Workshops

‫)‪TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASES-1 (TIMP-1‬‬ ‫‪INHIBITS TUMOR GROWTH AND ANGIOGENESIS IN THE‬‬ ‫‪TIMP-1 TRANSGENIC MOUSE MODEL‬‬ ‫)‪(Workshop: Transgenic models in angiogenesis‬‬ ‫‪hTIMP-1: (human) tissue inhibitor matrix metalloproteinases-1‬‬ ‫‪ TIMP‬מוכר כחלבון מולטי‪-‬פונקציונלי‪ .‬תפקידו בסרטן לא ידוע‪ ,‬נתקבלו דיווחים סותרים‪:‬‬ ‫‪anti tumor activity .1‬‬ ‫‪tumor growth stimulation .2‬‬ ‫המחקר המתואר‪ :‬יצירת גן ‪ TIMP‬הנתון לבקרת אלבומין וביטוי ברקמת הכבד של עכברים‬ ‫(פרומוטר‪+‬מעצם‪ ,‬ייקרא בשם‪ .)TIMP-Tg-mice :‬קבוצת הבקרה‪ :‬עכברים הטרוזיגוטיים‬ ‫לגן החדש‪ .‬הושתל גידול סרטני (ארליך) בעכברים‪.‬‬ ‫‪ :In vivo‬הגידול דוכא (ע"י עצירת התפתחות כלי דם חדשים באזור) בעכברים הטרנסגנים‪,‬‬ ‫במידה רבה יותר מאשר בקבוצת הבקרה‪.‬‬ ‫‪ :In vitro‬הגן לא השפיע על שגשוג תאי אנדותל (שכבה דקה של תאי ציפוי) ושגשוג תאי‬ ‫הגידול‪ .‬לכן נסיק כי האפקט המדכא לא נובע מרעילות‪ .‬הגן דיכא משמעותית יצירת תאי אנדותל‬ ‫צינוריים‪.‬‬ ‫מעבר לכך‪ in vitro ,‬לא חל שינוי ברמות ‪)matrix metalloproteinase (MMP‬‬ ‫אולם כן נצפה שינוי במרקר הזה ‪( in vivo‬בעכברים ההומוזיגוטיים לעומת קבוצת הבקרה‬ ‫הטרוזיגוטית)‪.‬‬ ‫מכל האמור לעיל‪ ,‬נשער כי ‪ TIMP‬מדכא את ביטוי הסרטן ע"י דיכוי השלבים המאוחרים של‬ ‫אנגיוגנזה (כנראה בעקיפין)‪ TIMP .‬פועל בהתחלה להגברת הגידול (ע"י מניעת אפופטוזיס)‪,‬‬ ‫ולאחר מכן מדכא את הגידול‪.‬‬

‫‪Cell-type-specific gene delivery into neuronal cells in vitro‬‬ ‫‪and in vivo‬‬ ‫)‪(Workshop: Gene Therapy II‬‬ ‫המחקר מדגים העברת גנים ספציפית לתאי עצב‪ .‬עד למחקר‪ ,‬היו קיימות שיטות שהראו העדפה מסויימת‬ ‫לתאי עצב‪ ,‬בהזרקה ישירה למוח‪ ,‬אך לא היתה בנמצא שיטה להדביק ספציפית תאי עצב‪.‬‬ ‫לכן‪ ,‬יש צורך להנדס מעטפת חלבונית לוירוס‪ ,‬שתיקשר לתא‪-‬מטרה ידוע (=תא עצב)‪.‬‬ ‫כדי להעצים את ההדבקה ואת הספציפיות‪ ,‬השתמשו במרכיבים‪:‬‬ ‫‪ gag.1‬של וירוס עופות (‪)Rev-A‬‬ ‫‪ Pol.2‬של ‪)SNV )spleen necrosis virus‬‬ ‫‪ envelope protein.3‬של ‪)VSV )vesicular stomatitis virus‬‬ ‫‪.4‬גליקופרוטאינים של וירוס הכלבת (‪ ,)RV‬שידוע כבעל זיקה עצבית גבוהה‬ ‫‪ NLS.5‬הוחדר‪ ,‬כדי לאפשר הדבקה של תאים "שקטים" – בשלב ‪.)G0 )quiescent‬‬ ‫לא בטוח שניתן להדביק תאים אלו גם ‪.in vivo‬‬ ‫‪ – neo.6‬עמידות לאנטיביוטיקה ניאוצין‪.‬‬

‫‪Nonviral Cytokine Gene Therapy on an‬‬ ‫‪Orthotopic Bladder‬‬ ‫‪Cancer Model‬‬ ‫(‪)Gene Therapy workshop 1‬‬ ‫ציטוקין‪ :‬חלבון שמופרש מבלוטות הלימפה ומתווך בין‪-‬תאי‪ ,‬ומווסת תגובות חיסוניות‪.‬‬

‫‪ :MHC Class I‬קיימים על פני שטח כל תא בגוף‪ .‬מציגים כלפי חוץ סימן למערכת החיצונית‪ ,‬אם קיים‬ ‫בתוך התא וירוס – או לא‪.‬‬ ‫טיפולים נוכחיים לסרטן שלפוחית השתן (כמו ‪ )BCG‬כוללים הגברת פעילות של ציטוקינים‪ .‬אבל טיפול זה‬ ‫בעל תופעות לוואי מרובות‪ ,‬וכשליש מהמטופלים כלל אינם מגיבים אליו‪.‬‬ ‫שימוש בציטוקינים רקומביננטים יקר‪ ,‬ודורש חזרות מרובות משום שהציטוקינים אינם יציבים (זמן מחצית‬ ‫חיים בשלפוחית קצר מאוד)‪ .‬בנוסף‪ ,‬האפקט של הציטוקין הרקומביננטי מוגבל‪ ,‬משום שלבקטריה אין יכולת‬ ‫לבצע מודיפיקציות שלאחר‪-‬טרנסקריפציה (הדרושות לציטוקין)‪ .‬לכן כדאי להשתמש בהדבקת התאים‬ ‫בשלפוחית בגן קבוע שמייצר ציטוקין‪ .‬הטיפול ה"רגיל" (באמצעות אדנו‪-‬וירוס) אינו יעיל במקרה זה‪ ,‬משום‬ ‫שאין בשלפוחית השתן קולטנים לאדנו‪-‬וירוס במידה מספקת‪ .‬לכן בוצע שימוש בליפוזומים‪.‬‬ ‫בניסוי המתואר הוחדרו שני ציטוקינים‪:‬‬ ‫‪ :IFN-α1‬גליקופרוטאין‪ ,‬מבקר גידול תאי‪ ,‬התמיינות‪ ,‬מדכא ביטוי אונקוגנים‪ ,‬תומך אפופטוזיס‪ ,‬מפעיל‬ ‫לימפוציטים ומקרופאג'ים‪ .‬בפרט‪ :‬מסוגל לדכא גידול ע"י מניעת יצירת כלי דם חדשים‪.‬‬ ‫‪ :GM-CSF‬מעורר שגשוג‪/‬התבגרות‪/‬תיפקוד של תאי דם‪.‬‬ ‫מטרת הניסוי‪ :‬לבדוק את יעילות העברת ציטוקינים ככלי ריפוי‪.‬‬ ‫תוצאות‪ :‬לאחר ההדבקה‪ ,‬נצפתה עליה ברמת הציטוקינים לעומת הדבקה בוקטור בלבד – שבה אין עלייה‬ ‫בציטוקינים‪ .‬עליה ברמת ‪ MHC Class I‬בתאים‪ .‬דיכוי גדילת תאים סרטניים שהודבקו בציטוקינים‪.‬‬ ‫ניסויים ‪ in vivo‬תמכו בתוצאות המתוארות למעלה‪.‬‬ ‫מבחינת ריפוי בעזרת ציטוקין‪ :‬בקבוצת הבקרה שרדו פחות עכברים מאשר בקבוצות הניסוי (‪ .)69%‬מתוך‬ ‫שלוש קבוצות הניסוי‪ ,‬לשתיים החדירו סוג אחד של ציטוקין שונה (‪ 77‬ו‪ 92-‬אחוז הישרדות)‪ ,‬ולקבוצה‬ ‫השלישית החדירו שילוב של שני הציטוקינים (ואחוז ההישרדות היה ‪ .)100‬החוקרים השתמשו במספר‬ ‫אמצעים כדי לוודא שהגידול היה מוגבל לתחום השלפוחית (בדיקה שלאחר‪-‬המוות וכו')‪ ,‬וגם וידאו שלא היתה‬ ‫רעילות לתאים (לא היה שינוי במשקל הגוף בקבוצה המטופלת)‪.‬‬ ‫נקודות נוספות בניסוי‪:‬‬ ‫‪.1‬החוקרים הצליחו להחדיר סרטן לרקמה ספציפית‪ ,‬בלי ליצור גרורות בטכניקה של צריבת‬ ‫האזור‪ ,‬והדבקת האזור הצרוב בתאים סרטניים‪ .‬שיטות אחרות לא מפיקות תוצאות כאלו‪.‬‬ ‫‪.2‬הדבקה באמצעות ליפוזום‪ .‬בעזרת הגן המדווח נצפתה הדבקה גם בשכבות העמוקות‪-‬פנימיות‬ ‫של הגידול‪ ,‬בעוד שהדבקה עם אדנו‪-‬וירוס נותנת הדבקה שטחית בלבד‪ .‬סברה‪ :‬שכבה של תאי‬ ‫אפיתל שהתמיינו לחלוטין מהווה מחסום בפני ההדבקה הויראלית‪.‬‬ ‫**** הערה שלי‪ :‬לפני החדרת ציטוקין נרצה לבדוק שהוא באמת משתתף פעיל בדיכוי הסרטן‪ ,‬או בכלל‬ ‫ללמוד את השפעתו‪ ,‬כדי שנוכל לבדוק אותה ‪ .in vivo‬אם מחדירים שני ציטוקינים‪ ,‬כדאי לבדוק אם הם‬ ‫פועלים יחד או לא‪.‬‬

‫‪Fine mapping of the 2p11 dyslexia locus‬‬ ‫‪and exclusion of TACR1as a candidate gene‬‬ ‫)‪(SNPs workshop‬‬ ‫דיסלקציה מיוחסת לחמישה גנים לפחות‪.‬‬ ‫מיפוי של ‪ ,2q11‬לוקוס של ליקויי למידה וביטול של (‪ tachykinin receptor1)TACR1‬כגן‬ ‫מועמד‪.‬‬ ‫מחקרי עבר מצאו קישור ללוקוס זה‪ .‬מטרת המחקר היא למצוא ברזולוציה גבוהה מיפוי של כ‪ 40-‬ס"מ אזור‬ ‫המקושר בכרומוזום ‪ 2‬ולצמצם את האזור החשוד בקשר באמצעות ‪ SNPs‬וסמני ‪.microsatellite‬‬

‫‪ - microsatellite‬משטחים חוזרים של מקטעי ‪ DNA‬קצרים המשמשים כסמנים גנטיים לאיתור תורשה‬ ‫במשפחות‪.‬‬ ‫התבצע מיפוי באמצעות מבט על משפחות פיניות‪ microsatellite markers 21 ,‬ו‪SNPs 6-‬‬ ‫‪ . markers‬באמצעות הגלאים הללו התבצע עידון של האזור המעורב לכדי ‪ 10.5‬ס"מ‪.‬‬ ‫‪ – TACR1‬גן המקודד ‪ G-protein receptor‬ל‪ tachkinin-‬ומעורב בפעילות עצבית ומצבי רוח‪,‬‬ ‫נבחן ברמת מוטציות כגן שיכול להשפיע על המחלה כיוון שהוא ממוקם באזור המעורב‪ .‬כיוון שלא התגלו‬ ‫מוטציות אצל הנחקרים ומכיוון שלא נמצאו ‪ haplotypes‬שונים באזור שנבחן ע"י ‪ SNPs 6‬הממוקמים‬ ‫בגן זה או סביבתו‪ ,‬הוסק שאין השפעה לגן על המחלה‪.‬‬ ‫על מנת לנתח את המבנה התורשתי כללי השתמשו ב‪ MA-‬וב‪ .SNP-‬ה‪ SNPs-‬נבחרו ממאגרי ‪SNPs‬‬ ‫ידועים בבני אדם וכאלו הידועים בקרבתם לחלק המקודד של ‪.TACR1‬‬ ‫מסריקה של הכרומוזום ע"י מספר גלאים‪ ,‬נעשתה בדיקה סביב האזור בו הסמן היה הכי דומיננטי אצל‬ ‫החולים‪ .‬כיוון שסמן זה היה במיקום המקודד את ‪ TACR1‬ניסו למצוא מוטציה בגן הגורמת למחלה‪ .‬עם זאת‬ ‫לא נמצאה אף מוטציה בגן‪ .‬נמצא פולימורפיזם לשני ‪ SNPs‬אך לא נמצא קשר ביניהם למחלה בנפרד ואף לא‬ ‫כ‪ .Haplotype -‬גם לאחר הוספת סריקה עם ‪ SNPs‬נוספים לא נמצא קישור של הגן במחלה אך הצליחו‬ ‫לצמצם את האזור המעורב על הכרומוזום‪.‬‬

‫‪Positional cloning of the major quantitative trait‬‬ ‫‪locus underlying lung tumor susceptibility in mice‬‬ ‫)‪(Positional Cloning workshop‬‬ ‫‪QTL – Quantitative Trait Locus‬‬ ‫תפקוד ומיקום משוער של הגן ידועים ומחפשים אחר הגן עצמו‪.‬‬ ‫מטרה‪ :‬זיהוי גנים שעשויים להיות הגורמים לרגישות לסרטן הריאות ע"י טכניקת ‪.positional cloning‬‬ ‫ידוע כי נוסף על גורמים סביבתיים‪ ,‬יש מרכיב גנטי במחלה‪ .‬אולם‪ ,‬ההטרוגניות הגנטית יחד עם תנאי הסביבה‬ ‫המשתנים בין חולה לחולה מקשים על הנסיון לזהות לוקוסים‪ .‬לכן‪ ,‬מבוצעים מחקרים על חיות מודל –‬ ‫עכברים‪ .‬מחקרים קודמים מיקמו את אחד הלוקוסים התורמים בשם ‪ pas1‬על מקטע מסויים בכרומוזום ‪.6‬‬ ‫תהליך‪ :‬המקטע של ‪ Pas1‬נלקח מזן של עכברים שידוע כרגיש במיוחד (‪ )A/J‬לסרטן הריאות‪ .‬המקטע‬ ‫הונדס‪ ,‬ונתחם ע"י שני מרקרים ידועים‪ ,‬והושתל בזן אחר (‪ ,)C57BL/6J‬שידוע כמתנגד לסרטן הריאות‪.‬‬ ‫בוצעו הכלאות חוזרות (‪ )repeated backcrosses‬עם דור ההורים הראשון‪ ,‬ובדור ה‪ 8-‬נלקחו ‪132‬‬ ‫זכרים‪ ,‬כל אחד מהם מכיל מקטע שונה של הכרומוזום‪ .‬זכרים אלה עם ‪ 3‬נקבות מאותו הזן המקורי שחסין‬ ‫(יחסית) לסרטן הריאות‪ ,‬והעמידו את הדור ה‪ .9-‬דור זה היה ‪( congenic‬כל הפרטים זהים גנטית‪ ,‬פרט‬ ‫ללוקוס בודד)‪.‬‬ ‫‪.1‬מבין עכברי הדור ה‪ ,9-‬נבררו עכברים מסויימים‪ ,‬על‪-‬סמך מרקרים גנטים ידועים‪ .‬עכברים אלו‬ ‫הודבקו בסרטן בגיל ‪ 5‬שבועות‪ ,‬והומתו ‪ 7.5‬חודשים לאחר‪-‬מכן‪ .‬הגידולים הסרטניים הוסרו‪,‬‬ ‫ונמדדו (מספר‪ ,‬נפח)‪ .‬כמו‪-‬כן‪ ,‬נמדדו השונויות בין הקבוצה המטופלת לבין קבוצת הביקורת‪.‬‬ ‫‪.2‬רנ"א נלקח מתאי הריאות של העכברים‪ .‬בוצע ‪ RT-PCR‬ואנליזת ‪.Northern Blot‬‬ ‫הקבוצה המטופלת פיתחה ‪ 6‬גידולים בנפח ‪ 1.91‬מ"מ מעוקב בממוצע לעכבר לעומת ‪ 0.7‬גידולים בנפח‬ ‫ממוצע ‪ 0.18‬מ"מ מעוקב בקבוצת הביקורת‪ .‬בצורה זו‪ ,‬צומצם האזור הראשוני מ‪ 32-‬מ"ב ל‪ 0.5‬מ"ב‪.‬‬

‫באזור שנמצא‪ 12 ,‬גנים משוערים‪ .‬ביטוי של ‪ 6‬מתוכם ברקמת הריאה אכן אושר‪ ,‬ע"י ‪ PCR‬ונורת'‪-‬בלוט‪.‬‬ ‫לאחר מכן‪ ,‬בוצע חיפוש ל‪ -functional polymorphism‬ואכן נתגלו ‪ 5‬גנים שהכילו פולימורפיזם‬ ‫כזה‪ ,‬או לחלופין הראו ביטוי שונה בין שני הזנים (הרגיש לסרטן והחסין לסרטן)‪ 5 .‬גנים אלו הפכו‬ ‫למועמדים סופיים לגן‪ .‬כדי לברור מי מהם בדיוק‪ ,‬נעשו ניסויים בהם בדקו מי מבין ‪ 5‬הגנים מדכא‪/‬מעורר‬ ‫גידול סרטני ב‪ cell lines-‬של עכבר‪ .‬רק אחד ענה לדרישות‪ .Las1 :‬כשהשתמשו ב‪ Las1‬מהזן הרגיש‬ ‫לסרטן‪ ,‬נוצרו גידולים סרטניים‪ .‬לעומת זאת‪ Las1 ,‬שנלקח מהזן החסין מנע כל גידול סרטני (‪in vivo‬‬ ‫‪.)and in vitro‬‬ ‫נתגלה כי פולימורפיזם מסויים (‪ AGT‬לעומת ‪ AAT‬בקודון ‪ )60‬קיים בזנים העמידים‪ ,‬לעומת הזנים‬ ‫הרגישים והרגישים למחצה‪ .‬לאחר מכן בדקו החוקרים את המיקום בתא בו ‪ Las1‬מתבטא‪ ,‬ומצאו‬ ‫הומולוגים במינים אחרים‪.‬‬ ‫החוקרים הגדילו ראש‪ ,‬ובדקו מועמד נוסף מבין ‪ 5‬הגנים‪ ,‬למרות שלא נצפתה בו ‪functional‬‬ ‫‪ :polymorphism‬הגן ‪ Kras2‬אלא רק ביטוי מוגבר של אחד האללים‪ .‬מסקנות‪ :‬ביטוי הגן לא משפיע‬ ‫על מספר הגידולים‪ ,‬אבל תורם לנפח מוגדל שלהם‪ .‬לאחר בדיקה נוספת‪ ,‬החוקרים גילו כי ‪ Kras2‬שהגיע‬ ‫מהזן הרגיש‪ ,‬מתבטא יותר בגידול סרטני‪ ,‬מאשר האלל שהגיע מהזן החסין‪.‬‬

‫‪Adenovirus-mediated Gα q-protein antisense transfer in‬‬ ‫‪neurons replicates Gα q gene knockout strategies‬‬ ‫מושגים‪:‬‬ ‫•‪ :Antisense‬מנגנון המונע ביטוי גן ע"י התערבות בשלב התרגום‬ ‫•‪ :G-protein‬משפחת חלבונים הטרו‪-‬טרימריים‪ ,‬הנמצאים בחלק התוך‪-‬תאי של הממברנה‪.‬‬ ‫החלבונים קושרים אליהם רצפטורים ובאמצעות שינוים מבניים והידרוליזה של ‪ GTP‬גורמים‬ ‫לשינוי במצב התעלות בתא (במישרין או בעקיפין)‪ ,‬ובכך מצמדים תגובות פנים‪-‬תאיות‬ ‫לרצפטורים על גבי התא‪.‬‬ ‫•אדנווירוס‪ :‬וירוס הגורם לדלקות בדרכי הנשימה ובעיניים‪.‬‬ ‫•‪ :Ganglion‬גנגליון‪ ,‬צבר תאי עצב‬ ‫רקע‪:‬‬ ‫שינוי תבניות ביטוי של גנים באמצעות אסטרטגיות ‪ antisense‬הוא נושא שראוי לבחינה‪ ,‬הן מנקודת מבט‬ ‫רפואית‪-‬טיפולית‪ ,‬והן מנקודת מבט מחקרית‪ .‬גישות ‪ antisense‬מנוצלות בשיעור גבוה בניתוח של ‪signal‬‬ ‫‪ pathways‬בין רצפטורים על גבי התא‪ ,‬ובין גורמים פעילים בפנים התא‪ ,‬והן יעילות במיוחד הודות‬ ‫לספציפיות הגבוהה שלהן‪.‬‬ ‫מוטיבציה‪:‬‬ ‫מחקרים קודמים איפשרו לזהות את תתי‪-‬היחידות של ‪ G-Protein‬המעורבים בדיכוי ‪ M-Channels‬של‬ ‫אשלגן‪ ,‬וב ‪ -N-channels‬של סידן‪ ,‬ב‪ SCG-‬של עכברוש‪ .‬אולם התוצאות שהופקו מגישות אלו סבלו‬ ‫מהגבלות ומאי‪-‬דיוקים‪ :‬תוצאות של ‪ oligonucleotides antisense‬לא היו עקביות‪ ,‬ושימוש ב ‪cDNA‬‬

‫‪ Expression Vector‬חייב הזרקה לפנים‪-‬הגרעין או הדבקה של תת‪-‬אוכלוסיה בשלב מיטוזה‪ .‬היה צורך‬ ‫ממשי בשיטה חדשה שתאפשר העברת הגן לאוכלוסיות תאים גדולות ולתאי עצב פחות סובלניים לשיטות‬ ‫ההחדרה הקודמות‪.‬‬ ‫שיטות‪:‬‬ ‫•מושבות תאים‪ :‬נוירונים מ‪ SCG-‬הופרדו מעכברושים צעירים ז"ל (בני ‪ 15-19‬יום)‪ ,‬וגודלו‬ ‫על זכוכיות‪ .‬העכברושים הומתו בעריפת ראשם‪ ,‬לא לפני ששאפו כמות נכבדת של פחמן‪-‬דו‪-‬‬ ‫חמצני – והכל ע"פ חוק בע"ח הבריטי (‪.)1986‬‬ ‫•ייצור אדנו‪-‬וירוס רקומביננט וההדבקה‪ :‬רצף ה‪ antisense-‬תואם לנוקלאוטידים ‪29-129‬‬ ‫בקצה ‪ '3‬של ה‪ UTR-‬בגן הרלבנטי בעכברוש‪ .‬הרצף ייחודי ל ‪( Gαq -protein‬גם על פני‬ ‫יחידות אלפא אחרות)‪ .‬הוירוסים הודבקו באמצעות פלסמיד והוגברו במשך ארבעה מחזורים‪.‬‬ ‫ההדבקה אושרה באמצעות בדיקת רצפים ובאמצעים נוספים (כמו ה‪ GFP-‬גן מדווח) בנוסף‪,‬‬ ‫נעשה שימוש בקבוצת מבחן של וירוסים שלא הודבקו במולקולת האנטי‪-‬סנס‪.‬‬ ‫•‪ :Immunofluorescence‬שימוש בצבע פלורוסנטי הקשור לנוגדנים לצורך זיהוי או כימות‬ ‫אנטיגנים‪.‬‬

‫תוצאות‪:‬‬ ‫•נמצא ריכוז וירוסים שיתן הדבקה אופטימלית של נוירונים‪ ,‬בפרק זמן סביר‪.‬‬ ‫•לאחר ההדבקה‪ ,‬נבדקה התפתחות פתולוגית ע"י הדגרת התאים המודבקים יחד עם צבע הנבלע‬ ‫ע"י תאים עם ממברנה פגומה‪ ,‬ונקשר לחומצות גרעין (‪ .)nucleic acids‬הצבע ניתן בריכוזים‬ ‫משתנים‪ .‬הריכוז שנבחר לבסוף לביצוע כל הניסויים הוא זה שנתן תאים חיים במשך זמן רב‬ ‫ביותר‪.‬‬ ‫•שיעור ההדבקה (כאשר נעשה שימוש בריכוז וירוסים אופטימלי‪ :‬שיעור הדבקה גבוה ושיעור‬ ‫פתוגני נמוך) עמד על למעלה מ‪ 60%-‬במושבה הראשית‪ ,‬ורוב התאים ב‪ cell line-‬הודבקו אף‬ ‫הם‪ .‬זהו שיפור גדול לעומת ההזרקה התוך‪-‬גרעינית‪ ,‬בה הזריקו למספר תאים בכל פעם‪.‬‬ ‫•ברוב התאים המודבקים‪ ,‬ניתן היה לראות ירידה ברורה של ביטוי ‪ Gαq‬בהשוואה לקבוצות‬ ‫הבקרה‪.‬‬ ‫•‪ Gαq‬הכרחי לתפקוד תקין של תעלת הסידן בתא‪ .‬בתאים שהודבקו בוירוס‪ ,‬חלה ירידה ניכרת‬ ‫בשחרור סידן ממאגרי התא‪.‬‬ ‫דיון‪:‬‬

‫•אדנו‪-‬וירוס רקומביננטי יכול בהצלחה להעביר אנטי‪-‬סנס למושבות‪,‬‬ ‫•ההעברה מתבטאת בהפחתה ספציפית של תת‪-‬היחידה הרלבנטית‪ ,‬וכתוצאה ישירה מכך נגרמת‬ ‫הפחתה בפעילות המתווכת ע"י תת יחידה זו‪.‬‬ ‫•החדרת אנטיסנס ויראלית משכפלת תוצאות שהושגו באמצעות אסטרטגיות השתקה אחרות‪.‬‬

‫סיכום‪:‬‬ ‫•שימוש באדנו‪-‬וירוס רקומביננטי כדי להעביר אנטיסנס של ‪ G-Protein αq‬לנוירונים ב‪SCG-‬‬ ‫(גנגליון) של עכברוש‪ ,‬ול‪ cell lines-‬נוירונליים‪.‬‬

‫•הטרנספקציה בוצעה כדי לפענח תהליכים הקשורים לחלבון הנ"ל ולמערכת העברת האותות‬ ‫התאית‪ .‬התוצאות הושוו לאסטרטגיות השתקה (‪ )knockdown‬מוכרות של ‪Gαq )antisense‬‬ ‫‪ )plasmid, knockout mouse‬ואכן נתגלה מתאם גבוה של חזרה על התוצאות‪.‬‬ ‫•הדבקות ב ‪ -GαqASAdV‬הורידו בצורה סלקטיבית את האימונו‪-‬ראקטיביות לחלבון‪ .‬ביטוי ‪G‬‬ ‫‪ αProtein‬אחרים לא שונה‪.‬‬

‫‪A Preliminary Transcriptome Map of Non-Small Cell Lung Cancer‬‬ ‫(‪)Transcriptome Workshop‬‬ ‫‪SAGE = Serial Analysis of Gene Expression‬‬ ‫בניית מפת הטרנסקריפטום‪ :‬נלקח מידע מספריות ‪ ,SAGE‬טויטת הגנום‪ ,‬מאגרי מידע ציבוריים ועוד‪.‬‬ ‫כל ‪ tag‬במידע זוהה ייחודית לגן אחד (חזרות נמחקו)‪.‬‬ ‫באמצעים מתמטיים‪-‬סטטיסטיים‪ ,‬חולקו הגנים לצבירים (‪ )clusters‬ע"פ תבנית ההתבטאות שלהם ביחס לשני‬ ‫סוגים של סרטן‪ ,‬ולרקמה בריאה‪.‬‬ ‫מתוך טיוטת הגנום ‪:‬הגיעו החוקרים ל‪ -27,542‬קלאסטרים‪ ,‬מתוכם ל‪ 26,992-‬היתה התאמה ייחודית למיקום‬ ‫בכרומוזום כלשהו‪ .‬מספר זה מתיישב עם הערכת הגנים בגנום (‪.)25k-40k‬‬ ‫מתוך ספריות ‪ SAGE: 374,643 tags‬נלקחו מ‪ 9-‬ספריות‪ .‬ראשית נבחרו טאגים בעלי זיקה לרקמות הריאה‬ ‫ואפיתל של מערכת הנשימה‪ .‬צמצום נוסף נעשה ע"י מחיקת טאגים שמקושרים לדנ"א מיטוכונדריאלי‪ ,‬או‬ ‫לרנ"א ריבוזומלי‪ .‬הטאגים שהופיעו ביותר מספריה אחת נבחרו לטיוטה הסופית‪ .‬בוצע מיפוי של הטאגים‬ ‫לגנים‪ .‬טאגים שמופו ליותר ממקום אחד – נמחקו גם כן‪ .‬סתירה מסויימת במספר הקלאסטרים הסופיים‬ ‫מיושבת ע"י ההשערה הבאה‪ alternative splicing :‬ונוכחות של מספר אתרים לביצוע פוליאדנילציה‬ ‫(=מוביל למספר טאגים של ‪ SAGE‬עבור גן בודד)‪.‬‬ ‫סה"כ‪ ,‬נמצאו מספר אזורים בעלי ביטוי מוגבר (פי ‪ 3‬או ‪ )4‬ומופחת (‪ 50-65%‬מהנורמל) בהתאם לרקמה‬ ‫(סרטנית או לא)‪.‬‬ ‫עבור סוג אחד של סרטן (‪ ,)adenocarcinoma‬נתגלו תבניות ביטוי מופחתות של קלאסטרים במתאם‬ ‫סטטיסטי תקין‪ .‬אולם‪ ,‬תבניות ביטוי מוגבר נתגלה עם ‪ ,p=0.5652‬כלומר תיתכן אקראיות ולא ניתן להסתמך‬ ‫על התוצאה‪ .‬הסבר משוער למקדם המתאם‪:‬‬ ‫‪.1‬בגלל המיקום של סרטן זה (היקפי)‪ ,‬תבנית ביטוי הגנים שלו דומה לתבנית‬ ‫הביטוי ברקמה לא‪-‬סרטנית‪.‬‬ ‫‪.2‬מספר ה‪ -SAGE tags‬אינו מספיק לביצוע מחקר‪.‬‬ ‫‪.3‬תת‪-‬סוגים רבים של סרטן זה‪.‬‬ ‫לכן התמקדו החוקרים בסוג השני של הסרטן‪ ,squamous tumors :‬עבורו נמצאו ‪ 15‬צבירים עם ביטוי‬ ‫מוגבר‪ ,‬ו‪ 28-‬עם ביטוי מופחת‪.‬‬ ‫איזורים מוגברים‪ :‬מתוך ‪ 15‬האיזורים המוגברים‪ 9 ,‬תואמים לתוצאות מחקרים קודמים‪ .‬גנים שבעבר נחשבו‬ ‫קשורים למחלה‪ ,‬לא בוטאו כלל במחקר הנוכחי‪ .‬רק הגן ‪( p63‬הומולוג של ‪ )p53‬נמצא כמועמד לגן משום‬ ‫שהוא הוגבר במחקר הנוכחי‪ ,‬והתוצאות תואמות למחקרים קודמים‪.‬‬ ‫איזורים מופחתים‪ :‬מתוך ‪ 28‬אזורים כאלה‪ 13 ,‬תאמו למחקרים קודמים‪.‬‬ ‫נמצאה חלוקה לא שווה של אזורים עם ביטוי דיפרנציאלי לאורך הגנום‪ .‬אבחנה זו מתיישבת עם ידע קודם‬ ‫בנוגע לכך ששינויים גנטיים משפיעים לרוב על סטים של גנים הממוקמים בקירבה פיזית‪ .‬אפשר לנצל עובדה‬ ‫זאת כדי לספק מרקרים חלופיים לסרטן‪ .‬עם זאת‪ ,‬אין להסתמך רק על כך משום שבכל קלאסטר‪ ,‬היו מספר‬ ‫גנים עם תבניות ביטוי שונות‪.‬‬

‫בעיות‪ :‬לא כל הגנים המוגברים – מבוטאים ביתר (ולהיפך)‬ ‫מפת הטרנסקריפטום שהוכנה ע"י החוקרים‪ ,‬רגישה יותר לאזורים שמבוטאים ביתר‪ .‬לא נצפה ‪clustering‬‬ ‫במספר אזורים שידוע כי הם נמחקים בסרטן ‪ .squamous‬אי‪-‬גילוי איזורים שנמחקו יכול להיות מוסבר בכך‬ ‫שרמת הביטוי של אותם איזורים‪ ,‬ממילא היה נמוך גם בנורמל‪ .‬ניתן לראות נתונים אלו בטבלאות במאמר‪:‬‬ ‫ביטוי‪-‬יתר מאופיין ע"י ביטוי של פי ‪ ,3-4‬לעומת ביטוי‪-‬חסר שמאופיין ב‪ 50%-‬ביטוי מהנורמל‪ .‬לכן סביר‬ ‫להניח‪ ,‬שגנים בביטוי‪-‬יתר מזוהים בקלות רבה יותר‪ ,‬בעוד שגנים בביטוי‪-‬חסר מיוצגים פחות מדי במפה‪.‬‬ ‫בנוסף לכל האמור לעיל‪ ,‬דיוק המפה הנוכחית מוגבל ע"י דיוק טיוטת הגנום‪ ,‬קריטריוני הצמצום שבוצעו‬ ‫בתחילת התהליך‪.‬‬

‫‪Gene Discovery in Bladder Cancer‬‬ ‫‪Progression‬‬ ‫‪using cDNA Microarrays‬‬ ‫(‪)Microarrays workshop‬‬