7) Fotosintesi - Calvin

LE REAZIONI AL BUIO: BUIO assimilazione fotosintetica del carbonio → il Ciclo di Calvin

“funzione” della FS

Bilancio delle “entrate” e delle “uscite” fra fotosintesi e respirazione: la fotosintesi e la respirazione sono due processi complementari e la “comunicazione” fra loro avviene proprio attraverso gli “zuccheri”

Relazioni fra Fase Luminosa e Fase Oscura:

La Fase Luminosa produce NADPH e ATP che vengono consumati e riportati a NADP+, ADP e Pi dalla Fase Oscura in cui la CO2 è ridotta a zuccheri C(H2O)n.

Il ciclo catalitico della fissazione della CO2 (ciclo di Calvin, Calvin ciclo C3 o ciclo riduttivo dei pentosi fosfati) fosfati si compie principalmente in 3 tappe: tappe - CARBOSSILAZIONE - RIDUZIONE - RIGENERAZIONE e necessita di - CO2 - UN ACCETTORE DELLA CO2 - NADPH - ATP.

L’enzima capace di fissare la CO2 su un accettore è la RUBISCO Ribulosio 1-5 difosfato carbossilasi-ossigenasi (ponte fra il non-vivente ed il vivente) L’enzima Rubisco è composto da 8 subunità grandi (L, arancio e giallo), codificate dal genoma plastidiale, e 8 subunità piccole (S, blu e viola), codificate dal genoma nucleare:

L8S8. L8S8 Vi sono 8 siti catalitici che lavorano indipendentemente l’uno dall’altro e che sono posti alle interfaccia fra le subunità L. Le subunità S hanno invece ruolo regolativo.

L S

La rubisco dei batteri fotosintetici ha le stesse proprietà catalitiche di quella delle piante, ma è composta solo da 2 subunità (piante: ragioni di “spazio”?)

Il SITO CATALITICO della Rubisco è organizzato attorno ad

uno ione Mg2+

(verde) coordinato da 3 aminoacidi fra cui una lisina carbamilata (cioè con una CO2 legata all’NH2 terminale, nella figura è in basso, mentre la CO2 in alto è quella già legata allo zucchero bisfosfato). Il carbammato viene stabilizzato dal Mg2+ stesso.

Reazione di carbamilazione:

-CH2-NH2 + CO2 → -CH2-NH-CO-OH OH

CO2

E – lys – N – C zucchero2P

H

O

Folding adeguato per la forma attiva dell’enzima: carbamilazione + Mg2+ (anche Rubisco Chaperone)

SCHEMATIZZAZIONE DEL SITO ATTIVO DELLA RUBISCO

Il Mg2+ è positivo e quindi può coordinare varie molecole che presentano

CO2 e RuBP

delle parziali cariche negative, quali appunto CO2, RuBP,il RuBP carbammato ed altri due aminoacidi opportuni.

Mg2+

HO

O C NH Residuo di lisina carbamilato

Catena aminoacidica della proteina

Quando il sito catalitico è costituito e quindi l’enzima è in forma attiva, vi si lega il ribulosio 1-5 bisfosfato (RuBP): l’enzima si chiude adesso su se stesso ed espelle le molecole d’acqua dal sito attivo fuorché quella legata al sito attivo stesso e necessaria per la catalisi.

Forma attiva della rubisco con il substrato legato (solo subunità L)

Alcune informazioni sulla RUBISCO: A dispetto del suo ruolo centrale nella fotosintesi, la rubisco è un enzima molto lento: lento carbossila solo tre molecole al secondo! (1000-100000 come range medio e generico di attività di altri enzimi).

La cellula supplisce a ciò aumentando le copie di enzima: è la proteina più abbondante sulla terra. Inoltre è anche poco specifica: specifica il sito di legame per la CO2 può legare anche l’O2 (con rapporto di frequenza 3:1): ossigenazione e fotorespirazione. In pratica l’enzima può legare anche O2 al substrato (il RuBP) invece che solo CO2.

LA REAZIONE DI FISSAZIONE DELLA CO2: LA CARBOSSILAZIONE DEL RuBP La Rubisco catalizza l’addizione di 1 CO2 sul RuBP (5C) con formazione di un composto intermedio instabile (6C) che per idrolisi dà 2 molecole di 3fosfoglicerato (2 x 3C = 6C). 2 C3 C6 C5

Il processo avviene in 3 TAPPE PRINCIPALI

I° TAPPA:

Enolizzazione ovvero passaggio del RuBP dalla forma chetonica alla forma enolica

P CO2 P

H+ O Carmaminico

La sottrazione di H+ di C3 dal RuBP forma un intermedio enediolico L’effetto polarizzante di Mg2+ e la vicinanza di un O carbaminico posizionato per accettare H+ è favorevole per la formazione dell’enediolo C2-C3, C2-C3 stabilizzato anche dalla protonazione dell’O di C2. L’O carbaminico è l’accettore iniziale di H+ di C3, ciò implica che la catalisi è iniziata dall’effetto combinato di polarizzazione del Mg2+ del carbonile di C2 del RuBP e di riduzione del pKa del C3 e del carbammato che accetta H+ di C3. La conformazione del sito attivo favorisce l’intermedio enediolo / carbanione e assiste la reazione.

II° TAPPA: Carbossilazione e idratazione ovvero addizione di una CO2 e di un H2O sul RuBP in forma enolica

Il Mg2+ stabilizza il 2, 3 enediolo coordinandone i gruppi idrossilici. Il Mg2+ coordina anche un O della CO2 che deve essere legata: in tal modo la CO2 viene mantenuta in una posizione favorevole per la reazione di attacco elettrofilo con il C2 del RuBP enediolo che nel frattempo è divenuto un nucleofilo: la CO2 è un elettrofilo ed il C2 dell’enediolo è ricco di elettroni! Il C2 della forma chetonica lo sarebbe stato molto meno! Quando l’enzima è chiuso sull’intermedio, solo piccole molecole come CO2 e O2 possono raggiungere l’enediolo. Avviene poi la reazione di addizione di H2O che produce la forma idratata dell’intermedio a 6 atomi di C 2'-carbossi, 3-cheto arabinitolo 1,5-bisfosfato: instabile!

III° TAPPA: Rottura del legame C-C ovvero produzione delle due molecole di PGA

Una volta che la carbossilazione e l’idratazione dei prodotti è avvenuta, l’intermedio carbossilato instabile si divide in due molecole (il legame fra il C2 ed il C3 è molto destabilizzato!).

La prima molecola di 3-fosfoglicerato (PGA) originatasi dalla metà inferiore dell’intermedio può ora essere rilasciata. La rottura del legame C2-C3 è il segnale per il sito attivo di aprirsi. I tre C superiori sono nella forma di carbanione che deve essere protonato per generare il secondo PGA. Il rilascio della seconda molecola lascia il sito aperto e disposto a legare un altro substrato.

ATTIVAZIONE, REGOLAZIONE ed INIBIZIONE della RUBISCO Attivazione: Per funzionare, la Rubisco deve essere convertita nella sua forma attiva. Deve quindi avvenire la carbamilazione della Lys, il carbammato poi coordina il Mg2+ ed il sito catalitico si attiva.

La carbamilazione e la decarbamilazione sono rapide e spontanee. L’attivazione della Rubisco implica un cambiamento conformazionale di L stabilizzato dal Mg2+. In questa forma, la Rubisco può legare il RuBP in modo tale da catalizzare la carbossilazione (o ossigenazione). La forma non carbamilata è inattiva, lega saldamente il RuBP senza poterlo processare.

La carbamilazione ed il legame con il Mg2+ sono favoriti dalla LUCE. E

H+

lys NH3+

E

CO2

H+

lys H+

NH2

E

Mg2+

lys H+

Durante la carbamilazione vengono liberati 2 H+!

NH

E lys

Mg2+

COO-

Come può questo tipo di reazione di attivazione della Rubisco “accoppiarsi” con le variazioni luce dipendenti del pH dello stroma del cloroplasto?

NH COOMg2+

….è sempre qualcosa del tipo “legge dell’azione di massa” che guida qualunque reazione, quelle dei sistemi biologici comprese! L’attivazione prevede liberazione di H+, sarà quindi stimolata da un aumento del pH stromatico che avviene proprio di giorno durante il trasporto fotosintetico degli e-. Inoltre, la [Mg2+] aumenta nello stroma proprio durante la fase luminosa per il bilanciamento di carica: la formazione del complesso attivo con il Mg2+ è quindi favorita di giorno. La Rubisco viene attivata durante il giorno proprio quando sono disponibili NADPH e ATP per il ciclo di Calvin………. Ma quale fase oscura?

Se la Rubisco non è carbamilata, lega saldamente il RuBP e non lo processa → notte. In tali condizioni, quando l’enzima dovrebbe cominciare a lavorare (all’alba!), la carbamilazione non potrebbe avvenire. Per essere attivata, la Rubisco richiede l’intervento dell’enzima RUBISCO ATTIVASI: ATTIVASI la RA promuove la carbamilazione della Lys, il carbammato poi coordina il Mg2+ ed il sito catalitico si attiva. La Rubisco Attivasi lavora permettendo il rilascio del RuBP dalla forma inattiva della Rubisco promuovendo in tal modo la carbamilazione dell’enzima libero. La RA per funzionare ha bisogno di ATP….. NOTTE: basso NADPH basso ATP basso Mg2+ Normale pH GIORNO: Trasporto degli ealto NADPH alto ATP alto Mg2+ alto pH

RUBISCO ATTIVASI inattiva, non vi è ATP disponibile RUBISCO inattiva non è favorita la carbamilazione, quindi legame a RuBP inattivante

La RUBISCO ATTIVASI può cominciare a lavorare…….

Schema per la conversione della Rubisco dalla forma inattiva a quella attiva grazie alla rubisco attivasi che prevede l’unfolding di alcune regioni a loop della rubisco.

Una domanda….. Ma perché di notte la Rubisco non è bene che funzioni? Di notte non sono disponibili NADPH e ATP per la riduzione del carbonio fissato, il ciclo di Calvin quindi non procederebbe e si accumulerebbe PGA…..che è tossico (è un acido e sarebbe anche osmoticamente attivo!)

Rubisco Attivasi ATP

ATP

Interazione, idrolisi ATP e cambiamenti conformazionali

ADP + P

ADP + P

RuBP RuBP

RuBP RuBP

RuBP

Rubisco inattiva

L’attività della rubisco è strettamente connessa con la presenza della luce. Ma quale fase oscura?

CO2-

-CO2

RuBP Carbamilazione, Rubisco attiva alto Mg2+ e alto pH Viene favorita la carbamilazione e quindi l’attivazione

RIDUZIONE DEL CARBONIO La reazione di fissazione della CO2 ha prodotto due molecole di 3-fosfoglicerato, ma questo composto è solo un acido organico e non presenta la tipica funzione aldeidica (o chetonica) degli zuccheri dove il carbonio si trova in forma ridotta (energia!). Quindi il passo successivo per la formazione degli zuccheri è la riduzione di tale molecola al carboidrato corrispondente, che è alla gliceraldeide-3-fosfato. RIDUZIONE DEL 3PGA: 1) Attivazione del 3PGA tramite fosforilazione Destabilizzazione della molecola e consumo di ATP

2) Riduzione dell’1-3PGA a G3P: energia luminosa → energia chimica stabile Utilizzo di NADPH, liberazione di un P, da ac. carbossilico ad aldeide!!

Il primo zucchero formato!

La G3P entra adesso nel Ciclo di Calvin per rigenerare l’accettore della CO2, cioè il RuBP….. Ci deve però anche essere un guadagno in termini di zuccheri, quindi: RuBP più precisamente, ogni tre molecole di RuBP che vengono carbossilate (3C5 + 3CO2) e poi ridotte, si formano sei molecole di G3P (6C3), di queste, cinque entrano nel CICLO DI CALVIN (5C3) per permettere la rigenerazione del RuBP (3C5) e quindi il procedere stesso delle reazioni di fissazione e riduzione del carbonio, mentre una (1C3) rappresenta il guadagno in carbonio ridotto della fotosintesi stessa.

3C5 + 3CO2 → 6C3 → 3C5 + 1C3

Regolette per “ricostruire” il Ciclo di Calvin Primo: gli zuccheri possono esistere nella forma aldeidica o nella forma carbonilica (= chetoni) → poliidrossialdeidi o poliidrossichetoni. Esempio: zucchero a 5 atomi di carbonio

aldeide

chetone

Regola della U: Generalmente, quando si trova una U come 2a vocale, lo zucchero è un chetone. Eccezione: fruttosio, diidrossiacetone

Ribosio

Isomeri strutturali

Ribulosio

Poliidrossi → caratteristica delle molecole è la presenza di numerosi gruppi -OH (idrossido, funzione “dolce”). La loro posizione (a destra o a sinistra) genera gli isomeri ottici detti anche epimeri. epimeri In pratica vi è un gruppo -OH per ogni atomo di C, infatti Cn(H2O)n= (CARBO-IDRATI) !

Molecole RoS

Xilulosio

Ribulosio Epimeri o Isomeri ottici

Molecole chirali, “speculari”: un atomo di C asimmetrico con 4 sostituenti diversi.

Secondo: Reazione di condensazione aldolica → addizione di uno ione enolato alle aldeidi e chetoni. Questa reazione avviene solo con aldeidi che hanno idrogeni in posizione α. Il carbonio del gruppo aldeidico, richiamando elettroni dal gruppo alchilico adiacente, rende infatti mobile (debolmente acido) un H di questo gruppo. La mobilità degli idrogeni in α è favorita dall'ambiente alcalino. Inoltre, il carbanione corrispondente è stabilizzato per risonanza:

H+

H+ Carbanione

Carbonio α

Questo carbanione può reagire con un'altra molecola di aldeide (o chetone) attraverso un attacco nucleofilo del suo carbonio α al carbonio aldeidico dell'aldeide (o carbonilico nel caso di un chetone) in quanto povero di elettroni: si formano prima lo ione alcossido e poi per protonazione l’aldolo.

Sebbene la condensazione aldolica sia perfettamente reversibile, l'equilibrio della reazione è fortemente spostato a destra, poiché l'acqua è un acido più forte dell'aldolo e lo ione alcossido è una base più forte di OH-.

Il Ciclo di Calvin sfrutta reazioni di questo genere per unire zuccheri oppure spostare frammenti a 2 atomi di carbonio fra uno zucchero ed un altro. Tutto questo al fine di: rimaneggiare i carboni presenti in 5 molecole di gliceraldeide3P (= 15 C) in 3 molecole di ribulosio3P (= 15 C) per rigenerare l’accettore iniziale della CO2 e permettere al Ciclo di Calvin stesso di procedere.

Terzo:

Gli enzimi del Ciclo di Calvin ALDOLASI: Attraverso la reazione di condensazione aldolica, condensano un C3 aldeide o chetone su un’altra molecola di zucchero, rispettivamente chetone o aldeide. Lo zucchero che si forma è in genere un chetone. Adeide + Chetone = Chetone!

TRANSCHETOLASI: spostano un frammento C2 da uno zucchero ad un altro. Più precisamente, questi enzimi fanno una condensazione aldolica sui generis, spostando un C2 da un chetone e condensandolo su una aldeide (con una precisa stereochimica R o S), lasciando come aldeide lo zucchero donatore e come chetone il ricevente. Nelle reazioni catalizzate da aldolasi e transchetolasi reagiscono sempre una aldeide ed un chetone per formare sempre come prodotti una aldeide ed un chetone con un differente numero di C. Nel caso specifico delle aldolasi si forma sempre un chetone con un numero di C pari alla somma dei reagenti.

FOSFATASI: i prodotti della condensazione aldolica operata dalle aldolasi formano sempre zuccheri con 2 gruppi fosfato uno in prima ed uno in ultima posizione derivanti dai gruppi P dei reagenti stessi (per altro in tal modo attivati: zuccheriP). Uno zucchero con un P legato al C in C1 non può essere riconosciuto da aldolasi e transchetolasi e quindi non può essere “rimaneggiato”. E’ necessaria la defosforilazione del C1 con idrolisi del legame estere del P per permettere allo zucchero di avere l’estremità libera per l’azione degli enzimi ed al ciclo di continuare. Quindi, dopo ogni condensazione aldolica segue sempre una defosforilazione.

CHINASI: fosforilano il substrato a spese di ATP (legame estere!)

EPIMERASI: cambiano la chiralità delle molecole: R o S.

ISOMERASI: cambiano la funzione delle molecole: aldeide o chetone Con tutte queste regole e con tali enzimi, i passi del Ciclo di Calvin diventano “obbligatori”!

Partenza del Ciclo di Calvin: 5C3 sotto forma di G3P da “rimaneggiare” fra loro. ♣ Per poter unire due zuccheri (reazione di condensazione aldolica) vi è bisogno di un chetone e di un’aldeide, allora isomerizzazione della G3P a DHAP attraverso una opportuna isomerasi:

♣ Il passo successivo non può che essere la condensazione aldolica dei due C3: G3P + DHAP → F1-6BP

ALDOLASI

♣ Si forma così il fruttosio 1-6 bisfosfato (chetone!), che deve essere “liberato”: F1-6BP → F6P + P

FOSFATASI

♣ Il fruttosio (chetone) può cedere un C2 ad una aldeide: F6P + G3P → E4P + XIL5P

TRANSCHETOLASI

♣ Si formano una aldeide C4 (eritrosio 4P) ed un chetone C5 (xilulosio 5P). Quest’ultimo è un epimero del ribulosio: è già stato ricostruito un C5. XIL5P → RuB5P

EPIMERASI

♣ Ripartendo dall’E4P, la reazione successiva non può che essere una condensazione aldolica con un chetone E4P + DHAP → SED1-7BP

ALDOLASI

sed = sedum

♣ Si forma il sedeptulosio 1-7BP (chetone), che a sua volta deve essere “liberato” SED1-7BP → SED7P + P

FOSFATASI

♣ Il SED7P (chetone) può cedere un C2 ad una aldeide formando una aldeide ed un chetone S7P + G3P → RIB5P + XIL5P

TRANSCHETOLASI

♣ Lo xilulosio segue la stessa epimerizzazione di prima, mentre il ribosio va incontro ad una isomerizzazione strutturale da aldeide a chetone RIB5P → RuB5P

ISOMERASI

♣ L’ultima tappa è la fosforilazione in C1 per ricreare l’accettore attivato della CO2 e chiudere il ciclo (spesa di ATP) RUB5P + ATP → RuB1-5BP + ADP

CHINASI

SCHEMA DEL CICLO DI CALVIN

SCHEMA DEL CICLO DI CALVIN

Tre molecole di ribulosio 1.5 P generano il guadagno di una molecola di aldeide 3 P glicerica

Riassumendo…..

1) Fissazione

3) Rigenerazione

Spesa energetica:

2) Riduzione

guadagno

Per ogni molecola di CO2 fissata 3ATP e 2NADPH (dalla fase luminosa!!!)

REGOLAZIONE DEL CICLO DI CALVIN

Diversi fattori concorrono alla regolazione dell’attività degli enzimi del Ciclo di Calvin. Calvin

I) Movimenti ionici dipendenti dalla luce Durante la fase luminosa: H+ dentro i tilacoidi e Mg2+ (e K+) fuori

- Mg2+ e Rubisco: stabilizzazione del carbammato e costituzione del sito attivo - Da pH 7 a pH 8: attivazione della Rubisco per carbamilazione oltre ad attività ottimale di enzimi tipo F1-6BP e fosforibulochinasi

II) Disponibilità di ATP e attivazione della Rubisco Attivasi - Solo durante il giorno è disponibile ATP (dalla fase luminosa) e quindi solo durate tale condizione la Rubisco Attivasi può lavorare e attivare la Rubisco stessa.

Abbiamo già precedentemente osservato che il SITO CATALITICO della Rubisco è organizzato attorno ad

uno ione Mg2+ (verde) coordinato da 3 aminoacidi fra cui una

lisina carbamilata (cioè con una CO2 legata all’NH2 terminale, nella figura è in basso, mentre la CO2 in alto è quella già legata allo zucchero bisfosfato). Il carbammato viene stabilizzato dal Mg2+

stesso.

Reazione di carbamilazione:

-CH2-NH2 + CO2 → -CH2-NH-CO-OH OH E – lys – N – C H

O

Folding adeguato per la forma attiva dell’enzima: carbamilazione + Mg2+ (anche Rubisco Chaperone)

III) Riduzione dei gruppi –SH dipendente dalla luce Stato di ossidazione delle proteine e loro attività catalitica

ossigeno

- G3P deidrogenasi - F1-6P fosfatasi - S1-7BP fosfatasi - Fosforibulochinasi - ATP sintasi

Nella sequenza degli AA di queste proteine riducente con vi sono due Cys (-SH) vicine e questi enzimi gruppi sulfidrilici sono attivi solo quando tali –SH sono in forma ridotta e non ossidati e legati fra loro con un -S-S-. Come funziona questo sistema?

Durante il giorno, a livello del PSI si ha la riduzione della Ferrodossina, piccola proteina con centri Fe-S che cede poi l’e- all’FNR per la riduzione del NADP+. La Fd può avere anche altri substrati, fra cui l’enzima Ferrodossina:tioredossina reduttasi (con Fe4-S4) che a sua volta può ridurre una particolare proteina detta Tioredossina. La Tioredossina è una piccola proteina solubile con due –SH vicini che può quindi esistere sia in forma ridotta (attiva) che in forma ossidata (inattiva): -Trp-Cys-Gly-Pro-Cyse nella sua forma ridotta riduce gli enzimi del Ciclo di Calvin in questione attivandoli.

Da segnale luminoso a segnale sulfidrilico attraverso l’enzima FD:TRX REDUTTASI

La tioredossina e gli enzimi bersaglio sono poi riossidati, e quindi disattivati, al buio dall’ossigeno.

Quindi, che senso ha parlare di fase oscura??? Il Ciclo di Calvin senza la luce non può procedere: - Rubisco (e gli altri enzimi con pH 8) - Tioredossine - ATP e NADPH Autoregolazione del ciclo di Calvin stesso. perché….

Prevenzione dell’accumulo notturno di 3PGA