3 Y 4.- Leyes De Mendel Y Electroforesis

PRÁCTICAS # 3 y 4 “LEYES DE MENDEL Y ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA PARA VISUALIZAR EL MATERIAL GENÉTICO” OBJETIVOS

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Entender los principios de la transmisión de los caracteres hereditarios y comprobar las leyes de Mendel utilizando Drosophila melanogaster como sistema biológico.

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Identificación de cada uno de los estados del ciclo de vida de Drosophila Melanogaster y sexado de los adultos.

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Entender como el método de Electroforesis por geles de agarosa nos ayuda a visualizar el material genético de los organismos y de esta forma lograr detectar presencia o ausencia de DNA extraños de manera rápida. INTRODUCCIÓN Drosophila es un bioensayo adecuado para el estudio de diferentes áreas de la biología y especialmente de la genética. Debido al amplio conocimiento que se tiene de sus características biológicas y su corto tiempo de generación, fácil mantenimiento en el laboratorio y su capacidad para metabolizar los compuestos químicos en forma similar a los mamíferos, puede ser utilizada para la investigación y la enseñanza de la genética. Para determinar un amplio espectro de eventos genéticos desde nivel molecular hasta el de poblaciones, con Drosophila se realizan pruebas in vivo e in vitro, tanto en células somáticas como germinales. En diferentes especies de este organismo se han obtenido numerosas mutaciones que se utilizan como marcadores que hacen evidentes los mecanismos genéticos que originan los efectos espontáneos o inducidos por diferentes agentes. La experimentación se puede desarrollar utilizando las cepas de laboratorio, o bien moscas de la naturaleza y es posible combinar las condiciones ambientales naturales con las de laboratorio. Características biológicas de Drosophila. Drosophila es un organismo eucarionte, un insecto holometábolo que sufre metamorfosis completa, presenta dimorfismo sexual, habita en los mismos medios que el hombre y se alimenta principalmente de frutos en fermentación. En condiciones de laboratorio a temperatura de 25°C y 60% de humedad relativa, la duración aproximada de los diferentes estados de su ciclo de vida es: Estado Desarrollo embrionario Larva del 1er. Estadío Larva del 2do. Estadío Larva del 3er. Estadío Pre-pupa Pupa Adulto

Tiempo 1 dia 1 día 1 día 2 días 4 horas 4.5 diás 40 a 50 días

El tiempo promedio del ciclo de vida es de 10 días, lo que permite obtener varias generaciones en un año. Por su pequeño tamaño se cultivan en espacios reducidos y a un bajo costo. Ciclo de vida. El desarrollo embrionario que sigue a la fertilización y formación del cigoto tiene lugar dentro de las membranas del huevo. El jebecillo produce una larva que al alimentarse y crecer se transforma en pupa. La pupa a su vez, se transforma en “imago” o adulto. La duración de estos estados varía con la temperatura y tipo de alimento. Los cultivos de Drosophila deben conservarse donde la temperatura no baje de 20 C ni sea mayor de 25 C. la exposición continua de los cultivos a temperaturas superiores a 30 C, puede causar esterilidad o muerte de las moscas; a temperaturas bajas, la viabilidad se reduce y el ciclo de vida se alarga notablemente. Por ejemplo, solo el estado larvario a 10 C requiere de alrededor de 57 días y a 15 C, 18 días. Huevo. El huevo de Drosophila Melanogaster, mide aproximadamente 0.5 mm de longitud, el lado dorsal es más aplanado que el ventral. La membrana externa o corion, es opaca y tiene hexágonos dibujados en su superficie. En la región antedorsal se presenta un par de filamentos que evita que el huevo se hunda en la superficie blanda del alimento donde es depositado. El espermatozoide penetra a través de una pequeña abertura o micrópilo en la saliente cónica del extremo anterior, durante el recorrido que hace el jebecillo dentro del útero. Las divisiones meióticas se realizan inmediatamente después de la penetración del espermatozoide, integrándose el núcleo del óvulo (pronúcleo femenino).

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Posteriormente el núcleo del espermatozoide y el del óvulo se unen para integrar el núcleo del cigoto, que se divide para dar los dos primeros núcleos de segmentación, lo que representa el estado inicial del desarrollo embrionario. Estado larvario. Después de salir del huevo, la larva sufre dos mudas, por lo que el estado larvario tiene tres estadíos. En el último (tercero), alcanza una longitud aproximada de 4.5 mm. Las larvas son tan activas y voraces, que el medio de cultivo en que viven, pronto se ve recorrido por surcos y canales, esto es la señal más evidente de que la nueva generación se está desarrollando con éxito. Las estructuras anatómicas de la larva más importantes para la experimentación en genética son: 1. Las gónadas; están colocadas en los cuerpos grasos laterales de la porción posterior de la larva. Los testículos tienen mayor tamaño que los ovarios, por lo que pueden distinguirse con mayor facilidad a través de la pared transparente del cuerpo. 2. El ganglio cerebral; está formado por tres lóbulos, se localiza en la porción anterior de la larva, puede identificarse con facilidad después de disecar a la larva. 3. Las glándulas salivales, son estructuras que se observan como dos sacos alargados, conectados al aparato mandibular de la larva, sus células presentan cromosomas politénicos o “cromosomas gigantes”, en los que s posible observar los patrones génicos en forma de bandas que se identifican bajo el microscopio con aumentos de 400X a 100X. 4. Los discos imagales de las alas, son estructuras de forma aplanada constituidas por células epiteliales que durante la metamorfosis forman las alas del adulto. Están situados en el tercio anterior de la larva. 5. Los discos imagales de los ojos, son estructuras de forma aplanada constituidas por células epiteliales que durante la metamorfosis forman los ojos del adulto. Están situados en el tercio anterior de la larva. La posibilidad de distinguir el sexo de las larvas permite obtener tejidos de un animal de sexo conocido, que es importante cuando se requieren animales de uno de los dos sexos, como sucede en los experimentos para medir los cambios producidos por algunos tratamientos sobre el cromosoma X que porta el espermatozoide. En tales experimentos, se utilizan larvas hembras, ya que normalmente reciben el cromosoma X paterno. Para esto, es mejor utilizar larvas y no adultos, debido a que las mejores células para el estudio de cromosomas en división proceden del ganglio de la larva y de las glándulas salivales de la larva en su estadío y contienen unos cromosomas enormes (cromosomas politénicos) en los que se pueden reconocer diversas alteraciones y rearreglos cromosómicos. Las células de los discos imagales, se utilizan para estudiar diferentes mecanismos genéticos en células somáticas. Pupación. La pupación ocurre después del tercer estadío larvario. Cuando la larva se está preparando para pupar se retira del medio de cultivo fijándose a una superficie relativamente seca, que puede ser la pared del frasco. Drosophila pupa dentro de la última cubierta larvaria que al principio es blanda y blanquecina, pero luego se hace dura y se obscurece. La pupa mide aproximadamente 5 mm de longitud en este estado, la diferenciación de todas las línes celulares es muy intensa. Al finalizar la metamorfosis dentro del pupario, emerge el imago o adulto rompiendo el extremo anterior de la envoltura puparia. Al principio la mosca es muy alargada, con las alas aún sin extender, que en poco tiempo se extienden y gradualmente el cuerpo toma la forma definitiva. Las moscas adultas son de color relativamente claro después de la emergencia y se obscurecen en las horas siguientes. Identificación del sexo de las moscas adultas. En Drosophila Melanogaster se presentan estructuras sexualessecundarias que permiten distinguir el sexo de los adultos. Característica Hembra Macho Extremo del abdomen Alargado Redondeado Aspecto del abdomen Abultado en la hembra gestante Sin abultamiento Número de segmentos abdominales 7 segmentos visibles al microscopio 5 segmentos visibles al microscopio

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Patas delanteras

No presenta peine sexual

Presenta peine cerdas gruesas)

sexual

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Medios de cultivo para Drosophila Melanogaster. Drosophila Melanogaster puede crecer prácticamente en cualquier medio de fermentación, sobre frutos suaves como la uva, plátano y ciruela, de ahí que la levaduras parecen ser un factor fundamental en su dieta. La fórmula que se utiliza en la mayoría de los laboratorios es la 68-1. Los nutrimentos básicos de sete medio son la harina de maíz, la sacarosa, la dextrosa y la levadura de cerveza; el agar se utiliza para obtener un medio cuya consistencia permita las numerosas manipulaciones que se requieren en las etapas sucesivas del experimento. El Tegosept M (nombre comercial del éster metílico del ácido paramino benzoico) y el ácido propiónico controlan efectibamente la proliferación de hongos y de bacterias, que sin estos agentes microbicidas pueden propagarse hasta impedir el desarrollo normal de las larvas y de los adultos (Félix, 1969). Mutantes de Drosophila Melanogaster. Entre los mutantes más útiles para la enseñanza experimental de la genética se tienen los siguientes: Marcador y Descripción B Bar (1-57.0). Los ojos están reducidos a una barra vertical en el macho y en las hembras homócigas. Las hembras homócigas son muy viables; las heterocigas tienen un número de facetas intermedio entre las homócigas y las silvestres. El carácter se considera como dominante. Tiene buena viabilidad. Bw Brown (2-104.5). Color le los ojos café al emerger, obscureciéndose después hasta granate; los testículos y vasa sin color; los tubos de Malpigio un poco más pálidos que en el tipo silvestre. Los ojos de las dobles combinaciones recesivas: v/v; bw/bw; cn/cn y st/st; bw/bw xon blancos. Cy Curly (2). Asociado con una inversión en el segundo cromosoma. Las alas fuertemente rizadas (abarquilladas), la condición homóciga es generalmente letal. e Ebony (3-70.7). Color del cuerpo negro brillante mucho más obscuro que el del silvestre. Las moscas recién emergidas son de color más claro que las moscas de mayor edad. Para evitar confusiones al separar moscas ebony jóvenes se dejan madurar unas horas o un día para clasificarlas. La viabilidad es aproximadamente igual a 0.8 de la del tipo silvestre. Ey Eyeless (4-0.2). Ojos reducidos generalmente a un cuarto o un medio del área normal del tipo silvestre; sin embargo se presentan varios grados de reducción que pueden diferir en los dos ojos. w White (1-1.5). ojos casi tan blancos como la nieve; ocelos, tubos de Malpigio y cubierta de los testículos incoloros. Se presenta con frecuencia (alrededor de 1 en 300 000 moscas) y tiene numerosos alelos de efecto intermedio entre w y el tipo silvestre. y Yellow (1-0). Color del cuerpo amarillo claro. Cerdas y pelos amarillos en la punta, pelos de alas y venas del mismo color; cerdas de la larva y partes bucales de color variable café, por esta característica el mutante puede ser identificado desde el estado larvario. ELECTROFORESIS El término electroforesis se usa para describir la migración de una partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. Muchas moléculas importantes biológicamente (aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos…) poseen grupos ionizables y existen en solución como especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas se van a separar en función de su carga cuando se aplica un voltaje a través de los electrodos. Existen muchos tipos de electroforesis, que se engloban en dos categorías fundamentales: -Electroforesis de frente móvil. -Electroforesis de zona. Actualmente, sólo se utiliza la electroforesis de zona, en la cual la muestra se desplaza sobre un soporte sólido, como papel de filtro, celulosa o gel (agarosa, acrilamida…) y los componentes de la muestra migran en forma de pequeñas bandas, también llamadas zonas. Electroforesis en gel La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas para separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos basándose en propiedades como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar una espectroscopía de masas, una PCR, una clonación o una secuenciación de ADN.

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La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo, si están cargadas positivamente, y hacia el ánodo, si están cargadas negativamente (en una electroforesis, los electrodos se comportan igual que en una cubeta electrolítica). La segunda parte del nombre, gel se refiere a la matriz usada para separar las moléculas. En muchos casos un gel es un polímero entrelazado de porosidad controlable. Cuando la separación es de proteínas, ADN o ácidos nucleicos pequeños (ADN, ARN o ribonucleótidos), el gel está compuesto por diferentes concentraciones de acrilamida/bisacrilamida y un iniciador de la polimerización, para producir redes de poliacrilamida de diferentes tamaños. Para separar ácidos nucleicos grandes (más de unos centenares de bases), la matriz empleada es agarosa purificada. En ambos casos, el gel forma una matriz sólida pero porosa. La acrilamida, en contraste con la poliacrilamida, es una neurotoxina y debe ser manejada cuidadosamente para evitar envenenamientos. Los materiales más comunes para separar moléculas de ácidos nucleicos son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarán al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema. En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular. Aplicaciones Ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos, no se pueden separar por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). En estos geles, la mobilidad electroforética varía inversamente con la masa molecular. Los fragmentos de ADN de sólo algunos miles de pares de bases, no pueden penetrar el gel de poliacrilamida. Este problema se resuelve utilizando agarosa en vez de poliacrilamida. De esta manera, los plásmidos, que son pequeñas partículas de ADN de bacterias o levaduras, que pueden replicarse autónomamente, pueden por ejemplo, separarse de ADN cromosomal. Revelado y visualización Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los ácidos nucleicos, o la plata, para las proteínas. Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografía. MATERIAL

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Moscas de la fruta: Drosophila melanogaster . Cultivos con huevos, larvas y pupas. Vaso de precipitados 500ml Gasa. Algodón. Agujas de disección. Caja de Petri. Cinta adhesiva.

∼ ∼ ∼ ∼ ∼ ∼

Microscopio estereoscópico. Pipeta Pasteur. Portaobjetos. Cubreobjetos. Toallas de papel Homogenizador

∼

Tubo eppendorf Piseta

∼

REACTIVOS ∼

Éter

∼

Agua destilada. Aceto-orceína.

∼

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∼ ∼ ∼ ∼ ∼

EtOH Bromuro de Etidio Agar Amplisize Agarose (BIO RAD) Buffer de corrimiento Buffer de carga

EQUIPO

∼ ∼ ∼

Centrifuga para tubos eppendorf Cámara de electroforesis Matriz o molde de agarosa

PROCEDIMIENTO Parte 1: Inmovilización de las moscas.  Para poder examinar a las moscas, es necesario inmovilizarlas utilizando éter.  Para inmovilizar un conjunto de moscas bastan unas gotas de éter y se pueden mantener en este estado durante más de 30 minutos reeterizándolas a intervalos regulares. Se puede hacer un eterizador utilizando un frasco con tapa, con la boca del mismo diámetro que los frascos de cultivo en la parte interior de la trapa se pega un pedazo de algodón con cinta adhesiva, colocándolo de manera que pueda cerrarse el frasco. Cuando se requiere anestesiar a las moscas se ponen unas gotas de éter en el algodón, se pasan las moscas sacudiendo (sin separar los frascos) el frasco de cultivo al eterizador. Inmediatamente se coloca la tapa con el algodón impregnado con el éter; las moscas se inmovilizarán en unos cuantos segundos, NO PROLONGAR EL TIEMPO DE ANESTESIA, PORQUE LAS MOSCAS PUDEN MORIR. Para examinarlas se sacan del eterizador, que se cierra para evitar que se evapore el éter. Parte 2: Desarrollo:

1.

Colocar las moscas anestesiadas sobre una tarjeta blanca y observarlas al microscopio estereoscópico. Identificar las características sexuales secundarias de hembras y machos, así como los fenotipos mutantes. Reesterizar si es necesario. 2. Se proporcionará a los alumnos cultivos con huevos y larvas. Los observará al microscopio estereoscópico, colocándolos en una gota de agua sobre un portaobjetos y tratará de identificar las estructuras mencionadas e ilustradas en esquemas proporcionados previamente. 3. Observación de las pupas. A través de la pared del frasco y en las pupas que saquen de los cultivos se observarán las estructuras mencionadas e ilustradas en esquemas proporcionados previamente. 4. Observación y sexado de los adultos Parte 3: Extracción de DNA de drosophila y restricción con enzimas para observar patrones en las poblaciones. 1. Macerar de 5 a 10 moscas de un mismo fenotipo, en una solución de DNAzol (reactivo para la extracción del DNA) con la ayuda de un homogenizador eléctrico 2. Guardar esta mezcla a 4ºC hasta la siguiente práctica. Parte 4: Electroforesis en gel de agarosa para la visualizar el material genético

1.

2.

Preparar 10 ml de EtOH al 75% y 100 ml de agarosa al 10 % (añadiéndole 10 ml de Bromuro de Etidio) Precaución: El bromuro de etilo es un carcinógeno y debe manejarse con cuidado. Hay que evitar que se derrame la disolución o tener contacto directo con esta. La punta que contiene bromuro de etidio debe ser descartada en un recipiente especial para descartar material contaminado con bromuro de etidio Preparar la cámara de electroforesis:

a) b) c) d) e) f) g)

Disolver la agarosa en 30 ml de amortiguador TBE 0.5x. Calentar por 45s, luego se agita con movimientos circulares hasta que se disuelvan todas las partículas de agarosa translúcidas. Se debe tener precaución con los recipientes calientes ya que pueden causar quemaduras. El soporte para “chorrear” el gel debe estar limpio y seco, se ajusta en el molde portagel o tabla niveladora y se colocan los peines que generarán los pozos para aplicar las muestras Cuando la agarosa alcanza los 50–60 °C aproximadamente se vierte en el centro de la bandeja para gel evitando la formación de burbujas. Se deja reposar, el gel tarda de 20–40 minutos para solidificar a temperatura ambiente. Una vez solidificado el gel se quitan los peines, sujetándolo con ambas manos y jalando cuidadosamente hacia arriba. Posteriormente se traslada el soporte para el gel hasta la cámara de electroforesis, colocando los

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h)

pozos mas cercanos al borde hacia el polo negativo (de color negro) debido a que las muestras migrarán hacia el ánodo (de color rojo) durante la electroforesis Se agrega TBE hasta sumergir el gel unos 2 a 6 mm.

3. centrifugar el material conservado en DNAzol 4. Separar el sobrenadante en un tubo nuevo 5. Colocar el sobrenadante en un tubo eppendorf y añadir EtOH 75% (Vol/Vol) 6. Centrifugar y decantar el sobrenadante 7. Hidratar con agua destilada 8. Colocar 5 ml de muestra y 5 ml de colorante en cámara de electroforesis 9. Hacer pasar a 100 Volts el gel 10. Se observa en la cámara de UV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS LEYES DE MENDEL

  

Total de moscas adultas: 30 [Total de machos: 25 (83.33%); Total de hembras: 5 (16.67%)] Total de pupas: 30 Total de prepupas: 50

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   

Total de larva de tercer estadío: 72 Total de larva de segundo estadío: 25 Total de larva de primer estadío: 2 Total general: 164

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Observaciones en 8 machos adultos:

 5 segmentos abdominales: 100%  Extremo del abdomen redondeado: 100%  Abdomen sin abultamiento: 100%  Peine sexual (cerdas gruesas): 100%  Ojos rojos: 87.5% (7/8); Ojos marrón: 12.5 (1/8)



Ojos completos (redondeados): 100%  Proporción ojos/cabeza:

∗ ∗ ∗ ∗

60%  (5/8): 62.5% 50%  (1/8): 12.5% 40%  (1/8): 12.5%

35%  (1/8): 12.5%  Alas extendidas: 87.5% (7/8) ∗ Observación al microscopio: en estado adulto



Observaciones en pupas:

En esta fase se observa que ya esta a punteo de formarse en adulto, ya que ya se constituye de la mayoría de las características adultas. En esta etapa no presenta ningún movimiento 

Observaciones en prepupas:

En esta fase el movimiento no lo presenta, ya que se prepara para continuar con su desarrollo a la siguiente fase

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

Observaciones en larvas de 3er estadío:

En esta etapa a un presenta bastante movimiento, en la cual busca adecuarse al medio para continuar con su desarrollo 

Observaciones en larvas de 2do estadio:

Presenta bastante movimiento, esta fue la fase en la que se encontró mas pequeña, ya que no se encontraron larvas en el 1er estadío. 

Observaciones en larvas de 1er estadío:

No se observaron en las larvas estudiadas que estuvieran en el 1er estadío de su desarrollo. Pero aquí se reconoce por que es muy pequeñita la larva y acaba de salir del embrión, para iniciar su proceso de desarrollo. ELECTROFORESIS



Observaciones y discusiones:

∗

Centrifuga para tubos eppendorf :

∗

Tubos eppendorf con la muestra de moscas con DNAzol (el cual contiene solventes orgánicos como el fenol, detergentes iónicos y un amortiguador el cual va a regular el pH del sistema); (el ultimo tubo que se observa es después de las centrifugaciones)

Para visualizar el material genético hay que lisar a las células para lo cual se utilizan detergentes iónicos como el SDS, Tritón, Tween (20), etc.; Al lisar las células el material genético queda libre y por medio de las centrifugaciones se obtienen las partes del lisado. La fuerza centrífuga hace que el soluto adquiera por gravedad las partículas del solvente para que aquello que no sea material genético se precipite. Se recupera el sobrenadante (en los tubos eppendorf) y se pasa al tubo de ensaye al cual se le agrega el etanol para precipitar ya que sustituye las moléculas de agua que rodean al DNA para sacra el agua y se haga visible como una molécula

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deshidratada (puede tener restos de DNAzol y contaminantes por lo cual después dse realiza el lavado con etanol al 75%). Al centrifugar de nuevo se observa un botón blanco el cual se va a hidratar..

∗

Cámara para la electroforesis: se coloca la placa de gel para con las muestras, se utiliza un voltaje de 100V para poder separar las moléculas del DNA (las grandes de las pequeñas) ya que esta técnica se basa en la migración de una molécula en un campo eléctrico.

El gel dentro de la cámara de electroforesis, es un gel de agarosa el cual es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición más homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0,5 a 2%; en este caso al 2% lo cual se refiere a lo que se necesita observar, en este caso pasan moléculas menos grandes como el DNA) poseen la propiedad de permanecer líquidas por encima de aprox. 50ºC y formar un gel, semisólido, al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimericas, embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas de ácido nucleico a su través, en mayor medida cuanto más grandes sean éstas.

Al preparar el gel enfriando la agarosa en el molde especial para la técnica, se dejan en él unos huecos o pocillos para poder introducir luego en ellos la muestra, y que así ésta se vea obligada a introducirse en el seno del gel cuando apliquemos el campo eléctrico.

(Se colocaron una a una cada muestra procesada del ADN de las moscas)

Se colocaron todas las muestras dentro del gel que se encuentra dentro de la solución Buffer con sales debido a que las sales son buenos conductores, se les pasó la corriente con carga (-), de donde se encuentran colocadas las muestras hacia (+). La migración tiene que ver con el tamaño de las moléculas, las más cercanas al polo negativo son las más grandes; a mayor concentración moléculas más pequeñas. La ventaja de la agarosa es que nos permite detectar presencia o ausencia de DNA extraño en el cuerpo.

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(Una vez que se les paso corriente durante 15 minutos se coloca en la cámara de UV)

Se observa el ADN de las moscas, comprobando la presencia de este por la coloración rosa fluorescente con ayuda de la luz UV y al correr (poco debido al escaso tiempo que se adicionó la carga) migraron las moléculas por el tamaño comprobando así que el ADN es una molécula de con carga Neta (-); Como resultado neto, la electroforesis separa los fragmentos de ácido nucleico según su tamaño o longitud, expresado en pares de bases como en el caso de la mosca si son de doble hebra, caso común del DNA para el cual en total la mosca tiene aproximadamente 3000 pares de bases (que en este caso no se cuantifico, pero es un dato teórico). CONCLUSIONES Las moscas Drosophila Melanoganster se utilizan muy comúnmente para el análisis e investigación debido a que se tiene conocimiento de sus características biológicas y su corto tiempo de generación, fácil mantenimiento en el laboratorio y su capacidad para metabolizar los compuestos químicos en forma similar a los mamíferos. En este caso se observaron mocas en las diferentes etapas de desarrollo, diferenciándolas una de la otra y de esta misma manera realizando el sexado entre las especies adultas y así mismo las diferencias observables al microscopio entre ellas. Para su posterior estudio se extrajo su ADN para poder observar su presencia y corrimiento por medio de la técnica de electroforesis en agarosa la cual permite separar moléculas de DNA, cuando éstas son sometidas a un campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula. Primero, la fuerza eléctrica atrae en DNA hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la partícula. En teoría dado que la fuerza impulsora es proporcional a la carga eléctrica, el parámetro que rige el avance (aceleración = fuerza/masa) de la electroforesis es realmente la relación carga/masa. Para un ácido nucleico, la carga eléctrica es proporcional a la longitud en nucleótidos, por lo que la relación q/m es la misma para todas las moléculas. Sin embargo, el efecto de retardo debido al gel depende del tamaño molecular. Como resultado neto, la electroforesis separa los fragmentos de ácido nucleico según su tamaño o longitud, expresado en nucleótidos (si son de hebra sencilla) o en pares de bases (si son de doble hebra, caso común del DNA). Es, por ello, posible establecer una curva de calibrado que relacione la movilidad con la longitud en pb. Para conseguir una recta se suele representar tamaño frente a 1/movilidad o log(tamaño) frente a movilidad, sin embargo esto solo se realizó cualitativamente ya que no se cuantificó la movilidad del ADN a través de la placa de agarosa, solo se observó cualitativamente al observar la coloración del medio. REFERENCIAS  M. Demerec y B. P. Kaufmann. 1975 (Traducción: R. Félix Estrada) Instituto Nacional de Energía Nuclear División de Aplicaciones. Departamento de Genética y Radiobiología. México.

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