas especificas. As enzimas podem ser isoladas e assim a biotecnologia enzimática pode convenientemente ser manipulada em bio-reatores apropriados. Por outro lado as células microbianas quando encontram-se imobilizadas em um suporte sólido, atuam como catalizadores que levam a reações químicas concretas, da mesma maneira que as enzimas isoladas, o que denota menos trabalho preparativo. Desta maneira uma grande parte da tecnologia de fermentações se refere ao cultivo de microrganismos em grande escala. A seleção e aplicação dos princípios da engenharia genética aplicada a microrganismos apropriados permitem manipular o conteúdo enzimático destes em determinadas condições. Também o crescimento de microrganismos em um substrato apropriado provocará a indução da enzima necessária para a degradação desse substrato de crescimento dentro da célula. Ex.: o cultivo de levedura sobre maltose induzirá a biossíntese da enzima maltase, (uma á glucosidase) que degrada maltose a glicose, que é necessária para a produção de energia química em forma de ATP dentro da levedura. MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL Introdução – Os produtos comercialmente importantes das fermentações industriais são de 4 categorias: células microbianas, moléculas grandes como enzimas e polissacarídeos, produtos básicos e metabólitos secundários que não são necessários para o crescimento celular. A produção comercial dos produtos de fermentação tem utilizado principalmente diversas espécies de bactérias, leveduras e fungos, ainda que os avanços recentes no desenvolvimento de técnicas de cultivos têm permitido utilizar células mais complexas nos processos de fermentação. Microrganismos Industriais – Na natureza existem duas classes principais de células, ambas utilizadas nos processo de fermentação industrial: procariontes - células bacterianas; eucariontes -leveduras, fungos, células animais e vegetais. Os microrganismos também se diferenciam em função de suas exigências de oxigênio, podendo dividir-se em estritamente aeróbias, como os Streptomyces e a maioria dos fungos filamentosos, que podem desenvolver-se unicamente em presença de O2 e os estritamente anaeróbios, como os Clostridios, que unicamente podem crescer na ausência de O2 e os microorganismos facultativos, entre eles as leveduras industriais, que podem crescer em situação de aerobiose e anaerobiose. As bactérias utilizadas nos processos fermentativos são principalmente quimiorganotróficos, isto é, podem obter sua energia e seu carbono por oxidação dos compostos orgânicos. As bactérias podem dividir-se em Gram positiva e Gram negativa, em função de suas resposta a coloração de Gram. A reprodução se dá por divisão assexuada. Os esporos são produzidos usualmente em resposta Prof. Raul Vicenzi

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as condições adversas do meio, porque são mais resistentes ao calor e aos compostos tóxicos que as células vegetativas e posteriormente germinam em condições apropriadas. As bactérias são desprovidas de clorofila, mas podem possuir outros pigmentos fotossintéticos Os fungos (bolores) também são quimiorganotróficos e os mais importantes utilizados nas fermentações se classificam principalmente em dois grupos: os Zigomycotina, asseptados dos gêneros Mucor e Rhizophus e os Deuteromycotina, septados dos gêneros Thicotherma, Aspergillus, Penicillium Fusarium e Aureobasidium. Os fungos são desprovidos de clorofila ou outros pigmentos fotossintéticos. Sua reprodução pode ser assexuada (esporulação) ou sexuada. As leveduras são fungos geralmente unicelulares e que se reproduzem de forma assexuada (por gemação ou divisão binária) ou sexuada. A levedura mais utilizada nos processos fementativos industriais é a Saccharomyces cerevisiae, principalmente para produção de álcool e nas panificações. Esta levedura não degrada a lactose, por isso para produzir álcool e biomassa a partir de soro de leite é utilizada Kluyveromyces lactis, que possuem as enzimas necessárias para degradar lactose. Outras leveduras importantes são: Candida utilis e Endomycopsis fibuliger Os vírus não têm estrutura celular alguma, possui o material genético (DNA ou RNA) contido por uma camada de proteína. Não possuem atividade metabólica e, portanto, não sintetizam protoplasma nem crescem. Em conseqüência disto sua multiplicação não pode ser feita por um processo de divisão, como nos microrganismos celulares. Novos vírus são “produzidos” pelas células nas quais penetram, de acordo com as informações contidas no seu ácido nucléico. São agentes submicroscópicos que infecta as plantas, animais e bactérias. Os vírus bacterianos (bacteriófagos) infectam os processos de fermentação de cepas microbianas e causa sérios problemas, particularmente nos cultivos “starter” utilizados no processamento de alimentos. Células animais e células vegetais também podem ser utilizadas nos processos fermentativos industriais, principalmente para a produção de antibióticos e hormônios vegetais. Necessitam de um meio muito nutritivo e são sensíveis a flutuações de fatores externos como temperatura, pH, O2 e CO2 dissolvidos. FONTES NUTRICIONAIS PARA OS MICRORGANISMOS Basicamente as necessidades nutricionais dos microorganismos são as mesmas de todos os seres vivos, que para renovarem seu protoplasma e exercerem suas atividades, exigem fontes de energia e fonte de material plástico. Nos seres superiores encontra-se apenas dois tipos nutritivos: a) os vegetais são fotossintéticos (obtém energia da luz solar) e autotróficos, se nutrem exclusivamente de substâncias inorgânicas; b) os animais são quimiotróficos, pois obtém energia as custas de reações químicas e heterotróficos, por exigirem fontes orgânicas de carbono. Entre os microrganismos há uma grande variedade de tipos intermediários. FONTES DE ENERGIA a) Algumas bactérias realizam fotossíntese, porém não produzem oxigênio. Podem utilizar fontes inorgânicas (liotróficas) ou compostos orgânicos (organotróficas) como doadores de elétrons. b) Os fungos, leveduras e a grande maioria das bactérias são quimiossintéticas, obtendo energia as Prof. Raul Vicenzi

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custas de reações químicas, nas quais substratos adequados são oxidados com desprendimento de energia. Estes substratos podem ser inorgânicos (litotróficos) ou orgânicos (organotróficos). No primeiro grupo encontramos apenas bactérias, como por exemplo, Thiobacillus, capazes de oxidar enxofre, produzindo ácido sulfúrico, podem ser utilizados na lixiviação de metais, como cobre e urânio. A grande maioria das bactérias e a totalidade de fungos, leveduras e, também, os protozoários são quimiorganotróficos. FONTES DE MATERIAL PLÁSTICO MATÉRIAS–PRIMAS COMO FONTE DE CARBONO Para os autotróficos a única fonte de carbono necessária é o CO2 . Para os heterotróficos, há necessidade de suprir o meio com outras fontes de carbono, naturais ou sintéticas: • Celulose, Amido, Sacarose, Lactose, Glicose (alto custo), Óleos, Metanol, Etanol; • Melaço de cana-de-açúcar – Composição variável (rico em aminoácidos, vitaminas, minerais, vários açúcares); corrigir deficiências (N, P, S); • Extrato de Malte –cevada malteada; 90-95% de CHO; rico em aminoácidos. MATÉRIAS–PRIMAS COMO FONTE DE NITROGÊNIO Quanto às necessidades de nitrogênio há três categorias principais de microrganismos: Alguns microrganismos, especialmente bactérias, retiram o nitrogênio diretamente da atmosfera e o converte em nitrogênio orgânico. Muitos fungos e quase totalidade das bactérias utilizam compostos inorgânicos de nitrogênio, como amônio e nitratos. Algumas bactérias exigem fontes orgânicas de nitrogênio. De um modo geral, adicionar aminoácidos ou hidrolisados de proteínas favorece o crescimento da maioria dos heterotróficos. o Sais de Amônio, Sais (nitratos); Uréia o Líquido da maceração do milho (± 4% N); o Extrato de levedura e Peptonas (laboratório) o Ar atmosférico ÍONS INORGÂNICOS ESSENCIAIS Além de nitrogênio, os microrganismos exigem uma série de outros elementos, sob a forma de compostos inorgânicos, alguns em quantidade bem maiores que outros. o Macronutrientes – P, S, K, Mg, Ca, Fe o Micronutrientes – Cu, Zn, Co, B, ... FATORES DE CRESCIMENTO São os compostos orgânicos indispensáveis a um determinado microorganismo, que ele não consegue sintetizar. Tais fatores devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa crescer, como por exemplo vitaminas (especialmente do complexo B), aminoácidos, nucleotídios, ácidos graxos, entre outros. Aspecto importante dessa exigência resulta do fato que, quando um microrganismo exige um determinado fator, seu crescimento será limitado pela quantidade desse fator presente no meio. Prof. Raul Vicenzi

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Dentro de certos limites, o crescimento será proporcional ao teor do composto limitante. Isso permite a elaboração de um método de dosagem de certos compostos, baseados na medida do crescimento microbiano. Essa é a base da dosagem microbiana de uma série de substâncias, principalmente aminoácidos e vitaminas. AGUA A água não constitui um nutriente, mas é absolutamente indispensável para o crescimento dos microrganismos. Seu papel é múltiplo. Os microrganismos se nutrem pela passagem de substâncias em solução através da membrana citoplasmática. Exerce função na regulação da pressão osmótica e regulação térmica. A maior parte dos microrganismos morre rapidamente pela dessecação, a não ser quando esta é precedida pelo congelamento brusco (liofilização) OXIGÊNIO ATMOSFÉRICO Como a água o oxigênio não é um nutriente e funciona apenas como receptor de hidrogênio nos processos de respiração aeróbica. Os microrganismos se comportam diferentemente em presença de O2 livre: Aeróbios – exigem oxigênio livre; alguns, porém, em pequenas quantidades não tolerando as pressões normais de O2 atmosférico; Anaeróbios – não toleram a presença de O2 livre; Facultativos – crescem na presença ou ausência de O2 . Entre as bactérias encontra-se os três tipos de comportamento. Os fungos (bolores) são estritamente aeróbios, enquanto as leveduras são aeróbias ou facultativas. CLASSIFICAÇÃO DOS MOSTOS SINTÉTICO: composição conhecida quantitativamente e qualitativamente é usado em pesquisas quando se quer controlar exatamente o curso de uma fermentação. O objetivo é saber a rota de fermentação, saber quanto e quando e quais os substratos que estão sendo utilizados pelos Microorganismos. Tem um alto custo. COMPLEXO: composição não é bem definida, estão enquadrados os meios naturais tais como: caldo de cana, melaço, suco de uva, extrato de leveduras, enquadram-se todos os mostos naturais. CARACTERISTICAS DO MOSTO Requerimentos básicos: 1) Proporcionar o máximo rendimento de produto ou biomassa por grama de substrato usado; 2) Produzir a máxima concentração de biomassa ou produto; 3) Permitir o máximo rendimento na formação do produto; 4) Produzir o mínimo de subprodutos indesejáveis; 5) Ser de uma qualidade permanente e estar disponível durante o ano todo 6) Não sofrer degradação durante a esterilização 7) Não deverá causar problemas em outras etapas do processo fermentativo particularmente: aeração, agitação, extração, purificação e tratamentos dos efluentes. Prof. Raul Vicenzi

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SUBSTRATOS UTILIZADOS NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA a) Açucaradas: neste grupo temos as diretamente fermentescíveis (contém monossacarídeos: Ex.: glicose, frutose, suco de uva, maçã, pêra, etc.). Principal substrato é um monossacarídeo (glicose) e este é metabolizado diretamente até piruvato. As matérias-primas indiretamente fermentescíveis são aquelas que contém dissacarídeos, predominando a maltose e sacarose. Ex.: caldo de cana-de-açúcar e melaço. A composição do melaço de cana-de-açúcar varia em função de fatores como: • qualidade da matéria-prima (variedade, idade, sanidade, maturação, queimada ou não, etc); • métodos de extração do açúcar (moagem, clarificação, cozimento, etc); • condições técnicas das regiões açucareiras; • condições e tempo de armazenamento. b) Amiláceas: contêm em sua composição polissacarídeos (amido) utilizada para produção de vodka, rum, whisky (tem que sofrer sacarificação). PREPARO DA MATÉRIA-PRIMA a) Melaço: deve sofrer uma preparação prévia (de 82 ºBrix 18 -20 ºBrix) CRUZ DE COBENGE: regra das misturas, utilizada para calcular os volumes para diluição do melaço. B M - b = Quantidade de melaço em peso d = volume litros) M b B - M = Quantidade de água em peso d = volume (litros) B = Brix do melaço b = Brix da água (zero) M = Brix desejado (18 –20º) d = densidade Ex.: melaço: 80 ºBrix Água; 0 ºBrix M = 20 ºBrix dmelaço = 1,6284 dágua = 1,0000 80

20 – 0 = 20 Kg melaço = 12,31 Litros 1,6284 20

0 Prof. Raul Vicenzi

80 – 20 = 60 kg de água = 60 litros 1,0000 13

Microbiologia industrial

No tanque de diluição controla-se: pH: entre 4,5 – 5,5 Nutrientes: Sulfato de amônio (1 g/L); fosfato (1 g/L) sulfato de Mg (0,1 g/L) {ativador enzimático} b) Caldo de cana-de-açúcar: não necessita diluição pois a cana sofre adição de água por aspersão na moenda para extração do açúcar, neste ponto o brix deve ficar entre 18-20 D = Brix do caldo x Volume do caldo - volume do caldo = Voluma de H2 O a ser adicionada Brix desejado Ex.:

Brix do caldo = 20 Volume = 50.000 L Brix desejado = 16º D = 20 x 50.000 – 50.000 = 12.500 L de H2 O a ser adicionada para ter 16º Brix 16 Após fazer a diluição corrige-se o pH para 4,5 - 5,5 usando ácido sulfúrico, cítrico ou ainda suco de limão (caseiro) e colocam-se os nutrientes. DETERMINAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS TOTAIS POR REFRATOMETRIA 1) Preparo do mosto: a) Determinação de sólidos solúveis por refratometria - Para cada grau acima de 20 ºC subtrai-se 0,06 por grau; - Para cada grau abaixo de 20 ºC soma-se 0,06 por grau: Ex.:

20 ºBrix a 25ºC 20 ºBrix a 15ºC

5 x 0,06 = 0,3 5 x 0,06 = 0,3

20 ºBrix – 0,3 = 19,7 ºBrix 20 ºBrix + 0,3 = 20,3 ºBrix

Um mosto inicialmente com 76 ºBrix preparar 300 ml de mosto com 16% de SST. 100 g melaço -------- 76 g SST X g --------------------- 16 g SST X = 21,05 g/100mL Para 300 mL = 63,15 g de mosto + 236,85 g de água RELACÃO ENTRE DIFERENTES GRAUS DE MEDIDA. 1 ºBrix corresponde a 0,54 ºBaumé 1 ºBaumé corresponde a 1,8 ºBrix 1 ºBrix corresponde a 0,85 ºBabo BRIX = % de sólidos solúveis existentes em uma solução de sacarose quimicamente pura. Prof. Raul Vicenzi

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Fermentadores

ELEMENTOS DE UM FERMENTÁDOR (BIOREATOR) O coração de qualquer processo fermentativo é sem dúvida o fermentador. Uma definição funcional para um fermentador seria dizer que consiste em um recipiente em que se mantém um ambiente favorável para que se desenvolva um determinado processo biológico. A palavra fermentador nos faz visualizar um recipiente de grande tamanho de aço inoxidável brilhante e com uma instrumentação muito sofisticada. Ainda que muitos fermentadores industriais são assim, outros importantes processos biológicos industriais, desenvolvidos em grande escala, são conduzidos em equipamentos muito menos sofisticados. Em alguns processos um fermentador pode consistir em um simples recipiente aberto, embora para processos cujas condições são muito sensíveis será necessário um sistema fechado e muito bem controlado capaz de manter um ambiente favorável. MEIO AMBIENTE As condições ambientais existentes dentro de um fermentador podem considerar-se sob três aspectos diferentes: condições biológicas, químicas e físicas. MEIO BIOLÓGICO Unicamente os microrganismos que contribuem para o processo em questão encontram-se presentes, enquanto que os não produtivos, destrutivos ou não desejáveis estejam excluídos do processo. Do ponto de vista de produção é importante também que os microrganismos desejados estejam presentes em quantidades suficientes para que o processo se desenvolva a um ritmo rentável. Um sistema que contenha somente o microrganismo desejado diz-se um sistema asséptico. A assepsia consegue-se, primeiro, esterilizando o meio, eliminando todos os organismos vivos, diz-se então esterilizado, segundo introduzindo o microrganismo desejado. O ato de introduzir o microrganismo desejado denomina-se inoculação. MEIO QUÍMICO Implica na composição do meio de crescimento microbiano, que deverá conter as concentrações adequadas de substratos ou nutrientes microbiológicos, assim como dos precursores sintéticos, livres de substâncias inibidoras e mantidas a um pH adequado. MEIO FÍSICO Refere-se fundamentalmente a temperatura do sistema cujo controle é muito importante quando se projeta um fermentador. Este parâmetro e a necessidade de manter a uniformidade das condições ao longo da fermentação, exigem um bom sistema de agitação, o que pode provocar por sua vez a ruptura dos organismos e de seus agregados. Quando se mantém um ambiente favorável os parâmetros ambientais não têm que necessariamente permanecerem constantes ao longo do tempo. Prof. Raul Vicenzi

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Fermentadores

Fermentação por batelada - características: v Diferentes fases de crescimento; v Diferentes condições ótimas; v Fermentação parece estar programada de acordo com a disponibilidade de nutrientes; v pH e temperatura oscilam ao longo do tempo, para que apareçam de acordo com estas trocas as sucessivas fases de crescimento PRINCIPAIS TIPOS DE FERMENTADORES Os fermentadores classificam-se em dois grandes grupos: v Fermentadores de cultivo disperso: neste sistema os microrganismos estão imersos no meio

de cultivo e seguem os movimentos dos nutrientes líquidos. O fermentador mais simples consiste em um tanque aberto no qual o microrganismo se dispersa no meio líquido. Estes fermentadores forma utilizados de geração em geração com muito êxito na indústria cervejeira já que ao formar-se na fase anaeróbica da fermentação, uma capa de espuma que contém CO2 e leveduras, impedindo que o ar penetre no interior do tanque. Para controlar a temperatura durante a fermentação se pode colocar tubos refrigerantes. São muito utilizados no tratamento biológico de águas residuais em fluxo lento, onde a superfície do líquido permite que se dissolva o O2 do ar e libere o CO2 . Estes efeitos podem ser acelerados com a agitação do líquido que aumenta a transferência de gases e mantém a homogeneidade. Nos sistemas anaeróbios os próprios gases da fermentação podem proporcionar a agitação, através do desenho do fermentador (cônico/cerveja) ou por meio mecânico (bombas de recirculação). v Fermentadores de cultivo imobilizado: nos sistemas imobilizados o microrganismo se

desenvolve sob forma de uma lâmina ou capa disposta sobre uma superfície que está em contato com o meio nutritivo. Em laboratórios se utiliza o “cultivo em superfície” (placas). Inicialmente a produção de penicilina era feira em garrafas que eram introduzidas em uma incubadora. Atualmente se utilizada o cultivo em superfície na fermentação do ácido cítrico (Aspergillus niger), que se cultiva em uma superfície com um meio adequado contendo melaço em bandejas de pouca profundidade, colocadas em estantes à temperatura constante e com circulação de ar freqüente. Também e pode desenvolver películas microbianas sobre uma superfície de meio sólida adequada. Este meio pode ser de leito fixo, em pedras, plástico particulado, lâminas de plástico onduladas, através dos quais se faz passar o meio líquido sobre a capa de microbiana da superfície. v Na prática, porém, ocorre que nos sistemas de cultivo disperso também aparece uma capa sobre

a superfície do recipiente, e no cultivo imobilizado existe um certo numero de microrganismos dispersos no meio de cultivo.

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Fermentadores

Qualquer processo fermentativo divide-se em uma etapa puramente fermentativa e outra de recuperação do(s) produto(s), conforme o esquema abaixo: Armazena,mento de Matérias-primas

Água do Processo

Preparação de Meios

Esterilizador

Inóculo Volume: 1 a 2 litros

Ar Estéril

Vapor

Energia

Fermentador de produção

Inóculo Preparado 1:10

Tanque de Semeadura (pé-de-cuba)

- água - ar - vapor

Refrigeração

Separação de células Com ou sem ruptura celular

Utilização de Subprodutos

Etapas de Recuperação do Produto

Tratamento de Efluentes

PRODUTO

Formulação

Envasamento e Armazenamento

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Esterilização na indústria fermentativa

ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR Introdução A esterilização implica a destruição, inativação ou remoção de toda forma de vida microbiana. Isso quer dizer que a esterilização provoca nos microrganismos uma perda irreversivel da capacidade de reprodução no ambiente considerado. Não implica, entretanto, a inativação total das enzimas celulares, toxinas, etc. Antes de entrarmos na discussão dos métodos, é conveniente fazermos algumas considerações em torno dos mecanismos de esterilização e das características das populações microbianas. O mecanismo letal varia conforme o processo de esterilização empregado. O efeito final, entretanto, é o mesmo. Deve ocorrer a destruição e/ou inativação da(s) enzimaas) envolvida(s) em processos vitais para o microrganismo. Teoricamente, basta que o agente esterilizante bloqueie uma reação enzimática essencial ou destrua uma molécula vital. Na prática, entretanto, agentes com ação tão especifica não encontram aplicação como esterilizantes, por vários motivos: A heterogeneidade da população microbiana; a possibilidade da existência de microrganismos com capacidade de utilizar outras “rotas metabólicas” para vencer o bloqueio estabelecido; a dificuldade do agente em atingir um alvo muito específico; etc., podem ser mencionados como fatores que justificam a utilização de agentes capazes de atingir o microrganismo de um modo mais grosseiro e inespecífico. Principalmente no caso da esterilização de equipamentos industriais, procura-se utilizar processos capazes de danificar generalizadamente a célula, em vez de se procurar um ponto específico de sua estrutura metabólica. Outra consideração importante, no caso da esterilização de equipamentos, é a cessação do efeito esterilizante no final do processo de esterilização. Em outras palavras, o agente ou condição esterilizante deve atuar eficientemente durante o processo de esterilização. Terminada a esterilização, não deve haver ação residual. No caso de fermentação industrial, por exemplo, uma possível ação residual pode ser tão ou mais prejudicial que a presença de certos contaminantes. Essas considerações ajudam a apontar os processos físicos como os métodos de escolha na esterilização de equipamentos. MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO Físicos

Químicos

Calor: Líquidos, Gases e vapores - Seco: Flambagem ; ar quente Esterilizantes gasosos: Óxido de etileno (mais - Úmido: vapor fluente, vapor sob pressão; eficiente que os demais; utilizado em câmaras tindalização. de esterilização) Radiação: Formaldeído – mais comum - Ultravioleta â-propiolactona- carcinogência - Ionizantes (RX e ã) Ácido peracético Filtração : Membranas Prof. Raul Vicenzi

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A escolha do método depende das características dos produtos a serem esterilizado e do custo do processo. Quando se usa agentes químicos: tempo de contato Quando se usa calor: tempo e a temperatura de contato OBS.: O vapor direto acarreta um aumento no volume do mosto MECANISMOS DE ESTERILIZACÃO Se bem que os métodos usuais de esterilização tenham uma ação generalizada sobre a célula, o mecanismo pelo qual isso é conseguido varia conforme o agente empregado. No caso do calor, sabe-se, desde os tempos de Koch, que o mecanismo de destruição dos microrganismos pelo calor seco não é o mesmo que ocorre quando se utiliza vapor. Exceto em casos em que haja uma destruição física do microrganismo, como é o caso da flambagem do equipamento a ser esterilizado, o mecanismo de esterilização não está bem elucidado. Em alguns casos, a ruptura da parede celular e a vacuolização da célula são aparentes e poderiam ser interpretadas como oriundas da atuação de forças osmóticas. A adsorção de corantes pelas células, a incapacidade de reprodução e, no caso de microrganismos móveis e a perda da motilidade, são características que auxiliam na constatação da perda de viabilidade de células individuais. Enquanto que a inativação pelo calor seco é, essencialmente, um processo oxidativo, o uso de vapor causa uma coagulação das proteínas celulares com prejuízo para a organização estrutural do microrganismo, afetando a sua competência fisiológica. TABELA 1 - Efeito da temperatura sobre o tempo necessário para destruir esporos bacterianos de fermentação simples em meio com concentração inicial de 1,6 x 105 esporos/mL TEMPERATURA (ºC) 100 105 110 115 120 125 130 135

TEMPO (minutos) 1200 600 190 7 19 7 3 1

Tempo de esterilização corresponde ao tempo em que o material foi submetido aquela temperatura específica e não ao tempo total do processo, que deve incluir o tempo de aquecimento e resfriamento. DESNATURAÇÃO DE PROTEÍNAS Além das estruturas primária, secundária e terciária, as moléculas de proteína podem ser constituídas por mais de uma cadeia de polipeptídios. A conformação estrutural da molécula protéica Prof. Raul Vicenzi

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é estabilizada por ligações covalentes e não-covalentes. Essas ligações reduzem a flexibilidade das cadeias polipeptídicas, garantindo sua disposição de uma forma ordenada, compacta e, conseqüentemente, de baixa entropia, em vez de uma associação ao acaso. Entre as ligações covalentes, o tipo de ocorrência mais geral é a ligação dissulfeto As ligações não-covalentes podem ser pontes de hidrogênio, ligações hidrofóbicas e iônicas. As ligações hidrofóbicas são as que mais contribuem para a estabilização da estrutura protéica, pois de um modo geral, 40% dos resíduos de aminoácidos de uma proteína possuem ramificações não-polares. Uma alteração estrutural da molécula de proteína é, normalmente, acompanhada de uma perda de atividade biológica, pois a ação de enzimas pode ser explicada por uma perturbação conformacional especifica induzida pelo substrato no centro ativo da enzima. Considerando-se que as células de microrganismos podem conter, normalmente, de 40 a 60% de seu peso seco em proteínas, e considerando-se, ainda, as funções metabólicas e/ou estruturais desempenhadas por essas proteínas na célula microbiana, pode-se perceber, com facilidade, o efeito que agentes ou condições capazes de desorganizar estruturalmente as proteínas poderão exercer sobre a célula. ALTERAÇÃO DNA Se, de um lado, agentes que atuam sobre as proteínas são capazes de comprometer diretamente a competência fisiológica, agentes capazes de causar alterações no material genético do microrganismo podem provocar o aparecimento de mutações letais. Donde a possibilidade de se utilizarem, na esterilização, substâncias ou condições que apresentem maior afinidade pelo ácido desoxirribonucléico (DNA). - Agentes químicos como propionolactona, ácido nitroso, etc., agem sobre o material genético das células, causando alterações que terão conseqüências sobre as características fisiológicas do microrganismo. - Radiações – Fazendo-se incidir uma radiação sobre microrganismos, os componentes celulares poderão absorver energia radiante. O efeito letal das radiações é uma demonstração da presença, na célula viva, de moléculas capazes de absorvera energia radiante. Proteínas e ácidos nucléicos, constituintes essenciais da matéria viva possuem estruturas que absorvem principalmente luz ultravioleta. As alterações fotoquímicas que ocorrem, em virtude da absorção de luz ultravioleta, são muito prejudiciais ás células. POPULAÇÃO MICROBIANA Ao tratar de esterilização, temos de levar em conta, também, as características dos microrganismos contaminantes do equipamento a esterilizar. No caso de existirem no equipamento apenas formas vegetativas de microrganismos, e se o meio em que se encontram for um meio que não as abrigue e proteja da ação do agente esterilizante, e mais ainda, se pudermos estar certos de que o agente esterilizante será capaz de atuar sobre as células microbianas em condições favoráveis e por tempo suficiente, então o problema de esterilização será relativamente simples. Prof. Raul Vicenzi

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FIGURA 1 - Esterilização de um meio de cultura em autoclave a 121 ºC por 20 minutos. O tempo total de esterilização é 100 minutos. ESTERILIZAÇÃO POR AGENTES FÍSICOS CALOR SECO Ø calor seco mata os microrganismos por oxidação dos componentes celulares. O ar seco não é um bom condutor de calor e sua ação não é tão enérgica quanto a do vapor. Por esse motivo é necessário uma temperatura e tempo maiores de esterilização. Ø o emprego do calor seco ou ar quente, é recomendado quando o contato direto ou completo do vapor sobre pressão com o material é indesejável ou improvável, que é o caso de vidraria, óleos, pós e substâncias similares. A esterilização pelo calor seco consiste em submeter o equipamento a ser esterilizado a uma temperatura tal que, durante o período de aquecimento, haja inativação dos microrganismos presentes. A maior resistência demonstrada por microrganismos ao calor seco parece depender de um endurecimento da camada mais externa da célula por meio de coagulação das protemas, dificultando a penetração do calor no interior da célula propriamente dita e ulterior coagulação das proteínas plasmáticas. Devido à muito menor capacidade de penetração do calor seco, é necessário aquecer o equipamento a ser esterilizado a temperaturas mais altas por tempo mais prolongado, o que torna esse método inadequado quando materiais como papel, algodão, plásticos, etc., estão presentes. Populações homogêneas de esporos apresentam uma relação linear de inativação com relação ao tempo de exposição a 125 ºC. A não-linearidade que ocorre com populações naturais, pode ser atribuída a uma heterogeneidade da população. As relações não-lineares obtidas com populações naturais podem ser reproduzidas por misturas adequadas de esporos com resistências térmicas diferentes, isolados daquelas mesmas populações. Aliás, essa heterogeneidade das populações Prof. Raul Vicenzi

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naturais pode ser devida não só à presença de esporos de espécies diferentes como também a diferentes graus de resistência térmica entre esporos de uma mesma espécie. A temperatura empregada tem sido 125 ºC e é comum cotar-se a resistência térmica de um microrganismo em relação ao D125 . A desorganização molecular que ocorre nas células, devido à exposição a temperaturas elevadas, pode se dar dos seguintes modos: a) ativação direta das moléculas pela energia térmica, com alteração conformacional por quebra de ligações intramoleculares e intervenção subseqüente de outras moléculas; b) reação de moléculas complexas com oxigênio, água ou vapor de água (no caso de esterilização pelo calor úmido). A exigência básica da esterilização pelo calor seco é que todo o material seja sujeito à temperatura esterilizante. As únicas causas possíveis de fracasso na esterilização são o controle defeituoso da temperatura; a não penetração do calor; e a presença de microrganismos com resistência térmica superior á esperada. CALOR ÚMIDO Ø calor úmido mata os microrganismos por desnaturação protéica, ou seja: pela coagulação das proteínas e enzimas celulares, e também a fusão dos lipídeos da membrana celular; Ø quanto maior a temperatura menor o tempo necessário; Ø Para destruir esporos temos que submeter este vapor de água a uma pressão positiva para alcançarmos as temperaturas de trabalho; Sempre que possível usa-se vapor para a esterilização, pelo seu alto conteúdo de calor por unidade de peso ou de volume; porque cede facilmente calor a uma temperatura constante e controlável; por ser de fácil produção e distribuição; e porque, mesmo sendo de aquecimento rápido, a velocidade de aquecimento e a temperatura final do equipamento podem ser controladas. TABELA 2 - Relação entre a pressão de vapor de água em diferentes pressões Pressão de vapor da água (atm) 0 0,34 0,68 1,00 1,36

Temperatura 100,0 109,0 115,0 121,0 126,5

Obs.: - Para assegurar a temperatura pela pressão de trabalho precisamos ter certeza de que todo o ar foi expulso, primeiro porque o ar não é bom condutor de calor, logo o calor não penetra no material a ser esterilizado. Segundo a temperatura do ar aquecido a uma pressão é inferior a temperatura do vapor aquecido a mesma pressão. Causas da inativação térmica de bactérias pelo calor úmido Os mecanismos propostos para explicar a influência letal do calor úmido sobre as bactérias são: (a) coagulação de proteínas; (b) inativação de enzimas; (c) desorganização dos lipídeos celulares; (d) desorganização do aparelho genético; (e) ruptura do RNA. Prof. Raul Vicenzi

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A morte das células expostas ao calor é exponencial. A base bioquímica desse fenômeno é difícil de ser explicada em termos de acontecimentos específicos na célula. O calor úmido age sobre vários componentes celulares e, na célula, pode-se observar uma série de efeitos. Inativação térmica dos esporos Os esporos são dotados de uma camada interna de mucopeptídeo recoberta por uma capa protéica rica em cisteína. As seguintes teorias tentam explicar a termorresistência dos esporos: impermeabilidade do esporo; enzimas em formas inativas estabilizadas; desidratação do material protéico, com estabilização conseqüente da maior interaproximação dos radicais hidrofóbicos e imobilização iônica. A inativação dos esporos em presença de vapor de água deve-se à atividade da água e não propriamente ao calor latente do vapor. Esse fato mostra que os altos coeficientes de temperatura, característicos da inativação térmica de esporos. só podem ser devidos a processos de coagulação de proteínas ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS POR RADIAÇÕES UV E IONIZANTES Os princípios básicos da utilização da radiação UV são a redução de microrganismos presentes no ar e a destruição de células depositadas na superfície do equipamento e expostas à radiação. A radiação UV tem sido empregada como agente auxiliar para diminuir os níveis de contaminação. A ação de radiações ionizantes (raios gama) sobre os microrganismos se manifesta como um uma inibição do poder de multiplicação dos mesmos. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS POR AGENTES QUÍMICOS Apresenta a vantagem de ser feita a temperatura inferior a 50ºC. Os fatores que influenciam na eficiência da esterilização são: tempo de contato, temperatura, pH, matéria orgânica, estabilidade ao oxigênio umidade, etc. detergentes, líquidos (ácidos e álcalis, glutaraldeído, formaldeído, iodófors, ácido peracético) Gases e vapores (ozônio, brometo de metila, formaldeído, â-propionolactona, óxido de etileno, ácido peracético) ESTERILIZAÇÃO DO MEIO DE CULTURA De acordo com um conceito bem amplo, a esterilização de um meio é a operação que tem por finalidade remover ou destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal, macro ou microscópicas, saprófita ou não, existentes no meio considerado. O grau de esterilização dos meios de fermentação varia conforme o processo a que se destina. Algumas vezes é totalmente dispensável (fermentação láctica de hortaliças e polvilho; tratamento biológicos de resíduos); realizada de forma incipiente (fermentação alcoólica; produção de leveduras para panificação; fermentação acética do vinagre); realizada com alto grau de exigência (produção de antibióticos, enzimas, vitaminas, acetona, butanol). Em ensaios laboratoriais sempre é necessário (devido ao uso de culturas puras) • Em plantas industriais o calor úmido é a principal forma de se efetuar a esterilização. Pode Prof. Raul Vicenzi

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ser feita nos próprios recipientes destinados a fermentação (processo descontínuo) ou em separado (processo contínuo) Ø ESTERILIZAÇÃO EM BATELADA: •

Vários meios de cultura são esterilizados no fermentador a 121 ºC (para destruir esporos), o tempo é calculado em função dos constituintes do mosto(pH, material em suspensão, etc) e do tamanho do fermentador. • Esterilizar ás válvulas e eletrodos e outros equipamentos que entram em contato direto com o fermentador • Método indireto - injetar vapor no fermentador através de camisa ou da serpentina; • Método direto - injetar vapor direto na solução nutriente, assim o vapor deve estar livre de aditivos químicos OBS.: O vapor gerado pela indústria normalmente contém substâncias potencialmente tóxicas aos microrganismos, derivadas de anticorrosivos utilizados no processo de geração de vapor. Com injeção direta de vapor no meio de cultura o volume deste aumentará, pois uma parte do vapor se condensa aumentando o volume do líquido dentro do fermentados. Vantagem a) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio simultaneamente, evitando perigos de contaminações; Desvantagem a) Manutenção de temperaturas altas por períodos longos, favorecendo possíveis alterações no meio; b) Consumo elevado de vapor e água de resfriamento; c) Problemas de corrosão pelo contato do equipamento com o meio aquecido. d) Elevado tempo ocioso do equipamento; e) interações químicas com nutrientes Ø

ESTERILIZAÇÃO CONTINUA • As principais desvantagens apresentas podem ser evitadas pela esterilização contínua; melhor controle de temperatura; temperaturas mais elevadas diminui o tempo da operação; Fornece meio esterilizados para fermentadores de vários tamanhos • Etapa preliminar obrigatória nos processos fermentativos contínuos, também tem valor nos processos em batelada, pois diminui o tempo de esterilização e a área física necessária para o processo, devido a relação exponencial entre taxa de morte e temperatura tomando bem menor o tempo necessário para a destruição de todos os microrganismos quando temperaturas maiores são utilizadas; • Na esterilização em batelada são necessários 30 a 60 minutos a 121 ºC, a esterilização contínua normalmente é realizada em 30 a 120 segundos a 140 ºC; • Meio de cultura torna-se diluído pois a condensação do vapor aumenta o volume do líquido, para resolver este problema o meio aquecido é bombeado através de uma válvula de expansão e o condensado é removido por uma bomba de vácuo até que o meio de cultura fique com a mesma concentração de antes da esterilização. Prof. Raul Vicenzi

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Pode se feita pela injeção direta de vapor ou por meio de trocadores de calor. • Em certos casos a pasteurização já pé suficiente para eliminar grande parte do flora microbiana. É uma operação rápida utilizando temperaturas próximas de 100 ºC seguida de resfriamento. Em meio ácidos equivale a uma esterilização • Para pequenas quantidade de meio pode-se lançar mão da tindalização.

FIGURA 2 - Esquema de esterilização contínua do meio de cultura em trocadores de calor

DESTRUIÇÃO DE NUTRIENTES A esterilização do meio pelo calor acarreta alterações na sua composição química. A experiência mostra que, quanto mais elevada for a temperatura de esterilização de um dado meio, menor será a destruição de nutrientes e, conseqüentemente, melhores serão os resultados da fermentação posterior. Esta menor destruição de nutrientes é uma conseqüência de fato – observada experimentalmente – de ser a energia de ativação de destruição térmica dos microrganismos maior do que a de destruição térmica dos nutrientes. Essa afirmativa é de importância prática, tanto na esterilização de meios de fermentação como na esterilização de alimentos. ESTERILIZAÇÃO DO AR As fermentações aeróbias, com o microrganismo em suspensão, constituem os processos fermentativos de maior importância industrial atualmente. Em tais fermentações a quantidade de ar introduzida no sistema é grande e é perfeitamente aceitável, que haja grande preocupação quanto a esterilização do ar a ser admitido nos fermentadores. Tais cuidados devem ser tomados principalmente nas horas iniciais da fermentação. - A maior parte dos processos fermentativos é conduzido com agitação vigorosa, e o ar fornecido ao fermentador deve ser estéril. - O número de partículas e microrganismos depende da localização da indústria, do movimento do ar e do tratamento prévio que o ar foi submetido.

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MÉTODOS PARA ESTERILIZAÇÃO DO AR Calor seco - normalmente antieconômica ou de difícil realização; Radiações – Apenas as radiações UV poderiam ter aplicação prática, porém pouco usada devido ao grande tempo de exposição. Pode ser usada em pequenas instalações (laboratórios, pesquisa). Atua mais como desinfetante. Filtração –É sem dúvida o processo mais importante por ser o de maior aplicação na industria. Filtros feitos de lã de vidro, acetato de celulose, etc Os filtros pode ser de dois tipos principais: Filtros que apresentam poros - retenção mecânica dos microrganismos (cartuchos de membranas de ésteres de celulose, nylon); Filtros de camadas de material fibroso (lã-de-vidro, ) - Atua na combinação de vários efeitos físicos: inércia, bloqueio, difusão, separação por gravidade e atração eletrostática.

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Metabolismo e cinética de crescimento microbiano

CRESCIMENTO CELULAR O crescimento dos microrganismos é uma parte integral de quase todos os processos de fermentação. Sabe-se que as bactérias se reproduzem por divisão binária, produzindo duas células de mesmo tamanho, entretanto a reprodução de muitas leveduras se dá por gemação;os mofos crescem por extensão das hifas e a morfologia de seu micélio pode variar em função do meio ambiente. quando um fungo cresce na superfície de um meio sólido produz uma rede miceliana , cuja natureza reflete a natureza do meio. Nos cultivos submersos, as células fúngicas podem crescer unidas a partículas de nutrientes suspensas na forma de micélio filamentoso difuso ou como massa densa. A morfologia e crescimento influem na velocidade de crescimento e na formação de produtos Quando um microrganismo é inoculado em um meio de volume e composição conhecidos, o cultivo passa por uma série de fases, como se pode observar na figura 1. Depois da inoculação, existe uma fase de latência, em que o microrganismo se adapta as condições do meio. Após um certo período de tempo em que a velocidade de crescimento das células aumenta gradualmente, as células crescem a uma velocidade constante máxima ; esta fase se denomina exponencial ou logarítmica. À medida que o crescimento continua, os nutrientes se vão esgotando e os produtos vão sendo excretados pelo organismo, a velocidade de crescimento diminui e finalmente o crescimento cessa, devido freqüentemente ao esgotamento de um nutriente ou pelo acumulo de algum produto tóxico; esta fase se denomina estacionária.

FIGURA 3 – Crescimento de um microorganismo em um cultivo desontínuo

FATORES QUE INFLUEM NA VELOCIDADE DE CRESCIMENTO A velocidade de crescimento varia com o tipo de célula microbiana e também em função das condições físico-químicas do meio ambiente. Em geral, o tempo para que se duplique a biomassa aumenta com a complexidade do microrganismo, de forma que os tempos de duplicação médio para as células animais e vegetal são substancialmente maiores que os de mofos e leveduras, que por sua vez são maiores que das bactérias. Prof. Raul Vicenzi

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Metabolismo e cinética de crescimento microbiano

O crescimento celular varia com a temperatura. A maioria dos microrganismos cresce entre 25 e 35 ºC. Dentro deste espaço o crescimento aumenta com o aumento da temperatura até um valor máximo, acima do qual a velocidade cai rapidamente devido ao incremento da taxa de morte microbiana. O pH influi no crescimento da mesma forma que na atividade enzimática. A maioria dos microrganismos cresce em uma escala de pH variando de 3 a 4. A velocidade de crescimento da célula microbiana depende da atividade de água (Aw) e da umidade relativa. As bactérias necessitam uma Aw 0,95 enquanto os mofos podem crescer em valores de atividade de água menores, de até 0,7 como mínimas. Como em qualquer reação química, a velocidade de crescimento depende da concentração de nutrientes químicos, e pode ser descrita pela equação de Monod. Os valores típicos de Ks para as diversas fontes de carbono estão compreendidos entre 1 e 10 mg/dm3 . As células podem crescer a velocidades próxima as ìmax quando a fonte de carbono limitante é maior que 10 Ks ou 10 a 100 mg/dm3 . As concentrações de carboidratos elevadas podem inibir o crescimento devido ao efeito osmótico que tem uma influencia maior sobre as bactérias do que sobre os mofos Foi comprovado que a quantidade de massa celular total, formada durante o crescimento celular, é freqüentemente proporcional a quantidade de substrato utilizado. Biomassa produzida (g) ãx/s = -----------------------------Substrato consumido (g)

ãx/s =coeficiente de rendimento de biomassa

METABOLISMO MICROBIANO O crescimento microbiano depende da capacidade da célula para utilizar os nutrientes de meio ambiente e sintetizar os compostos macromoleculares das estruturas celulares e também os principais compostos de baixo peso molecular, necessário para a atividade celular. O metabolismo intermediário inclui as reações que transformam os compostos de carbono e nitrogênio que entram na célula em novo material celular ou em produtos que são excretados. A síntese desses compostos necessita energia e a maioria das células utilizada nas fermentações, são heterotróficas e obtém sua energia a partir da quebra de compostos orgânicos. Nos processos respiratórios ou aeróbios, os microrganismos são capazes de oxidar completamente alguns dos substratos a CO2 e H2 O, obtendo o máximo de energia para a conversão dos substratos remanescentes em nova massa celular. No metabolismo fermentativo ou anaeróbio, as células são menos eficazes para converter os substratos orgânicos em material celular e usualmente excretam intermediários degradados parcialmente. O crescimento de urna cultura microbiana pode ser dividido em fases ou estágios. Após a inoculação de uma cultura em um meio nutriente existe um período durante o qual o crescimento parece não ocorrer; este período refere-se à fase lag e pode ser considerado como uma fase de adaptação. Seguindo um período durante o qual a taxa de crescimento das células aumenta gradualmente, as células crescem a uma taxa constante, este período é conhecido como fase exponencial. Quando o crescimento diminui ou cessa e as células entram fase estacionária. Após um Prof. Raul Vicenzi

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longo período de tempo o número de células viáveis decresce e a cultura entra na fase de morte ou declínio. Tanto quanto esta cinética de crescimento, o comportamento de uma cultura pode ser descrito de acordo com os produtos, os quais são gerados durante os estágios da curva de crescimento. Quando um microrganismo é inoculado em um meio rico em nutrientes, a velocidade da divisão celular, e portanto a produção de biomassa, varia de acordo com uma seqüência característica. A fase lag pode virtualmente ser eliminada aumentando o tamanho do inóculo e otimizando as condições físicas dentro do fermentador. Em um processo industrial a duração da fermentação contribui pra o custo do produto, logo uma fase lag mínima é aconselhável.

FIGURA 4. Curva de crescimento de biomassa e consumo de glicose em um cultivo em batelada. Quando um microrganismo cresce em um ambiente no qual todos os seus nutrientes essenciais estão em excesso, esses nutrientes se transformam em produtos finais do metabolismo energético, em calor, ou em compostos requeridos para a reprodução de novas células. Durante a fase exponencial de crescimento a divisão celular ou velocidade de aumento da biomassa chega a ser máxima e os produtos gerados são essencialmente para o crescimento das células e incluem: aminoácidos, nucleotídeos, proteínas, ácidos nucléicos, lipídios, carboidratos, etc. Estes produtos são conhecidos como os primeiros produtos do metabolismo ou METABOLITOS PRIMÁRIOS e a fase a qual eles são produzidos (fase log ou exponencial) como trofofase. Também se inclui nesta categoria a biomassa celular que pode ser considerada como o metabólito mais primário. Muitos produtos do metabolismo primário são considerados economicamente importantes e são produzidos por fermentação. Durante a desaceleração e na fase estacionária, algumas culturas microbianas sintetizam compostos os quais não são produzidos durante a trofofase e os quais parecem não ter nenhuma função óbvia no metabolismo celular. A estes compostos nos referimos como METABÔLITOS SECUNDÁRIOS e a fase na qual eles são produzidos (equivalente à fase estacionária) como idiofase. É importante salientar que os metabólitos secundários ocorrem em cultivos contínuos a Prof. Raul Vicenzi

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baixas taxas de crescimento sendo uma propriedade destas, baixas taxas de crescimento, e também, da fase onde não tem crescimento celular. TABELA 3. Produtos do metabolismo primário microbiano e sua significância comercial. Metabolismo Primário

Significância Comercial

Etanol

Ingrediente ativo em bebidas alcoólicas, usado como combustível em motores quando misturado ao petróleo Vários usos na indústria alimentar Intensificador de Flavor Suplemento alimentar Intensificador de Flavor Precursor do Aspartame - Adoçante Aplicação na indústria alimentar Suplementa Alimentar

Ácido Cítrico Ácido glutâmico Lisina Nucleotídeos Fenilalanina Polissacarídeos Vitaminas

Fonte: Stanbury, Whitaker & Hall in Principles of Fermentation Technology. 1995. Os metabólitos secundários são compostos que não são necessários para a biossíntese celular, não tendo um papel direto no metabolismo energético. A biossíntese destes compostos está intimamente ligada com o metabolismo primário das células que os produzem, já que normalmente seus precursores são metabólitos primários ou modificados, como ácidos orgânicos, aminoácidos, derivados de açúcares e bases nitrogenadas. Um conceito apropriado para os metabólitos secundários é “são os compostos não essenciais para o crescimento exponencial” (Wiseman, A.) Os metabólitos secundários mais importantes do ponto de vista comercial são os antibióticos, entre eles a Penicilina, cuja produção anual chega a 10.000 ton/ano. As toxinas e os alcalóides representam o resto dos metabólitos secundários de importância industrial. Quando se observa que microrganismos crescem a taxas relativamente baixas de crescimento no seu meio ambiente natural, isto sugere indicio de que é a idiofase que prevalece sobre a trofofase, a qual pode ser mais uma das propriedades da cultura de microrganismos. METABOLISMO ENERGÉTICO A energia necessária aos microrganismos pode ser fornecida pela luz (organismos fototróficos), ou pela oxidação de substâncias químicas (organismos quimiorganotróficos). Nos dois casos a energia vai ser estocada pela forma de energia de ligação química, biologicamente utilizável. Trata-se essencialmente da ligação anidridofosfórica do trifosfato de adenosina (ATP), formada pela fosforilação do difosfato de adenosina (ADP). ORGANISMOS QUIMIORGANOTRÓFICOS A maioria das bactérias, leveduras e mofos são incapazes de efetuar a fotossíntese, utilizam a energia liberada no decorrer das reações químicas de oxidação. São chamadas quimiorganotróficas. As reações de oxidação podem ser efetuadas de vários modos: Prof. Raul Vicenzi

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- Perda de elétron: Fe++ Fe+++ + e- + energia - Desidrogenação: R-CH2 OH - Hidratação-desidrogenação: R-CHO + H2 O - Descarboxilação-desidrogenação: R-CO-COOH + H2 0

R-CHO + 2H+ + 2e- + energia

R-COOH + 2H+ 2e- + Energia

R-COOH + CO2 + 2H+ + 2e- + Energia

Em todos os casos há perda de elétrons freqüentemente acoplada a uma perda de prótons. Estes elétrons e prótons, após transferência mais ou menos longa, feita por intermédio de uma cadeia de oxiredução, vão reduzir um aceptor final. Os microrganismos quimiorganotróficos tiram sua energia da oxidação de substâncias orgânicas elaboradas, as quais devem obrigatoriamente encontrar-se no meio, logo, trata-se de microrganismos heterotróficos. A grande maioria dos microrganismos que intervém na biotecnologia faz parte deste grupo. ACEPTOR FINAL DE ELÉTRONS O sistema de transporte de elétrons é mais ou menos complexo e recorre as enzimas (desidrogenases, citocromos redutases, etc.) e co-enzimas (FAD, NAD, NADP, citocromos, etc.) que são intermediários aceptores de elétrons (e de prótons); trata-se de um seguimento de reações acopladas com oxiredução. No final desta cadeia, elétrons (e prótons) servem para reduzir um aceptor final que pode ser de diversas naturezas: Oxigênio molecular, composto mineral oxidado ou composto intermediário do metabolismo. Existe, também, um mecanismo de eliminação de elétrons e prótons próprio de numerosas bactérias anaeróbias, sob a forma de hidrogênio, devido a hidrogenase. Se o substrato for completamente oxidado, diz-se que há respiração (fala-se às vezes, de via oxidativa). Se o substrato for parcialmente oxidado e, por isso, incompletamente degradado, o que acarreta a formação de metabólitos, diz-se que há fermentação. A fermentação traz geralmente o nome da(s) substância(s) produzida(s) ou da mais abundante se a produção for complexa. RESPIRAÇÃO AERÓBIA Existem vários mecanismos de respiração aeróbia. O fato comum entre eles é que o aceptor final de prótons é o oxigênio do ar e não podem intervir senão quando os microrganismos são cultivados em condições de aerobiose. Para cada par de prótons transformados em água, há formação de 3 moléculas de ATP, podendo às vezes haver uma oxidação direta. Esta via leva a formação de peróxido de hidrogênio (H2 02 ) que é tóxico para célula; exceto se esta possuir catalase, enzima capaz de decompor o H2 O2 . Quando um microrganismo possui esta via, e não tem catalase, é morto pelo oxigênio do ar, sendo portanto, um anaeróbio estrito. Prof. Raul Vicenzi

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FERMENTAÇÃO / RESPIRAÇÃO Na fermentação propriamente dita, uma substância orgânica originária da degradação do substrato serve como aceptor de elétrons (e de prótons). De fato, pode-se considerar que é a mesma substância que serve, ao mesmo tempo, de doador e aceptor. Numerosas fermentações podem ser efetuadas em anaerobiose, pois todos os prótons liberados servem para reduzir um substrato orgânico; outras devem ser efetuadas em aerobiose, pois pelo menos uma parte dos prótons liberados servem para reduzir o oxigênio.

CINÉTICA DO CRESCIMENTO MICROBIANO Na fase logarítmica podemos dizer que dobram por intervalo de tempo: • O número de células (bactérias e leveduras): • A biomassa (actomicetos e fungos). Ø

A velocidade de crescimento se mantém constante durante a fase logarítmica, ainda que o meio se altere pelo consumo de substrato e excreção de metabólitos. Ø A velocidade de crescimento independe da concentração do substrato, pois um excesso de substrato está presente. • O substrato limitante é a substância que pela mudança de sua concentraçao promove: • mudanças na velocidade de crescimento do microrganismo • mudanças na velocidade de consumo do substrato • mudança na velocidade de formação do produto. Na pratica podemos dizer que todo o substrato é limitante. O processo industrial é interrompido ao final da fase logarítmica ou antes da fase de declínio, depende se o processo é associado ou não associado. A taxa de aumento da biomassa está relacionada com a velocidade específica de crescimento (ì) e a concentração da biomassa (X) expressa em g/L. dx ------- = ìX , onde dt ì = velocidade máxima da biomassa X = concentração de biomassa Ø A taxa do aumento do número de células está relacionada com a velocidade específica de

crescimento e com a densidade celuIar (N) expressa em células/L. dN ------- = ìN , onde N = densidade celular dt Ø O tempo de geração (G) é uma constante da cepa da célula e depende das condições de cultivo. É o espaço de tempo necessário para que uma célula se duplique. Quando o microrganismo está na fase exponencial o tempo de geração é constante e dado por: Prof. Raul Vicenzi

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t G = --- = z

t -------------------3,322 log Nf/Ni

METABOLISMO MICROBIANO A síntese do produto se dá no interior da célula, para que o substrato seja convertido em produto, ele deve entrar na célula e ser biotransformado por uma seqüência específica de enzimas. Quanto mais complexo o produto, maior será o número de enzimas envolvidas no metabolismo. Esquema simplificado do metabolismo celular. S ⇒ [X – P] ⇒ P

ENTRADA DO PROCESSO: transporte do substrato para dentro da célula METABOLISMO - TRANSFORMACÃO: é o que diferencia o processo químico do fermentativo. Às vezes X =P. SAIDA DO PROCESSO: liberação do produto da enzima, podendo ficar intra ou extracelular. S = concentração do substrato em g/L X = concentração de células em g/L P = concentração do produto em g/L ou mg/L VELOCIDADE DE FORMAÇÃO DE CÉLULAS A velocidade de formação de células e dada pela variação da concentração de células em função do tempo, na fase exponencial de crescimento (fase log), a velocidade é constante e pode ser calculada pelo numero de células (N) por contagem direta dos microrganismos ou por contagem em placas e ainda pela massa seca de células (X). Ela é chamada velocidade especifica de crescimento, calculada por:

ì=

ln Nf – ln Ni ------------------ou tf – ti para [ ] de células

ln Xf – ln Xi -------------------tf - ti para Biomassa

ou

ln DOf – ln DOi --------------------tf - ti para densidade ótica

FIGURA 5- Variação da Concentração Celular em Função do Tempo OBS.: Para microrganismos não filamentosos é preferível utilizar número de células e para microrganismos filamentosos, a massa seca de células. Prof. Raul Vicenzi

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VELOCIDADE DE CONSUMO DE SUBSTRATO A medida que a célula está se reproduzindo os substratos estão sendo consumidos, a velocidade de consumo do substrato será teoricamente constante, enquanto for constante o crescimento celular, isto quase nunca acontece, uma vez que o substrato não é só utilizado para o crescimento celular, mas também para formação de metabólitos, em alguns processos o substrato pode ter uma velocidade de consumo quase linear por um período de tempo, e a velocidade é chamada de velocidade específica de consumo do substrato e é calculada por:

ì=

ln Sf – ln Si ------------------tf – ti

Sf = concentração de substrato

FIGURA 6 - Variação da Concentração de Substrato em Função do Tempo

VELOCIDADE DE FORMAÇÃO DO PRODUTO A velocidade de formação do produto tende a ser constante durante um período de tempo. É chamada de velocidade especifica de formação do produto e calculada por:

ì=

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ln Pf – ln Pi ------------------tf – ti

Pf = Produto final

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FIGURA 7 - Variação da Concentração de Produto em Função do Tempo

VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO É função de três parâmetros: - Concentração de substrato limitante (S) - Velocidade máxima de crescimento (ì max ) - Constante especifica do substrato (ks), equivale a concentração em ì = 0,5 ìmax É a concentração de substrato que dá a metade da velocidade máxima de crescimento. E dada pela equação de MONOD, que equivale a equação de Henri-Michaelis-Menten para cinética enzimática. S ì = ìmax --------------Ks = corresponde a metade do ìmax Ks + S

FIGURA 8 - Relação entre a Velocidade de crescimento e Concentração de Substrato Prof. Raul Vicenzi

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Existindo vários substratos limitantes, podemos estender a equação de Monod para: K1 .S1 K2 .S2 Kn .Sn ì= ìmax . --------- + --------- + + .......+ ----------K 1 + S1 K 2 + S2 K n + Sn - Se existir um excesso de todos os substrato, então ì = ìmax e a cultura está na fase log, na sua velocidade máxima de crescimento. Se o primeiro substrato for exaurido e outro substrato estiver presente, teremos uma segunda fase lag e log com outro tempo de geração que caracteriza a metabolização deste segundo substrato, este fenômeno é chamado de DIAUXIA. Isto ocorre porque um dos substratos, geralmente a glicose, é catabolizada preferencialmente e inibe a quebra de outros substratos. As enzimas que catabolizam os outros substratos são induzidas (durante a segunda fase lag) após a metabolização completa do primeiro substrato. TABELA 4 - Efeito do comprimento da cadeia de glicose na velocidade máxima de crescimento de Fusarium graminearum a 30ºC AÇÚCAR Glicose Maltose Maltotriose

Nº de UNIDADE de GLICOSE 1 2 3

ìmax (h-1 )

G (h)

0,28 0,22 0,18

2,48 3,15 3,85

FIGURA 9 – Crescimento triáuxico de Fusarium graminearum Com isto chegamos a conclusão que o ì máximo depende do: • microrganismo; • condições de cultivo; • composição do meio de cultura; • temperatura de incubação; • outros fatores (pH, oxigênio, etc.)

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CLASSIFICAÇÃO DOS PROCESSOS

TIPO 1 - ASSOCIADO No processo associado o produto é derivado diretamente do metabolismo primário, usado para a produção de energia. O crescimento, o catabolismo de carboidratos e a formação do produto ocorrem ao mesmo tempo. A TROFOFASE (fase de crescimento) e a IDIOFASE (fase de formação do produto) não são separadas. Ex. produção de biomassa, etanol e ácido glucônico. Sendo A, B, e C, produtos intermediários do metabolismo primário, a formação do produto pode ser considerada: A

⇒

B

⇒

C ⇒ PRODUTO

FIGURA 10 - Relação entre Crescimento Celular e Formação de Produto em um Processo Associado TIPO 2- SEMI-ASSOCIADO O Produto é derivado de um substrato usado no metabolismo primário, mas segue uma rota colateral. A tropofase e a idiofase são separadas. Em fermentação em batelada este tipo de cinética possui dois pontos importantes: 1) crescimento celular acompanhado de alto consumo de substrato e pouca ou nenhuma formação de produto; 2) O crescimento diminui e a formação do produto começa acompanhada de um alto consumo de substrato. Ex.: produção de ácido cítrico e de alguns aminoácidos. A reação de formação do produto pode ser exemplificada como: A B C Metabolismo Primário

D Prof. Raul Vicenzi

E

Produto 37

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FIGURA 11 - Relação entre Crescimento Celular e Formação de Produto em um Processo Semi-Associado TIPO 3 - NÃO ASSOCIADO O metabolismo primário e a formação do produto ocorrem em tempos separados. O produto não é derivado do catabolismo, mas de rotas anfibólicas. Neste tipo de fermentação, o metabolismo primário ocorre acompanhado do consumo de substrato, após isto o produto é formado por reações do metabolismo intermediário. Ex.: muitos antibióticos e vitaminas. Nesse tipo de processo freqüentemente condições ótimas para o crescimento celular não são as mesmas para a formação do produto e a fermentação pode ser dividida em duas etapas, onde na primeira se dá condições às células crescerem e após altera-se a temperatura, pH, quantidade de oxigênio ou concentração de nutrientes para favorecer a formação do produto.

FIGURA 12 - Relação Entre Crescimento Celular e Formação de Produto em um Processo Não associado A classificação dos processos depende da produção do metabólito, da composição do meio de cultura e da regulação da cepa utilizada. Podem ocorrer formas intermediárias: Prof. Raul Vicenzi

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- Produção de ácido láctico: tipo 1 e 2 - Produção de antibióticos aminonoglicosídicos: tipo 2 e 3 Um processo pode se comportar de duas formas distintas, conforme os parâmetros de fermentação. Por exemplo, a produção de etanol é um processo associado, mas pela modificação das condições de fermentação, pode ser forçado a se comportar como não-associado.

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EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES - STARTERS

Os cultivos starters são utilizados atualmente no processamento de alimentos para induzir diversas mudanças em suas propriedades, tais como a modificação da textura, a conservação, o desenvolvimento de aromas ou melhora nutricional, e na produção de enzimas. As principais aplicações de cultivos starters se encontram nas indústrias de panificação, cárnea e leiteira, ainda que existam leveduras starters destinadas a fermentação de bebidas alcoólicas e a produção de álcool industrial. Atualmente está se impondo o emprego de starters preparados com cepas de microrganismos mais adequados para elaboração de cada produto. As culturas starters usadas nos produtos cárneos curados consistem, normalmente de um organismo tipicamente acidificante como Lactobacillus ou Pediococcus para estabilizar o produto biologicamente e um organismo com características nitrato redutoras que, por uma série de reações produzirá uma atrativa cor avermelhada associada com o tipo de produto, sendo que o organismo nitrato redutor normalmente é Micrococcus ou Staphylococcus coagulase negativa. 1. DEFINIÇAO: Starters são grupos de microrganismos selecionados com características bioquímicas desejadas e definidas produzidos sob rigorosas e controladas condições (pH, temperatura, acidez, substrato, etc.) e são usados na elaboração de produtos fermentados. 2. OBJETIVOS DO USO DE STARTERS. Ø Incorporar um número desejado de microrganismos no meio de modo que estes possam crescer, multiplicar-se e produzir as alterações desejáveis no meio e no produto final; Ø Superar o desenvolvimento de qualquer agente contaminante, competindo com estes pelos substratos e pela produção de substâncias que inibam os contaminantes; Ø Ajustar uma escala de produção, permitindo uma produção programada de produtos (se inocular, pode-se ter certeza do que será o produto final e o tempo que leva a produção); Ø Obter uma maior uniformidade em diferentes lotes de produção; PARA UMA CULTURA MICROBIANA SER UTILIZADA COMO STARTER DEVE POSSUIR ALGUNS REQUISITOS FUNDAMENTAIS COMO: • ser tolerante ao sal (salmoura de 6 a 10%); • ser tolerante a presença de nitritos (50 a 100 ppm) • ter crescimento na faixa de 26 a 43 ºC e temperatura ótima de crescimento entre 32 a 35 ºC; • ser homofermentativo (produzir somente ácido láctico); • não ser proteolítico; • não ser lipolítico; • não produzir sabores e aromas atípicos ao produto final; Prof. Raul Vicenzi

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não ser patogênico; • apresentar destruição térmica a 57-60 ºC. Os cultivos starters não devem ser patogênicos, toxigênicos nem formar antibióticos, além disso não devem degradar os aminoácidos a aminas farmacologicamente ativas (ex. histamina) ou a ácido sulfidrico. As bactérias lácticas devem formar muito pouco ou nenhum peróxido de hidrogênio, não formar gás e pouco ou nenhum ácido acético. 3. PRODUÇÃO DE CULTURAS PARA FERMENTAÇAO EM ALIMENTOS Selecão: Selecionar cepas ou microorganismos que vão produzir a característica ideal. • O microorganismo deve ser geneticamente estável. Manutenção: Uma vez obtido o cultivo satisfatório devemos mantê-lo puro e ativo. Mantêm-se a cultura ativa por transferência ou repicagem em meio de cultura apropriado. O meio de cultura de repicagem deve ser o mesmo da atuação, de preferência; No ponto médio da fase exponencial de crescimento, guardar sob refrigeração para paralisar o crescimento. Neste ponto temos o maior número de células viáveis e mais saudáveis de uma cultura, se a usarmos como inoculante de um processo. O nível de sobrevivência depende do ambiente: cuidar a temperatura, culturas mantidas a altas temperaturas (ou mesmo ambiente) continuarão metabolizando e suas enzimas podem ser descaracterizadas. Usar sempre a mesma porcentagem de inóculo. Usar culturas que estão com o seu crescimento no ponto médio da fase exponencial. Se o inóculo for uma cultura mais resistente, podemos usar a cultura até o final da fase estacionária. 4. PUREZA DA CULTURA Evitar a presença de contaminantes. Os métodos de controle usados para checar a pureza do inóculo vão depender do tipo de microrganismo em questão: Exame microscópico é um método utilizado para identificação de contaminantes desde que se conheça a morfologia do microrganismo que estamos trabalhando e que o contaminante tenha uma morfologia diferente A detecção de substâncias produzidas pelos contaminantes e que não são produzidas pelos starters. Ex.: culturas lácticas são todas catalase negativa, enquanto que a grande maioria dos contaminantes são catalase positiva. Repicar uma amostra para o meio onde o contaminante cresce bem e de preferência tenha colônias características. Em caso de a contaminação retornar para a cultura estoque, ou se houver a suspeita de que esta está contaminada, fazer a repurificação estriando a cultura em meio seletivo para a cultura desejada e proceder a purificação. Prof. Raul Vicenzi

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5. CARACTERÍSTICAS DAS BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS São anaeróbias facultativas: crescem melhor com baixa tensão de oxigênio; São basicamente sacarolíticas: outros componentes são pouco alterados Produzem grande quantidade de ácido láctico: são ineficientes quanto a produção de energia Divisão quanto a fermentação da lactose: homo e heterofermentativas; Mecanismos biossintéticos pobres: é necessário o suprimento de carboidratos, aminoácidos, lipídios, minerais, etc, para que se desenvolvam: Não usam O2 no seu metabolismo, por isto não decompõem completamente o alimento e seus metabólitos básicos acumulam no meio. A única forma de metabolismo energético é a fermentação: São gram-positivas. 6. FERMENTAÇÃO POR STARTERS É alteração da matéria-prima, formando alimentos com características sensoriais agradáveis e proporcionando uma maior vida-de-prateleira. Os primeiros produtos fermentados foram descobertos empiricamente e serviam apenas para conservar. Após desenvolveu-se um certo gosto por produtos fermentados, hoje fabricados para obter propriedades de conservação e atender a demanda do mercado. E considerada como um método de preservação provocando modificações das características químicas da matéria-prima e pelo fato de que os agentes conservadores se formam como produto da mesma, por ação dos microrganismos são, no entanto alterações dirigidas. As transformações mais importantes de produtos alimentícios tem como principal substrato os carboidratos. Quase todos os conservantes produzidos por ação microbiana são ácidos (ácido láctico) e álcool. O efeito conservante dessas substâncias geralmente é complementado pela aplicação de outros métodos: baixas temperaturas, calor, anaerobiose, sal, açúcar, adição de um ácido (vinagre). As bactérias lácticas são utilizadas em uma série de produtos como: queijos, leites fermentados, vegetais e produtos cárneos produzem substâncias inibidoras (ácidos, álcool, H2 O2 e antibióticos (bacteriocinas)). 7. TIPOS DE FERMENTAÇÃO Os microrganismos lácticos utilizados na indústria de alimentos uns são homo e outros heterofermentativos, ou seja, alguns produzem apenas ácido láctico (homofermentativos) como produto da transformação do substrato em questão e, outros produzem ácido láctico e uma gama de outros ácidos que ficam incorporados ao produto. Láctica: picles, chucrute, azeitonas verdes, queijo, leites fermentados, produtos cárneos, etc.. Alcoólica: vinho, cerveja, sucos de frutas fermentadas, licores, destilados. etc... Acética: maionese, vinagre, etc. Propiônica: ácido propiônico. Prof. Raul Vicenzi

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8. IMPORTÂNCIA DO DESENVOLVIMENTO DA ACIDEZ a) Controle de contaminações indesejáveis, antagonismo (patogênicos); b) Ajuda na eliminação de umidade. Ex. queijos. c) Formação do sabor; d) Formação de corpo e textura; e) Facilita a ação de outros aditivos. Ex. a renina atua melhor em pH ácido; f) Ajuste do pH adequado para os diversos processos fermentativos; g) Conservação dos produtos (aumenta a vida útil ou vida-de-prateleira dos produtos.); h) Produção de bacteriocinas (proteínas que são produzidas a partir de seu metabolismo) 9. IMPORTANCIA DO ÁCIDO LACTICO NOS PRODUTOS FERMENTADOS a) Preservação do produto; b) Seleção da flora microbiana, evitando contaminações; c) Contribui para o sabor, aroma e flavor dos produtos fermentados; d) Melhora a digestibilidade de alguns produtos: Ex.: a precipitação de proteínas em partículas finas facilita a digestão enzimática; e) Melhora a utilização do Cálcio, Fósforo e Ferro no organismo (são melhores absorvidos em pH ácido); f) Estimula a secreção do suco gástrico. 10 FATORES IMPORTANTES NO DESENVOLVIMENTO DA FERMENTAÇÃO A presença de antibióticos constitui um sério problema para obtenção de starters lácticos. A penicilina, muito utilizada para combater mamites, e a aureomicina em concentrados da dieta. Os resíduos desses antibióticos no leite produzem inibição dos microrganismos lácticos ate 96 horas após a aplicação ter sido feita no animal. Níveis de 0,05 a 0,10 U.I. de penicilina/mL inibem o desenvolvimento da maioria dos Streptococcus e 0,5 U.I./mL inibe por completo a fermentação. Os Lactobacillus são mais resistentes, embora algumas espécies são inibidas por completo com 5 U.I./mL de penicilina no leite. Presença de resíduos de sanitizantes (iodóforos e amonioquaternários), os iodóforos em baixas concentrações estimula a presença de ácidos enquanto que em níveis maiores (50 a 100 ppm) a reduzem. Geralmente o cloro ativo em concentrações entre 25 e 200 ppm impedem a fermentação láctica. Amonioquaternários, níveis entre 25 e 75 ppm causam diminuição da velocidade ou detenção da fermentação. 11. IMPORTÂNCIA DAS CULTURAS STARTERS PARA INDÚSTRIA As formas de obtenção e estocagem de culturas starters tem proporcionado o aparecimento de culturas em melhores condições de uso do que as tradicionalmente usadas. O estoque das culturas é mantido em plantas de processamento via sub culturas em laboratório Prof. Raul Vicenzi

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O uso de culturas congeladas ou liofilizadas tem tomado possível inocular o volume de cultura diretamente no produto ou na preparação deste em uma cuba. Existem diversas vantagens para o uso de culturas starters concentradas: •

A atividade da cultura pode ser cuidadosamente controlada para monitorar a planta de processamento; • A manutenção do estoque de cultura da planta de processamento pode ser eliminado; • Menos trabalho é requerido; • O sistema de rotação de cultura starter é fácil de estabelecer ajudando a manter o controle sobre a bacteriofase; Os recentes desenvolvimentos da ciência e tecnologia de starters estão gradualmente encontrando novas aplicações. As seguintes tendências certamente figurarão nos futuros negócios da indústria de alimentos: Ø Uso de bactérias ácido lácticas especializadas em trocar ou promover certos tipos de

funcionalidade protéica; Ø Controlar a maturação de produtos fermentados; Ø Produção de novos produtos (diferentes composições, textura e flavor); Ø Novos produtos lácteos (produtos lácteos puros ou misturada com cereais); Ø Uma nova geração de bebidas fermentadas (terapêuticas e bebidas profiláticas; novos flavors); Ø Produtos com baixo teor de gordura; Ø Suplementos dietéticos para atletas, crianças e idosos; Ø Produtos lácteos não alergênicos;. Ø Destoxificação de certos produtos fermentados; Ø Produtos enriquecidos com antimicrobianos; Ø Disponibilidade de um largo espectro de bactérias ready-set starter. Existem inúmeros fatores que ajudam a proteger os produtos cárneos fermentados da rancificação pelo oxigênio do ar e dentre eles destaca-se a catalase dos micrococcaceae a qual quebra os peróxidos, incluindo o peróxido de hidrogênio produzido por Lactobacillus, além disso, os micrococcaceae também ajudam a aromatizar os produtos curados e o presunto cru, conforme mostra a figura 13. Redução do Nitrato

Desenvolvimento e estabilização da cor e do produto curado e inibição da rancidez

Degradação dos Peróxidos Hidrólise das gorduras

Intensificação do odor e flavor

Figura 13 - Efeito da catalase positiva (micrococcaceae) em produtos curados e produtos crus. Fonte: Lücke, 1986. Prof. Raul Vicenzi

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A figura 14 mostram de forma simplificada como os grupos de bactérias são importantes na carne e nos produtos cárneos e como elas podem ser distinguidas entre si. Os microrganismos mais importantes na fabricação de linguiça seca e presunto cru pertencem aos gêneros Lactobacillus. Staphyllococcus e Micrococcus A função mais importante das bactérias catalase positivas (particularmente Micrococcaceae) em produtos cárneos curados é manter a cor do produto e proteger as gorduras contra o ataque do oxigênio do ar, pois a rancidez é um problema maior nos produtos cárneos crus do que nos cozidos. Isto e devido ao fato de que muitos Lactobacillus produzem peróxidos durante a cura do produto e nos produtos cozidos não existem enzimas lipolíticas. Bastonetes

Coccus

Não forma esporos Catalase negativa

Catalase positiva

Não forma esporos

Micrococcus Staphylococcus

Catalase negativa

Forma esporos

Catalase positiva

Obrigatoriamente anaeróbia

Aeróbio ou aneróbio facultativo Bacillus

Aerotolerante anaerobia

Obrigatoriament e anaeróbia

Aerotolerante anaerobia

Lactobacillus

Anaeróbio facultativo

Aeróbio obrigatório Clostridium

Aeróbio

Brochothrix

FIGURA 14- Bactérias gram-negativas importantes para a carne e produtos cárneos. Fonte:Lücke, 1986. Atividade Lipolitica dos Micrococcus Micrococcaceae são também usados como starters devido a sua atividade lipolítica que dará uma contribuição essencial ao flavor do produto. Os micrococcus têm uma grande atividade lipolitica sendo capazes de atacar ácidos graxos de cadeia longa ou curta, triglicérides de 16 a 18 átomos de carbono. Observou-se que o máximo de atividade lipolítica do micrococcus ocorreu a pH 7,0 e a 32 ºC e esta atividade decresce com o decréscimo do pH e temperatura. Por exemplo a pH 5,5 e 11 ºC nenhuma atividade lipolítica extracelular foi observada sobre diversos triglicérides e gordura de suíno. Talon (1993), testou Staphylococcus warnieri 854, 863 e 864, Sraphylococcus saprophyticus M252 e 852 e Micrococcus varians M204 com relação a sua atividade lipolitica e percebeu que amostra inoculada com Micrococcus varians teve uma atividade menor que as outras bactérias testadas, no entanto, segundo o mesmo autor, a diferença entre estas cepas não pode ser explicada Prof. Raul Vicenzi

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pelo seu crescimento, embora microccocus varians tenha mostrado o maior crescimento, sua atividade lipolítica foi inferior as demais bacterias, sendo Staphylococcus saprophyticcus 852 a capa que apresentou a maior atividade lipolítica. Conforme relata Talon (1993), a produção de lipases por Micrococcus varians depende do O2, pois nenhuma atividade lipolitica pode ser detectada quando esta cepa foi cultivada sem agitação e aeração. Debevere (1976), já relatava que Micrococcus varians necessita crescer sob agitação e aeração para hidrolisar gordura de suíno. Esta atividade pode ser evidenciada pelo decréscimo dos ácidos graxos insaturados ao final da incubação e pode ser devido ao metabolismo bacteriano ou a oxidação, pois as bactérias forem obtidas sob condições de agitação e aeração apropriadas. Outros autores também mostraram que Micrococcus varians foi capaz de produzir em adição a oxidação outros compostos carbonílicos a partir de ácidos graxos saturados (Talon, 1993). O flavor típico dos salames é devido a produção de ácidos durante a fermentação, ao sal e a diferentes compostos derivados ao catabolismo dos açucares ou ainda a compostos produzidos durante a maturação da carne estes compostos podem ser de origem não enzimática, como durante a oxidação dos lipídios ou pode ser resultado de uma Esta catálise e devida a enzimas endógenas no caso dos produtos onde são usados starters como o presunto curado mas depende também de enzimas exógenas no caso dos produtos. Efeito dos Cultivos Starters em Embutidos Secos As bactérias lácticas inibem, pela formação de ácido láctico, o desenvolvimento de microrganismos indesejáveis e melhoram a textura dos embutidos secos. Em troca. a microbiota catalase positiva, melhora a cor, aroma e proteção do produto frente ao efeito prejudicial do oxigênio. Para tanto, depende do tipo de produto desejado a conveniência do emprego de cultivos starters e quais deles devem ser empregados. Formação de Cor e Flavor A formação de cor no produto curado é resultado de uma série de reações desencadeadas pelas bactérias nitrato redutoras, principal característica do gênero Micrococcus e Staphylococcus que inicialmente, reduzem o nitrato a nitrito e, posteriormente, devido à produção de ácido pelas bactérias acidificantes (acidolácticas) ocorre a queda do pH, a reação prossegue e os nitritos são decompostos a óxido nítrico para entao reagir com a mioglobina, formando nitromioglobina que vai conferir a cor característica dos produtos curados, conforme mostra a figura 15. Ação bacteriana

NaNO3 (Nitrato de Sódio) NaNO2 + H2 O

NaNO2 + O2 PH = 5,4 a 6,0

HNO2 + NAOH (Ácido nitroso)

3HNO2

2NO + H2 O + HNO

NO + Mioglobina Nitrosomioglobina FIGURA 15- Esquema das reações de formação de cor pela ação das bactérias nitrato redutoras. Fonte: Coretti, 1971 Prof. Raul Vicenzi

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As reações de formação de cor são fortemente influenciadas pela velocidade e intensidade de acidificação que, quando muito intensa, resulta na inibição dos microrganismos redutores do nitrato. Em conseqüência, o produto apresenta o centro de cor cinza. Ocasionalmente pode surgir um defeito chamado nitrite burn quando houver uma fase de latência muito grande dos microrganismos lácticos, os microrganismos sensíveis ao ácido e redutores de nitrato reduzem quantidades excessivas deste. Posteriormente, as bactérias lácticas reduzem o pH e uma coloração marrom-esverdeada torna-se aparente. Um balanço dinâmico entre microrganismos redutores de nitrato e microrganismos lácticos previne este tipo de deterioração. A formação do flavor no produto curado, importante contribuição dos Micrococacceae, pode ser produzido de 4 maneiras: • Oxidação lipídica • Fermentação dos açúcares • Catabolismo derivado de aminoácidos como a valina, leucina ou isoleucina; • Alimentação do animal, Outra importante contribuição desta espécie é a produção de catalase a qual remove o H2 O2 produzido nelas bactérias acidoláticas, pois este representa um forte agente oxidante exercendo efeitos adversos sobre a cor, aroma e vida de prateleira dos produtos curados. PROCEDIMENTOS DE MANUTENÇÃO Micrococcus sp são inicialmente cultivados em Agar nutriente ou em caldo de levedura. Incubação a 30-37 ºC, com crescimento abundante. As culturas podem ser estocadas em refrigerador (5ºC) em tubos hermeticamente fechados por 3 a 5 meses ou em meio líquido com uma camada superficial de parafina por 1 a 2 anos ou ainda na forma liofilizada por 5 anos ou mais. Para uma cultura starter ter significância comercial é preciso um tratamento de preservação para que as células mantenham sua viabilidade e atividade fermentativa durante o transporte e estocagem. A liofilização é freqüentemente utilizada como metodologia conveniente para este fim. A exposição das células a este tratamento e a subseqüente reidratação podem ter efeito adversos sobre as células, tais como aumento da fase lag e redução da atividade fermentativa. A imobilização da bactéria em um gel de polímero (pérolas de alginato de cálcio com glicerol 1M e um crioprotetor) antes da liofilização, confere as pérolas de gel uma proteção adicional durante o processo de liofilização e proporciona um melhor controle do ambiente ao qual as células serão expostas durante a reidratação e sobre a inoculação direta no substrato para fermentação.

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SISTEMAS DE FERMENTAÇÃO O termo fermentação no sentido mais amplo possível, pode ser definido como todo o processo no qual microrganismos catalisam a conversão de uma dada substância num determinado produto. O processo de conversão pode requerer ou não oxigênio, e os próprios microrganismos podem estar incluídos entre os produtos formados. Os processos fermentativos podem ser classificados de acordo com a maneira através da qual o substrato é adicionado e o produto é retirado. Assim sendo, numa fermentação descontínua, o substrato pe inicialmente carregado num recipiente e, ao término do processo, o produto é retirado do mesmo. Em uma operação contínua a matéria-prima é adicionada com uma vazão constante e o meio fermentado é retirado com a mesma vazão de alimentação. Devem ainda ser mencionados os processos semicontínuos, nos quais a adição do meio e a retirada do produto são efetuadas intermitentemente. Tais processos podem ser considerados como intermediários entre os descontínuos e os contínuos. FERMENTAÇÃO DESCONTÍNUA O sistema descontinuo e considerado um sistema fechado exceto pela adição de oxigênio, um agente antiespumante e um acido ou base para controlar o pH. Contém uma quantidade limitada de meio, em que o inóculo passa por um numero de fases (curva de crescimento). Utiliza-se sempre um inoculo novo, depois de terminada a fermentação retira-se o produto e o resto vai fora; tem elevado custo. Os processos descontínuos podem ser classificados em três grandes grupos: • Processo em cada dorna recebe o inóculo; • Processos com recirculação dos microrganismos; • Processo por meio de cortes. No primeiro caso cada fermentador recebe um inóculo recentemente preparado. Desde que a técnica de preparo do pé-de-cuba tenha sido adequadamente obedecida, este sistema de trabalho é o que oferece melhores condições para uma boa fermentação, uma vez que cada fermentador recebe uma suspensão de microrganismos de elevada atividade e, praticamente, isenta de células contaminantes. Na fermentação com circulação ou aproveitamento dos microrganismos, procede-se da seguinte maneira: No início de funcionamento da instalação, algumas dornas são inoculadas com péde-cuba; o meio, uma vez completamente fermentado, é centrifugado, obtendo-se assim uma suspensão de microrganismos de elevada concentração; a suspensão obtida é quase sempre submetida a um tratamento com vistas a eliminação de células inativas e de microrganismos contaminantes e é então, utilizada como inóculo de outro fermentador. Quando bem conduzida, essa técnica pode ser desenvolvida durante meses consecutivos sem necessidade de preparo de novo péde-cuba.

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Finalmente, na fermentacão por meio de cortes, opera-se do seguinte modo: inicia-se o trabalho inoculando-se uma dorna (que será chamada de dorna A) com pé-de-cuba: quando a fermentacão atinge um estágio apropriado, passa-se parte do conteúdo do fermentador A para um fermentador vazio (que será chamado de dorna B) e, em seguida, enche-se as duas dornas com o meio a fermentar. Essa operação recebe o nome de corte. Diz-se que a dorna A foi cortada para a dorna B, ou ainda, que B recebeu um corte de A. A sucessão de cortes pode acarretar sérias quedas de rendimento, principalmente quando se trabalha com meio não esterilizado. As Figuras 1 e 2 mostram o que pode acontecer nesse caso. O número máximo de cortes sucessivos não pode ser previsto. Em cada caso somente o controle do rendimento ao processo poderá dizer em que momento e conveniente suspender-se o trabalho por meio de cortes e iniciar-se nova fermentação com inóculo novo. Às vezes, o processo de cortes é utilizado na fase industrial do preparo do próprio inóculo, podendo-se operar do seguinte modo: em um dos tanques de crescimento do microrganismo uma vez alcançado o momento da transferência para o tanque subseqüente apenas uma fração da suspensão microbiana é transferida, completando-se o tanque com mosto novo. Consegue-se, dessa maneira, em alguns casos evitar diversas das etapas iniciais do processo de preparo do inóculo. Convém lembrar a possibilidade, na prática industrial, de serem utilizados processos mistos (batelada + cortes). É o que acontece, por exemplo, em algumas fábricas de aguardente de cana que durante a semana trabalham pelo processo de corte e no fim da semana submetem o conteúdo de alguns fermentadores a uma centrifugação, utilizando a suspensão microbiana obtida como inóculo de fermentadores para a semana subseqüente. A principal desvantagem das fermentações descontínuas quando se utiliza para produção de produtos associados ao crescimento, é que a formação eficiente de produto tem lugar unicamente durante uma fração do ciclo de fermentação.

FIGURA 16 – Ilustração do ciclo de uma fermentação descontínua Prof. Raul Vicenzi

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Os sistemas contínuos, com volumes de saída de produto elevados podem ser, em conseqüência, muito mais eficazes em determinadas aplicações em termos de produtividade do fermentador (volume de produção por unidade de volume por unidade de tempo, Kg.m-3 .h-1 ). PROCESSOS SEMICONTINUOS Os processos fermentativos chamados semicontínuos, utilizados, em alguns casos, em escala industrial, consistem no seguinte: carrega-se o fermentador com meio, adiciona-se o inóculo e aguarda-se o termino da fermentação; retira-se, então, da dorna, um certo volume de líquido fermentado e adiciona-se igual volume de meio novo: terminada a fermentação retira-se novamente do fermentador, um dado volume de liquido e adiciona-se igual volume de meio; e assim por diversas vezes durante meses consecutivos. Também nesse caso, o controle do rendimento do processo poderá determinar o momento em que o trabalho pela técnica descrita deva ser suspenso, para ser iniciada uma nova fermentação com inóculo recentemente preparado. Os produtos gerados não vão atrapalhar, pois vai haver uma diluição e as concentrações retornam a níveis iniciais de diluição. PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO Este processo e uma melhoria do processo descontínuo tradicional. Utiliza-se para produção de produtos como a penicilina. Neste sistema o substrato vai sendo adicionado em intervalos ao longo do processo de maneira escalonada a medida que se processa a fermentação com objetivo de que a célula não se reproduza muito e assim continuar a fermentação. Geralmente não é possível medir a concentração de direta e continuamente durante fermentação a fim de controlar o processo de alimentação, tem que ser medidos parâmetros indiretos que estão correlacionados com o metabolismo do substrato crítico. Ex: na produção de ácidos orgânicos o valor do pH pode ser utilizado para determinar a velocidade de alimentação de glicose. Esta forma de processo elimina os efeitos limitantes pelas fontes de carbono utilizadas rapidamente, reduz a viscosidade do meio e o efeito dos constituintes tóxicos ou simplesmente faz com que a etapa de formação do produto seja a mais longa possível. Desvantagem - a formação do produto tem lugar unicamente durante uma fração do ciclo de fermentação (na fase exponencial) Em um cultivo descontínuo, a concentração de biomassa por unidade de tempo (t) é:

X – XR = ã (S R - s) Onde: X = concentração celular no tempo t; XR = inóculo ou concentração celular inicial; ã = rendimento para o substrato limitante (g de biomassa por g de substrato consumido); s = concentração de substrato no tempo t; SR = Concentração inicial do meio. Prof. Raul Vicenzi

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x – XR Por tanto:

ã

= -------------SR – s

A quantidade de biomassa alcançada na fase estacionária depende teoricamente da concentração inicial do substrato limitante do crescimento e da eficiência do organismo em converter o substrato em material celular. Por tanto, supondo que o substrato limitante do crescimento seja S = 0 na fase estacionária o rendimento será: x – XR ã = -------------SR SISTEMA CONTÍNUO Antes de fixarmos os objetivos deste capítulo, devemos definir o que se entende por fermentação contínua. E considerado um sistema aberto em que o meio vai sendo adicionado continuamente ao bioreator e vai eliminando-se simultaneamente igual volume de meio fermentado. Existem 2 tipos fundamentais de reatores contínuos: reatores de mistura completa e reatores de fluxo de pistão. Apesar do grande esforço devotado por inúmeros pesquisadores ao assunto, as fermentações contínuas ainda constituem um enorme campo a ser explorado, principalmente no que se refere a sua aplicação em processo de interesse econômico. Essa afirmativa poderá ser melhor compreendida se atentarmos para o numero relativamente pequeno de instalações industriais que utilizam os processos contínuos de fermentação e, entre as instalações existentes, para o número ainda pequeno de produtos fabricados por esses processo. Assim sendo, os processos contínuos constituem uma das tecnologias mais promissoras no campo da biotecnologia pois, apesar da escassez das instalações industriais existentes e da pouca diversificação dos produtos fabricados, muitos pesquisadores têm mostrado. em escala-piloto ou semiindustrial, a possibilidade de fabricação de diversos produtos através de cultivo contínuo, e também as vantagens deste sobre as fermentações descontínuas. A titulo de exemplo, podemos mencionar o ácido glicônico, ácido láctico, glicogênio, cloranfenicol penicilina, vitamina B12. Entre os microrganismos produzidos, podemos citar os gêneros Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Clostridium, Penicillium, Saccharomyces, Torula, etc. Os fatos mencionados anteriormente, aliados às vantagens que um cultivo contínuo apresenta para estudos da fisiologia de microrganismos, visto que as condições ambientais permanecem constantes com o tempo, o que, evidentemente não acontece com os processos descontínuos, justificam plenamente o interesse em pesquisarmos e entendermos melhor este tipo de sistema. As teorias da fermentação contínua foram estabelecidas a partir de balanços materiais e da introdução de alguns conceitos e definições. Um dos conceitos importantes é o substrato limitante. Entende-se por substrato limitante o material que, quando submetido a uma mudança de concentração, afeta o crescimento, o consumo de substrato e a formação de produtos do Prof. Raul Vicenzi

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microrganismo cultivado. REATORES DE MISTURA COMPLETA Neste reator em estado de equilíbrio, o crescimento das células se controla ajustando a concentração de um substrato. Qualquer substrato que requeira carboidrato, nitrogênio, sais e oxigênio pode ser usado como substrato limitante. O crescimento das células se mantém constante utilizando a turbidez para controlar a concentração de biomassa e a velocidade de alimentação da solução de nutrientes se ajusta de forma apropriada. Num processo contínuo não se tem cepas preparadas para o processo, a contaminação não é controlada com facilidade porque o mosto está sempre entrando. Se o processo for aeróbico temos o ar como fonte de contaminação. Uma alternativa é o processo semi-contínuo onde de tempo em tempo se adiciona o inóculo adaptado a um antibiótico, porém o rendimento é ruim. Em um reator contínuo de mistura completa de uma só etapa, a adição de substrato a uma velocidade adequada combinada com a eliminação a uma velocidade volumétrica igual de meio de cultivo do recipiente produz um estado estacionário em que a formação de biomassa está em equilíbrio com a perda de células, e nestas condições podemos dizer que: a) a velocidade de crescimento especifico (ì) é controlada pela velocidade de diluição (D), posto que ì = D. b) A concentração de substrato no estado estacionário S em um fermentador e determinada pela taxa de diluição, segundo a equação abaixo, se as cinéticas seguem o modelo de Monod e D < ìmax. KS D S = ------------ìmax - D c) A concentração de biomassa no estado estacionário, X é determinada pelas variáveis operacionais SR e D, segundo a equação abaixo: KS D X = ã [ SR – ------------- ] X = ã [S R – s] ìmax - D Na figura seguinte é mostrado o efeito da velocidade de diluição sobre as concentrações de substrato e biomassa no estado estacionário e sobre a produtividade de biomassa. Como podemos ver, a medida que D se aproxima de ìmax, a concentração residual de substrato limitante necessária para suportar o aumento de velocidade de crescimento se eleva e portanto a concentração de substrato também aumenta (até o limite superior s = SF) enquanto que a biomassa diminui. Quando se utiliza um sistema de cultivo contínuo, por exemplo em um processo de fermentação industrial de produção de proteínas de organismos unicelulares, a quantidade de células produzidas por unidade de tempo (velocidade de produção) e por unidade de substrato utilizado (ã) deve ser máxima. No estado estacionário, a velocidade de produção será igual ao produto da velocidade de fluxo pela concentração celular. Para que a produção celular seja máxima a velocidade de diluição deverá ser alta embora não exceda o ì max ou se perderá material. Prof. Raul Vicenzi

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FIGURA 17 – Influencia da velocidade de diluição nas concentrações de biomassa (x) e substrato (s) no estado estacionário e a produtividade da biomassa (P’) Na produtividade máxima combinando uma produção elevada com uma de substrato eficaz, se obtém uma velocidade de fluxo igual a máxima velocidade de produção, ou ligeiramente inferior, e com a maior concentração de substrato possível no fluxo de alimentação. REATORES DE FLUXO PISTÃO Neste tipo de fermentação contínua a solução de cultivo flui através de um reator tubular sem mistura. A composição da solução de nutrientes, número de células, transferência de massa (consumo de oxigênio) e as concentrações de produto variam em diferentes posições dentro do sistema, de uma forma análoga a das trocas ocorridas ao longo do tempo em um fermentador descontínuo. Na entrada do reator as células devem adicionar-se continuamente junto com a solução de nutrientes (geralmente um fluxo que reverte de um desvio da saída do fermentador ou da saída de um segundo fermentador), ou seja, um sistema de reciclagem de biomassa. Em um processo contínuo em condições de equilíbrio a perda de células devido ao fluido que sai deve ser balanceada, pelo crescimento dos microrganismos. A velocidade do fluxo se define como a velocidade de fluxo volumétrico (que entra e sai) através do volume do fermentador.

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INTRODUÇÃO AO ESTUDO DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Durante milhares de anos o álcool etílico tem sido produzido para o consumo humano, e também há milhares de anos tem sido possível fazer bebidas alcoólicas concentradas mediante destilação. Em países de extensas áreas agrícolas como Brasil, EUA e África do Sul, tem sido feitos estudos para elaboração de etanol a partir de amido e sacarose, para ser utilizado como combustível juntamente com a gasolina. PRIMEIROS ESTUDOS SOBRE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA BECHNER: Século 17 - somente os líquidos açucarados são capazes de entrar em fermentação alcoólica. O álcool se formava durante o processo de fermentação, erradamente julgando a necessidade de ar para causar o fenômeno que dizia ser semelhante à combustão; BLACK: Século 18 - postulou que o álcool etílico e o gás carbônico eram os únicos produtos formados do açúcar durante a fermentação alcoólica; LAVOISIER: 1789 - primeiro a efetuar um estudo quantitativo da fermentação alcoólica, identificou além do álcool etílico e do gás carbônico um outro composto, o ácido acético. GAY LUSSAC: Seguiu os estudos de Lavoisier, formulou a equação que julgava representar o fenômeno da fermentação alcoólica: C6 H12 O6 2C2 H5 OH + 2CO2 PASTEUR: 1857 - Explicou a natureza da fermentação alcoólica, atribuindo-a a atuação de seres vivos, as leveduras, como agentes causais. EMBDEN, MEYERHOF, ROBISON, NEUBERG, CORI, PARNAS E WARBURG: Século 19 Foram os arquitetos pioneiros da identificação das rotas bioquímicas que hoje representam a fermentação alcoólica em todas as suas etapas. FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR MICRORGANISMOS Generalidade - a fermentação alcoólica pode ser considerada como a oxidação anaeróbica, parcial, da glicose, por ação de leveduras, com a produção final de álcool etílico e anidrido carbônico, além de outros produtos secundários. É processo de grande importância, através do qual é obtido todo o álcool industrial, e todas as bebidas alcoólicas, destiladas e não destiladas e, como produto secundário, o gás carbônico. E ainda utilizado na panificação e na obtenção de leveduras prensadas. Bebidas alcoólicas são produzidas de um grande número de substratos ou matérias cruas, mas especialmente de cereais, frutas e sementes com alto teor de açúcar, incluem as bebidas não destiladas como cerveja, vinho (11,5%), cidras e sakê, as destiladas como o whiski (43%) e rum são produzidos de cereais fermentados e melaços, respectivamente, enquanto o brandy é produzido pela desti1ação do vinho. Outras bebidas destiladas tais como vodka (40%) e gin, são produzidos pela destilação de melaços fermentados, grãos e batata. Uma variedade de vinhos fortes são produzidos pela adição de álcool destilado para obter um conteúdo de álcool entre 15-20%, inclui-se este caso os sherries e vinhos amadeirados. Prof. Raul Vicenzi

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MATÉRIAS-PRIMAS Qualquer produto que contenha açúcar ou outro carboidrato, constitui-se em matéria-prima para obtenção de etanol. Entretanto, para que seja viável economicamente, é preciso considerar seu volume de produção, o rendimento industrial e o custo de fabricação. Três tipos de substratos podem ser utilizados na obtenção de etanol por fermentação: a) raízes que contém amido, tubérculos ou grãos; b) melaços ou suco de cana-de-açúcar ou de beterraba; c) madeira ou resíduos do processamento de madeiras. O uso do soro de queijo não tem valor comercial, atualmente. A matéria-prima utilizável na fermentação alcoólica varia com as características agrícolas da região, com as características da própria matéria-prima e com a finalidade da fermentação alcoólica. PREPARAÇÃO DO SUBSTRATO As matérias-primas de interesse nacional, destinadas à fabricação de álcool fornecem uma mistura de glicídios e outras fornecem amido. Os substratos requerem preparação prévia adequada, para somente depois passarem as dornas de fermentação. Sacarinas - nas quais figuram a glicose a levulose (melaço, uso de uvas, suco de frutas, mel e outras), e a sacarose (caldo de cana-de-açúcar). Neste caso, a sacarose é hidrolisada por uma exo-enzima, sacarase, produzida pela levedura. C12 H22 O11 sacarose

+ H2 O + sacarase

C6 H12 O6 + C6 H12 O6 glicose levulose

O caldo de cana-de-açúcar invariavelmente é utilizado in natura, podendo ,às vezes ser diluído e/ou aquecido e clarificado; O melaço deve ser diluído com água. As concentrações do mosto são comumente expressas em graus brix, diluindo-se os melaços para graduações entre 15 e 25 ºBrix, com médias de 18-20 ºBrix. Mostos muito diluídos fermentam mais rapidamente e sujam menos os aparelhos de destilação, mas exigem, maior espaço para fermentação, mais consumo de vapor, mais mão-de-obra e favorecem contaminações do mosto Amiláceas - tais como a mandioca, batata, milho, arroz, trigo, e outros cereais, utilizados na produção de álcool fino, cerveja, e certas bebidas destiladas. Tem que se considerar que as leveduras não produzam amilase, para a hidrólise do amido. Conseqüentemente, tais substâncias tem que sofrer uma operação prévia de sacarificação, para ficarem em condições de serem utilizadas pelas leveduras. Essas sacarificação ou hidrólise do amido, pode se puramente química, por ação de ácidos fortes, como na produção de álcool de mandioca ou batata. (C 6 H10 O5 )n + H2 SO4 amido

n C6 H12 O6 glicose

Entretanto, na obtenção de bebidas como a cerveja, o uísque, o sakê e do próprio álcool, o amido é hidrolisado, pela ação enzimática.

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(C 6 H10 O5 )n +

n2

H2 O + amilase

n2

C12 H20 O11 maltose

A maltose surge de modo semelhante à sacarose. A sacarificação enzimática do amido pode ser feita por três processos diferentes: Através da maltagem, ou emprego do malte. Este produto é preparado a partir de sementes de cereais, em germinação, secas e reduzidas a pó, e se caracteriza pela sua riqueza em amilase. Adicionado ao amido previamente preparado, transforma-o em maltose. A maltose é utilizada entre outros, em cervejaria e na produção de uísque. Pelo processo amilo, que consiste no emprego simultâneo de um fungo capaz de produzir a amilase que atua sobre o amido (Rhizopus japonicum, Aspergillus orizae, Mucor delemar, Amylomyces rouxii e outros) e da levedura encarregada da fermentação do açúcar proveniente da hidrólise. Este processo é utilizado na produção do sakê. Pelo emprego de preparados enzimáticos produzidos previamente em culturas puras, por certos microrganismo (Fungos e Bactérias). Celulósicas, a celulose da madeira pode, eventualmente, ser utilizada na fermentação alcoólica, necessitando, porém, ser hidrolisada por via química: (C 6 H10 O5 )n celulose

+ H2 SO4

n

C6 H12 O6 glicose

AGENTES DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA As leveduras, de um modo geral, são capazes de desdobrar a glicose, com produção de álcool etílico e gás carbônico. Entretanto, o número de espécies envolvidas na fermentação industrial é bastante reduzido. Mais de 96% do etanol produzido por fermentação é através da utilização de Saccharomyces cerevisiae ou espécies semelhantes, particularmente Saccharomyces uvarun. Somente poucas espécies desses microrganismos são utilizados na fabricação de álcool. As mais importantes são: a) Saccharomyces cerevisiae Hansen utilizada principalmente na produção de álcool comum, aguardente, cerveja e outras bebidas e na panificação; b) Saccharomyces ellipsoideus Hansen (Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus Dekker) utilizadas na produção de vinho de uva; c) Saccharomyces calbergensis, para a produção de cerveja Utiliza-se a Saccharornyces cerevisae e Schizosaccharomyces pombe, quando o substrato é costituido de hexoses, e Candida utilis quando uma parcela do substrato for constituído por pentoses O microrganismo utilizado para fermentação pode ser: selvagem, selecionado ou prensado. A levedura empregada na fermentação, depende de várias fatores, entre as quais o substrato ou matéria prima utilizada, o teor alcoólico desejado no produto final, a duração da fermentação, as propriedades do produto, e outros. MICRORGANISMO SELVAGEM: é o microrganismo natural que acompanha o próprio mosto. Através desta fermentação tem-se uma fermentação impura, pois junto com o microrganismo ou levedura utilizada na fermentação tem-se também bactérias que vão competir causando o que se Prof. Raul Vicenzi

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chama DESVIO DE FERMENTAÇÃO, tendo-se uma fermentação de baixo rendimento e lenta pois a fermentação não tem um controle da qualidade dos microrganismos e, por ser lenta facilita a contaminação; tem-se um produto com baixo teor alcoólico o que facilita sua deterioração. MICRORGANISMO SELECIONADO: é de origem natural (Ex. caldo de cana, pode-se isolar o microrganismo) isolado da natureza e selecionado para determinado uso, isto é feito pela série bioquimica onde se faz um estudo do microrganismo. Após tem-se uma cultura pura, tendo-se conhecimento por exemplo da velocidade de fermentação, resistência ao álcool; esta cultura pura pode ser seca ou liofilizada ou ainda congelada. PREPARAÇÃO DO MICRORGANISMO SECO: chama-se pé-de-cuba; pega-se o envelope contendo o microrganismo e coloca-se em contato com água morna estéril para reidratar, após o fermento é adicionado em uma pequena quantidade estéril do mosto em que vai ser usado e mantido por 24 horas, após este tempo por mais 24 horas em uma quantidade maior de mosto, também estéril, sempre controlando-se o grau Brix e continua-se aumetando a quantidade de mosto até atingir o grau Brix desejado na concentração celular desejada, pode-se também fazer uma adaptação deste microrganismo a agentes antisépticos como o metabissulfito, este processo é gradativo visto que o microrganismo tem que sofrer uma adaptação aos meios que se deseja usar. MICRORGANISMO PRENSADO: neste caso usa-se normalmente Saccharomnyces cerevisiae; fazse um mosto de melaço e coloca-se o microrganismo, injeta-se também oxigênio as células de Saccharomyces c.; após estas células passam por uma centrífuga e depois são prensadas. No caso de Saccharomyces cerevisiae é um bom processo para produção de fermentados alcoólicos. NUTRIÇÃO CELULAR Levedura é quimiorganotrófica, pois obtém energia através da oxidação de compostos orgânicos desdobrando-os para retirar energia. Os elementos nutritivos mais importantes representam-se pelo carbono, nitrogênio, fosfatos, sais de magnésio, potássio e cálcio. Certos tipos de matérias-primas requerem a adição de substâncias minerais para suprir as necessidades da levedura em certos elementos principalmente P e K . O caldo de cana-de-açúcar é uma matéria prima quase completa sendo deficiente em Nitrogênio e Fósforo, dai adição de 0,1 g/L de sulfato de amônio e 0,1 g/L de fosfato. O mosto preparado com caldo de cana-de-açúcar deve conter entre 14 e 18% de sólidos solúveis, não menos porque a produção de álcool seria pequena, logo esta fermentação estará sujeita a contaminação e, acima de 18% a produção de álcool vai inibir a divisão celular (microrganismo não vai multiplicar-se). FATORES QUE AFETAM A FERMENTAÇÃO Entre os vários fatores ambientes que afetam a fermentação citamos: Temperatura, variável de acordo com o tipo e finalidade do processo; assim, o ótimo para a produção de álcool, aguardente, vinho e outros produtos se situa entre 26 e 32º C, ao passo que, para a cerveja, está entre 6 a 20ºC; Prof. Raul Vicenzi

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pH do mosto, também variável entre 4,0 e 5,0 para a produção de álcool, entre 4,0 e 4,5 para a cerveja. O pH baixo inibe o desenvolvimento de bactérias contaminantes, sem prejudicar o desenvolvimento das leveduras. Concentração matéria prima: se bem que a levedura suporta concentrações de açúcar em torno de 22 a 24%, nos processos industriais ela é variável de acordo com a finalidade do processo: situa-se entre 12-14% no melaço, para a produção de álcool, entre 6-9% para a produção de cerveja, entre 22-24% no suco de uva para obtenção de vinho; Teor alcoólico do produto, o aumento do teor alcoólico do mosto em fermentação inibe o desenvolvimento da própria levedura: no geral este cessa em concentrações de 11-12% do álcool. Deve-se ter em conta que o teor alcoólico depende do teor inicial em açucares, o qual, por sua vez, é variável com o fim a que se destina. Na produção do álcool industrial, por exemplo, parte-se de uma concentração baixa de açucares (12-14%) para se obter seu desdobramento total em 24-48 horas, sem que a levedura seja inibida pelo teor alcoólico final; Oxigênio - em anaerobiose, o rendimento em álcool é maior, uma vez que, em aerobiose, há oxidação total da glicose; Anti-sépticos e Antibióticos – utilizados para controlar o problema das contaminações. Cada produto age diferentemente. Alguns favorecem a atividade de leveduras ao mesmo tempo em que inibem bactérias e fungos. No processamento de vinhos é muito comum o uso de SO2 . O uso dos antibióticos é de agente esterilizante, em virtude de suas propriedades bacteriostáticas. A penicilina é um bom inibidor de contaminações. Pode-se usar, também, cloranfenicol, tetraciclina e clorotetraciclina. CORREÇÕES DO MOSTO Normalmente se fazem correções em termos de elementos nutritivos. A correção dependa da natureza da matéria-prima. Substratos amiláceos sofrem esterilização, adição de fosfatos e correção de pH. Substratos como o melaço faz-se a diluição e pode-se adicionar fosfatos e saís de amônio. Caldo de cana-de-açúcar adiciona-se fosfatos, sais de amônio e vitaminas. Pode-se adicionar farelo de arroz como fonte de vitamina e aminoácidos, e também magnésio, cobalto e manganês. Além de antibióticos e anti-sépticos. PREPARO DO INÓCULO Podem ser utilizadas leveduras selvagens (pequenas cantinas e destilarias de aguardente) ou selecionadas, tolerantes a altas concentrações de etanol e com boa velocidade de fermentação. Também se utilizam as leveduras de panificação, prensadas e secas. Em qualquer caso é conveniente preparar adequadamente o pé-de-cuba, pois esta prática melhora sensivelmente a fermentação. CRESCIMENTO DA CÉLULA NO TANQUES DE FERMENTAÇÃO MÉTODO DA MASSA SECA No momento em que se tem mosto e adiciona-se o microrganismo começa a fermentação, acompanha-se o crescimento através da massa seca: coleta-se uma amostra de 50 ml, coloca-se em Prof. Raul Vicenzi

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uma cápsula (tarada) em banho-maria para evaporação do liquido, após todo o liquido ter evaporado leva-se a cápsula para estufa a 100 ºC por 3 horas, após pesa-se ou até peso constante. MÉTODO DA CURVA DE CRESCIMENTO O número de células é visto inoculando-se a massa seca em um caldo e fazendo-se as diluições necessárias e, destas aplicando-se em placas de Petri com meio de cultivo apropriado. Após incubação conta-se as colônias de acordo com as diluições e monta-se um gráfico (curva de crescimento) Log do nº de microrganismos versus tempo. MECANISMO DA FERMENTAÇÃO O mecanismo de fermentação foi quantificado pela primeira vez por Gay Lussac, baseandose na estequiométrica da conversão de uma hexose em etanol e anidrido carbônico. C6 H12 O6 hexose

C2 H5 OH + 2CO2 etanol anidrido carbônico

A fermentação alcoólica decore da via catabólica da frutose bifosfato (FBP) degradada da glicose. Esta degradação serve a todos os seres vivos, com exceção de algumas bactérias, para obtenção de energia e materiais para construção da célula, denomina-se também rota de EmbdenMeyerhof-Parnas (EMP), seus descobridores, no entanto também na maioria das vezes nomeia-se segundo seu primeiro produto intermediário característico, a frutose-1,6-bifosfato. A degradação da glicose, a glicólise, transcorre nas células fermentativas e naquelas que utilizam o açúcar até CO2 de maneira comum até o ácido pirúvico. O piruvato produzido durante a glicólise é convertido a acetaldeído e etanol. Este processo se dá em duas fases: 1ª FASE: o piruvato sofre a descarboxilação em uma reação irreversível catalisada pela piruvato descarboxilase. Esta reação é uma descarboxilação simples e não envolve a oxidação do piruvato A piruvato descarboxilase requer Mg2+ e tem uma coenzima firmemente ligada, a Tiamina Pirofosfato 2ª FASE: através da ação da álcool desidrogenase, o acetaldeído é reduzido a etanol, com NADH, derivado da atividade da gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, fornecendo o poder redutor. Portanto ao invés de lactato, os produtos finais da fermentação alcoólica são o etanol eo CO2 . A equação geral da fermentação alcoólica é: Glicose + 2ADP + 2Pi 2 Etanol + 2C02 + 2ATP + 2H2 0 A piruvato descarboxilase está caracteristicamente presente nas leveduras, as quais são agentes biológicos ativos responsáveis pela fermentação alcoólica; por isto a escolha da linhagem apropriada é de importância fundamental para o êxito da fermentação. Teoricamente se pode obter a partir de 1g de glicose, 0,511g de etanol e 0,489g de CO2 . Quando se fermentam substratos puros, o rendimento é de 95% e se reduz a 91% quando se utiliza matéria-prima de grau industrial. Porém, na prática, aproximadamente 10% da glicose é convertida em biomassa e o rendimento de etanol e CO2 deve alcançar 90% do valor teórico. O ATP formado é usado para suplementar outros requerimentos de energia pela célula. Prof. Raul Vicenzi

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Em termos de quantidade, 100 g de glicose pode produzir, após a fermentação, 48,4g ou 61 mL de etanol, 46,6g de gás carbônico, 3,3g de glicerol, 0,6g de ácido succínico e 1,2 g de biomassa (células de leveduras). Estes valores refletem o rendimento ideal de Pasteur na fermentação alcoólica para a glicose, que representam 94,7% do rendimento ideal de GL. A fermentação só é possível graças a ação das leveduras. SISTEMAS DE FERMENTAÇÃO Distinguem-se quatro tipos principais de processos de fermentação industrial, que são: Sistemas de cortes – depois que se faz a primeira fermentação, divide-se o volume do mosto em dois recipientes, completa-se os dois e deixa-se fermentar. Um envia-se para destilaria e outro deixa-se para produzir inóculo para mais dois. Sistema de reaproveitamento de inóculo – após a fermentação deixa-se decantar as leveduras, retirase o vinho para a destilação, trata-se o inóculo (pe-de-cuba) e realimenta com novo substrato. Sistema de cultura pura – para cada nova fermentação, parte-se de um novo tubo de cultura selecionada, seguindo todos os passos de preparação do inóculo em etapas de laboratório e industrial até as dornas de fermentação, onde junta-se inóculo e substrato. Sistema de recuperação de leveduras – após a fermentação, passa-se todo o substato por separadoras centrífugas, onde se separa 10 a 20% do volume, líquido espesso com aparência de creme, o qual se denomina leite ou creme de leveduras. Envia-se este creme para tratamento com ácido sulfurico (até pH 2,2-2,3) e água, sob agitação, por 4 horas e daí, de novo, para as dornas de fermentação. Com este sistema reduz bastante a fase inicial das fermentações, devido a concentração de inóculo. Nos processos contínuos o crescimento ótimo das leveduras e a produção de etanol, se realizam em condições de limitações de açúcar (<1 g/L) e em ambiente microaeróbio (0,2 a 5 mg O2 /g matéria seca.h). Os sistemas descontínuos para a produção de etanol se iniciam aerobicamente para obter a máxima biomassa, já que se as condições anaeróbias começam demasiadamente cedo, a densidade celular não será suficientemente alta para obter uma boa velocidade de conversão. Pode ser necessária aeração forçada durante determinado tempo, para evitar a perda de rendimento. Freqüentemente utiliza-se a fermentação descontínua com recirculação de inóculo para a produção de etanol. Quando se utilizam melaços de boa qualidade o rendimento máximo é de 95% do valor teórico. TABELA 5 - Comparação de vários tipos de fermentação para a produção de etanol (Moirella, 1984) Processo de Concentração Fermentação de açúcar % Descontínuo 16,7 Contínuo 15,6 Contínuo com 16,7 recirculação

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Concentração de células g/L 21,3 19,7 100

Etanol g/L 85,6 79,1 85,6

Produtividade específica g/g células.h 0,42 0,72 0,42

Produtividade específica por unidade de volume g/L.h 11,8 14,1 42,5

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PRÁTICA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Tão logo se mistura o inóculo ao mosto corrigido, inicia-se a fermentação alcoólica dos açúcares fermentescíveis, nele contido. Esta fermentação passa por algumas fases distintas: A fase preliminar inicia-se no momento do contato do levedo com o mosto. Caracteriza-se por multiplicação celular intensa, pequena elevação de temperatura e pequeno desprendimento de dióxido de carbono. Nessa fase, garante-se a produção de grande quantidade de células de poderfermento máximo, o que se consegue em temperatura baixa e mosto convenientemente preparado. Sua duração é de 4 a 6 h e varia de acordo com o sistema de fermentação que se usa na destilaria. A fase tumultuosa caracteriza-se pelo desprendimento volumoso e intenso de dióxido de carbono, conseqüência da existência de um número suficiente de células para desdobrar os açúcares fermentescíveis do mosto. A temperatura eleva-se rapidamente, a densidade do mosto se reduz e elevam-se a percentagem de álcool e a acidez. O substrato agita-se como em ebulição. Os inconvenientes da elevação exagerada de temperatura corrigem-se com refrigeração. O desprendimento de dióxido de carbono é evidente. O aspecto da espuma difere para cada raça de levedura e para cada tipo de substrato. No caldo de cana não-clarificado, é espessa, viscosa e volumosa, a ponto de transbordar em dornas abertas. Ao contrário das fermentações de substratos de melaço, não reagem bem à adição de antiespumantes comumente usados na indústria de álcool. Nos mostos de melaço, com óleo vegetal misturado com ácido mineral, as espumas cedem com facilidade. A fase tumultuosa ou principal dura de 12 a 16 h. A fase complementar, que leva de 4 a 6 h para se completar, caracteriza-se pela diminuição da intensidade do desprendimento do dióxido de carbono, menos agitação no líquido e diminuição da temperatura. Nessa fase, a concentração de açúcares chega ao fim. Embora se note aumento da proporção dos álcoois superiores do começo ao fim da fermentação alcoólica, acredita-se que, na fase complementar, esse aumento seja mais notável, por motivos vários. A fermentação alcoólica é um processo rústico, ocorrendo mesmo em condições adversas, embora com desvantagens econômicas. Por esta rusticidade, que se deve principalmente as leveduras, não é feito a esterilização dos substratos, bastando que lhes dêem condições de concentração adequada, nutrientes e alguns desinfetantes, para que ocorra em condições satisfatórias. O controle das fermentações alcoólicas, para contornar possíveis infecções faz-se por tópicos: Tempo de fermentação – a duração média de um processo fermentativo de caldo de cana-de-açúcar ou melaço é de 24 horas e as de mosto amiláceos é de 36 horas. Odor de fermentação – o aroma das fermentações puras é penetrante, ativo e tende para o odor de frutas maduras. Cheiro ácido, a ranço, ácido sulfídrico e outros indicam irregularidades. Aspecto da espuma – embora varie com a natureza do mosto, temperatura e cepas de leveduras, apresenta-se com aspecto típico e característicos para as mesmas condições. Drosófilas – infalivelmente, quando há infecção acética, aparecem as “moscas-do-vinagre”, em quantidade proporcional à contaminação. Temperatura – Alterações importantes na curva de temperatura, do início ao final da fermentação, alertam para possíveis defeitos de fermentação. Prof. Raul Vicenzi

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Densidade do mosto – Durante a fermentação, a densidade do mosto decresce segundo uma curva harmônica com as fases da fermentação. De sua observação percebem-se as alterações no processo fermentativo. Açúcares do mosto – Consomem-se de acordo com a curva da densidade. Acidez do substrato em fermentação – não deve haver grandes alterações entre a acidez final e a inicial. Quando a final for mais que o dobro da inicial, é indicação de má fermentação. PRODUTOS SECUNDÁRIOS DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA Desde que se tem por objetivo a produção de etanol, pode-se considerar como secundário qualquer outro produto que se origine durante o processo fermentativo. Entre eles, destaca-se: dióxido de carbono, álcoois superiores, glicerina, ácido succínico e aldeído acético. Pode-se encontrar uma gama muito variada de produtos derivados de fermentações paralelas, normalmente por efeito de microorganismos contaminantes: ácido acético, ácido láctico, ácido butírico, dextranio, cetonas, gás sulfídrico, bases nitrogenadas, ácidos graxos, furfural, aldeídos, ésteres e outros. No processamento de alguns produtos como bebidas fermentadas (cerveja, vinho ,cidra, etc) e destiladas (aguardentes, rum, uísque e outras), alguns destes compostos secundários tem uma grande importância por conferir sabores e odores às bebidas. SEPARAÇÃO DAS LEVEDURAS As técnicas mais rápidas de fermentação estão baseadas no princípio de Melle-Boint, onde as células das leveduras ao final da fermentação são separadas e recicladas a um substrato novo. A recuperação das leveduras é igualmente essencial para a conversão rápida nos produtos de fermentação contínua. Na prática, a recuperação nunca é total; uma proporção de lerveduras morre por causas naturais e parte da levedura separada deve sempre ser eliminada para impedir o acúmulo de material em suspensão. A smior parte das destilarias utilizam a técnica de centrifugação para a recuperação das leveduras. RECUPERAÇÃO DO ETANOL Conseguir uma concentração alta de etanol ao final da fermentação é um requerimento essencial para manter baixos os custos. A medida que aumenta a concentração de etanol, se requer menos vapor para a destilação primária. Após a fermentação, os substratos açucarados denominam-se vinhos, com uma constituição variável, mas encerrando sempre substância gasosas, sólidas e líquidas. As primeiras representam-se principalmente pelo dióxido de carbono, que se dissolve em pequena proporção no vinho. Os sólidos se fazem presentes pelas células de leveduras, bactérias, sais minerais, açúcares infermentados e impurezas mecânicas em suspensão. Os líquidos mais importantes são a água e o etanol, em percentagens que variam de 88-93%, a 12-7%, respectivamente nos vinhos comuns. Os álcoois amílico, isoamílico, propílico, butílico, isobutilico, aldeídos, ácidos, furfural, glicerina, ésteres e ácidos orgânicos constituem outra parcela de líquidos de pequena importância em relação ao volume, mas de grande efeito quanto a qualidade dos destilados, sobretudo no caso das aguardentes. Prof. Raul Vicenzi

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Do vinho, separa-se o álcool, em grau de pureza e concentração variáveis, por destilação. Nessa operação, transforma-se a substância mais volátil de um sólido ou de um líquido em vapor, para, em seguida, condensá-lo e resfriá-lo de tal forma que se separe dos outros aos quais estava misturado e se recupere de forma líquida. Em relação à maneira de se conduzir a destilação, classifica-se em intermitente e contínua. A primeira realiza-se em alambiques e é poco usada para produção de etanol, restringindo-se a pequenas instalações para produção de aguardente ou de álcool vínico. Toda a produção de álcool industrial realiza-se em sistema contínuo. As destilarias de aguardente que, para serem econômicas, devem produzir quantidades superiores a 2 mil litros por hora, também operam com aparelhos contínuos. Estabelece-se uma diferença entre as colunas de destilação para aguardentes e as para produção de flegma industrial, ou seja, o destilado que, a seguir, se submeterá a nova destilação para purificação e concentração. Este se obtém em colunas de alto grau. As aguardentes são misturas hidroalcoólicas com uma percentagem de álcool em coluna ao redor de 50 ºGL com aroma e sabor (buquê) característicos que dependem das impurezas voláteis, que acompanham o destilado e que fazem parte da fração líquida dos vinhos, juntamente com a água e o etanol. Obtêm-se em colunas de baixo grau. Ao considerar a relação de energia para fabricação de etanol, o custo da destilação é o mais caro. As etapas de destilação convencional compreendem. a) Destilação primária – coluna inicial para concentrar a 85% ou superior, com eliminação de impurezas como aldeídos; b) Retificação – para conseguir concentrações de 96,5%. Ao mesmo tempo podem ser eliminadas misturas de álcoois superiores por decantação em água. c) Desidratação – Para produção de combustível com concentração de 99,4% ou mais, utilizando benzeno ou ciclohexano. DESTILACÃO DESCONTÍNUA Quando se realiza uma destilação intermitente, faz-se uma carga no aparelho, esgota-se o vinho por aquecimento, separando-se os vapores por condensação e refrigeração, descarrega-se o resíduo ou vinhaça, faz-se nova carga e assim por diante. Esse tipo de destilação realiza-se em alambiques simples de um só corpo ou em aparelhos de dois a três corpos, nos quais se consegue recuperar calor pela condensação dos vapores destilados, por meio de resfriamento com o líquido que se destilará em uma próxima carga. Quando se executa uma destilação descontinua, realiza-se uma destilação simples vaporizando-se primeiro as substâncias mais voláteis do que a água e o álcool. O primeiro destilado e uma mistura de água, álcool, bases voláteis, aldeídos, ácidos e chamase, na prática, destilado de cabeça. Depois de sua separação, os vapores do vinho são mais ricos em etanol, com menor quantidade de impurezas voláteis, e chamam-se destilado de coração. Finalmente, quando já quase se esgotou o etanol do vinho, passam vapores mais impuros, que se constituem de etanol, água e impurezas menos voláteis, como os álcoois superiores. É o destilado de cauda. O destilado que se recolhe como produto final da destilação constitui-se de uma mistura de Prof. Raul Vicenzi

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produtos de cabeça, de coração e de cauda, ou apenas de coração, separando-se produtos de cabeça e de cauda em proporções de 10 a 20% do total, conforme o destino que terá. DESTILACÃO CONTÍNUA Realiza-se em colunas de destilação fazendo-se a alimentação continua do aparelho com vinho, retirando-se continuamente a vinhaça na base e o destilado no topo. A separação dos componentes secundários, que se constituem de todas as substâncias que não é etanol, faz-se pelo topo do aparelho, pela base ou lateralmente em alturas determinadas segundo a natureza das impurezas. As colunas de destilação constituem-se de gomos cilíndricos superpostos, contendo seções transversais as quais se dá o nome de bandejas ou pratos. Os gomos e as bandejas superpostos, formam como que uma série de aparelhos de destilação simples, um destilando os seus vapores no outro, através de calotas, e recebendo liquido residual do imediatamente superior, através de tubos que se denominam sifões. O aquecimento das colunas faz-se na base, por meio de vapor d’água, por injeção, por serpentina ou por trocadores de calor, segundo a riqueza do liquido no interior ou a natureza da operação. O aquecimento das bandejas faz-se pelo calor dos vapores que ascendem na coluna. Os vapores emitidos por uma mistura de etanol-água são mais ricos do que o líquido gerador. Esses vapores condensando-se no prato imediatamente superior, enriquecem o liquido aí existente e aquecem-no à ebulição, gerando vapores mais ricos, e assim por diante. A temperatura na coluna decresce da base para o topo, ao mesmo tempo em que o teor alcoólico aumenta da base para o topo do aparelho. Os vapores que saem na parte superior da coluna dirigem-se para o condensador, onde passam para a fase líquida. Desse líquido, retorna-se uma parte á cabeça da coluna e envia-se o restante a um refrigerador e, daí, para fora do circuito. A retrogradação, ou refluxo auxilia a manutenção de vapores ricos na cabeça da coluna. Se se faz a alimentação da coluna de destilação pelo topo, os vapores que ali se emitem não são muito concentrados e a coluna chama-se de baixo grau. Se a alimentação faz-se pela altura média do aparelho, divide-se a coluna em dois troncos: um de esgotamento, abaixo da alimentação e outro de concentração, acima da alimentação. A coluna chama-se de alto grau, os vapores são mais ricos em etanol, e geralmente mais puros. Numa coluna de destilação, a graduação alcoólica maior ou menor obtém-se em função do número de pratos superpostos. Um número maior eleva mais a graduação alcoólica dos vapores. Numa coluna de baixo grau, emitem-se vapores de graduação alcoólica relativamente baixa e, normalmente, recolhem-se depois de condensados, sob a forma de mistura com as impurezas voláteis de cabeça. As impurezas de cauda eliminam-se parcialmente na vinhaça, pela base. Nas colunas de alto grau, normalmente se retiram os produtos de cabeça do condensador deflegmador e o destilado, ou flegma, parcialmente purificado, retira-se lateralmente, do tronco de concentração. As impurezas de cauda eliminam-se parcialmente nas vinhaças. Prof. Raul Vicenzi

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RETIFICAÇÃO Da destilação dos vinhos, obtém-se o flegma, que é um líquido alcoólico mais rico do que o líquido que o originou, mas em estado impuro. A retificação é a operação pela qual separa-se o álcool das impurezas que o acompanham no flegma. Freqüentemente confunde-se retificação com concentração porque, durante a retificação, normalmente trabalha-se com flegma de concentração relativamente baixa que, durante a operação, aumenta a graduação alcoólica até o máximo, ao mesmo tempo em que se purifica. As impurezas voláteis constituem-se daquelas substâncias que, embora em pequena proporção percentual, causam grande efeito, comunicando características tais que o álcool não se presta à fabricação de licores, perfumes e outros usos industriais. As substâncias impurificantes têm ponto de ebulição mais alto ou mais baixo que o do etanol e, segundo essa característica, separam-se como produtos de cabeça ou de cauda. O ponto de ebulição não é, entretanto, condição suficiente para a separação por destilação fracionada porque se formam, nos aparelhos de destilação, misturas azeotrópicas com a água e o etanol e entre as próprias impurezas, de forma que produtos de ponto de ebulição mais alto podem vir a se constituir em produtos de cabeça. Segundo alguns autores, a separação das impurezas depende da solubilidade no álcool concentrado e quente, produzindo-se maior quantidade de impurezas no destilado quando a impureza é pouco solúvel. A solubilidade será maior quanto menor for a concentração de etanol. Considera-se uma impureza de cabeça ou de cauda, relacionando o coeficiente de solubilidade da substância à percentagem de álcool puro no líquido ou nos vapores. Assim sendo, quando a impureza existir em proporção superior a um em relação ao álcool absoluto (100% de etanol), na mistura, será de cabeça; se inferior à unidade, será de cauda e, quando for ora superior e ora inferior, será ora de cabeça e ora de cauda. Não se consegue fazer purificação completa do álcool pela retificação. DESIDRATAÇÃO DO ETANOL Não se pode, pela destilação, obter álcool etílico com concentração superior a 97,2% em volume porque, nessa concentração, a mistura de etanol e água é azeotrópica. Os processos industriais para desidratação classificam-se em químicos e físicos. Os primeiros baseiam-se no emprego de substâncias químicas como óxido de cálcio, acetato de sódio, carbonato de potássio e outros, que são capazes de absorver a água do etanol retificado na fase líquido ou vapor. Os processos físicos baseiam-se na variação da pressão, destilação de mistura hiperazeotrópica, obtida por processos químicos, absorção de vapores usando corpos sólidos, destilação em presença de um terceiro corpo (benzeno, cloreto de butila, tricloroetileno) e uso de absorventes regeneráveis (glicerina, solução de carbonato de potássio em glicerina), que fracionam a mistura azeotrópica por absorção de álcool ou de água.

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Separação dos produtos de fermentação

SEPARAÇÃO DOS PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO

INTRODUÇÃO À medida que o processo fermentativo se desenvolve, o produto de assimilação ou de desassimilação vai se formando ou se acumulando. Seu acúmulo raramente se dá na fase lag, começando, normalmente, na fase logarítmica, podendo, entretanto, coincidir com a fase estacionária ou mesmo de declínio. Em qualquer dos casos, teoricamente, há uma curva correspondente ao aparecimento do produto, seu acréscimo até um máximo e posterior declínio. O industrial não pode se ater exclusivamente ao rendimento máximo. Deverá estar atento para o máximo de produção econômica, que, nem sempre, é o máximo de produção técnica. Atingir esse máximo, ou ultrapassálo, pode acarretar dificuldades na recuperação do produto, além de causar uma alta do custo industrial, com o aumento do tempo da fermentação. Esse aumento concorre para o uso mais prolongado dos recipientes de fermentação com maiores gastos de energia, de aeração, de nutrientes, de antiespumante, de mão-de-obra e outros, podendo ser mais elevados que a receita do produto, quando recuperado em um estágio menos avançado, embora com menos rendimento industrial. Quando as células param de se reproduzir ou quando as células não têm mais material a metabolizar no substrato, pode haver a autólise, ou iniciar-se a respiração, resultando em mudança de atividades do meio. Num meio de fermentação alcoólica, as células autolisadas fornecem aminoácidos que se transformam em álcoois superiores. Essa transformação pode ser desejável em indústrias de bebidas destiladas, mas é prejudicial para a indústria de álcool industrial. Na recuperação da penicilina, os agentes fermentadores devem ser rapidamente separados do substrato por filtração e o material retido nos filtros deve ser lavado também rapidamente. Há um ponto crítico, para essa separação, que, ultrapassado, dificulta a separação devido ao aparecimento de uma camada viscosa, que dificulta a filtração e a lavagem. As perdas se dão por dificuldade da operação e por decomposição do produto. Nas fermentações de vinagre, o contacto muito prolongado com o meio fermentado pode levar o agente de fermentação a oxidar totalmente o ácido acético a CO2 e H2 O, diminuindo o rendimento. Nos processos fermentativos em que a remoção da espuma é necessária, esse único cuidado poderá colaborar para o aumento da produção. Há antiespumantes que não são metabolizados, como os silicones, tensoativos muito eficientes, usados em pequenas quantidades. Outros, são dispersos em óleos animais ou vegetais e podem ser metabolizados, interferindo na produção. O momento e o espaçamento entre as aplicações são importantes. Geralmente, deve-se evitar a adição nos momentos finais da fermentação, para que o microrganismo seja capaz de remover a causa de interferência na produção, que poderá também influir no processo de recuperação. Atingindo-se o máximo de rendimento comercial, com a observação dos cuidados específicos para cada processo fermentativo, inicia-se a separação do produto do substrato fermentado, para apresentá-lo da forma mais pura possível, ao tipo particular de consumo a que se destina. Cada processo fermentativo tem uma forma de recuperação. Para facilitar, agrupamos em processos desenvolvidos por leveduras, fungos, bactérias e actinomicetes. Prof. Raul Vicenzi

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UNIDADES OPERACIONAIS Para a recuperação dos produtos de fermentação, estão envolvidas operações que se enquadram em alguns casos gerais como filtração, centrifugação, adsorção, extração por solventes, precipitação e sedimentação, cristalização, destilação, evaporação e secagem. FILTRAÇÃO E a operação pela qual se separam as partículas suspensas em um fluido que se desloca em um meio poroso, como conseqüência de uma diferença de pressão. O meio poroso, que é o meio filtrante, retém as partículas, que vão se acumulando e formando camadas porosas superpostas, que constituem o que se denomina de torta. Com a continua deposição de material sólido, embora os extratos da torta sejam porosos, estabelece-se um decréscimo progressivo do fluxo, chegando a interromper-se. Para compensar o decréscimo do fluxo, lança-se mão de artifícios como o aumento da diferença de pressão e a remoção da torta. Há uma grande variedade de filtros, que se classificam de acordo com a pressão que provoca a filtração. Quando se trata de suspensões de células, de micélio principalmente, as tortas são compressíveis. Nesse caso, há conveniência em se utilizarem os filtros a vácuo, sobretudo os rotativos, cuja área de filtração é ampla e oferece as vantagens das lavagens concomitantes e a remoção continua da torta esgotada. Há necessidade de se adaptar cada meio ao processo de filtração, por adição de coagulantes, modificação do pH, adição de auxiliares de filtração e aquecimento da massa miceliar, dependendo do microrganismo usado e das condições da fermentação. No caso de penicilina, o micélio é compressível, mas nas filtrações de estreptomicina, a massa celular é mais compressível ainda, sendo necessário adicionar um auxiliar de filtração e, ainda, recobrir o tambor com uma torta desse auxiliar de filtração, antes de receber o micélio, para se evitar a colmatação total do leito filtrante. Renova-se a torta do auxiliar de filtração a cada revolução do tambor. Nos filtros rotativos a vácuo, há geralmente uma divisão de setores no tambor, com diferentes intensidades de vácuo para propiciar a retenção do substrato a filtrar sobre o meio filtrante, para lavar a torta, para esgotá-la depois da lavagem e para permitir que ela seja eliminada da superfície filtrante. Os produtos cristalinos que se obtêm por tratamento dos meios de fermentação normalmente facilitam a filtração e não são compressíveis, o que permite que se usem altas pressões. Nesse caso, usam-se filtros centrífugos, com possibilidade de se usarem diferenças de pressão equivalentes a centenas de vezes a força da gravidade. A lavagem das tortas é realizada com mínimas porções de água, diluindo-se pouco os licores-mãe, o que é uma vantagem no caso de recuperação secundária. SEDIMENTAÇÃO Consiste em separar um fluido claro, límpido, brilhante, de uma suspensão. Pode ser continua ou descontínua, mas, em geral, quando se trata de líquidos oriundos de fermentação, a sedimentação é descontinua. Ela é importante fator no preparo dos vinhos e cervejas. Pela própria natureza desses produtos, a decantação dos sólidos é feita de forma descontínua e muito lentamente. O processo leva meses para o caso da purificação dos vinhos. Como em qualquer outra sedimentação descontinua, mantém-se esses substratos fermentados em ambientes onde não haja alterações importantes de Prof. Raul Vicenzi

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temperatura que possam criar movimentos do fluido por meio de convecção, o que irá causar dificuldade de deposição das partículas em suspensão. Nos mostos fermentados de uvas, a deposição se dá rapidamente nos primeiros dias, após o término da fermentação, mas o líquido sobrenadante ainda não é claro. Elimina-se o sedimento e abandona-se o material ao repouso, para que se forme um novo sedimento de partículas menores. Todas as vezes que se forma um sedimento compacto, este é eliminado, até que não haja mais o que depositar. Se não há mais depósitos e o líquido ainda está turvo, faz-se um tratamento pelo calor ou pelo frio, para provocar a aglutinação das partículas que irão se sedimentar, ou lança-se mão de auxiliares de decantação, que envolvem as partículas, dando-lhes as condições necessárias para vencerem a viscosidade do meio, aumentarem a velocidade de sedimentação e se depositarem no fundo. CENTRIFUGAÇÃO E uma operação na qual se aplica a força centrífuga para separar sólidos e fluidos de diferentes densidades. Usa-se sempre que há necessidade de aplicar forças superiores á da gravidade, que atua nas sedimentações ou nas filtrações. A força centrífuga é conseguida em equipamentos capazes de fazer o material descrever uma trajetória curva. Os primeiros equipamentos centrífugos foram os filtros centrífugos, que não são mais do que cestas perfuradas para separar sólidos de líquidos. Faz-se a centrifugação de forma contínua ou descontínua. Esta se realiza em cestas, perfuradas ou não, que giram comumente sobre um eixo vertical. Há centrifugas descontinuas, automáticas, verticais. As centrifugas que separam as células de levedura para purificação ou para produção de proteína alimentar são do tipo contínuo com rotor vertical de discos. A centrífuga consta de uma base, sobre a qual se assenta o conjunto de discos que recebe movimento de um motor elétrico através de transmissão por meio de correias trapezoidais. Os discos, de forma cônica e de diâmetro aproximado de 300 mm, empilham-se sobre um suporte vertical que se assenta numa base provida de perfurações com boquilhas tangenciais e que gira sobre um eixo vertical. A montagem fecha-se com uma tampa rosqueada, formando um conjunto rígido. A alimentação é feita pela parte superior do suporte, dirigindo-se para a base por uma tubulação central. Durante o percurso, recebe a aceleração centrifuga. O material mais denso, que se constitui de células e de substrato, passa para o exterior, pelas boquilhas, e o líquido menos denso flui para cima, no espaço entre os discos, e sai pela parte central. O líquido flui por cima dos discos e o material sólido, no caso as células, separam-se na parte inferior dos discos e saem pelas perfurações da base. Em última análise, sobre cada disco, onde flui uma camada delgada de substrato, dá-se uma sedimentação de pequena espessura separando o liquido denso, rico em células, na parte inferior, do líquido isento de células, na parte superior. EXTRAÇÃO POR SOLVENTES É a transferência de uma substância dissolvida de um solvente para outro no qual sua solubilidade é maior, observando-se que a miscibilidade entre os dois solventes seja mínima ou Prof. Raul Vicenzi

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inexistente. A operação básica é a extração líquido-líquido, a qual só se efetua se houver um contacto muito estreito entre a solução e o solvente e se houver uma perfeita separação das fases. Aplica-se a extração por solventes para separar sólidos solúveis que estejam em mistura com substâncias insolúveis, para separar componentes pouco voláteis de uma mistura, para separar substâncias de mesma volatilidade de uma mesma solução ou quando estão mutuamente dissolvidos, para separar substâncias instáveis em uma destilação fracionada, para separar substâncias pouco voláteis existentes em uma solução em concentração mínima. A extração por solventes é feita continuamente ou de forma intermitente. Neste último caso, adiciona-se o solvente em um tanque contendo a solução a extrair, agita-se e deixa-se em repouso para decantar. A extração continua é feita associando-se um recipiente de decantação ao misturador. A operação continua em multiestágio é mais eficiente, sendo feita em contracorrente ou com refluxos do material extraído. Enquanto que, normalmente, a extração líquido-liquido é feita em colunas verticais, com circulação descendente da fase mais densa e fluxo ascendente da fase menos densa, a separação do solvente na recuperação de penicilina é feita em separadoras centrífugas especialmente projetadas para líquidos de diferentes densidades. Faz-se a separação da mesma forma, porém os líquidos são eliminados pela parte superior da centrifuga: o mais denso na periferia e o de menor densidade na parte central. ADSORÇÃO A adsorção é uma operação básica que se realiza pelo contacto de um sólido com um fluido, resultando na alteração da composição do fluido pela deposição de alguns componentes na superfície do sólido. A adsorção é um fenômeno complexo que se manifesta de diferentes maneiras. A adsorção física caracteriza-se pela condensação de gases sobre os sólidos em temperaturas acima do ponto de orvalho. A adsorção química é estabelecida por ligação química definida entre os átomos ou moléculas da substância depositada e as moléculas da superfície do sólido. A adsorção por troca iônica processa-se pelo intercâmbio de íons entre a superfície adsorvente e o material depositado. Para que se possa empregar a adsorção, é necessário que haja contato íntimo entre as fases fluida e sólida, que a parte não adsorvida do fluido se separe facilmente do adsorvente e que se possa regenerar o adsorvente por eliminação do adsorvido. A adsorção é realizada pela passagem do fluido através de um leito estacionário de adsorvente. A regeneração do adsorvente faz-se de acordo com a natureza do material adsorvido, por diferença de pressão, vapor, soluções químicas e aumento de temperatura. Geralmente, submetem-se as soluções extraídas de penicilina a um tratamento com carvão para descorar, usando-se o método de contacto disperso em estágio simples, acondicionando o carvão em um tanque, agitando e filtrando-se em seguida. CRISTALIZAÇÃO Pela cristalização, obtém-se a penicilina em estado de pureza, estável e mais potente que por processos de evaporação. A cristalização pode substituir a liofilização. A cristalização é uma operação básica importante na obtenção de produtos puros, pois os cristais separados de uma solução Prof. Raul Vicenzi

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têm uma composição determinada, geralmente de elevada pureza. As impurezas que acompanham os cristais são levadas da superfície ou separadas por outros métodos, como a redissolução e recristalização. Para conseguir-se a cristalização de uma substância, concentra-se a solução que a contém até um ponto de supersaturação, a partir do qual aparecem os primeiros núcleos, que depois crescem, esgotando o meio. Industrialmente, procede-se á recuperação da penicilina por cristalização concentrando-se a solução até a supersaturação e adicionando-se uma semente, ou seja, juntando-se uma quantidade de penicilina á solução. Os cristais que se adicionam funcionam como núcleos de cristalização que irão crescer pela migração do antibiótico do meio para a superficie dos cristais adicionados. A cristalização de sulfato de di-hidroestreptomicina consegue-se sob agitação e com adição de metanol à solução aquosa, durante período prolongado, evitando-se as superconcentrações localizadas. DESTILAÇÃO A destilação é a separação de componentes de uma mistura pela vaporização parcial da mistura e pela recuperação dos vapores por meio de condensação. Uma destilação fracionada é feita por uma série de destilações e condensações na mesma coluna, ou em colunas separadas, obtendo-se condensados enriquecidos com o material que se desejou separar. É uma operação de extração vapor-líquido. Emprega-se a destilação e a destilação fracionada na recuperação do etanol e na recuperação de solventes, como é o caso de acetona-butanol-etanol, etanol-acetona, acetona-isopropanol e etanolbutanol. Em todos os casos, trata-se de extrair, de um líquido de composição complexa, seus componentes mais voláteis, em grau de pureza de acordo com o emprego. A destilação, como operação básica, pode-se classificar em destilação simples e destilação com refluxo ou condensação parcial. Há quem prefira chamá-los de destilação simples ou periódica e destilação metódica ou sistemática. Em relação à maneira de conduzir a operação, classifica-se em destilação intermitente e em destilação continua. Em qualquer dos casos, a destilação pode ser conduzida á pressão atmosférica ou a pressão reduzida. A destilação simples é a operação mediante a qual se submete o substrato fermentado a ação do calor, obtendo-se vapores que são diretamente recolhidos, condensados e retirados para fora do aparelho. A destilação continua até se exaurirem completamente do líquido os componentes mais voláteis. No caso do etanol, quanto mais destilado se recolher, menor será a concentração do componente mais volátil, devido ao arraste de água junto com os vapores. Na destilação com refluxo, há uma condensação parcial dos vapores de componentes mais voláteis nas paredes em contacto com a atmosfera e o retorno ao substrato em aquecimento. Esse retorno toma o nome de refluxo, retrogradação ou deflegmação. Os aparelhos de destilação industriais possuem dispositivos para intensificar essa deflegmação. Nos deflegmadores, onde a condensação parcial é efetuada em caixas tubulares, paredes de água e tubulações, controla-se voluntariamente a retrogradação. A destilação descontínua é executada por meio de cargas em aparelhos providos de uma caldeira e um dispositivo de concentração provido bandejas perfuradas ou de borbulhamento. Os Prof. Raul Vicenzi

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vapores concentrados encaminham-se para um condensador de refluxo, de onde uma parte retorna à caldeira e outra segue para um refrigerador e dai para a proveta. A destilação continua difere da precedente pela contínua alimentação do aparelho de fracionamento com o liquido alcoólico fermentado, com ininterrupta separação do produto puro e eliminação constante de substâncias impurificantes como subprodutos, e a eliminação contínua de um resíduo. Para a obtenção de aguardentes com concentração alcoólica ao redor de 50% de etanol em volume, a destilação processa-se em apenas uma coluna sem tronco de concentração, sem deflegmação e sem eliminação de impurezas, as quais comunicam ao destilado seu aroma e paladar característicos. Somente em casos especiais se faz a retificação de aguardentes. Para a obtenção de etanol industrial com concentração ao redor de 96-97ºC de álcool em volume, isento de impurezas, fraciona-se o destilado em álcool de primeira e álcool de segunda, separando-se os álcoois superiores como subproduto e os outros componentes secundários (aldeídos, bases voláteis, ésteres e ácidos). A purificação do etanol, denominada retificação, industrialmente é processada de forma continua, por destilações sucessivas em várias colunas, denominadas colunas depuradora, destiladora, retificadora e de repasse final. Na primeira, o substrato fermentado sofre aquecimento em uma coluna com um número de bandejas suficiente para produzir, no topo, mistura de vapores de baixo ponto de ebulição, que é eliminada após a condensação e o resfriamento. Na segunda, esgotase o substrato, retirando-se o etanol na cabeça da coluna sob a forma de um destilado com uma concentração ao redor de 50% de álcool em volume. Na base da coluna, escoa-se o substrato isento de álcool. Na terceira coluna, concentra-se o álcool e separam-se os álcoois superiores, de ponto de ebulição mais elevado que o etanol, na base da coluna. No topo, obtém-se uma mistura de vapores de ponto de ebulição menor, ao mesmo tempo que se retira o etanol de alta concentração. Envia-se este á quarta coluna, onde se separam mais impurezas, de ponto de ebulição inferior ao do etanol. Em algumas instalações, substitui-se essa quarta coluna por um tronco, no topo da coluna retificadora, com apenas alguns pratos. Ao final dessas destilações, obtém-se uma mistura binária de etanol e água que, no máximo, pode conter 97,2% de etanol em volume. A mistura binária nessa proporção é azeotrópica. A concentração do etanol a níveis superiores pode ser realizada, na indústria, por meio de técnicas que absorvem água ou deslocam o ponto azeotrópico. Quando dois líquidos são mutuamente miscíveis, os vapores emitidos por um dos dois sofre a ação dissolvente do outro, e há uma alteração nas respectivas tensóes parciais. Na destilação, produzem-se vapores mais ricos do que o líquido gerador. No caso de uma mistura ideal de dois líquidos, os vapores emitidos são mais ricos do que o líquido gerador, no componente mais volátil. Para uma dada pressão, verifica-se que, variando a composição do líquido, varia o ponto de ebulição, aumentando gradualmente da temperatura do líquido mais volátil para a dos menos volátil, sem passar por máximos ou por mínimos. Se, nas mesmas condições, o ponto de ebulição do líquido passa por um máximo ou por um mínimo, os vapores que se formam nessa temperatura são saturados e de composição constante. E o Prof. Raul Vicenzi

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fenômeno de azeotropismo. Em concentrações superiores á mistura azeotrópica, obtêm-se, da mistura binária etanol-água, vapores mais pobres do que o líquido gerador. A desidratação é feita pela incorporação, à mistura azeotrópica, de substâncias desidratadoras, como o glicerol, ou pela adição de substâncias arrastadoras, como o benzol ou o tricloroetileno. Elas formam misturas azeotrópicas binárias, com a água, ou ternárias, com etanol e água, de ponto de ebulição inferior ao da mistura azeotrópica etanol-água, podendo ser separadas nas colunas de destilação. Obtém-se o etanol com concentrações acima de 99,5% em volume e recuperam-se o desidratante ou os arrastadores. Os solventes são recuperados também por destilação dos substratos fermentados, comumente obtidos na indústria com 2,2% de acetona em peso. O equipamento para recuperar acetona, butanol e etanol consta de um conjunto de colunas de destilação com condensadores, deflegmadores e demais acessórios. Nele se obtém, primeiro, um destilado impuro, que é encaminhado para uma coluna, para separação da acetona, depois para outra coluna, para separação de etanol e, finalmente, para uma quarta coluna, onde se recupera o butanol. Na seqüência de operações para obtenção da acetona e do butanol, recupera-se o etanol, metiletilcetona e isopropanol como subprodutos em misturas azeotrópicas e, também, álcoois superiores e aldeídos, que se separam, como nas colunas de retificação de etanol. EVAPORAÇÃO E uma operação que tem por fim concentrar uma solução eliminando parte do liquido por ação do calor. Comumente o aquecimento é feito indiretamente, por meio de vapor expandido em uma caixa tubular. A concentração dos líquidos fermentados para recuperação dos produtos de fermentação é feita principalmente em evaporadores de tubos compridos verticais, de 3,5 a 6 m, de pequeno diâmetro, fechados em uma caixa e ligados a uma câmara de vapores. Esta, por sua vez, liga-se a um condensador barométrico e a um gerador de vácuo, que pode ser ejetor, condensador multijato ou bomba de vácuo. O aquecimento é feito por vapor de água que se condensa por fora dos tubos. O líquido movimenta-se no interior dos tubos por meio de convecção natural, circulando de baixo para cima e chocando-se com um anteparo que facilita a separação das fases liquida e vapor, além de quebrar as espumas. SECAGEM Normalmente se chama de secagem a evaporação de água contida num material, sendo o vapor de água arrastado por uma corrente de ar ou gases inertes. Usa-se amplamente a secagem na recuperação dos produtos de fermentação, ligando-se principalmente ás operações de acabamento. Durante a secagem, há uma transferência simultânea de calor e de matéria. Ao contrário da evaporação, a quantidade de água eliminada é pequena em relação ao teor de sólidos do material. Os aparelhos empregados na indústria são agrupados nos seguintes tipos: secadores de armário, rotativos, por pulverização ou atomização, a vácuo e de tambor. A liofilização é um processo especial de secagem. Prof. Raul Vicenzi

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SEPARAÇÃO DOS PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAÇÃO COM LEVEDURAS 1. Levedura de panificação As leveduras de panificação são o produto da fermentação de substratos açucarados por Saccharomyces cerevisae, em condições especiais de concentração, nutrientes e aeração, visando à proliferação de células. Estas são, posteriormente, separadas do substrato por centrifugação. Dessa centrifugação, obtêm-se células acompanhadas por uma certa quantidade de substrato, que se elimina por meio de lavagens com água e centrifugações. Geralmente as separações e lavagens se fazem em três centrifugações sucessivas, procedendo-se, além da separação e purificação das células, à concentração do material obtido. Este, cuja denominação industrial é leite ou creme de leveduras, refrigera-se, a seguir a 8-9 ºC e conduz-se para filtros-prensa ou rotativos a vácuo, de onde se obtém uma torta de leveduras, muito clara, com aproximadamente 31% de sólidos. A umidade extracelular é da ordem de 15 %. Essa torta é misturada depois com água, em misturadores semelhantes ás amassadeiras de panificadoras, reduzindo-se a concentração para 25% de sólidos. Pode-se adicionar, ainda, plasticizantes, para facilitar a formação dos blocos prensados. Usa-se lecitina, óleos vegetais, ésteres de ácidos graxos, que melhoram a aparência. Daí encaminha-se a massa de células para máquinas empacotadoras, onde se prensam e se embalam os blocos compactos de células de levedura com peso pré-fixado, sem contacto manual. A levedura prensada sob refrigeração conserva-se estável por um período prolongado, mas é inviável para regiões onde há falta de recursos para armazenamento à baixa temperatura. Nesses locais, emprega-se a levedura ativa seca que se obtém a partir das tortas dos filtros, dispersando-a e secando-a sob a forma de grânulos. A secagem é feita sob condições especiais, de forma a não prejudicar a integridade física e a atividade fisiológica e enzimática. O teor de umidade ótimo é de 8% sendo que a 5-6 %, reduz-se à atividade da levedura e a 10% não se conserva bem. 2. Levedura alimentar E a levedura produzida para fins de alimentação. Rica em proteína e em vitaminas do complexo B, é preparada, principalmente para alimentação animal, fermentando-se substratos de resíduos por leveduras do gênero Candida ou retirando-se dos meios de fermentação alcoólica uma parte de leveduras do gênero Saccharomyces. As leveduras alimentares são leveduras secas, inativas, mortas, sendo irrisória a utilização de leveduras frescas para esse fim. Sua recuperação de um ou de outro substrato é semelhante ao que se descreveu para a levedura de panificação, sem os cuidados de assepsia normalmente utilizados para a produção de levedura de panificação, sobretudo quando se trata da recuperação de parte das leveduras já usadas na fermentação alcoólica. Nas indústrias de álcool, obtém-se o leite de levedura geralmente por uma ou duas separações, e a seguir envia-se para um secador de tambores rotativos. Aí, á pressão normal e à temperatura de 100 ºC, ou mais elevadas, seca-se, sob a forma de uma película que, depois de moída, se procede à embalagem em sacos de papel. Prof. Raul Vicenzi

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3. Etanol E produzido industrialmente pela fermentação de sucos açucarados por leveduras das espécies Saccharomyces cerevisiae, S. ellipsoideus e S. uvarum. Pode-se considerar a recuperação do etanol sob diversos aspectos: utilização direta dos substratos fermentados, recuperação do etanol parcialmente concentrado e parcialmente purificado, concentrado e purificado, e desidratado. Quando se trata da utilização do etanol conjuntamente com o substrato que sofreu a fermentação alcoólica, portanto sem açúcares, temos a distinguir os substratos originários de frutas e os originários de grãos. No primeiro caso, o principal representante é o vinho de uva, resultante de fermentação de uvas ou do suco de uvas, por leveduras alcoólicas. No segundo, o representante mais importante é a cerveja, que é o resultado da fermentação de grãos, sobretudo de cevada. Em ambos os casos, o substrato ou mosto fermentado sofre uma série de tratamentos com vistas a sua purificação e obtenção de um líquido cristalino, transparente e brilhante. Tratamentos pelo frio, pelo calor e adição de agentes de clarificação provocam a deposição das substâncias em suspensão. A recuperação do etanol, no caso, é feita por sedimentação do substrato fermentado, que se separa em líquido decantado claro contendo de 3 a 6% de álcool em volume nas cervejas e de 10 a 18% nos vinhos. As bebidas destiladas são os álcoois parcialmente concentrados e parcialmente purificados. São obtidos submetendo-se os substratos fermentados a uma destilação pela qual se separa o etanol juntamente com a água e alguns produtos voláteis como álcoois superiores, aldeídos, ésteres e ácidos. As bebidas alcoólicas têm uma concentração de etanol que oscila entre 38 e 54% em volume, e um teor de componentes voláteis secundários que varia de acordo com a técnica de destilação. A apresentação comercial das bebidas varia de acordo com os processos de acabamento do produto, mas a recuperação do etanol depende só de uma operação, a destilação, que se faz em alambiques ou em colunas contínuas de bandejas superpostas e de borbulhamento. Os álcoois industriais são o resultado de destilação fracionada, procedendo-se primeiro à obtenção de um álcool parcialmente concentrado e parcialmente purificado, por destilação do substrato fermentado. A seguir, procede-se á redestilação, para obter-se um líquido alcoólico com, no mínimo, 96% de etanol em volume e um teor mínimo de impurezas voláteis que são eliminadas no decorrer da operação denominada retificação. O álcool assim obtido, denominado álcool retificado, com um teor mínimo de 96% em volume, tem um emprego amplo, sendo usado em fabricação de bebidas, explosivos, perfumes, borracha sintética, medicamentos, como solvente, como combustível, como anti-séptico e em muitos outros campos. Essas operações se realizam em colunas continuas de bandejas superpostas e de borbulhamento. Para ser usado como combustível, o etanol deve ter concentração mais elevada e essa concentração só se obtém por um tratamento especial de desidratação. A destilação fracionada não é mais suficiente porque a 97,2% de álcool em volume forma-se uma mistura azeotrópica binária álcool-água. A desidratação faz-se necessária e realiza-se industrialmente por emprego de substância desidratante ou por deslocamento do ponto azeotrópico. No Brasil, as técnicas mais usadas são os usos do glicerol como substância desidratante, e da mistura de benzol para deslocar o ponto Prof. Raul Vicenzi

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azeotrópico. Em um ou em outro caso, recupera-se o auxiliar de desidratação, que volta a ser usado, com um mínimo de perda. 4. Álcoois poli-hidricos Entre eles o glicerol é o mais importante e há várias técnicas para sua recuperação. Em resumo, centrifugam-se os resíduos ou os substratos fermentados, para se eliminarem os microrganismos, procede-se a uma concentração até um máximo de 40 % de água, adiciona-se hidróxido de metal alcalino terroso em ligeiro excesso e, em seguida, adiciona-se solução alcoólica miscível com água, causando-se a precipitação da maior parte das impurezas. Decanta-se e destilase, eliminando-se o solvente e recolhendo-se o glicerol bruto. Novas lavagens, concentração, mistura com C6 H5 NH2 , evaporação a 100-145 ºC, separação por decantação, lavagem e nova concentração, propiciam a obtenção do glicerol com alta percentagem de pureza. PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAÇÃO COM FUNGOS 1. Riboflavina Leveduras e bactérias são capazes de sintetizar a riboflavina ou vitamina B2, mas, industrialmente, os fungos são mais usados, sobretudo as espécies Ashbya gossypii e Eremothecium ashbyii. Usa-se a riboflavina diretamente com o substrato, sob a forma de concentrado vitamínico, ou isolada do meio fermentado. No primeiro caso, envia-se o substrato fermentado, com 0,5 a 0,6 g de riboflavina por litro, para um concentrador a vácuo, onde se faz a eliminação de água até consistência de xarope e, dai, leva-se para um secador de tambor, onde se obtêm um concentrado com 2,5% de vitamina B2. As técnicas de isolamento da riboflavina do meio fermentado envolvem a extração por meio de solventes, por precipitação e sedimentação, por adsorção e pela redução da solubilidade por agentes químicos ou por meio de bactérias. Em linhas gerais, filtra-se a solução contendo riboflavina, ajusta-se o pH a 5,0-5,5 com ácido sulfúrico, adiciona-se um agente redutor à temperatura de 25-30 ºC. Os agentes redutores mais comuns são tiossulfato de sódio, cloreto de estanho, cloreto de cromo, sulfato de cromo e cloreto de titânio. Com essa técnica, precipita-se o precursor da riboflavina, decanta-se e filtra-se com auxiliar de filtração. A extração é feita sobre o filtrado, com álcool isopropilico a 75%. 2. Ácido glucônico Industrialmente, usam-se culturas de Aspergilius niger. Sua recuperação faz-se sob a forma de gluconato de cálcio, procedendo-se á separação do micélio por filtração e, a seguir, a neutralização do filtrado com leite de cal. Faz-se a separação dos cristais por centrifugação, enviando-se o licor-mãe para um concentrador a vácuo onde a temperatura 3. Ácido cítrico É produzido por culturas selecionadas de Aspergilius niger. Sua recuperação é feita separando-se o micélio por filtração e lavagem. A solução que se obtém, com 2,5 a 3,5% de ácido cítrico, impurificada com açúcares, substâncias pécticas, colóides e pigmento amarelo, purifica-se Prof. Raul Vicenzi

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procedendo-se á precipitação de sal cálcico do ácido cítrico, lavagem e posterior regeneração do ácido por tratamento com ácido sulfúrico. Submete-se a solução obtida a uma concentração a vácuo, para elevá-la de 15 a 60% de sólidos, e passa-se á purificação, para a eliminação de impurezas minerais, orgânicas e de pigmentos. A purificação é feita pelo tratamento com carvão ativo, sulfato de bário e ferrocianeto de potássio, mantendo-se uma acidez no meio ao nível de 0,200 em ácido sulfúrico para conservar as impurezas em suspensão.. Faz-se depois uma filtração para se obter um xarope incolor com 58% de ácido cítrico, que é recuperado por cristalização e centrifugação. Os cristais com 99,5% de pureza são enviados a um secador a vácuo e o licor retorna ao processo. 4. Enzimas Dos vários fungos ensaiados para preparação industrial de enzimas, o Aspergillus niger é o mais utilizado. A enzima produzida em maior escala é a á -amilase, cuja separação do substrato é feita separando-se o micélio, por filtração, concentrando-se o filtrado quatro vezes em evaporador a vácuo, ajustando-se o pH a 7,5-8,5, e precipitando-se a enzima com 1,6 a 2,3 volumes de álcool isopropilico por volume de filtrado concentrado. Separa-se por centrifugação ou filtração e seca-se o precipitado obtido. 4. Penicilina Os agentes de fermentação são, geralmente, Peniclilium notatum e P. Chrysogenum. Separase o micélio por filtração e após faz-se uma série de extrações por solventes. Há também um processo de recuperação de penicilina por adsorção em carvão, porém, o processo por solventes é mais usado. Para reduzir as perdas durante a filtração e lavagem, ajusta-se o pH ou adiciona-se um auxiliar de filtração, que coagula o material em suspensão e contribui para diminuir o arraste da proteína. O teor de penicilina no meio é da ordem de 0,5 a 1,5 %. Após a filtração, o líquido é submetido a uma extração com acetato de butila acidificado, que dissolve o antibiótico. Em uma segunda extração, o solvente orgânico contendo o antibiótico é tratado com água e álcali. Nessas novas condições, o ácido penicilinico dissolve-se na fase aquosa, que é, então, separada do solvente orgânico. A solução aquosa obtida é submetida a nova extração com solventes orgânicos acidificados, que dissolvem o ácido penicilínico impurificado com outros ácidos orgânicos. O tratamento com água mais base orgânica provoca a cristalização da penicilina e a separação do solvente e do sal de ácido penicilinico. Com uma filtração em filtro bacteriológico, consegue-se a cristalização em condição perfeitamente asséptica e, desse ponto até o acabamento final, todas as operações têm de ser conduzidas dentro da mais rigorosa assepsia. Após a cristalização, filtra-se e conduz-se a penicilina para o secador e depois segue para a embalagem. 5. Vitamina B 12 A vitamina B 12 que, industrialmente, produz-se pelo Strepromyces olivaceus, está intimamente associada ao micélio do actinomiceto nas primeiras 60 horas de fermentação. Obtém-se sua atividade com a recuperação da massa de microrganismos por centrifugação ou filtração e posterior secagem á pressão normal e a 50ºC. Para se obter a vitamina livre das células, ajusta-se o pH do mosto a 5 com Prof. Raul Vicenzi

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ácido sulfúrico, aquece-se a mistura á ebulição para libertar a vitamina, elimina-se o microrganismo por centrifugação ou em filtros rotativos a vácuo e concentra-se o filtrado à densidade de um xarope. Adicionam-se 100 mg/litro de sulfito de sódio, para evitar a decomposição da vitamina, e prosseguese a operação, secando-se o concentrado em secadores de tambor. Tritura-se o material obtido, com 5% de umidade, em moinhos de martelo e, a seguir, faz-se a embalagem para o consumo. 6. Estreptomicina Após a fermentação, elimina-se a massa celular de Streptomyces griseus, adicionando-se ácido ao meio, que é, então, aquecido e, a seguir, filtrado em filtros rotativos a vácuo. Conduz-se o filtrado a colunas de resinas catiônicas e aniônicas, onde se retêm as bases e a estreptomicina. Com uma solução diluída de ácido clorídrico, liberam-se as bases sob a forma de cloretos e a estreptomicina. Concentra-se a solução substituindo-se a maior parte da água por metanol, e procede-se a cristalização do antibiótico sob a forma de sal complexo de cálcio, em presença de cloreto de cálcio. Faz-se a concentração misturando-se metanol, destilando-se o metanol e a água e adicionando-se metanol puro. Redissolve-se o sal complexo em água, purifica-se, liofiliza-se e acondiciona-se, para usá-la nessa forma ou para empregá-la no processo de transformação em sulfato de estreptomicina ou sulfato de di-hidroestreptomicina. O uso de resinas intercambiadoras de íons facilitou sobremaneira a técnica de recuperação da estreptomicina. Com uma resina aniônica com grupos amônio-quaternários, pode-se converter o complexo de cloreto de cálcio em sulfato de estreptomicina. A regeneração com ácido sulfúrico converte o complexo em sulfato de cálcio e sulfato de estreptomicina e retém ânion cloreto. Pela fluidização do leito de resina causado pelo uso de fluxo ascendente, pode-se arrastar o sulfato de cálcio, insolúvel, suspenso na solução do antibiótico. PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAÇÃO COM BACTÉRIAS 1. Dextrânio E um polissacarídeo produzido por bactérias do gênero Leuconostoc, destacando-se, como mais importante produtor industrial, o Leuconostoc mesenreroides. O dextrânio separa-se facilmente por floculação com álcoois ou acetonas, adicionando-se ao substrato volume igual de solvente. Do fermentador, passa-se o substrato para um recipiente provido de sistema de aquecimento, onde se adiciona água e metanol. O sobrenadante é encaminhado para colunas de recuperação do álcool e a fase mais pesada é levada para um hidrolisador com aquecimento, onde se trata com ácido clorídrico. A seguir, filtra-se em filtro-prensa e encaminha-se a um tanque de fracionamento provido de aquecimento, onde se adicionam metanol e água. Separam-se três fases: uma de baixo e outra de alto peso molecular, que se encaminham para a recuperação do metanol, e uma terceira, contendo o polissacarídeo, que é enviada a um tanque de dissolução, também aquecido, para ser dissolvida com água. Desse tanque, passa-se o material para uma coluna intercambiadora de íons, e dai para um concentrador a vácuo, para um filtro bacteriológico, para um secador por aspersão, e para a embalagem em condições assépticas. Prof. Raul Vicenzi

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Separação dos produtos de fermentação

2. Ácido lático E recuperado dos meios fermentados por Lacobacillus delbrueckii ou L. bulgaricus, tratandose com hidróxido de cálcio ate pH 10-11, aquecendo-se á ebulição, para matar os microrganismos, precipitando-se o material protéico, filtrando-se, concentrando-se e secando-se o filtrado. A purificação pode ser obtida pela esterificação de álcool metílico, separando-se o álcool do éster metilico de ácido lático, em uma coluna de destilação, hidrolisa-se o lactato de metila e separa-se o metanol do ácido lático, em outra coluna de destilação. 3. Ácido acético O ácido acético é recuperado com o substrato de fermentação, para ser usado sob a forma de vinagre. Quando se deseja um produto de alta concentração, procede-se á filtração e concentração do líquido, que se obtém de fermentações submersas. 4. Solventes Os solventes normalmente produzidos por fermentação são a acetona, o butanol e o isopropanol, geralmente sob a forma de misturas de etanol-butanol, butanol-acetona, etanol-butanolacetona, butanol-isopropanol e etanol-acetona. Os microrganismos envolvidos são: Clostridium acetobutylicum, para butanol-acetona, Clostridium butyricum, para butanol-isopropanol, e Bacterium acetoethylicus, para etanol-acetona. A recuperação dos solventes é feita em colunas de destilação, procedendo-se primeiro á separação dos solventes do mosto fermentado, obtendo-se um destilado com aproximadamente 40% dos solventes. Submete-se esse destilado ao fracionamento em colunas especiais, onde se obtém cada um dos componentes separadamente e em alto grau de pureza. Na produção de acetona-butanol-etanol a proporção dos solventes obtidos gira ao redor de 32%, 68% e 2%, respectivamente.

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DIGESTÃO ANAERÓBICA (fermentação metanogênica) Digestão anaeróbica é o nome que se dá a produção de metano e gás carbônico a partir de matéria orgânica na ausência de oxigênio, mediante uma população mista de microrganismos. Os principais benefícios comerciais são a produção de energia, a redução da contaminação e o controle do odor. Em principio qualquer resíduo orgânico pode ser tratado desta forma e o processo tem sido aplicado a uma ampla gama de resíduos industriais, agrícolas e domésticos. A favor do uso em grande escala da digestão anaeróbica, estão os trabalhos de tratamentos de águas residuárias realizados há mais de um século e ao êxito das plantas de biogás na Índia e China. É uma fermentação diferente das demais. Na respiração aeróbica tem-se redução do oxigênio e oxidação do carbono. O processo preferencial é a oxidação da matéria orgânica pelo processo aeróbio. Ausência de O2 tem-se oxidante alternativa que deverá ser reduzido pelo processo biológico com utilização de energia com substância reduzida e a oxidada não pode ser tóxica. Ex: CO2 , NO3 , SO4 sãos as mais importantes porque estão relacionadas com ciclos biológicos do C, S e N. O FeIII é reduzido para obtenção de ferro metálico a partir de minério de ferro Quando o peixe morre cessa a respiração (fornecimento de O2 ) e a reação não é mais reversível (ocorre a liberação do odor característico). No pescado ocorre a transformação do óxido de trimetilamina em trimetilamina Na respiração anaeróbia está ligada a cadeia respiratória dos microrganismos Na fermentação ocorre a produção de succinato a partir do fumarato por bactérias fermentativas., que também é chamada respiração do fumarato. O processo aeróbio tem preferência ao anaeróbio, ao contrário somente sem oxigênio. A fermentação metanogênica começou a ter destaque em 1973 com a crise do petróleo. 1) Despoluição 2) Produção de gás: 1 m3 gás = 0,7 m3 CH4 + 0,3 m3 CO2 = 6000 kcal = 6,8 kw/h 1 m3 biogás = 6,8 kwh Biodigestor com 10 m3 produz 10 m3 gás/dia – 68 kw hora / dia Na fermentação tem-se: Substancia + Microrganismos – PRODUTO Substrato : Biomassa primária – Resíduos agrícolas Resíduos florestais Resíduos marinhos Biomassa secundária Resíduos urbanos Resíduos Industriais Resíduos domésticos Resíduos Agroindustriais Esgotos domésticos Biomassa terciária – Lodos das estações de tratamentos Prof. Raul Vicenzi

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BIOQUÍMICA E MICROBIOLOGIA DA DIGESTÃO ANAERÓBIA INTERAÇÃO DE ESPÉCIES A digestão anaeróbia dos resíduos orgânicos implica um cultivo misto de bactérias com uma complexa interdependência que culmina com a produção de metano pelas bactérias metanogênicas. Estas bactérias utilizam um número muito limitado de substrato para a formação de metano, principalmente acetado e hidrogênio mais gás carbônico, de forma que as bactérias hidrolíticas e fermentativas devem atuar primeiramente sobre a matéria orgânica, produzindo, como produtos finais, os substratos para as bactérias metanogênicas. POPULAÇÃO MICROBIANA NOS DIGESTORES Identificar as espécies de microrganismos que existem nos digestores é difícil, já que nunca se está seguro de que as condições utilizadas permitam o crescimento de todos os microrganismos que estão presentes. Contar o número de cada espécie é ainda mais difícil, especialmente porque a mair parte dos resíduos são particulados e existem bactérias unidas as partículas. Portanto, na atualidade, o conhecimento da microbiota dos digestores está baseada em uma concepção de amplos grupos tróficos, aparentemente comuns a todos os processos, que atuam sobre a digestão de resíduos complexos. As bactérias são muito específicas e desdobram compostos de 1 átomo de carbono. Estes organismos com seus substratos e produtos são mostrados na Figura seguinte e são: ⇒ Bactérias hidrolíticas e fermentativas (Grupo I) ⇒ Bactérias acetogênicas produtoras de hidrogênio (Grupo II) ⇒ Bactérias metanogenicas (Grupo III). ⇒ Um grupo adicional (Grupo IV) capaz de sintetizar acetato a partir de H2 e anidro carbônico, as bactérias homoacetogenicas, é de pouco significado. BACTÉRIAS HIDROLÍTICAS E FERMENTATIVAS Este grupo contém anaeróbios estritos e facultativos e é responsável pela eliminação de pequenas quantidades de oxigênio, que se introduzem, por exemplo, na alimentação do digestor. Nos digestores é realizada a hidrólise das proteínas, a celulose a hemicelulose e a pectina. A lignina é praticamente não biodegradável em sistemas anaeróbios. Tem também as bactérias acidogenicas, que produzem ácidos a partir de açucares simples. BACTÉRIAS ACETOGÊNICAS OBRIGATÓRIAS PRODUTORAS DE H2 Estas bactérias também são conhecidas como bactérias Várias são as espécies importantes na digestão, por exemplo, Syntrophomonas wolfei, que oxida butirato a acetato quando cresce com uma metanogênica e Sintrophobacter wolinii, que degrada propionato a acetato e H2 . A beta-oxidação dos ácidos graxos de cadeia longa a acetato e a fermentação de compostos aromáticos também ocorrem devido à atividade este grupo de microrganismo Prof. Raul Vicenzi

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Resíduos celulósicos, amido, proteínas, lipídios, etc

Bactérias hidrolíticas e fermentadoras do GRUPO I Formaledeído Acetaldeído

H2 + CO2

Proprionato, butirato, ácidos graxos de cadeia longa

Bactérias homoacetogenicas GRUPO IV Acetato

Acetaldeído

Bactérias acetogênicas produtoras estritas de H2 GRUPO II (Requerem baixas pressões parciais de H+)

H2

Bactérias metanogênica GRUPO III

CH4 + CO2

CH4

BACTÉRIAS METANOGÊNICAS Estas bactérias estão entre os anaeróbios mais estritos conhecidos e seu cultivo tem requerido o desenvolvimento de uma série de técnicas capazes de manter o ambiente estritamente livre de oxigênio. Essas bactérias atuam sobre uma gama bastante limitada de substratos. Nove espécies podem crescer convertendo o formaldeído a metano mais CO2 e somente três espécies (todas da espécie Metanosarcina bakeri) são capazes de crescer sobre acetato, metanol e metilamina. Methanobacterium formicum – são autotróficos, isto é, reduzem o CO2 . Methanosarcina baskeri Methanopirillus – bastonetes curvos Methanobacterium – bastonetes não curvos Methanotrix

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EQUAÇÃO ESTEQUIOMÉTRICA GERAL DE BUSWELL Cn HaO6 + (n + a/4 – b/2) H2 O C6 H12 O6

(n/2 – a/8 + b/4) CO2 + (n/2 + a/8 + b/4)CH4 3 CH4 + 3 CO2

C6 H12 O6 + 6 O2

3 CO2

+ 6 H2 O - 686 kcal

3 CH4 + 6 O2

3 CO2

+ 6 H2 O - 630 kcal

[630/686] % da energia continua sobre a forma de metano e [56/686] é liberado. A fermentação metanogênica produz uma pequena carga de biomassa. Outra reação : Fonte de CH4 é o CO2 CO2 + 4H2 CH4 + 2H2 O - 32,4 kcal O H2 é liberado de duas moléculas de glicose. 2 CH2 OH –CHOH – CHOH 2 CH3 – CO – COOH + 2 H2 O

2 CH3 – CO – COOH + 2 H2 2 CH3 – COOH + CO2 + 2 H2

Fazendo a soma das reações (carbono marcado) 2 CH3 COOH + 2 CO2 + 4 H2 2 CH4 + CH4 + 3 CO2 + 2 H2 O CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2 O – 32,4 kcal 4 CH3 OH (metanol) 3 CH4 + CO2 + 2 H2 O 3 moléculas de metanol são reduzidas a metano e 1 molécula é oxidada a CO2 Bactérias autotróficas, aquelas que geram sua própria energia a partir de substâncias minerais. Elas utilizam o CO2 para produzir metano e energia. PRODUÇÃO DE GÁS Depende de cada substrato Glicídios C6 H12O6

3 CH4

+ 3CO2 + H2 O

8500 kcal/m3 Biogás – 4500 kcal/m3 Proteínas 4CH2 NH2 COOH +2H2 O

3 CH4

+ CO2 + 4CO2 + 4NH3

Biogás ¾ 8500 Prof. Raul Vicenzi

6375 kcal/m3 82

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Lipídios 4C3 H5 (OH)3 + 2H2 O 12CH3 (CH2 )16 COOH + 2H2 O

7 CH4 + 5CO2 52CH4 + 20CO2 56 CH4 + 25 CO2 59/84 * 8500 5970 kcal/m3

EXEMPLO SACAROSE - 6CH4 6 * 0,0224 = 0,1344 L de gás 0,1344 litros * 1000 kg = 0,39 L/kg 324 g 1 kg 0,4 litros de gás / kg sacarose REATORES – EVOLUÇÃO Natureza – ausência de oxigênio – Anaerobiose Rumem Biodigestores (bovinos) Chinês Rurais Indiano No biofertilizante há o enriquecimento de N e P e empobrecimento do C. O inconveniente é que o biofertilizante é líquido, pois transporta 90% de água. TIPOS DE DIGESTORES Os digestores podem ser desenhados para sua utilização em situações rurais (baixa tecnologia) ou para aplicações industriais sofisticadas. Pode ser operado de forma descontínua ou preferencialmente de forma contínua. Digestores de baixa tecnologia Normalmente não necessitam de aquecimento e são misturados manualmente. Para os climas frios deve-se fazer o isolamento. Digestores descontínuos É muito complicado trabalhar com material sólido ou semi-sólido em digestores contínuos. Nestes casos é conveniente utilizar os reatores descontínuos, pois estes necessitam de poucos equipamentos adicionais. Tanques reatores com agitação contínua Estes digestores agitados e com o conteúdo perfeitamente misturado, de alimentação contínua, são utilizados para tratar de material com baixo teor de sólidos (2 a 10%). A agitação serve: a) para distribuir o material administrado no reator; b) para impedir o acúmulo de sólidos não digeridos; c) para distribuir o calor aplicado, e d) para impedir o acúmulo de películas. A agitação Prof. Raul Vicenzi

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pode ser mecânica ou por recirculação de gás, quando o gás produzido é borbulhado de volta ao digestor. Os microrganismos sedimentados podem ser recuperados e recolocados no digestor. É importante ter um depósito para gás produzido, pois o mesmo não é produzido de maneira uniforme durante o dia. Reatores anaeróbios de capa de sedimentos com fluxo para cima (UASB) É particularmente indicado para tratamento de resíduos solúveis de baixa concentração de sólidos (<1% de MS). O material residual entra por uma base do digestor e flui para cima, através do lodo, com bactérias sedimentadas e de uma região do digestor onde as bactérias que floculam sedimentam em grânulos de aproximadamente 4mm de diâmetro. Os resíduos tratados que emergem na superfície do lodo passam para uma área tranqüila sem borbulhamento de gás, onde sedimentam as bactérias que se separam. Defeitos: Não pode ter entrada muito rápida de afluente; Não trata bem material particulado, os quais podem depositar-se no leito reduzindo a eficiência; O afluente pode formar canais na capa de sedimento (lodo) ao invés de passar uniformemente por todo o volume do leito. Reatores de película Estes podem ser subdivididos nos que tem um meio de suporte estacionário, filtros anaeróbios, e aqueles que o próprio suporte está em movimento na corrente do líquido. Filtros anaeróbios Os resíduos são passados sobre a população de bactérias unidas a um suporte sólido inerte, como, PVC, poliéster, bolas de cristal, brita, areia grossa. Utilizado para tratar material vegetal com 1 a 10% de MS e resíduos animais. Reatores de leito expandido ou fluidizado Os resíduos aquosos que fluem através destes reatores fluidizam o ao menos expandem o leito de partículas onde estão unidas as bactérias. As partículas em suspensão estão em movimento contínuo e pode conseguir-se uma transferência muito eficiente de substrato se for impedida a formação de canais ou a obstrução. TIPOS DE RESÍDUOS PARA A DIGESTÃO A classificação mais prática dos resíduos com propósitos de digestão anaeróbia é em resíduo de força baixa, média e alta e resíduos sólidos. Para subdvidir em base de matéria seca ou ao conteúdo de sólidos totais (ST), estas categorias correspondem aproximadamente a 0,2-1%; 1-5%; 512% e 2-40% de ST, respectivamente. E necessário conhecer, também se o resíduo é totalmente solúvel ou contenha material particulado. Nem toda a matéria seca em um resíduo é biodegradável, por exemplo, os compostos inorgânicos, etc. Recorre-se a vários métodos para quantificar o conteúdo orgânico de um resíduo: determinação de sólidos voláteis (cinzas) e determinação da DQO (Demanda Química de Oxigênio), determinação de DBO 5 (Demanda Biológica de Oxigênio, medida Prof. Raul Vicenzi

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durante o período de 5 dias) e COT (carbono orgânico total, somente para amostra solubilizadas). A lignina, embora orgânica, não é totalmente degradada anaerobicamente. COMPOSIÇÃO QUÍMICA Os resíduos devem constituir um meio adequado de crescimento para a microbiota do digestor e se não estão presentes, deverão ser adicionados nutrientes como fosfatos, microelementos e nitrogênio. É desejável uma relação C:N abaixo de 40:1. Os resíduos devem ter uma boa capacidade tamponante, ao redor da neutralidade, atribuído aos fosfatos, íos de amônio, carbonatos e bicarbonatos, ácidos graxos voláteis ou outros ácidos orgânicos e aminas. Assim não é necessário controle do pH na digestão. Também deverão ser conhecidos possíveis inibidores, por exemplo, amônio em resíduos ricos em proteínas, sulfatos em resíduos do processamento de papel e metais em resíduos de cortumes. ORIGEM DOS RESÍDUOS Resíduos do processamento industrial e de alimentos As águas residuárias do processamento de açúcar é um substrato clássico. Resíduos da industria cervejeira, de destilado, resíduos de vegetais, da industria de conservas podem ser utilizado, porém normalmente são produzidos sazonalmente. Outros substratos que podem serem utilizados são o soro do queijo e resíduos de matadouros. Dejetos de Animais e Biomassa Agrícola A digestão anaeróbica tem potencial na agricultura para reduzir a contaminação e os patógenos, controle de odores e para produção de energia. Normalmente o esterco de ruminantes contém sólidos que já sofreram uma degradação microbiana durante 1-4 dias na passagem pelo rúmem, de forma que contém uma maior quantidade de lignocelulose e conseqüentemente terão menor rendimento. A biomassa agrícola seca, palha, bagaço de cana-de-açúcar, restos da industrialização de milho, etc. A digestibilidade pode ser pequena e a relação C:N pode ser alta. A biomassa verde tem boa fermentação. Resíduos Domésticos Os sedimentos das águas residuárias tem sido usados na digestão anaeróbica, nos sistemas de esgotos cloacais municipais desde o início do século passado na Europa. O gás produzido é utilizado para aquecimento da própria planta, pois o objetivo primeiro é reduzir a contaminação e os odores. OPERAÇÃO DO DIGESTOR Temperatura de digestão Existem duas faixas de temperaturas nas quais os digestores são operados: os mesófilos (2025º a 40-45ºC) e os termófilos (50-55ºC a 60-65ºC). Cada um implica uso de diferentes bactérias. A produção de gás diminui rapidamente nos limites destas faixas e os efeitos de um curto período de Prof. Raul Vicenzi

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aumento de temperatura da faixa mesófila para a faixa termófila pode necessitar muitas semanas para ser recuperado. Tempo de retenção e velocidade de carregamento O tempo de retenção hidráulica (TRH) ou seja, o espaço de tempo que o líquido adicionado passa no interior do digestor é dado pela expressão: Volume do Digestor TRH = Volume diário de resíduos adicionados O tempo de retenção dos sólidos será mais longo que este se as partículas são conservadas no digestor. Os resíduos simples podem passar através dos digestores, com retenção de microrganismos, com TRH de somente algumas horas, porém os resíduos complexos são digeridos a TRH de 10 dias ou mais. A velocidade que os sólidos são adicionados no digestor é função do volume adicionado diariamente e do conteúdo em sólidos do material utilizado. A velocidade de carregamento se expressa como peso de matéria orgânica (geralmente kg de sólidos voláteis [VS] ou de DQO) por m3 de digestor por dia. A carga máxima que pode ser aplicada dependo o desenho do digestor e do tipo do resíduo. Para um UASB de escala completa, tratando águas residuárias do processamento de açúcar, pode conseguir-se mais de 15 kgDQO.m-3.dia -1 . Para um digestor de baixa tecnologia operando com esterco animal a 35ºC uma boa operação seria de aproximadamente 4 kgSV.m-3 .dia-1 . Rendimento O rendimento em gás é uma medida do grau de digestão da matéria orgânica. É o volume de gás gerado por unidade de peso de matéria orgânica adicionada ao digestor. Se são adicionados substratos orgânicos puros e estes são degradados completamente a CO2 e CH4 , então pode-se calcular o rendimento seguinte de gás por kg de substância adicionada. Amido/celulose/glucose 0,8 m3 kg-1 Ácidos graxos (baseados em estearato) 1,5 m3 kg-1 Proteína (baseada em (C 5 H7 NO2 ) 0,9 m3 kg-1 Rendimentos tão altos raramente são conseguidos na prática, já que geralmente a conversão da matéria orgânica é incompleta. Valores da ordem de 0,6 m3 kg-1 SV são obtidos a partir de sedimentos de leveduras de cervejarias e de destilarias. O esterco suíno pode dar rendimentos de gás de 0,4m3 kg-1 de SV adicionados, porém esterco bovino pode dar valores de 0,2m3 kg-1 . O rendimento de gás varia conforme a composição do resíduo, o tempo de retenção e a presença de inibidores, entre outros. Digestão em duas etapas Os diferentes grupos da população microbiana nos digestores tem condições de operação ótima diferentes e a eficiência pode ser melhorada separando a etapa de acidificação, que necessita de bactérias feremtativa e hidrolíticas, da etapa metanogênica que requerem bactérias acetogênicas, estritamente produtoras de H2 , e bactérias metanogênicas. Isso pode ser conseguido mantendo o pH Prof. Raul Vicenzi

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do recipiente na reação inicial em 6 ou menos, quando a produção de metano é inibida, mas a hidrólise e a fermentação continuam. O gás produzido na primeira etapa está misturado com CO2 e H2 . ENERGIA NOS DIGESTORES O gás produzido na fermentação anaeróbia é composto por aproximadamente 70:30 de CH4 :CO2 , sendo gás combustível. A energia de maior interesse é aquela chamada energia livre, obtida após o aquecimento do digestor, do aquecimento do conteúdo misturado e das perdas produzidas no sistema. Parâmetros que afetam a produção total de gás O volume de gás que pode ser produzido a partir de uma quantidade determinada de resíduos, o rendimento em gás, é um parâmetro crítico para o desenho do digestor. Os fatores mais importantes que afetam o rendimento de gás são: o tipo de resíduo, a temperatura de operação, tempo de retenção e a presença de inibidores. O volume de gás produzido por um digestor é diretamente proporcional a massa de sólidos biodegradáveis que foi adicionado, dentro dos limites de operação. Tipo de resíduos O volume de gás dependerá da mistura de vários componentes presentes no resíduo. Para substratos complexos como esterco de animais, geralmente não é possível calcular a quantidade de gás que pode ser produzido a não ser empiricamente. Temperatura de operação Geralmente o máximo de gás é produzido pelas bactérias anaeróbias mesófilas em temperaturas ao redor de 35ºC, e pelas bactérias termófilas em aproximadamente 55ºC, podendo variar conforme o tipo de resíduo. A produção de gás é menor em outras temperaturas, mas é difícil estabelecer uma relação entre a temperatura e a produção de gás. Devemos ter em mente em qual temperatura devemos operar o digestor, pois poderia haver a necessidade de muita energia, para o aquecimento do digestor, porém com pequeno rendimento em gás. Tempo de Retenção Para um conteúdo de sólidos constante, um aumento no TRH dará uma maior produção de gás, todavia a relação não é linear. Como o material a ser digerido é de composição complexa, os componentes individuais serão degradados a diferentes velocidades. Em uma situação real, aumentando o TRH requerido para tratar um volume de resíduo afim de dar um maior rendimento em gás, supõe desvantagens, principalmente em relação ao aumento do custo do digestor. Se não existe limite de quantidade de material disponível para a disgestão, então é conveniente colocar maior quantidade de material no digestor e reduzir o TRH, e assim produzir maior quantidade de gás por dia, porém com menor rendimento em gás.

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Fermentação metanogênica

Volume de material admitido no sistema Quanto maior o teor de sólidos biodegradáveis, maior será a produção total de gás, até o limite da velocidade aceitável de carregamento. O limite do conteúdo de sólidos será geralmente observado na prática, ou obtido sobre o que pode ser conseguido por sedimentação, no caso dos lodos, ou pelo que pode ser manejado pelas bombas existentes, no caso de esterco com alto teor de sólidos. Se o teor de sólidos for maior que 10-12% é necessário adicionar água para facilitar o manejo. Toxidez a) NH4 +/NH3 – Nos resíduos agrícolas podem ser encontrados altos teores de amônio (ex.: 3.000 a 4000ppm de nitrogênio amoniacal) nos digestores alimentados com esterco de suínos e de aves. A adaptação das populações microbianas e a seleção natural de cepas capazes de trabalhar em níveis mais altos de amônio podem ocorrer no decorrer de vários meses, de forma que a digestão pode acontecer em níveis de 5.000ppm de N amoniacal. A toxicidade do amônio depende do pH, sendo maior em pH alcalino. Embora possa perder parte da amônia volátil, todo o N é retido durante a digestão, de forma que os efluentes perdem pouco valor fertilizante. b) SO4 2- - Alguns resíduos industriais, por exemplo processamento de papel, podem ser ricos em sulfatos. O SO4 2- e o CO2 competem pelo H2 ,sendo utilizado pelas bactérias redutoras de sulfato. c) Contaminante industriais agrícolas – antibióticos adicionados a ração de animais pode prejudicar o bom funcionamento dos digestores. Desinfetantes e detergentes presentes nas águas residuárias podem ser problemas, mas geralmente nas quantidades recomendadas não tem ocorrido maiores danos. Metais pesados podem também conduzir a problemas de funcionamento, mas não tem maiores danos se também apresentar altas doses de sulfatos, pois os metais precipitam. Parâmetros que afetam a produção de energia A energia livre produzida por um digestor é a diferença entre a energia total produzida e a utilizada para manter o processo. Geralmente o material deve ser bombeado até o digestor, deve ser aquecido a temperatura de operação, há perdas de calor através das paredes e o conteúdo do digestor deve ser misturado, cada uma destas operações consomem energia. O maior aporte de energia para os digestores que operam em climas temperados com resíduos a temperatura ambiente e geralmente elevar a temperatura de material que entra até a temperatura de operação, freqüentemente uma subida de 25ºC ou mais. Considerações Finais – Economia A digestão anaeróbia, embora muitas vezes é utilizada para o controle da contaminação, é também utilizada freqüentemente para a produção de energia. É quase impossível dar um valor monetário ao controle da poluição, e mesmo quando a produção de energia é a principal razão, uma avaliação econômica não é simples, especialmente se não for possível afirmar de antemão qual a quantidade de gás a ser produzido

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TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS INTRODUÇÃO Após os antibióticos, as enzimas são os produtos mais explorados na indústria biotecnológica. Reações catalizadas por enzimas utilizando-se células intactas de microrganismos vêm sendo utilizadas ao longo da história, principalmente na fabricação de cervejas, vinhos e panificações. As enzimas isoladas têm sido utilizadas há mais de 50 anos no preparo de rações animais e outras aplicações industriais. Muitas das enzimas obtidas de vários tipos de microrganismos podem ter um uso comercial. Por isso devem ser separadas das células que as produzem e purificadas. Em qualquer caso, a enzima deverá purificar-se o mínimo necessário para eliminar as atividades que produzem interferências porque, em alguns casos, como as determinações analíticas, é necessário utilizar altos níveis de purificação. Atualmente comercializam-se em todo o mundo mais de 1500 toneladas de enzimas por ano, correspondendo a um mercado mundial estimado em mais de US$ 2 bilhões. Sendo que mais de ¾ deste valor é constituído somente por quatro enzimas: proteases bacterianas usadas em detergentes, a gluco-amilase, á -amilase bacteriana e a glucose-isomerase, utilizada na industrialização de xaropes de glucose e frutose a partir do amido. As enzimas são biocatalizadores que as células utilizam para realizar uma série de conversões químicas e são largamente utilizados nas indústrias químicas, farmacêuticas e de alimentos; Para apresentar atividade catalítica, algumas enzimas requerem a participação de moléculas menores (co-fatores) de natureza não protéica. Estes podem ser íons (Zn, Ca, etc) ou moléculas orgânica, as coenzimas (NAD, FAD, NADP, etc). A ação catalítica das enzimas se faz, como a dos catalisadores inorgânicos, através da redução da energia de ativação da reação, sem alteração do seu equilíbrio termodinâmico. Além de reduzirem a energia de ativação, incrementando a velocidade da reação, as enzimas apresentam elevada especificidade. A obtenção de enzimas comerciais pode ser feita a partir de fontes animais, vegetais e microbianas. Sua produção pode ser aumentada pela transferência das informações genéticas para um microrganismo hospedeiro. Esses microrganismos geneticamente modificados (OGMs) podem então, ser cultivados sob as melhores condições. No Japão a produção de enzimas por fonte microbianas é o aspecto mais importante no desenvolvimento da área de biotecnologia; NOMENCLATURA: Os nomes sistemáticos incluem o substrato, a reação catalisada e a terminação ase. Exemplo: α-1,4 D glicano glicohidrolase. Nomes triviais também são empregados (pectina esterase, glutamato desidrogenase, entre muitas). Outra forma é pelo código de enzima (EC number), como por exemplo, pectina esterase, a qual apresenta o seguinte numeração EC 3.1.1.11.

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ALGUMAS ENZIMAS DE IMPORTÂNCIA INDUSTRIAL ENZIMA

FONTE

Amilase

B. subtilis; niger A. niger; oryzae

Amiloglucosidase

APLICAÇÕES A. Ind. têxtil, álcool, xaropes, produção de glicose, processo fermentativos, panificações A. Produção de glicose

Celulases

Diversos fungos

Hidrólise da celulose e produção de álcool

Protease bacteriana Protease fungica

B. subtilis A. niger; oryzae

Coalho bacteriano

Mucor miehei

Industria de queijos

Pectinases Inulinase

Diversos fungos K. marxinus

Indústria de sucos de frutas, vinhos, polpas, etc. Produção de frutose

Lacase

Diversos fungos

Biodegradação da lignina e remoção de resíduos fenólicos

Xilanases

Diversos fungos e bactérias

Biodegradação de hemicelulose, branqueamento do papel.

Detergentes, ind de filmes fotográficos A. Ind. De carnes, cerveja, panificação

combustíveis

e

OBTENÇÃO INDUSTRIAL DE ENZIMAS FONTE

ORIGENS

MÉTODO DE OBTENÇÃO

Vegetais

Sementes Sucos Polpas Raízes Mucosas Pâncreas Fígado Sangue

Trituração de tecidos

Bactérias Fungos Leveduras

Cultura submersa ou semi-sólida

Animais

Microrganismos

Trituração de tecidos

VANTAGENS DO USO DE MICRORGANISMOS PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS SÃO: Ø Ø

Número de enzimas que podem ser produzidas é virtualmente ilimitado; A produção de enzimas não está sujeita a flutuações de mercado que afetem a produção ou fornecimento de matérias-primas (Ex.: preço da carne e seus derivados, sazonalidade, políticas de crédito ao cultivo de lavouras, etc);

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Ø Ø

Ø

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A metodologia para obtenção de enzimas por fermentação microbiana pode ser facilmente escalonada para atender a qualquer demanda de mercado. Através de técnicas biotecnológicas, é possível alterar as propriedades das enzimas produzidas, com vistas à melhoria na sua aplicabilidade para o barateamento dos processos de produção e purificação. Pode-se utilizar matérias-primas baratas ou mesmo subprodutos que, de outra maneira, seriam descartados exigindo investimentos em proteção ambiental (ex.: soro de leite, vinhoto, resíduos de celulose, etc.).

Vantagens do uso de enzimas Poupar Capital

Substituição de ingredientes Eliminação /substituição de coadjuvantes no processamento Processamento mais eficiente com menos subprodutos indesejáveis e maior capacidade na planta industrial

Gerar Capital

Aumento da produtividade Melhoria do produto Produto original

ALGUMAS ENZIMAS E SUAS DOSAGENS MÉDIAS EM ALIMENTOS (SOBRE % DE SÓLIDOS ORGÂNICOS TOTAIS) ENZIMA

ALIMENTO

DOSAGENS (% SOT)

Papaína

Produtos forneados Carnes/carnes enlatadas Cervejas

0,0078 0,0044 0,0045

Renina

Queijos Gelatinas/pudins Balas/Caramelo Óleos e Gorduras Snacks

0,0360 0,0040 0,000016 0,000084 0,00056

Pectinase

Produtos Forneados Frutas Processadas/sucos Sopas não cremosas

0,00000026 0,00350 0,060

Invertase Amilases

Doces/Balas/Caramelos Cereais matinais Açúcar e cobertura Gelatinas e pudins Xarope de milho

0,0078 0,0030 0,0520 0,0000020 0,0520

Bromelina

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ENZIMAS NA INDUSTRIA DE ALIMENTOS TEM COMO FUNÇÃO: Ø Reduzir a viscosidade Ø Melhorar extrações Ø Promover reações de bioconversão e de separação Ø Mudar a funcionalidade de produtos Ø Sintetizar produtos químicos Ø Funcionarem como bacteriostáticos/bactericidas Ø Melhorar os processos do ponto de vista ambiental

APLICAÇÕES INDUSTRIAIS Na industria de alimentos tem sido utilizados enzimas durante muitos anos. Isto ocorre principalmente na industria de panificações e cervejeira. A maioria das enzimas utilizadas é enzimas extracelulares de origem microbiana. As proteases constituem aproximadamente 50% das enzimas microbianas. Emprego das amilases – A capacidade que tem a á–amilase de catalisar a degradação do amido mediante o rompimento ao acaso dos enlaces presentes nas porções intermediárias da cadeia, tem aplicações importantes em determinadas industrias, entre elas a s de panificações, cervejarias, fabricação de uísque e processamento de papel e têxtil. Podem ser produzidas a partir do fungo Aspergillus ou por cultivos bacterianos (á–amilase termoestável) a partir de bactérias termófilas. Emprego das proteases – existe uma enorme variedade de aplicações para estas enzimas. Os detergentes domésticos têm pequenas quantidades de protease bacterianas (Bacillus subtilis e B. licheniformis). Esta enzima também pode ser usada na indústria de couro e na indústria têxtil. A papaína é muito usada e é obtida do látex do mamão (Carica papaya). É utilizada para amaciar carnes. Atua prioritariamente na degradação do tecido conjuntivo e também sobre a actomiosina. É uma enzima bastante termoestável. Outra aplicação é na industrialização da cerveja, para degradar precipitados formados a partir do complexo proteína-tanino formado durante o armazenamento a frio da bebida, evitando, assim, a turbidez da cerveja. A obtenção de proteases pode ser de origem animal entre as quais destaca-se pepsina, tripsina, quimotripsina, utilizadas na preparação de alimentos infantis. A renina pode ser obtida do 4º estomago de bezerros lactantes e é usada no processamento de queijos. A protease fúngica (Aspergillus orizae) é utilizada na panificação, para modificação das características das massas. Emprego de enzimas na industria de açúcar - produção de glicose a partir de amido é realizada em todo o mundo. Para isso utiliza-se amiloglucosidase (glucamilase) [Aspergillus niger] para que se possa degradar os enlaces á–1,6 da molécula de amido. As á -amilases (Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis; Aspergillus orizae). somente podem romper os enlaces á-1,4 da cadeia principal do amido, assim não podendo degradar-se até glicose, aparecendo o que se denomina de dextrina limite, as quais podem ser degradas posteriormente pela atividade das amiloglucosidase. A conversão do amido a glucose é um processo importante na industria, pois a glicose que não é muito doce, é utilizada como substrato para a produção de frutose via utilização da Prof. Raul Vicenzi

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glucose isomerase de origem bacteriana, que produz quantidades equivalentes de frutose e glicose. Esta mistura se denomina de açúcar invertido e pode também ser produzida pela hidrólise ácida da sacarose, pela ruptura enzimática da sacarose ou pela ação de invertase de leveduras. A glucose isomerase é a enzima intracelular mais utilizada na industria de alimentos. Outra enzima importante é a á -galactosidase (lactases) produzida por leveduras como Kluyveromyces lactis, K. fragilis e bacteriana de Bacillus spp., que hidrolisa a lactose em seus monossacarídios constituintes. Isto é importante para retirar a lactose de leites, pois algumas pessoas são intolerantes a este dissacarídeo. A glucose pode ser eliminada em alguns alimentos, onde pode causar alterações de cor, mediante o uso de glucoseoxidase fúngica. Esta enzima utiliza glucose e oxigênio evitando assim a oxidação dos alimentos. Emprego das pectinases e celulases – Cepas de Aspergillus niger produzem pectinases e hemicelulases. Os componente principais das pectinases são a pectinaesterase, endometilgalacturonato liase e a poligalacturonase.Nos processos de extração de sucos de frutas e na elaboração de vinhos, a pectinase eleva o rendimento de suco, reduz a viscosidade e melhora a extração da cor. As celulases comerciais produzidas por cepas de Trichoderma reesei, Penicillium funiculosum e Aspergillus niger, são usadas na cervejaria, na produção de álcool e no tratamento de resíduos. Seu maior potencial de uso é na conversão de lignocelulose e da celulose de madeira em glucose. O Penicillium emersonii produzem uma â-1,3;1,4-glucanase com aplicação nas hidrólise dos â-glucanos da cevada. A maioria das enzimas extracelular é usada na forma livre e não são recuperadas para reutilização. Ao contrário as enzimas intracelulares implica o uso de enzimas ou células imobilizadas ou livres que podem reciclar. As glucose isomerases se preparam mediante a imobilização das enzimas isoladas em suportes sintéticos. ALGUNS EXEMPLOS DE ENZIMAS E SUAS CARACTERÍSTICAS DE PROCESSO Origem vegetal Papaína - Classe - proteolítica - Procedência – Carica papaya - Um látex fresco contém aproximadamente 12% do peso seco em papaína - Utilização industrial: Cervejaria –estabilização coloidal da cerveja Industria da carne – amaciamento – degrada o tecido conjuntivo duro Fabricação de hidrolisado de peixe – alimentação animal Industria farmacêutica – medicamentos A papaína industrial tem ótimo de temperatura 55/60ºC e boa termoestabilidade – zona crítica – 67/70ºC; Faixa de pH larga – 5 a 7 Prof. Raul Vicenzi

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Origem microbiana A produção de enzimas microbianas voltou-se para processos de fermentação. Vantagens da fermentação em relação às enzimas de extração: Ø Produção independente das imposições sazonais e geográficas; Ø Possibilidade de utilização de matérias-primas baratas; Ø Rendimentos de produção pode ser aumentado pelo aprimoramento das linhagens e otimização das condições de fermentação Produção de enzimas exocelulares: Os microrganismos são cultivados em meio adequado e a enzima é extraída desde meio; Produção de enzimas endocelulares: Os microrganismos crescem em meio adequado, depois as células são rompidas e as enzimas são extraídas; A produção de enzimas supõe um certo número de etapas Ø Especificidade – tipo preciso de enzima Ø pH ótimo – varia de acordo com a enzima Ø Temperatura ótima; Ø Seleção da linhagem; geralmente do local onde as substâncias a degradarem são abundantes, meio rico seguido de seletivo; Ex.: amido como única fonte de carbono para os microrganismos que possuem amilase Característica da linhagem isolada Ø Desenvolver-se em meio simples e barato; Ø Produzir o mínimo de metabólitos secundários – Ex.: antibióticos Ø Excretar a enzima de modo que seja facilmente separada e purificada; Ø Não conduzir a diferentes poluentes; Ø Não ser patogênicas ou produzir compostos tóxicos As linhagens podem ser aprimoradas por mutações MUTAÇÕES Ø Visa obter linhagens que produzem mais enzimas e um menor custo; Ø Visam suprimir características da linhagem selvagem, caso sejam inconvenientes para a produção industrial; Ø Nas mutações, os mecanismos de regulação, sejam ao nível dos genes ou a nível enzimático, são alterados; Ø Pode-se obter mutantes onde as necessidades de indutor é reduzida ou suprimida em relação ao selvagem, isso é importante caso o indutor tenha um custo elevado; Ø Pode-se obter mutantes cuja biossíntese das enzimas não seja mais reprimida por um dos produtos terminais; Prof. Raul Vicenzi

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Ø Pode-se obter mutantes resistentes a repressão catabólica cuja síntese das enzimas não seja

mais reprimida pela glicose; Ø Às vezes se faz necessário um mutante que não produza metabólito secundário, o qual pode inibir o microrganismo de interesse. Ø Produção de mutantes que não esporulem, os esporos resistem aos tratamentos de recuperação, e afeta a produção de enzimas extracelulares. ENGENHARIA GENÉTICA - Permite inserir no genoma de uma bactéria um gene de outro microrganismo. - Conservação das linhagens industriais – liofilização e nitrogênio líquido. PRODUÇÃO DE ENZIMAS Faz muito tempo que as preparações de enzimas microbianas vem sendo largamente utilizadas para uma variedade de propósitos na produção de numerosos alimentos. Todos os processo de fermentação, inclusive de alimentos fermentados, são manifestações de reações enzimáticas. As enzimas microbianas são obtidas por fermentação em condições controladas de alto rendimento em cultivos de superfície ou submersos. As células excretam as enzimas extracelulares no meio e a primeira etapa de recuperação da enzima a partir dos cultivos submersos consiste na separação do líquido livre de células, que contém a enzima, através de filtração ou centrifugação. Os processos de fermentação com cultivos em superfície são amplamente utilizadas para a produção de enzimas extracelulares fúngicas e neste caso a massa semi-sólida da pós-fermentação se extrai, usualmente com água, antes de ser filtrada. O sobrenadante ou filtrado que contém a enzima se concentra e se vende como uma preparação enzimática líquida que contém conservantes e/ou estabilizantes ou se precipita, seca-se e se tritura para obter a enzima em forma de pó ou grânulos. PROCESSO DE IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS A imobilização de enzimas dentro da célula hospedeira foi a técnica utilizada no primeiro processo comercial baseado na glicose isomerase. As células de Streptomyces que continham a enzima eram aquecidas durante certo tempo para desnaturar as enzimas autolíticas, estabilizar as células e torná-las permeáveis às moléculas pequenas. Outro método se baseia no emprego de agentes floculantes para fixar a glucose isomerase dentro das células de Arthobacter. Estas preparações enzimáticas se transformam em grânulos com objetivo se serem usadas em reatores enzimáticos. A glicose isomerase também pode fixar-se dentro das células através de um aldeído bifuncional reativo de entrecruzamento, como o glutaraldeído. Em outros processos para a produção de glucose isomerase imobilizada industrial as células microbianas que contenham a enzima são fixadas com glutaraldeido e presas em gelatina. Também se utiliza o aprisionamento em fibras, em materiais como o triacetato de celulose, para fixar enzima isolada para uso industrial. Entre as enzimas comerciais imobilizadas desta forma se encontra a glucose isomerase, a amiloacilase e a â-galactosidase. Prof. Raul Vicenzi

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Os microrganismos mais importantes utilizados na produção de enzimas extracelulares industriais são os Bacillus e os Aspergillus, que em conjunto representam 80 a 85% do mercado de enzimas extracelulares Atualmente o Trichoderma reesei são os principais produtores de celulase. A glicose isomerase é produzida a partir de Arthrobacter, Streptomyces e Actinoplanes para a produção de xaropes de frutose. Enzimas de origem fúngica – cultura de superfícies, fina camada em meio líquido, meio semi-sólido. Ex.: amilases de Aspergillus, proteases de Aspergillus e Mucor, Pectinases de Penicillium Culturas submersas são preferíveis – são mais bem adaptadas aos diferentes controles, reduzindo riscos de contaminação; Culturas submersas são mais bem otimizadas do fermentador–piloto para o industrial PREPARAÇÃO DO INÓCULO Ø A linhagem deve ser preservada e sem riscos de contaminação; Ø Deve-se evitar muitas culturas sucessivas; Ø Deve-se partir de linhagem liofilizada e semear um só fermentador que deverá inocular o fermentador industrial; Ø O volume do inóculo é de 3 –10% do volume do fermentador; Ø O meio usado na preparação do inóculo deve ser semelhante ao do fermentador; Ø O tempo de permanência varia de 10 a 80 horas dependendo do tipo de processo. COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA Ø Fonte de C, N e os principais fatores de crescimento; Ø Pode encurtar a fase de latência adicionando alguns fatores; Ø A produção de enzima pode não ocorrer num meio próprio para o crescimento do microrganismo; Ø Deve-se levar em conta a necessidade de um indutor, as repressões possíveis por um composto de meio, a repressão catabólica produzida pela glicose, podendo esta ser substituída por um glicídio, ou por amido previamente hidrolisado; Ø Pode-se fazer meio concentrados, levando em conta a dificuldade de aeração e o aumento da pressão osmótica; Ø As matérias-primas perfazem 60-80% do custo de uma produção de enzimas por fermentação; Ø A composição do meio de cultura deve ser definida com cuidado, levando em conta o custo. Ø A composição deve levar em conta as etapas de extração; Ø Os meios são geralmente esterilizados no fermentador, geralmente com altas temperaturas, que destrói menos os fatores de crescimento e desenvolve menor coloração no meio. Ø As amilases e proteases importantes comercialmente são produzidas de B. amyloliquefaciens e B. licheniformis tem a velocidade de síntese constante com pouca dependência do substrato presente no meio. As enzimas extracelulares têm sua síntese em velocidade baixa na ausência de substrato, porém aumenta milhares de vezes quando induzidas. A maltose é o melhor indutor para a á-amilase de A. orizae. O amido, a maltose e a glucose estimulam a produção de amiloglucosidase por A. niger. A celobiose e a lactose são os melhores indutores de celulase de Prof. Raul Vicenzi

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T. reesei e também serve de fonte de carbono. A produção de poligalacturonase por A. niger está associada á presença de pectina no meio. A síntese de enzimas extracelulares está usualmente associada com as fases de crescimento exponencial e estacionária. Em quase todos as condições, as espécies de Bacillus produzem proteases extracelulares durante a fase de crescimento estacionária. A síntese á-amilase por B. licheniformis e A. orizae ocorre durante a fase de crescimento exponencial, porém para o B. subtilis e B. amyloliquefaciens a enzima é produzida na fase estacionária. EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO Terminada a fermentação, as enzimas devem ser separadas das células e do meio e tratadas de modo a obter uma preparação comercial que corresponda aos critérios de pureza e estabilidade desejados. Esses tratamentos são operações unitárias simples, tais como: centrifugação, filtração, evaporação, precipitação secagem, etc. As preparações enzimáticas podem ser comercializadas sob diferentes formas, pó, líquida, liofilizadas, concentrada, imobilizada, etc. Nos casos de enzimas intracelular (endocelulares), a recuperação é mais difícil e supõe uma etapa complementar de trituração ou lise das células microbianas. Após este tratamento, essas enzimas são purificadas como as enzimas extracelulares. As formas líquidas são mais fáceis de utilizar que as formas desidratadas, porém estas tem maior estabilidade para conservação.

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ESQUEMA GERAL PARA A PRODUÇÃO E PROCESSAMENTO DE ENZIMAS

Produtos Celulares Imobilizados ↓ Procedimento de Imobilização ↓ Separação Liq /Sol → Descarte do líquido ↓ Tratamento Posterior e formação de partículas ↓ Secagem ↓ Produto Sólido Ex. glucose isomerase

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Fonte de Cultivo ⇓ Propagação ⇓ Fermentação ⇓ Separação das células do Meio ⇓ Produtos intracelulares ↓ Liberação da enzima ↓ Separação de Sol/liq Sólido descartado ↓ Concentração do líquido ↓ Purificação e estabilização → Secagem ↓ ↓ Produto Líquido Produto Sólido Ex.: glucose oxidase

Produtos Extracelulares ↓ Separação do caldo →Descarte de sólidos ↓ Concentração do líquido ↓ Purificação e estabilização ↓ ↓ Secagem ↓ ↓ Produto líquido Produto Sólido Ex. Proteases Proteases Amilases Pectinases

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