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IL PROGETTO GENOMA UMANO Nature 431, 931 ­ 945 (21 October 2004); doi:10.1038/nature03001   Finishing the euchromatic sequence of the human genome INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM A list of authors and their affiliations appears in the Supplementary Information Correspondence and requests for materials should be addressed to F .S. Collins  ([email protected]), E. S. Lander ([email protected]), J. Rogers ([email protected])  or R. H. Waterston ([email protected]).  The sequence described here has been deposited in public databases, with the 24  human chromosomes having accession numbers NC000001 to NC000024. The sequence of the human genome encodes the genetic instructions for human physiology, as  well  as  rich  information  about  human  evolution.  In  2001,  the  International  Human  Genome  Sequencing  Consortium  reported  a  draft  sequence  of  the  euchromatic  portion  of  the  human  genome.  Since  then,  the  international  collaboration  has  worked  to  convert  this  draft  into  a  genome sequence with high accuracy and nearly complete coverage. Here, we report the result of  this finishing process. The current genome sequence (Build 35) contains 2.85 billion nucleotides  interrupted  by  only  341  gaps.  It  covers  99%  of  the  euchromatic  genome  and  is  accurate  to  an  error rate of 1 event per 100,000 bases. Many of the remaining euchromatic gaps are associated  with  segmental  duplications  and  will  require  focused  work  with  new  methods.  The  near­ complete  sequence,  the  first  for  a  vertebrate,  greatly  improves  the  precision  of  biological  analyses of the human genome including studies of gene number, birth and death. Notably, the  human  genome  seems  to  encode  only  20,000–25,000  protein­coding  genes.  The  genome  sequence reported here should serve as a firm foundation for biomedical research in the decades  ahead.

LA MAPPA FISICA DEL GENOMA Si usano vettori ad inserti lunghi (es. Library in YAC)

Per prima cosa, si determinano i CONTIG, cioè set di cloni che si sovrappongono parzialmente. Via via che l’assemblaggio va avanti, i contig diventano equivalenti ad un unico cromosoma

Il processo è agevolato se, invece di digerire tutto il DNA genomico, si digerisce il DNA di uno specifico tipo di cromosoma, separato mediante FACS

Fluoroforo 1: AT Fluoroforo 2: GC

Come si assemblano i contig? DETERMINAZIONE DELL’ORDINE ATTRAVERSO Sequence-Tagged Sites (STS) E EST STS: corta sequenza di DNA UNICA che viene ottenuta da inserti clonati più lunghi (es: genoteca in fago λ).

Si disegnano coppie di primers per PCR in grado di amplificare ciascuna TAG

La presenza di un amplificato indica che nel clone da YAC è presente la TAG

Se uno stesso amplificato compare in due diversi cloni da YAC vuol dire che si sovrappongono e si costituisce il contig

IL SEQUENZIAMENTO AUTOMATIZZATO DEL DNA

Un esempio: il clonaggio e la mappatura del cromosoma

Y

Purificazione di cromosomi Y mediante FACS

Digestione

Genoteca in cloni di fago λ

Sequenziamento parziale e disegno di coppie di primers per STS (160 paia di primers)

Ulteriore suddivisione dei pool positivi fino ad assegnare una STS ad uno YAC Sequenziamento dei cloni= sequenziamento del cromosoma

Digestione più incompleta

Genoteca in cloni di YAC (10368 cloni; inserti ≈650 kb Ogni regione rappresentata in media 4 volte)

Suddivisione in 18 pool e amplificazione con le coppie di primers

L’attribuzione del contenuto totale Di STS di ogni YAC permette La sovrapposizione e l’allineamento nei contig

La tecnica della PCR, unitamente alle recenti acquisizioni sulla sequenza del genoma umano, consente di clonare direttamente un gene specifico, senza bisogno di costruire delle genoteche

-Devono essere note le sequenze che fiancheggiano la regione da clonare -La regione da clonare non deve essere troppo lunga

I VETTORI DI ESPRESSIONE

L’ESPRESSIONE DI UN GENE CLONATO

Produzione di proteine di Interesse commerciale, (farmacologico, terapeutico, Industriale, ecc.)

Studio della funzione di una proteina

VETTORE DI ESPRESSIONE E’ un vettore di clonazione Deve permettere, sia la TRASCRIZIONE (=PROMOTORI trascrizionali), sia la TRADUZIONE (=SITO DI ATTACCO DEL RIBOSOMA) del gene

-GLI OSPITI FINALI PIÙ COMODI PER LA PRODUZIONE COMMERCIALE SONO I BATTERI, IN PARTICOLARE E.coli.

PROTEINE RICOMBINANTI IMPORTANTI PER L’USO TERAPEUTICO UMANO PRODOTTE IN E. coli E APPROVATE DALL’FDA

Categoria terapeutica

Prodotto

Indicazioni in breve

Ormone di interesse terapeutico

Insulina umana

Trattamento del diabete

Insulina glargine Insulina lispro Insulina glucolisine

Derivati dell’insulina mutagenizzati

Somatotropina

Trattamento delle deficienze della crescita

Fattori di crescita ematopoietici

Filgrastim

Derivato del G-CSF Riduzione della durata della neutropenia e dell’incidenza della neutropenia febbrile in pazienti neoplastici trattati con chemioterapici citotossici

Agenti trombolitici

Reteplase Saruplase

Interferoni umani

Interleuchine umane

Derivati dell’attivatore del plasminogeno. Infarto miocardico acuto

Interferone alfa-2b

Trattamento di: leucemia a hairy cells; epatite cronica B e C; AIDS; cancro

Interferone beta 1-b

Trattamento della sclerosi multipla

Interferone gamma

Trattamento della granulomatosi cronica

IL-2

Carcinoma renale

IL-11

Trattamento della trombocitopenia

COME SI CONVINCE UN BATTERIO A PRODURRE UNA PROTEINA DI ORIGiNE EUCARIOTA??

1) Il gene deve essere sotto forma di cDNA 2) Bisogna adattare l’accoppiata cDNA/vettore in modo da consentire al batterio di effettuare la trascrizione e la traduzione -Promotore -Inizio della trascrizione -Terminazione della trascrizione -Inizio della traduzione proteina

RNAm

L’inizio e la fine della trascrizione sono molto diversi nei batteri e negli eucarioti I batteri hanno un’unica RNA polimerasi

NUCLEO (β,β , 2α) Fattore σ

Il nucleo dell’RNA pol ha bassa processività

RNA polimerasi = Nucleo pol + fattore σ

L’RNA pol trova un segnale di termine e si stacca dal DNA stampo

Il fattore σ riconosce il promotore e induce l’assocoazione del nucleo dell’RNA pol con il DNA

L’RNA pol inizia a svolgere il DNA…..

L’RNA pol polimerizza l’RNA rapidamente (50 NTP/sec) con alta processività

…e comincia a trascrivere (inizio abortivo)

5’

3’

Il fattore si stacca. L’RNA pol cambia conformazione

Segnali di inizio della trascrizione (promotori) nei batteri

Sequenza di consenso

-E’ ad essi (DNA a doppio filamento) che si lega il fattore σ

-Le regioni più conservate (che interagiscono con il fattore σ) sono nelle regioni -10 e -35 -Le alternative nucleotidiche nelle posizioni -10 e -35 determinano la forza con cui il fattore σ si lega al promotore e quindi la frequenza con cui il gene verrà trascritto. E’ un meccanismo regolativo

I promotori sono asimmetrici: l’orientamento del promotore indica quale dei due filamenti di DNA verrà trascritto

La terminazione della trascrizione nei batteri

Segnale di termine (TERMINATORE) del DNA: E’ costituito da una sequenza simmetrica di DNA seguita da una fila di coppie A-T

Legame debole DNA/RNAm

Forza la pinna ad aprirsi

L’inizio della trascrizione negli eucarioti TYPE OF POLYMERASE                         

GENES TRANSCRIBED

RNA polymerase I                                        

5.8S, 18S, and 28S rRNA genes

RNA polymerase II

all protein­coding genes, plus snoRNA  genes and some snRNA genes

RNA polymerase III

                     

tRNA genes, 5S rRNA genes, some snRNA genes and genes for other small RNAs

-La RNA-polimerasi II, anche in vitro, non può iniziare a trascrivere senza l’aiuto dei FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE

-In vivo, bisogna anche tenere conto del compattamento del DNA nei nucleosomi e in forme di ordine di struttura superiore

Ingredienti per la trascrizione in vitro in una cellula eucariota

Ingredienti per la trascrizione in vivo in una cellula eucariota

Più di cento singole subunità!!!

L’allungamento della trascrizione negli eucarioti è strettamente accoppiata alla modificazione dell’RNAm

La terminazione della trascrizione negli eucarioti è completamente diversa da quella dei procarioti

La RNA-polII continua a polimerizzare anche dopo il taglio dell’RNAm. Come perde la processività? BOH?!?

Anche l’inizio della traduzione è diverso tra batteri ed eucarioti

Negli eucarioti il ribosoma riconosce l’AUG in prossimità del cap presente in 5’ dell’RNAm

Lega direttamente Il Cap

Il complesso si sposta in 5’ 3’ per cercare il 1° AUG

I° RNAt

Il sito di attacco del ribosoma nei batteri: le sequenze Shine Dalgarno

5’-AGGAGGU-3’

Segnala al ribosoma la posizione dell’AUG giusto da cui iniziare la traduzione. E’ posta a poche basi a monte dell’AUG Forma coppie di basi con l’rRNA 16S della subunità 30S del ribosoma Permette l’inizio della traduzione da siti AUG Interni all’RNAm

Riassumendo: i batteri 3) 4) 5) 6)

Non fanno splicing Hanno promotori diversi (riconosciuti dal fattore σ) Hanno una terminazione della trascrizione diversa Hanno un inizio della traduzione diverso (sequenze ShineDalgarno)

terminatore

Si inganna il batterio utilizzando il cDNA ed inserendo opportunamente le sequenze regolatrici nel vettore di espressione

pro = promotore batterico SD = sequenza Shine-Dalgarno T

T= terminatore batterico

COME SI REGOLA L’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI? 1)

La scelta del PROMOTORE

FORTE

REGOLABILE

Per produrre tanta proteina

Per produrla al momento giusto

Sigma Factor   Promoters Recognized

                                                      Promoter Consensus  −35 Region               −10 Region σ70    Most genes         TTGACAT               TATAAT σ32    Genes induced by heat shock                                 TCTCNCCCTTGA             CCCCATNTA σ28    Genes for motility and chemotaxis           CTAAA                                 CCGATAT σ38    Genes for stationary phase and stress response             ?                     ?     −24 Region                           −12 Region σ54    Genes for nitrogen metabolism and other functions      CTGGNA               TTGCA

Si usano promotori riconosciuti dal fattore σ 70

Alcuni promotori utilizzati nei vettori di espressione per batteri

plac

IPTG (isopropil-b-D-tiogalattopiranoside): induttore gratuito di plac

placUV5:

derivato di plac: ha mutazioni in -10 che lo rendono più forte del wild-type

ptrp

Il fago ha un controllo genetico operone-simile che regola i due stati vitali

PL

cI: repressore di cro, PL e PR

Impedisce la produzione delle proteine della fase litica

cIts:

PLinattivo

mutante temperatura-sensibile del repressore cI

28°C

cIts

42°C

PL attivo

Come si regola l’espressione genica nei procarioti? 2) IL NUMERO DI COPIE DEL PLASMIDE ORI1

Sostituzione dell’ORI

ORI2

Plasmide con ORI efficiente

Plasmide efficiente nella regolazione della trascrizione e traduzione ma con ORI poco efficiente

Ulteriore incremento dell’espressione

L’INTEGRAZIONE DEL DNA NEL CROMOSOMA BATTERICO 1) Le cellule possono perdere il plasmide per SOVRACCARICO METABOLICO Utilizzare marcatori di selezione può essere costoso per preparazioni su larga scala

Fermentatore con unità di dispersione di microbolle

2) I batteri devono essere rilasciati nell’ambiente

Si effettua per GENE TARGETING Definizione generale GENE TARGETING: pilotare la ricombinazione Del DNA in siti specifici del DNA genomico Si realizza inserendo nel vettore navetta delle regioni di omologia con il sito del cromosoma in cui si vuole avere ricombinazione

≈50bp

-Il gene scelto come sito di ricombinazione non deve essere essenziale per E. coli Gene non essenziale

-Il plasmide non si deve poter propagare in E. Coli (es. ORI di B. subtilis) -Il promotore deve essere inducibile (controllo dall’esterno)

Gene non essenziale

Le PROTEINE DI FUSIONE

1) Diminuire la suscettibilità proteolitica

2) Agevolare la purificazione

3) Aumentare la solubilità

1) DIMINUZIONE DELLA SUSCETTIBILITA’ PROTEOLITICA

linker Gene E.coli

Gene estraneo

RNAm

p. di fusione

Proteasi specifica

2) AGEVOLARE LA PURIFICAZIONE

Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys Viene tagliato dall’enterochinasi bovina

es:flag

3) AUMENTO DELLA SOLUBILITA’

Si ottiene fondendo geni codificanti proteine poco solubili con proteine o peptidi altamente solubili

La MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Permette di generare cambiamenti della codificazione degli amminoacidi di una proteina agendo a livello del DNA del gene clonato

Ottenimento di proteine con nuove proprietà

Determinazione di residui importanti per processi quali la regolazione post-traduzionale, il folding proteico, l’interazione con altreproteine, la catalisi enzimatica, ecc.

MUTAGENESI MIRATA AGLI OLIGONUCLEOTIDI: Permette di introdurre mutazioni puntiformi -Si deve sapere esattamente l’esatta sequenza nucleotidica della regione del DNA che codifica il codone dell’RNAm da modificare -Il tipo di cambiamento che si vuole apportare (es: GCA

ACA=ser

ala nello studio della p-Ser)

Si usa un oligonucleotide di sintesi che ha un nucleotide discordante dove si vuole mutagenizzare

LA MUTAGENESI MIRATA AGLI OLIGONUCLEOTIDI CON IL DNA DI M13

Metodo per arricchire il DNA di M13 mutato Il ceppo dut ung

dUTPasi: abbassa il livello di dUTP

Uracile-N-glucosilasi: Rimuove il dUTP Incorporato nel DNA

ATT Ile

CTT Leu

LA MUTAGENESI MIRATA AGLI OLIGONUCLEOTIDI CON DNA PLASMIDICO

In realtà l’efficienza è bassa

50/50?

METODO PER ARRICCHIRE IN PLASMIDI MUTAGENIZZATI

NaOH

Klenow+T4+lig

LA MUTAGENESI CASUALE CON INNESCHI OLIGONUCLEOTIDICI DEGENERATI

Permette di generare tutti i possibili cambiamenti di un amminoacido in un certo sito Si usa quando non sono note le sostituzioni in grado di modificare la proteina bersaglio

VANTAGGI Non è necessario conoscere in dettaglio il ruolo di particolari aminoacidi nel funzionamento di una proteina Si possono ottenere mutanti inattesi dotati di proprietà utili, poiché vengono sostituiti più amminoacidi