Workshops

  • November 2019
  • PDF

This document was uploaded by user and they confirmed that they have the permission to share it. If you are author or own the copyright of this book, please report to us by using this DMCA report form. Report DMCA


Overview

Download & View Workshops as PDF for free.

More details

  • Words: 2,346
  • Pages: 8
‫)‪TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASES-1 (TIMP-1‬‬ ‫‪INHIBITS TUMOR GROWTH AND ANGIOGENESIS IN THE‬‬ ‫‪TIMP-1 TRANSGENIC MOUSE MODEL‬‬ ‫)‪(Workshop: Transgenic models in angiogenesis‬‬ ‫‪hTIMP-1: (human) tissue inhibitor matrix metalloproteinases-1‬‬ ‫‪ TIMP‬מוכר כחלבון מולטי‪-‬פונקציונלי‪ .‬תפקידו בסרטן לא ידוע‪ ,‬נתקבלו דיווחים סותרים‪:‬‬ ‫‪anti tumor activity .1‬‬ ‫‪tumor growth stimulation .2‬‬ ‫המחקר המתואר‪ :‬יצירת גן ‪ TIMP‬הנתון לבקרת אלבומין וביטוי ברקמת הכבד של עכברים‬ ‫(פרומוטר‪+‬מעצם‪ ,‬ייקרא בשם‪ .)TIMP-Tg-mice :‬קבוצת הבקרה‪ :‬עכברים הטרוזיגוטיים‬ ‫לגן החדש‪ .‬הושתל גידול סרטני (ארליך) בעכברים‪.‬‬ ‫‪ :In vivo‬הגידול דוכא (ע"י עצירת התפתחות כלי דם חדשים באזור) בעכברים הטרנסגנים‪,‬‬ ‫במידה רבה יותר מאשר בקבוצת הבקרה‪.‬‬ ‫‪ :In vitro‬הגן לא השפיע על שגשוג תאי אנדותל (שכבה דקה של תאי ציפוי) ושגשוג תאי‬ ‫הגידול‪ .‬לכן נסיק כי האפקט המדכא לא נובע מרעילות‪ .‬הגן דיכא משמעותית יצירת תאי אנדותל‬ ‫צינוריים‪.‬‬ ‫מעבר לכך‪ in vitro ,‬לא חל שינוי ברמות ‪)matrix metalloproteinase (MMP‬‬ ‫אולם כן נצפה שינוי במרקר הזה ‪( in vivo‬בעכברים ההומוזיגוטיים לעומת קבוצת הבקרה‬ ‫הטרוזיגוטית)‪.‬‬ ‫מכל האמור לעיל‪ ,‬נשער כי ‪ TIMP‬מדכא את ביטוי הסרטן ע"י דיכוי השלבים המאוחרים של‬ ‫אנגיוגנזה (כנראה בעקיפין)‪ TIMP .‬פועל בהתחלה להגברת הגידול (ע"י מניעת אפופטוזיס)‪,‬‬ ‫ולאחר מכן מדכא את הגידול‪.‬‬

‫‪Cell-type-specific gene delivery into neuronal cells in vitro‬‬ ‫‪and in vivo‬‬ ‫)‪(Workshop: Gene Therapy II‬‬ ‫המחקר מדגים העברת גנים ספציפית לתאי עצב‪ .‬עד למחקר‪ ,‬היו קיימות שיטות שהראו העדפה מסויימת‬ ‫לתאי עצב‪ ,‬בהזרקה ישירה למוח‪ ,‬אך לא היתה בנמצא שיטה להדביק ספציפית תאי עצב‪.‬‬ ‫לכן‪ ,‬יש צורך להנדס מעטפת חלבונית לוירוס‪ ,‬שתיקשר לתא‪-‬מטרה ידוע (=תא עצב)‪.‬‬ ‫כדי להעצים את ההדבקה ואת הספציפיות‪ ,‬השתמשו במרכיבים‪:‬‬ ‫‪ gag.1‬של וירוס עופות (‪)Rev-A‬‬ ‫‪ Pol.2‬של ‪)SNV )spleen necrosis virus‬‬ ‫‪ envelope protein.3‬של ‪)VSV )vesicular stomatitis virus‬‬ ‫‪.4‬גליקופרוטאינים של וירוס הכלבת (‪ ,)RV‬שידוע כבעל זיקה עצבית גבוהה‬ ‫‪ NLS.5‬הוחדר‪ ,‬כדי לאפשר הדבקה של תאים "שקטים" – בשלב ‪.)G0 )quiescent‬‬ ‫לא בטוח שניתן להדביק תאים אלו גם ‪.in vivo‬‬ ‫‪ – neo.6‬עמידות לאנטיביוטיקה ניאוצין‪.‬‬

‫‪Nonviral Cytokine Gene Therapy on an‬‬ ‫‪Orthotopic Bladder‬‬ ‫‪Cancer Model‬‬ ‫(‪)Gene Therapy workshop 1‬‬ ‫ציטוקין‪ :‬חלבון שמופרש מבלוטות הלימפה ומתווך בין‪-‬תאי‪ ,‬ומווסת תגובות חיסוניות‪.‬‬

‫‪ :MHC Class I‬קיימים על פני שטח כל תא בגוף‪ .‬מציגים כלפי חוץ סימן למערכת החיצונית‪ ,‬אם קיים‬ ‫בתוך התא וירוס – או לא‪.‬‬ ‫טיפולים נוכחיים לסרטן שלפוחית השתן (כמו ‪ )BCG‬כוללים הגברת פעילות של ציטוקינים‪ .‬אבל טיפול זה‬ ‫בעל תופעות לוואי מרובות‪ ,‬וכשליש מהמטופלים כלל אינם מגיבים אליו‪.‬‬ ‫שימוש בציטוקינים רקומביננטים יקר‪ ,‬ודורש חזרות מרובות משום שהציטוקינים אינם יציבים (זמן מחצית‬ ‫חיים בשלפוחית קצר מאוד)‪ .‬בנוסף‪ ,‬האפקט של הציטוקין הרקומביננטי מוגבל‪ ,‬משום שלבקטריה אין יכולת‬ ‫לבצע מודיפיקציות שלאחר‪-‬טרנסקריפציה (הדרושות לציטוקין)‪ .‬לכן כדאי להשתמש בהדבקת התאים‬ ‫בשלפוחית בגן קבוע שמייצר ציטוקין‪ .‬הטיפול ה"רגיל" (באמצעות אדנו‪-‬וירוס) אינו יעיל במקרה זה‪ ,‬משום‬ ‫שאין בשלפוחית השתן קולטנים לאדנו‪-‬וירוס במידה מספקת‪ .‬לכן בוצע שימוש בליפוזומים‪.‬‬ ‫בניסוי המתואר הוחדרו שני ציטוקינים‪:‬‬ ‫‪ :IFN-α1‬גליקופרוטאין‪ ,‬מבקר גידול תאי‪ ,‬התמיינות‪ ,‬מדכא ביטוי אונקוגנים‪ ,‬תומך אפופטוזיס‪ ,‬מפעיל‬ ‫לימפוציטים ומקרופאג'ים‪ .‬בפרט‪ :‬מסוגל לדכא גידול ע"י מניעת יצירת כלי דם חדשים‪.‬‬ ‫‪ :GM-CSF‬מעורר שגשוג‪/‬התבגרות‪/‬תיפקוד של תאי דם‪.‬‬ ‫מטרת הניסוי‪ :‬לבדוק את יעילות העברת ציטוקינים ככלי ריפוי‪.‬‬ ‫תוצאות‪ :‬לאחר ההדבקה‪ ,‬נצפתה עליה ברמת הציטוקינים לעומת הדבקה בוקטור בלבד – שבה אין עלייה‬ ‫בציטוקינים‪ .‬עליה ברמת ‪ MHC Class I‬בתאים‪ .‬דיכוי גדילת תאים סרטניים שהודבקו בציטוקינים‪.‬‬ ‫ניסויים ‪ in vivo‬תמכו בתוצאות המתוארות למעלה‪.‬‬ ‫מבחינת ריפוי בעזרת ציטוקין‪ :‬בקבוצת הבקרה שרדו פחות עכברים מאשר בקבוצות הניסוי (‪ .)69%‬מתוך‬ ‫שלוש קבוצות הניסוי‪ ,‬לשתיים החדירו סוג אחד של ציטוקין שונה (‪ 77‬ו‪ 92-‬אחוז הישרדות)‪ ,‬ולקבוצה‬ ‫השלישית החדירו שילוב של שני הציטוקינים (ואחוז ההישרדות היה ‪ .)100‬החוקרים השתמשו במספר‬ ‫אמצעים כדי לוודא שהגידול היה מוגבל לתחום השלפוחית (בדיקה שלאחר‪-‬המוות וכו')‪ ,‬וגם וידאו שלא היתה‬ ‫רעילות לתאים (לא היה שינוי במשקל הגוף בקבוצה המטופלת)‪.‬‬ ‫נקודות נוספות בניסוי‪:‬‬ ‫‪.1‬החוקרים הצליחו להחדיר סרטן לרקמה ספציפית‪ ,‬בלי ליצור גרורות בטכניקה של צריבת‬ ‫האזור‪ ,‬והדבקת האזור הצרוב בתאים סרטניים‪ .‬שיטות אחרות לא מפיקות תוצאות כאלו‪.‬‬ ‫‪.2‬הדבקה באמצעות ליפוזום‪ .‬בעזרת הגן המדווח נצפתה הדבקה גם בשכבות העמוקות‪-‬פנימיות‬ ‫של הגידול‪ ,‬בעוד שהדבקה עם אדנו‪-‬וירוס נותנת הדבקה שטחית בלבד‪ .‬סברה‪ :‬שכבה של תאי‬ ‫אפיתל שהתמיינו לחלוטין מהווה מחסום בפני ההדבקה הויראלית‪.‬‬ ‫**** הערה שלי‪ :‬לפני החדרת ציטוקין נרצה לבדוק שהוא באמת משתתף פעיל בדיכוי הסרטן‪ ,‬או בכלל‬ ‫ללמוד את השפעתו‪ ,‬כדי שנוכל לבדוק אותה ‪ .in vivo‬אם מחדירים שני ציטוקינים‪ ,‬כדאי לבדוק אם הם‬ ‫פועלים יחד או לא‪.‬‬

‫‪Fine mapping of the 2p11 dyslexia locus‬‬ ‫‪and exclusion of TACR1as a candidate gene‬‬ ‫)‪(SNPs workshop‬‬ ‫דיסלקציה מיוחסת לחמישה גנים לפחות‪.‬‬ ‫מיפוי של ‪ ,2q11‬לוקוס של ליקויי למידה וביטול של (‪ tachykinin receptor1)TACR1‬כגן‬ ‫מועמד‪.‬‬ ‫מחקרי עבר מצאו קישור ללוקוס זה‪ .‬מטרת המחקר היא למצוא ברזולוציה גבוהה מיפוי של כ‪ 40-‬ס"מ אזור‬ ‫המקושר בכרומוזום ‪ 2‬ולצמצם את האזור החשוד בקשר באמצעות ‪ SNPs‬וסמני ‪.microsatellite‬‬

‫‪ - microsatellite‬משטחים חוזרים של מקטעי ‪ DNA‬קצרים המשמשים כסמנים גנטיים לאיתור תורשה‬ ‫במשפחות‪.‬‬ ‫התבצע מיפוי באמצעות מבט על משפחות פיניות‪ microsatellite markers 21 ,‬ו‪SNPs 6-‬‬ ‫‪ . markers‬באמצעות הגלאים הללו התבצע עידון של האזור המעורב לכדי ‪ 10.5‬ס"מ‪.‬‬ ‫‪ – TACR1‬גן המקודד ‪ G-protein receptor‬ל‪ tachkinin-‬ומעורב בפעילות עצבית ומצבי רוח‪,‬‬ ‫נבחן ברמת מוטציות כגן שיכול להשפיע על המחלה כיוון שהוא ממוקם באזור המעורב‪ .‬כיוון שלא התגלו‬ ‫מוטציות אצל הנחקרים ומכיוון שלא נמצאו ‪ haplotypes‬שונים באזור שנבחן ע"י ‪ SNPs 6‬הממוקמים‬ ‫בגן זה או סביבתו‪ ,‬הוסק שאין השפעה לגן על המחלה‪.‬‬ ‫על מנת לנתח את המבנה התורשתי כללי השתמשו ב‪ MA-‬וב‪ .SNP-‬ה‪ SNPs-‬נבחרו ממאגרי ‪SNPs‬‬ ‫ידועים בבני אדם וכאלו הידועים בקרבתם לחלק המקודד של ‪.TACR1‬‬ ‫מסריקה של הכרומוזום ע"י מספר גלאים‪ ,‬נעשתה בדיקה סביב האזור בו הסמן היה הכי דומיננטי אצל‬ ‫החולים‪ .‬כיוון שסמן זה היה במיקום המקודד את ‪ TACR1‬ניסו למצוא מוטציה בגן הגורמת למחלה‪ .‬עם זאת‬ ‫לא נמצאה אף מוטציה בגן‪ .‬נמצא פולימורפיזם לשני ‪ SNPs‬אך לא נמצא קשר ביניהם למחלה בנפרד ואף לא‬ ‫כ‪ .Haplotype -‬גם לאחר הוספת סריקה עם ‪ SNPs‬נוספים לא נמצא קישור של הגן במחלה אך הצליחו‬ ‫לצמצם את האזור המעורב על הכרומוזום‪.‬‬

‫‪Positional cloning of the major quantitative trait‬‬ ‫‪locus underlying lung tumor susceptibility in mice‬‬ ‫)‪(Positional Cloning workshop‬‬ ‫‪QTL – Quantitative Trait Locus‬‬ ‫תפקוד ומיקום משוער של הגן ידועים ומחפשים אחר הגן עצמו‪.‬‬ ‫מטרה‪ :‬זיהוי גנים שעשויים להיות הגורמים לרגישות לסרטן הריאות ע"י טכניקת ‪.positional cloning‬‬ ‫ידוע כי נוסף על גורמים סביבתיים‪ ,‬יש מרכיב גנטי במחלה‪ .‬אולם‪ ,‬ההטרוגניות הגנטית יחד עם תנאי הסביבה‬ ‫המשתנים בין חולה לחולה מקשים על הנסיון לזהות לוקוסים‪ .‬לכן‪ ,‬מבוצעים מחקרים על חיות מודל –‬ ‫עכברים‪ .‬מחקרים קודמים מיקמו את אחד הלוקוסים התורמים בשם ‪ pas1‬על מקטע מסויים בכרומוזום ‪.6‬‬ ‫תהליך‪ :‬המקטע של ‪ Pas1‬נלקח מזן של עכברים שידוע כרגיש במיוחד (‪ )A/J‬לסרטן הריאות‪ .‬המקטע‬ ‫הונדס‪ ,‬ונתחם ע"י שני מרקרים ידועים‪ ,‬והושתל בזן אחר (‪ ,)C57BL/6J‬שידוע כמתנגד לסרטן הריאות‪.‬‬ ‫בוצעו הכלאות חוזרות (‪ )repeated backcrosses‬עם דור ההורים הראשון‪ ,‬ובדור ה‪ 8-‬נלקחו ‪132‬‬ ‫זכרים‪ ,‬כל אחד מהם מכיל מקטע שונה של הכרומוזום‪ .‬זכרים אלה עם ‪ 3‬נקבות מאותו הזן המקורי שחסין‬ ‫(יחסית) לסרטן הריאות‪ ,‬והעמידו את הדור ה‪ .9-‬דור זה היה ‪( congenic‬כל הפרטים זהים גנטית‪ ,‬פרט‬ ‫ללוקוס בודד)‪.‬‬ ‫‪.1‬מבין עכברי הדור ה‪ ,9-‬נבררו עכברים מסויימים‪ ,‬על‪-‬סמך מרקרים גנטים ידועים‪ .‬עכברים אלו‬ ‫הודבקו בסרטן בגיל ‪ 5‬שבועות‪ ,‬והומתו ‪ 7.5‬חודשים לאחר‪-‬מכן‪ .‬הגידולים הסרטניים הוסרו‪,‬‬ ‫ונמדדו (מספר‪ ,‬נפח)‪ .‬כמו‪-‬כן‪ ,‬נמדדו השונויות בין הקבוצה המטופלת לבין קבוצת הביקורת‪.‬‬ ‫‪.2‬רנ"א נלקח מתאי הריאות של העכברים‪ .‬בוצע ‪ RT-PCR‬ואנליזת ‪.Northern Blot‬‬ ‫הקבוצה המטופלת פיתחה ‪ 6‬גידולים בנפח ‪ 1.91‬מ"מ מעוקב בממוצע לעכבר לעומת ‪ 0.7‬גידולים בנפח‬ ‫ממוצע ‪ 0.18‬מ"מ מעוקב בקבוצת הביקורת‪ .‬בצורה זו‪ ,‬צומצם האזור הראשוני מ‪ 32-‬מ"ב ל‪ 0.5‬מ"ב‪.‬‬

‫באזור שנמצא‪ 12 ,‬גנים משוערים‪ .‬ביטוי של ‪ 6‬מתוכם ברקמת הריאה אכן אושר‪ ,‬ע"י ‪ PCR‬ונורת'‪-‬בלוט‪.‬‬ ‫לאחר מכן‪ ,‬בוצע חיפוש ל‪ -functional polymorphism‬ואכן נתגלו ‪ 5‬גנים שהכילו פולימורפיזם‬ ‫כזה‪ ,‬או לחלופין הראו ביטוי שונה בין שני הזנים (הרגיש לסרטן והחסין לסרטן)‪ 5 .‬גנים אלו הפכו‬ ‫למועמדים סופיים לגן‪ .‬כדי לברור מי מהם בדיוק‪ ,‬נעשו ניסויים בהם בדקו מי מבין ‪ 5‬הגנים מדכא‪/‬מעורר‬ ‫גידול סרטני ב‪ cell lines-‬של עכבר‪ .‬רק אחד ענה לדרישות‪ .Las1 :‬כשהשתמשו ב‪ Las1‬מהזן הרגיש‬ ‫לסרטן‪ ,‬נוצרו גידולים סרטניים‪ .‬לעומת זאת‪ Las1 ,‬שנלקח מהזן החסין מנע כל גידול סרטני (‪in vivo‬‬ ‫‪.)and in vitro‬‬ ‫נתגלה כי פולימורפיזם מסויים (‪ AGT‬לעומת ‪ AAT‬בקודון ‪ )60‬קיים בזנים העמידים‪ ,‬לעומת הזנים‬ ‫הרגישים והרגישים למחצה‪ .‬לאחר מכן בדקו החוקרים את המיקום בתא בו ‪ Las1‬מתבטא‪ ,‬ומצאו‬ ‫הומולוגים במינים אחרים‪.‬‬ ‫החוקרים הגדילו ראש‪ ,‬ובדקו מועמד נוסף מבין ‪ 5‬הגנים‪ ,‬למרות שלא נצפתה בו ‪functional‬‬ ‫‪ :polymorphism‬הגן ‪ Kras2‬אלא רק ביטוי מוגבר של אחד האללים‪ .‬מסקנות‪ :‬ביטוי הגן לא משפיע‬ ‫על מספר הגידולים‪ ,‬אבל תורם לנפח מוגדל שלהם‪ .‬לאחר בדיקה נוספת‪ ,‬החוקרים גילו כי ‪ Kras2‬שהגיע‬ ‫מהזן הרגיש‪ ,‬מתבטא יותר בגידול סרטני‪ ,‬מאשר האלל שהגיע מהזן החסין‪.‬‬

‫‪Adenovirus-mediated Gα q-protein antisense transfer in‬‬ ‫‪neurons replicates Gα q gene knockout strategies‬‬ ‫מושגים‪:‬‬ ‫•‪ :Antisense‬מנגנון המונע ביטוי גן ע"י התערבות בשלב התרגום‬ ‫•‪ :G-protein‬משפחת חלבונים הטרו‪-‬טרימריים‪ ,‬הנמצאים בחלק התוך‪-‬תאי של הממברנה‪.‬‬ ‫החלבונים קושרים אליהם רצפטורים ובאמצעות שינוים מבניים והידרוליזה של ‪ GTP‬גורמים‬ ‫לשינוי במצב התעלות בתא (במישרין או בעקיפין)‪ ,‬ובכך מצמדים תגובות פנים‪-‬תאיות‬ ‫לרצפטורים על גבי התא‪.‬‬ ‫•אדנווירוס‪ :‬וירוס הגורם לדלקות בדרכי הנשימה ובעיניים‪.‬‬ ‫•‪ :Ganglion‬גנגליון‪ ,‬צבר תאי עצב‬ ‫רקע‪:‬‬ ‫שינוי תבניות ביטוי של גנים באמצעות אסטרטגיות ‪ antisense‬הוא נושא שראוי לבחינה‪ ,‬הן מנקודת מבט‬ ‫רפואית‪-‬טיפולית‪ ,‬והן מנקודת מבט מחקרית‪ .‬גישות ‪ antisense‬מנוצלות בשיעור גבוה בניתוח של ‪signal‬‬ ‫‪ pathways‬בין רצפטורים על גבי התא‪ ,‬ובין גורמים פעילים בפנים התא‪ ,‬והן יעילות במיוחד הודות‬ ‫לספציפיות הגבוהה שלהן‪.‬‬ ‫מוטיבציה‪:‬‬ ‫מחקרים קודמים איפשרו לזהות את תתי‪-‬היחידות של ‪ G-Protein‬המעורבים בדיכוי ‪ M-Channels‬של‬ ‫אשלגן‪ ,‬וב ‪ -N-channels‬של סידן‪ ,‬ב‪ SCG-‬של עכברוש‪ .‬אולם התוצאות שהופקו מגישות אלו סבלו‬ ‫מהגבלות ומאי‪-‬דיוקים‪ :‬תוצאות של ‪ oligonucleotides antisense‬לא היו עקביות‪ ,‬ושימוש ב ‪cDNA‬‬

‫‪ Expression Vector‬חייב הזרקה לפנים‪-‬הגרעין או הדבקה של תת‪-‬אוכלוסיה בשלב מיטוזה‪ .‬היה צורך‬ ‫ממשי בשיטה חדשה שתאפשר העברת הגן לאוכלוסיות תאים גדולות ולתאי עצב פחות סובלניים לשיטות‬ ‫ההחדרה הקודמות‪.‬‬ ‫שיטות‪:‬‬ ‫•מושבות תאים‪ :‬נוירונים מ‪ SCG-‬הופרדו מעכברושים צעירים ז"ל (בני ‪ 15-19‬יום)‪ ,‬וגודלו‬ ‫על זכוכיות‪ .‬העכברושים הומתו בעריפת ראשם‪ ,‬לא לפני ששאפו כמות נכבדת של פחמן‪-‬דו‪-‬‬ ‫חמצני – והכל ע"פ חוק בע"ח הבריטי (‪.)1986‬‬ ‫•ייצור אדנו‪-‬וירוס רקומביננט וההדבקה‪ :‬רצף ה‪ antisense-‬תואם לנוקלאוטידים ‪29-129‬‬ ‫בקצה ‪ '3‬של ה‪ UTR-‬בגן הרלבנטי בעכברוש‪ .‬הרצף ייחודי ל ‪( Gαq -protein‬גם על פני‬ ‫יחידות אלפא אחרות)‪ .‬הוירוסים הודבקו באמצעות פלסמיד והוגברו במשך ארבעה מחזורים‪.‬‬ ‫ההדבקה אושרה באמצעות בדיקת רצפים ובאמצעים נוספים (כמו ה‪ GFP-‬גן מדווח) בנוסף‪,‬‬ ‫נעשה שימוש בקבוצת מבחן של וירוסים שלא הודבקו במולקולת האנטי‪-‬סנס‪.‬‬ ‫•‪ :Immunofluorescence‬שימוש בצבע פלורוסנטי הקשור לנוגדנים לצורך זיהוי או כימות‬ ‫אנטיגנים‪.‬‬

‫תוצאות‪:‬‬ ‫•נמצא ריכוז וירוסים שיתן הדבקה אופטימלית של נוירונים‪ ,‬בפרק זמן סביר‪.‬‬ ‫•לאחר ההדבקה‪ ,‬נבדקה התפתחות פתולוגית ע"י הדגרת התאים המודבקים יחד עם צבע הנבלע‬ ‫ע"י תאים עם ממברנה פגומה‪ ,‬ונקשר לחומצות גרעין (‪ .)nucleic acids‬הצבע ניתן בריכוזים‬ ‫משתנים‪ .‬הריכוז שנבחר לבסוף לביצוע כל הניסויים הוא זה שנתן תאים חיים במשך זמן רב‬ ‫ביותר‪.‬‬ ‫•שיעור ההדבקה (כאשר נעשה שימוש בריכוז וירוסים אופטימלי‪ :‬שיעור הדבקה גבוה ושיעור‬ ‫פתוגני נמוך) עמד על למעלה מ‪ 60%-‬במושבה הראשית‪ ,‬ורוב התאים ב‪ cell line-‬הודבקו אף‬ ‫הם‪ .‬זהו שיפור גדול לעומת ההזרקה התוך‪-‬גרעינית‪ ,‬בה הזריקו למספר תאים בכל פעם‪.‬‬ ‫•ברוב התאים המודבקים‪ ,‬ניתן היה לראות ירידה ברורה של ביטוי ‪ Gαq‬בהשוואה לקבוצות‬ ‫הבקרה‪.‬‬ ‫•‪ Gαq‬הכרחי לתפקוד תקין של תעלת הסידן בתא‪ .‬בתאים שהודבקו בוירוס‪ ,‬חלה ירידה ניכרת‬ ‫בשחרור סידן ממאגרי התא‪.‬‬ ‫דיון‪:‬‬

‫•אדנו‪-‬וירוס רקומביננטי יכול בהצלחה להעביר אנטי‪-‬סנס למושבות‪,‬‬ ‫•ההעברה מתבטאת בהפחתה ספציפית של תת‪-‬היחידה הרלבנטית‪ ,‬וכתוצאה ישירה מכך נגרמת‬ ‫הפחתה בפעילות המתווכת ע"י תת יחידה זו‪.‬‬ ‫•החדרת אנטיסנס ויראלית משכפלת תוצאות שהושגו באמצעות אסטרטגיות השתקה אחרות‪.‬‬

‫סיכום‪:‬‬ ‫•שימוש באדנו‪-‬וירוס רקומביננטי כדי להעביר אנטיסנס של ‪ G-Protein αq‬לנוירונים ב‪SCG-‬‬ ‫(גנגליון) של עכברוש‪ ,‬ול‪ cell lines-‬נוירונליים‪.‬‬

‫•הטרנספקציה בוצעה כדי לפענח תהליכים הקשורים לחלבון הנ"ל ולמערכת העברת האותות‬ ‫התאית‪ .‬התוצאות הושוו לאסטרטגיות השתקה (‪ )knockdown‬מוכרות של ‪Gαq )antisense‬‬ ‫‪ )plasmid, knockout mouse‬ואכן נתגלה מתאם גבוה של חזרה על התוצאות‪.‬‬ ‫•הדבקות ב ‪ -GαqASAdV‬הורידו בצורה סלקטיבית את האימונו‪-‬ראקטיביות לחלבון‪ .‬ביטוי ‪G‬‬ ‫‪ αProtein‬אחרים לא שונה‪.‬‬

‫‪A Preliminary Transcriptome Map of Non-Small Cell Lung Cancer‬‬ ‫(‪)Transcriptome Workshop‬‬ ‫‪SAGE = Serial Analysis of Gene Expression‬‬ ‫בניית מפת הטרנסקריפטום‪ :‬נלקח מידע מספריות ‪ ,SAGE‬טויטת הגנום‪ ,‬מאגרי מידע ציבוריים ועוד‪.‬‬ ‫כל ‪ tag‬במידע זוהה ייחודית לגן אחד (חזרות נמחקו)‪.‬‬ ‫באמצעים מתמטיים‪-‬סטטיסטיים‪ ,‬חולקו הגנים לצבירים (‪ )clusters‬ע"פ תבנית ההתבטאות שלהם ביחס לשני‬ ‫סוגים של סרטן‪ ,‬ולרקמה בריאה‪.‬‬ ‫מתוך טיוטת הגנום ‪:‬הגיעו החוקרים ל‪ -27,542‬קלאסטרים‪ ,‬מתוכם ל‪ 26,992-‬היתה התאמה ייחודית למיקום‬ ‫בכרומוזום כלשהו‪ .‬מספר זה מתיישב עם הערכת הגנים בגנום (‪.)25k-40k‬‬ ‫מתוך ספריות ‪ SAGE: 374,643 tags‬נלקחו מ‪ 9-‬ספריות‪ .‬ראשית נבחרו טאגים בעלי זיקה לרקמות הריאה‬ ‫ואפיתל של מערכת הנשימה‪ .‬צמצום נוסף נעשה ע"י מחיקת טאגים שמקושרים לדנ"א מיטוכונדריאלי‪ ,‬או‬ ‫לרנ"א ריבוזומלי‪ .‬הטאגים שהופיעו ביותר מספריה אחת נבחרו לטיוטה הסופית‪ .‬בוצע מיפוי של הטאגים‬ ‫לגנים‪ .‬טאגים שמופו ליותר ממקום אחד – נמחקו גם כן‪ .‬סתירה מסויימת במספר הקלאסטרים הסופיים‬ ‫מיושבת ע"י ההשערה הבאה‪ alternative splicing :‬ונוכחות של מספר אתרים לביצוע פוליאדנילציה‬ ‫(=מוביל למספר טאגים של ‪ SAGE‬עבור גן בודד)‪.‬‬ ‫סה"כ‪ ,‬נמצאו מספר אזורים בעלי ביטוי מוגבר (פי ‪ 3‬או ‪ )4‬ומופחת (‪ 50-65%‬מהנורמל) בהתאם לרקמה‬ ‫(סרטנית או לא)‪.‬‬ ‫עבור סוג אחד של סרטן (‪ ,)adenocarcinoma‬נתגלו תבניות ביטוי מופחתות של קלאסטרים במתאם‬ ‫סטטיסטי תקין‪ .‬אולם‪ ,‬תבניות ביטוי מוגבר נתגלה עם ‪ ,p=0.5652‬כלומר תיתכן אקראיות ולא ניתן להסתמך‬ ‫על התוצאה‪ .‬הסבר משוער למקדם המתאם‪:‬‬ ‫‪.1‬בגלל המיקום של סרטן זה (היקפי)‪ ,‬תבנית ביטוי הגנים שלו דומה לתבנית‬ ‫הביטוי ברקמה לא‪-‬סרטנית‪.‬‬ ‫‪.2‬מספר ה‪ -SAGE tags‬אינו מספיק לביצוע מחקר‪.‬‬ ‫‪.3‬תת‪-‬סוגים רבים של סרטן זה‪.‬‬ ‫לכן התמקדו החוקרים בסוג השני של הסרטן‪ ,squamous tumors :‬עבורו נמצאו ‪ 15‬צבירים עם ביטוי‬ ‫מוגבר‪ ,‬ו‪ 28-‬עם ביטוי מופחת‪.‬‬ ‫איזורים מוגברים‪ :‬מתוך ‪ 15‬האיזורים המוגברים‪ 9 ,‬תואמים לתוצאות מחקרים קודמים‪ .‬גנים שבעבר נחשבו‬ ‫קשורים למחלה‪ ,‬לא בוטאו כלל במחקר הנוכחי‪ .‬רק הגן ‪( p63‬הומולוג של ‪ )p53‬נמצא כמועמד לגן משום‬ ‫שהוא הוגבר במחקר הנוכחי‪ ,‬והתוצאות תואמות למחקרים קודמים‪.‬‬ ‫איזורים מופחתים‪ :‬מתוך ‪ 28‬אזורים כאלה‪ 13 ,‬תאמו למחקרים קודמים‪.‬‬ ‫נמצאה חלוקה לא שווה של אזורים עם ביטוי דיפרנציאלי לאורך הגנום‪ .‬אבחנה זו מתיישבת עם ידע קודם‬ ‫בנוגע לכך ששינויים גנטיים משפיעים לרוב על סטים של גנים הממוקמים בקירבה פיזית‪ .‬אפשר לנצל עובדה‬ ‫זאת כדי לספק מרקרים חלופיים לסרטן‪ .‬עם זאת‪ ,‬אין להסתמך רק על כך משום שבכל קלאסטר‪ ,‬היו מספר‬ ‫גנים עם תבניות ביטוי שונות‪.‬‬

‫בעיות‪ :‬לא כל הגנים המוגברים – מבוטאים ביתר (ולהיפך)‬ ‫מפת הטרנסקריפטום שהוכנה ע"י החוקרים‪ ,‬רגישה יותר לאזורים שמבוטאים ביתר‪ .‬לא נצפה ‪clustering‬‬ ‫במספר אזורים שידוע כי הם נמחקים בסרטן ‪ .squamous‬אי‪-‬גילוי איזורים שנמחקו יכול להיות מוסבר בכך‬ ‫שרמת הביטוי של אותם איזורים‪ ,‬ממילא היה נמוך גם בנורמל‪ .‬ניתן לראות נתונים אלו בטבלאות במאמר‪:‬‬ ‫ביטוי‪-‬יתר מאופיין ע"י ביטוי של פי ‪ ,3-4‬לעומת ביטוי‪-‬חסר שמאופיין ב‪ 50%-‬ביטוי מהנורמל‪ .‬לכן סביר‬ ‫להניח‪ ,‬שגנים בביטוי‪-‬יתר מזוהים בקלות רבה יותר‪ ,‬בעוד שגנים בביטוי‪-‬חסר מיוצגים פחות מדי במפה‪.‬‬ ‫בנוסף לכל האמור לעיל‪ ,‬דיוק המפה הנוכחית מוגבל ע"י דיוק טיוטת הגנום‪ ,‬קריטריוני הצמצום שבוצעו‬ ‫בתחילת התהליך‪.‬‬

‫‪Gene Discovery in Bladder Cancer‬‬ ‫‪Progression‬‬ ‫‪using cDNA Microarrays‬‬ ‫(‪)Microarrays workshop‬‬

Related Documents

Workshops
December 2019 24
Workshops
August 2019 30
Workshops
November 2019 25
Workshops
May 2020 19
Workshops
May 2020 15
Ch6 Workshops
November 2019 12