3.- Obtencion De Emulsina

PRÁCTICA # 3 “OBTENCIÓN DE EMULSINA” OBJETIVOS 

Obtener una enzima, la emulsina, a partir de almendras dulces.

INTRODUCCIÓN El nombre proteína proviene de la palabra griega proteios, que significa lo primero. Las proteínas constituyen gran parte del cuerpo animal: lo mantienen como unidad y lo hacen funcionar. Se las encuentra en toda la célula viva. Son el material principal de la piel, los músculos, tendones, nervios y la sangre, enzimas, anticuerpos y muchas hormonas. (Sólo los ácidos nucleicos que controlan la herencia pueden desafiar la posición de las proteínas, además aquellos desafían la síntesis de estas.) Desde un punto de vista químico las proteínas son polímeros grandes. Son poliamidas, y los monómeros de los cuáles se derivan los ácidos α-aminocarboxílicos. Una sola molécula proteínica contiene cientos, e incluso miles de unidades de aminoácidos, que pueden ser de unos 20 tipos diferentes. El número de moléculas proteínicas diferentes que pueden existir es casi infinito. Las proteínas son compuestos a base de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y generalmente azufre y fósforo. El elemento característico es el nitrógeno. Todas las enzimas, algunas hormonas y muchos componentes estructurales importantes de la célula son proteínas. Las moléculas de proteína son muy grandes y contienen miles de átomos; su estructura es extremadamente compleja. Gran parte de las proteínas intracelulares son enzimas, sustancias que regulan la rapidez con que se han de tener numerosas reacciones celulares. Las moléculas de proteína están formadas por componentes más simples llamados aminoácidos. Puesto que cada proteína puede tener cientos de aminoácidos combinados en ciertas proporciones y orden es posible una variedad prácticamente infinita de moléculas de proteína. Se han ideado métodos de análisis para reconocer la disposición exacta de aminoácidos en una molécula proteínica. ESTRUCTURAS DE LAS PROTEÍNAS: Pueden distinguirse varios niveles de organización en la molécula de proteína. El primer nivel es la llamada estructura primaria, que depende de la serie de aminoácidos en la cadena de polipéptidos. Esta serie, está determinada a su vez, por la serie de nucleótidos de RNA y DNA del núcleo de la célula. Un segundo nivel de organización de las moléculas proteínicas supone la adopción de la forma de hélice u otra configuración regular por la cadena de polipéptidos. Estas cadenas ordinariamente no se encuentran planas en una molécula de proteína, sino que adoptan formas espiralazas para dar una estructura tridimensional. Una de las estructuras secundarias comunes de las moléculas proteínicas es el hélice en α, que se supone una formación espiralaza de la cadena de polipéptidos básica. La hélice en α es una estructura geométrica muy uniforme con 3.6 aminoácidos que ocupan cada vuelta de la hélice. La estructura helicoidal es determinada y mantenida por la formación de enlaces de hidrógeno entre residuos de aminoácidos en vueltas sucesivas de espiral. Un tercer nivel de estructura de moléculas proteínicas es el desdoblamiento de la cadena de péptidos sobre sí misma para formar proteínas globulares. De nuevo enlaces débiles como enlaces de hidrógeno, iónicos e hidrofóbicos se forman entre una parte de la cadena de péptidos y la otra parte, de modo que la cadena se desdobla de una manera específica para dar una estructura general específica de la molécula proteínica. Enlaces covalentes como los de disulfuro (-S-S-) son importantes en la estructura terciaria de muchas proteínas. La actividad biológica de una proteína depende en gran parte de la estructura primaria específica que es mantenida junta por esos enlaces. Cuando una proteína se calienta o trata con cualquiera de una variedad de productos químicos, se pierde la estructura terciaria. Las cadenas de péptidos espiralazas se desdoblan para dar una configuración aleatoria acompañada por una pérdida de la actividad biológica de la proteína. Este cambio se llama “desnaturalización”. Los 20 aminoácidos aminados que suelen encontrarse en las proteínas poseen todos un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxílico (-COOH), pero sus cadenas laterales son distintas. El mas simple de todos, la glicina, tiene como cadena lateral un H; la alanita, un grupo –CH3. El grupo amino permite al aminoácido aminado actuar como base y combinarse con ácidos; el grupo ácido, le permite combinarse con las bases.

Los aminoácidos y las proteínas sirven de amortiguadores y pueden resistir a cambios de acidez y alcalinidad. Los aminoácidos se unen entre sí para formar proteínas mediante un enlace peptídico entre el grupo amino de una molécula y el grupo carboxilo de la otra. Los aminoácidos puros obtenidos de las proteínas tienen sabor dulce. Cuando se ingieren proteínas son hidrolizadas a aminoácidos antes de ser absorbidas a la corriente sanguínea. Los aminoácidos son llevados a todas las regiones del organismo, donde sirven para la elaboración de nuevas proteínas, o son metabolizados para liberar energía. Las proteínas tienen importancia primordial como componentes estructurales de las células y como constituyentes funcionales de enzimas y algunas hormonas, pero pueden servir también como combustible para producción de energía. Los aminoácidos pierden primero su grupo amino por una reacción enzimática llamada desaminación. El grupo amino reacciona con otras sustancias para formar urea, que se excreta. El resto de la molécula puede transformarse por una serie de fases intermedias en glucosa, que se utiliza pronto como combustible, o almacenarse como glucógeno. Las plantas pueden sintetizar todos los aminoácidos a partir de sustancias simples. Los aminoácidos que los animales no pueden sintetizar y que deben obtener en su alimentación se llaman aminoácidos esenciales. Debe comprenderse que estos aminoácidos no son más esenciales que otros; sólo lo son respecto a la alimentación, pues no es posible sintetizarlos. PEPTIDOS Los péptidos son un tipo de moléculas formadas por la unión de varios aminoácidos mediante enlaces peptídicos. Los péptidos, al igual que las proteínas, están presentes en la naturaleza y son responsables de un gran número de funciones, muchas de las cuales todavía no se conocen. La unión de un bajo número de aminoácidos da lugar a un péptido: Oligopéptido: Número de aminoácidos < 10. Polipéptido : Número de aminoácidos > 10. Proteína: número de aminoácidos > 100. Los péptidos se diferencian de las proteínas en que son más pequeños (tienen menos de diez mil o doce mil Daltons) y que las proteínas pueden estár formadas por la únión de varios polipéptidos y a veces grupos prostéticos. Un ejemplo de polipéptido es la insulina la cual se compone de 55 aminoácidos y se conoce como una hormona´de acuerdo a la función que tiene en el organismo de los seres humanos. En cuanto a las reacciones del grupo amino, es muy interesante la reacción con el reactivo de Sanger para secuenciar, ya que si tenemos el 2,4-dinitrofenil-péptido y lo hidrolizamos por hidrólisis ácida, se hidrolizarán todos los enlaces peptídicos y obtendremos el dinitrofenil del primer aminoácido de la secuencia, el NH2 terminal, más el resto de los aminoácidos disgregados en el medio. Con esta reacción Sanger consiguió secuenciar la insulina. En esta reacción, el núcleo coloreado de dinitrobenceno se une al átomo de nitrógeno del aminoácido para producir un derivado amarillo, el derivado 2,4-dinitrofenil o DNP-aminoácido. El compuesto DNFB reaccionara con el grupo amino libre del extremo amino de un polipéptido, así como también con los grupos amino de los aminoácidos libres. El enlace C – N que se forma es por lo general mucho más estable que un enlace peptídico. De esta forma, haciendo reaccionar una proteína nativa o un polipéptido intacto con el DNFB, hidrolizando la proteína en acido y aislando los DNP-aminoácidos coloreados, puede identificarse el grupo amino terminal del aminoácido en una cadena polipeptídica. El grupo amino-terminal de la lisina y algunos otros grupos funcionales de las cadenas laterales también reaccionaran con el DNFB. Sin embargo, después de la hidrólisis, solo el derivado del grupo amino terminal del aminoácido original tendrá su grupo α-amino bloqueado; asimismo, tales DNP-α-aminoácidos pueden separarse de otros derivados DNP mediante procedimientos de extracción simples. Con cualquiera de los variados métodos cromatograficos se podrá identificar a los DNP-α-aminoácidos

Pero este proceso consume mucha energía, ya que, teniendo el primer aminoácido hay que obtener los demás rompiendo por otras zonas. Esto se evita con el procedimiento de Edman (también es una reacción de aminoácidos): Como la ciclación se da en condiciones ácidas suaves, no se rompen los enlaces, y se da la feniltiohidantoína del aminoácido NH2-terminal + el resto del péptido intacto.

2

Se separan ambos compuestos y por cromatografía se detecta. Con el resto del péptido se sigue con el mismo procedimiento hasta tener la secuencia completa. Éste método se conoce como Degradación de Edman, y es la reacción que usan los secuenciadores automáticos de proteínas. Pero estos secuenciadores sólo pueden secuenciar los 20-30 primeros aminoácidos, por lo que tendremos que hidrolizar y seguír después. Esto es porque el rendimiento no es del 100% y perdemos péptido poco a poco, y al final no nos queda. Sólo las enzimas consiguen un rendimiento al 100%. Reacciones del grupo carboxilo También podemos secuenciar empezando por el extremo carboxilo-terminal, para lo que se usan enzimas como la carboxipeptidasa. Es una proteasa que hidroliza los enlaces peptídicos. Ésta en concreto es una exoproteasa (ataca a la proteína por un extremo) que ataca al extremo carboxilo-terminal. Se emplean 2 tipos, la carboxipeptidasa A y B. Catalizan la misma reacción, pero tienen especificidad distinta. La A sólo rompe el enlace peptídico si el aminoácido carboxilo-terminal es hidrofóbico. La B lo rompe si es básico. Hay que controlar muy bien el tiempo de reacción, ya que cuando se libera un carboxilo-terminal el siguiente aminoácido se convierte en el carboxilo-terminal. Reacciones de los grupos R Respecto a las reacciones de los grupos R, existen muchos reactivos que reaccionan de forma específica con determinados grupos R (OH de la serina, tiol de la cisteína...). Esto se usa para ver qué aminoácido es esencial para el funcionamiento de la proteína. Dentro de las reacciones de ls grupos R, una interesante desde el punto de vista de aislamiento y purificaciñon de proteínas es la del grupo tiólico (SH) de la cisteína, que es fuertemente reductor. En presencia de O2 tiene mucha tendencia a oxidarse. Si hay dos moléculas de cisteína; en presencia de oxígeno, se oxidan para originar una molécula de cistina:

Esto ocurre frecuentemente en una proteína, cuando se pliega y dos moléculas de cisteína quedan próximas en el espacio, generando un puente disulfuro. El puente disulfuro ocurre de forma natura, y debe formarse para estabilizar la estructura tridimensional de la proteína. Sin embargo, puede que no deba ocurrir de forma natural, por ejemplo, si hay cisteínas esenciales expuestas (necesarias para la funcionalidad). Cuando aislamos una proteína de su entorno natural, ponemos a la proteína en presencia de oxígeno, con lo que esos grupos tiólicos se pueden oxidar, y la proteína perder su funcionalidad. Para evitar esto, en los medios de aislamiento y purificación de proteínas añadimos β-mercapto-etanol, cuyo grupo tiólico es más reductor que el de la propia cisteína; tiene más tendencia a oxidarse.

De modo que al añadir β-mercapto-etanol, éste se oxida y protege así los grupos tiólicos de la cisteína. Cuando queremos estudiar la composición de aminoácidos de una proteína tenemos que hidrolizarla completamente, con lo que tenemos una mezcla de todo el conjunto de aminoácidos libres que consituyen dicha proteína. Para evitar, en toda esta manipulación, que las Cys que tengamos en el medio se oxiden, tenemos que proteger su grupo tiólico añadiendo como reactivo iodoacetato:

Así transformamos la cisteína en carboximetilcisteína.

3

PROTEINAS El nombre proteína proviene de la palabra griega πρώτα ("prota"), que significa "lo primero". Este nombre está bien elegido. Entre todos los compuestos químicos, ciertamente hay que considerar a las proteínas como las más importantes, puesto que son las sustancias de la vida. Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos. En los vertebrados, las proteínas son los compuestos orgánicos más abundantes, pues representan alrededor del 50% del peso seco de los tejidos. Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia y/o actividad de este tipo de sustancias. Bastan algunos ejemplos para dar idea de la variedad y trascendencia de funciones a ellas asignadas. Son proteínas casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en organismos vivientes; muchas hormonas, reguladores de actividades celulares; la hemoglobina y otras moléculas con funciones de transporte en la sangre; anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra infecciones o agentes extraños; los receptores de las células, a los cuales se fijan moléculas capaces de desencadenar una respuesta determinada; la actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del músculo durante la contracción; el colágeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de sostén. Las proteínas son macromoléculas formadas por aminoácidos Las proteínas son moléculas de enorme tamaño; pertenecen a la categoría de macromoléculas, constituidas por gran número de unidades estructurales. Entre otros términos, se trata de polímeros. Debido a su gran tamaño, cuando estas moléculas se dispersan en un solvente adecuado, forman obligatoriamente soluciones coloidales, con características que las distinguen de las soluciones de moléculas más pequeñas. Por hidrólisis, las moléculas proteínicas son escindidas en numerosos compuestos relativamente simples, de pequeño peso, que son las unidades fundamentales constituyentes de la macromolécula. Estas unidades son los aminoácidos, de los cuales existen veinte especies diferentes y se unen entre sí mediante enlaces peptídicos. Cientos y miles de estos aminoácidos pueden participar en la formación de la gran molécula polimérica de una proteína. Todas las proteínas contienen carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno y casi todas poseen también azufre. Si bien hay ligeras variaciones en diferentes proteínas, el contenido de nitrógeno representa, término medio, 16% de la masa total de la molécula; es decir, cada 6,25g de proteínas contienen 1 g de N. El factor 6,25 se utiliza para estimar la cantidad de proteína existente en una muestra a partir de la medición de N de la misma. La síntesis proteica es un proceso complejo cumplido por las células según las directrices de la información suministrada por los genes. Se suelen clasificar de acuerdo a los siguientes criterios: color, olor y aspecto Según su forma Fibrosas: presentan cadenas polipéptidas largas y una atípica estructura secundaria. Son insolubles en agua y en soluciones acuosas. Algunos ejemplos de estas son la queratina y colágeno Globulares: se caracterizan por doblar sus cadenas en una forma esférica apretada o compacta. La mayoría de las enzimas, anticuerpos, algunas hormonas, proteínas de transporte, son ejemplo de proteínas globulares y también poseen aminoopeptidiosis al 5% para hacer simbiosis. Según su composición química Simples u holoproteínas: su hidrólisis sólo produce aminoácidos. Ejemplos de estas son la insulina y el colágeno (fibrosas y globulares). Conjugadas o heteroproteínas: su hidrólisis produce aminoácidos y otras sustancias no proteicas llamado grupo prostético (sólo globulares) Estructura Artículo principal: Estructura de las proteínas Presentan una disposición característica en condiciones ambientales, si se cambia la presión, temperatura, pH, etc. pierde la conformación y su función. La función depende de la conformación y ésta viene determinada por la secuencia de aminoácidos. Conformaciones o niveles estructurales de la disposición tridimensional: Estructura primaria. Estructura secundaria. Nivel de dominio. Estructura terciaria. Estructura cuaternaria. A partir del nivel de dominio sólo las hay globulares. La Determinación de la Estabilidad proteíca La determinación de la estabilidad proteíca, es un proceso mediante el cual se sabe la resistencia de desnaturalización de una proteína. La desnaturalización es un proceso que sufre la proteína al someterse a determinadas temperaturas y en la cual se pierde su estructura espacial y, por tanto, su función.

4

la estabilidad proteica se usa principalmente en la industria láctea, para saber si una leche puede ser procesada a pasteurización o si sus proteínas no pueden calentarse. Se emplea también en gastronomía, para poder utilizar las proteínas con la seguridad de que no perderán su valor nutritivo al ser calentadas. Para esto es necesario utilizar alcohol al 68% o 68ºGL (es decir, de cada 100gr de solución, sólo 68gr son alcohol). Al diluir alcohol en una muestra del producto, no debe generar grumos de ningún tipo. Si los hay, se dice que la prueba es positiva (+) y se indica que no se puede calentar, si no hay, se dice que es negativa (-) y se puede someter a un tratamiento térmico. Las proteinas son obtenidas desde los ribosomas y también desde el reticulo endoplasmatico rugoso. Las proteinas sintetizadas en los ribosomas son para un estricto funcionamiento interno y la sintetizadas en el RER son empaquetadas en el aparato de golgi para ser usadas en el medio externo y también actuar en la membrana celular, como canales carrier, con diferentes funciones de adhesion, transportadora, receptora, entre otras. Estas proteínas también se pueden unir a oligosacáridos, formando glicoproteinas muy importantes en el reconocimiento celular (con los glicolipidos, las 2 forman el glucocalix) Estas son macromoléculas compuestas por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. La mayoría también contienen azufre y fósforo. Las mismas están formadas por la unión de varios aminoácidos, unidos mediante enlaces peptídicos. El orden y disposición de los aminoácidos en una proteína depende del código genético, ADN, de la persona. Las proteínas constituyen alrededor del 50% del peso seco de los tejidos y no existe proceso biológico alguno que no dependa de la participación de este tipo de sustancias. Las funciones principales de las proteínas son: Ser esenciales para el crecimiento. Las grasas y carbohidratos no las pueden sustituir, por no contener nitrógeno. Proporcionan los aminoácidos esenciales fundamentales para la síntesis tisular. Son materia prima para la formación de los jugos digestivos, hormonas, proteínas plasmáticas, hemoglobina, vitaminas y enzimas. Funcionan como amortiguadores, ayudando a mantener la reacción de diversos medios como el plasma. Actúan como catalizadores biológicos acelerando la velocidad de las reacciones químicas del metabolismo. Son las enzimas. Actúan como transporte de gases como oxígeno y dióxido de carbono en sangre. (hemoglobina). Actúan como defensa, los anticuerpos son proteínas de defensa natural contra infecciones o agentes extraños. Permiten el movimiento celular a través de la miosina y actina (proteínas contráctiles musculares). Resistencia. El colágeno es la principal proteína integrante de los tejidos de sostén. Energéticamente, estas sustancias aportan 4 Kcal por gramo de energía al cuerpo. Las proteínas son clasificables según su estructura química en: Proteínas simples: Producen solo aminoácidos al ser hidrolizados. Albúminas y globulinas: Son solubles en agua y soluciones salinas diluidas (ej.: lactoalbumina de la leche). Glutelinas y prolaninas: Son solubles en ácidos y álcalis, se encuentran en cereales fundamentalmente el trigo. El gluten se forma a partir de una mezcla de gluteninas y gliadinas con agua. Albuminoides: Son insolubles en agua, son fibrosas, incluyen la queratina del cabello, el colágeno del tejido conectivo y la fibrina del coagulo sanguíneo. Proteínas conjugadas: Son las que contienen partes no proteicas. Ej.: nucleoproteínas. Proteínas derivadas: Son producto de la hidrólisis. En el metabolismo, el principal producto final de las proteínas es el amoníaco (NH 3) que luego se convierte en urea (NH2)2CO2 en el hígado y se excreta a través de la orina. Continuación: Proteinas de origen vegetal y de origen animal. Las uniones peptídicas se establecen entre los grupos amino y los carboxilo de otro aminoácidos, formando dipéptidos--> tripéptidos--> tetrapéptidos--> POLIPÉPTIDOS. Cada enlace forma un plano Algunos polipéptidos funcionan per se como hormonas (Insulina y glucagón -->> regulan la glucosa en sangre) o neurotransmisores (colecistoquinina--> sensación de hambre) La estructura primaria viene determinada por la secuencia de aminoácidos en la cadena proteica, es decir, el número de aminoácidos presentes y el orden en que están enlazados. La conformación espacial de una proteína se analiza en términos de estructura secundaria y estructura terciaria. La asociación de varias cadenas polipeptídicas origina un nivel superior de organización, la llamada estructura cuaternaria. Por último, la asociación de proteínas con otros tipos de biomoléculas para formar asociaciones supramoleculares con carácter permanente da lugar a la estructura quinaria. ESTRUCTURA PRIMARIA Las proteínas tiene múltiple niveles de estructura. La básica es la estructura primaria. La estructura primaria de una proteína es simplemente el orden de sus aminoácidos. Por convención el orden de escritura es siempre desde el grupo amino-terminal hasta el carboxilo final. Para encontrar datos sobre las estructura de , por ejemplo la hexoquinasa, navegue hasta Brookhaven Protein Data

5

Bank 3D browser y entre hexokinase para la búsqueda, o SCOP (Structural Classification of Proteins) y use la referencia PDB número 1HKG.

Estructura primaria de la Insulina: consta de dos cadenas de AA enlazadas por puentes disulfuro entre las cisteínas ESTRUCTURA SECUNDARIA La estructura secundaria de una proteína es la que adopta espacialmente. Existen ciertas estructuras repetitivas encontradas en las proteínas que permiten clasificarlas en dos tipos: hélice alfa y lámina beta. Una hélice alfa es una apretada hélice formada por una cadena polipeptídica. La cadena polipetídica principal forma la estructura central, y las cadenas laterales se extienden por fuera de la hélice. El grupo carboxílo (CO) de un aminoácido n se une por puente hidrógeno al grupo amino (NH) de otro aminoácido que está tres residuos mas allá ( n + 4 ). De esta manera cada grupo CO y NH de la estructura central (columna vertebral o "backbone") se encuentra unido por puente hidrógeno. Existen tres modelos de alfa hélice. El primero muestra solo al carbono alfa de cada aminoácido. El segundo muestra todos los átomos que forman la columna vertebral del polipéptido . El tercero y mas completo modelo, muestra todos los puentes hidrógeno que mantienen la alfa-hélice. Las hélices generalmente están formadas por aminoácidos hidrófobos, en razón que son, generalmente, la máxima atracción posible entre dichos aminoácidos. Las hélices se observan, en variada extensión, prácticamente en todas las proteínas. ESTRUCTURA TERCIARIA La estructura terciaria es la estructura plegada y completa en tres dimensiones de la cadena polipeptídica, la hexoquinasa que se usa como icono en esta página es una estructura tridimensional completa.

A diferencia ded la estructura secundaria, la estrtuctura terciaria de la mayor parte de las proteínas es específica de cada molécula, además, determina su función. EL plegamiento terciario no es inmediato, primero se agrupan conjuntos de estructuras denominadas dominios que luego se articulan para formar la estructura terciaria definitiva. Este plegamiento está facilitado por uniones denominadas puentes disulfuro, -S-S- que se establecen entre los átomos de azufre del aminoácido cisteína. Existen, sin embargo dos tipos de estructuras terciarias básicas: proteínas fibrosas, insolubles en agua, como la alfa queratina o el colágeno y proteínas globulares, solubles en agua. ESTRUCTURA CUATERNARIA Solo está presente si hay mas de una cadena polipeptídica. Con varias cadenas polipeptídicas, la estructura cuaternaria representa su interconexión y organización. Esta es la imagen de la hemoglobina, una proteína con cuatro

6

polipéptidos, dosalfa-globinas y dos beta globinas. En rojo se representa al grupo hem (complejo pegado a la proteína que contiene hierro, y sirve para transportar oxígeno). ENZIMAS Los enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución. Las enzimas son grandes proteínas que aceleran las reacciones químicas. En su estructura globular, se entrelazan y se pliegan una o más cadenas polipeptídicas, que aportan un pequeño grupo de aminoácidos para formar el sitio activo, o lugar donde se adhiere el sustrato, y donde se realiza la reacción. Una enzima y un sustrato no llegan a adherirse si sus formas no encajan con exactitud. Acción De Enzimas La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición. El sustrato se une al enzima a través de numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno, electrostáticas, hidrófobas, etc, en un lugar específico , el centro activo. Este centro es una pequeña porción del enzima, constituido por una serie de aminoácidos que interaccionan con el sustrato. Con su acción, regulan la velocidad de muchas reacciones químicas implicadas en este proceso. El nombre de enzima, que fue propuesto en 1867 por el fisiólogo alemán Wilhelm Kühne (1837-1900), deriva de la frase griega en zyme, que significa 'en fermento'. En la actualidad los tipos de enzimas identificados son más de 2.000. Clasificación de las enzimas 1. Óxido-reductasas ( Reacciones de oxido-reduccisn). 2. Transferasas (Transferencia de grupos funcionales) 3. Hidrolasas (Reacciones de hidrólisis) 4. Liasas (Adicisn a los dobles enlaces) 5. Isomerasas (Reacciones de isomerizacisn) 6. Ligasas (Formacisn de enlaces, con aporte de ATP) 1.Oxido-reductasas: Son las enzimas relacionadas con las EMULSINA Las almendras dulces son muy nutritivas: más de la mitad de su peso corresponde a grasas vegetales digeribles, tienen más proteínas que la carne de vaca y son ricas en fósforo, calcio y vitaminas del grupo B. También poseen una enzima, la emulsina o sinaptasa, que favorece la digestión. Desde el punto de vista medicinal, aumentan la secreción de leche materna cuando ésta es escasa y tienen propiedades antihelmínticas, esto es, favorecen la expulsión de lombrices intestinales. La leche de almendra, que se obtiene triturando almendras secas y peladas y luego mezclándolas con agua, se recomienda como sustituto de la leche de vaca y en tratamientos de problemas cardiovasculares y diabetes. Las almendras amargas contienen además amigdalina, un glucósido que por acción de la emulsina y en presencia de agua, produce ácido cianhídrico. Este ácido, antiguamente llamado ácido prúsico, se combina con el potasio para dar cianuro potásico, que es un veneno muy potente. Por suerte, las almendras amargas, como su propio nombre indica, tienen mal sabor y son raros los casos de envenenamiento involuntario por ingestión de esta variedad. UNIONES GLUCOSÍDICAS La unión glicosídica más frecuente es la unión 1,4´. El carbono anomérico de un azúcar se enlaza al átomo de oxígeno de C4 del segundo anillo. Celobiosa: enlace glusídico β-1,4´. La celobiosa, disacárido obtenido a partir de la hidrólisis parcial de la celulosa, contiene un enlace 1,4´. El carbono anomérico de una unidad de glucosa se une, a través de un enlace ecuatorial (β) carbono-oxígeno, al C4 de otra unidad de glucosa. A este enlace acetálico β-1,4´ entre dos moléculas de glucosa se lo denomina enlace β-1,4 ´glucosídico. Maltosa: enlace glucosídico α-1,4´. La maltosa es un disacárido que se obtiene cuando se trata el almidón con cebada germinada, denominada malta. Este proceso de malteado es el primer paso para la obtención de cerveza, transformando los polisacáridos y monosacáridos que fermentan fácilmente. Igual que la celobiosa, la maltosa contiene un enlace glucosídico 1,4´ entre

7

dos unidades de glucosa. La diferencia en la maltosa es que la estereoquímica del enlace glucosídico es α en lugar de β.

MATERIAL CANTIDAD Erlenmeyer de 125 ml 1 Vidrio de reloj 1 Embudo de vidrio 1 Erlenmeyer de 250 ml 1 Pinzas de 3 dedos c/ 1 nuez Agitador magnético 1 SUSTANCIAS Almendras desengrasadas Ácido Acético al 1 %

CANTIDAD

MATERIAL Espátula Agitador de vidrio Probeta de 25 ml Recipiente de peltre Frasco vial

CANTIDAD 1 1 1 1 1

Barra magnética

1

SUSTANCIAS

10 g

Acetona

40 mL

p-nitro glucosido

CANTIDAD 50 Ml

fenil-D- 1 mg

EQUIPO Balanza analítica

PROCEDIMIENTO: Extracción de la emulsina 

Se pesan 10 g de polvo de almendras desengrasadas (Nota 1), se colocan en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y se agregan 40 ml de ácido acético al 1 %; someta la mezcla a una agitación constante durante 20 minutos, cuidando de sujetar el matraz con una pinza, para evitar que el movimiento lo desplace.



Se suspende la agitación y se filtra por gravedad, la solución filtrada se enfría en baño de hielo, y se le añade poco a poco 25 mL de acetona. Mantenga la solución en el baño de hielo durante 10 minutos (Nota 2), filtre por gravedad.



La emulsina se puede recuperar del papel filtro y guardar, ya seca, en el refrigerador. Es recomendable hacer una determinación cuantitativa del p-nitro fenol formado en la reacción con emulsina.

NOTAS Nota 1: Use, según el caso, las almendras desengrasadas a temperatura ambiente o las almendras desengrasadas a temperatura de reflujo, que preparo de la practica anterior. Nota 2: Observe que la emulsina precipita como un sólido blanco.

8

RESULTADOS:

la mezcla de las almendras y el acido acético al 1% se somete a agitación sin calentamiento

La emulsina se recupera filtrando por gravedad

la solucion filtrada que se obtuvo a partir de la mezcla anterior se deja enfriar en un baño de agua con hielos por 10 min. Y se le agrega acetona. Se empieza a formar un precipitado, el cual es la emulsina

La emulsina obtenida, tenía un aspecto viscoso y gelatinoso de color blanco-amarillento

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:



La técnica que se realizó fue cualitativa ya que no se contaba con el p-nitro fenil -β -D- glucósido, por lo cual no se pudo comparar la actividad de la emulsina obtenida, bajo diferentes temperaturas por la acción del reactivo.



Cuando se baja la temperatura a la mezcla de almendras dulces desengrasadas y ácido acético y se agrega la acetona, se observa al fondo del matraz que se va formando un precipitado blanco-amarillento; al filtrar en el papel se obtuvo una sustancia blanco-cremosa de consistencia viscosa que correspondía a la emulsina.



No se filtró con la bomba de vacío debido a que esta ejerce mucha fuerza y se podría absorber la proteína hacia las aguas madres, por lo tanto se perdería una parte de la enzima; tampoco se dejo secar el papel al calor ya que esta se hubiera desnaturalizado, por lo tanto también se perdería y no se podría pesar correctamente, luego entonces no se puedo calcular el rendimiento, por lo cuál la técnica fue meramente cualitativa.

CUESTIONARIO 1. ¿Con qué otros nombres se conoce a la emulsina? β- Glucosidasa, Glusidasa o Carbohidrasa 2. ¿Por su modo de acción, ¿cómo se clasifica esta enzima? En 1837 Liebig extrajo de las almendras un fermento soluble que catalizaba la descomposición de la amigdalina en glucosa y ácido hidrociánico y lo llamó “emulsina”. 3. Escriba la reacción que se produce entre la enzima y el glucósido.

9

CH2OH

O

HO CH2OH HO

O

HO

O

EMULSINA

O

HO

CH2

HO

OH

O

OH

O

OH

+

CH2

HO

OH

HO CN

HO

O HO

CN

HCN +

O H

4. La comparación de la actividad enzimática de la emulsina extraída de las dos muestras de almendras dulces tratadas, a que conclusiones le lleva. No se realizó el experimento, sin embargo, Las medidas de actividad enzimática, deben hacerse en condiciones “Standard” de todos los parámetros que influyen en la velocidad, tales como las concentración de enzima, de sustrato, de cofactores, de producto y de inhibidores, el pH y la temperatura. 5. ¿Qué otro glucósido natural podría emplear para comprobar la actividad de la enzima? La (+)-celobiosa, y metil-α-D-glucósido 6. ¿Qué usos podría darle al residuo de las almendras? Se podrían lavar y usarlas de abono para las plantas. 7.- Proponga un método para hacer la determinación cuantitativa del p-nitro fenol formado durante la reacción con emulsina: El P-nitro fenol es un compuesto amarillo-coloreado brillante que tiene absorbencia máxima en 405 NM. El incremento en absorbancia a 405 nm es proporcional a la cantidad de emulsina en la muestra. CONCLUSIONES: Se extrajo emulsina a partir de almendras desengrasadas, aunque no se le hicieron las pruebas para ver la capacidad de la emulsina a falta de reactivos observamos su consistencia y la característica de las enzimas, ya que la emulsina es una enzima. Las enzimas, son proteínas, que se encargan de catalizar reacciones químicas, para poder funcionar, deben tener sus estructuras intactas, cuando por medio de ciertas reacciones, o por medio del calor, inactivas a las enzimas, se dice que las desnaturalizas, y al hacerlo, impides la función de las enzimas. Así que en realidad, la desnaturalización inactiva a las enzimas. Las almendras a grandes cantidades son toxicas ya que la emulsina, que sirve para digestión, al combinarse con el agua o con el jugo gástrico forma ácido cianhídrico el cual es altamente toxico.

BIBLIOGRAFÍA: ℘ Ville, C. A.: Proteínas. En: Biología. 6ª ED. Interamericana, México, 1974. 31-33.

℘

Berezov T.T, Korovkin B.F: “Química de las proteínas”. En Bioquímica, 1ª ED. Mir Publishers Moscow Moscú, Rusia, 1992. pp. 19 – 64.

10