Un Nuevo Metodo Para Ver El Adn

V 22

V 22 V 22 VVVV

UN NUEVO METODO PARA VER EL DNA GLORIA ELENA LEON PAZ ENRIQUE RODRIGUEZ

2008

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

2

V22

V22

UN NUEVO METODO DE ANALISIS DEL DNA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

3

V22 UN NUEVO MÉTODO DE ANALISIS DEL DNA. EL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN QUE A CONTINUACIÓN DESCRIBIREMOS ES EL RESULTADO DE UNA INTENSA EXPERIENCIA CIENTÍFICA, DE UNA BÚSQUEDA Y UN DESCUBRIMIENTO QUE ES DE CIERTA MANERA UN ENCUENTRO ANTICIPADO CON EL FUTURO.

EL AÑO DE 1985 INICIAMOS LAS PRUEBAS PRELIMINARES DE UNA NUEVA INVESTIGACIÓN EN EL CENTRO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Y TECNOLÓGICAS DE LA UNIVERSIDAD DE SONORA (CICTUS) PARA POSTERIORMENTE CONTINUARLAS EN EL CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN ALIMENTACIÓN Y DESARROLLO ( CIAD ) EN HERMOSILLO SONORA, MÉXICO; INSTITUCIÓNES EN LA QUE TRABAJABA COMO INVESTIGADORA EN LAS DÉCADAS DE LOS SETENTAS Y LOS OCHENTAS. NUESTRO INTERÉS ESTABA ENFOCADO A REALIZAR VARIAS PRUEBAS EXPERIMENTALES SUSTENTADAS EN NUMEROSAS OBSERVACIONES Y REFLEXIONES TEÓRICAS E INVESTIGACIÓN BIBLIOGRÁFICA, EL RESULTADO DE ESTAS PRUEBAS NOS LLEVARÍA POCO DESPUÉS A LA ELABORACIÓN DE UNA HIPÓTESIS QUE SERIA BASE Y PRINCIPIO DE UNA INVESTIGACIÓN MÁS PROFUNDA QUE ROMPERÍA RADICALMENTE CON EL MÉTODO TRADICIONAL DE ANÁLISIS DE DNA POR MEDIO DE ELECTROFORESIS.

PARA TODOS LOS INVESTIGADORES QUE NOS DEDICAMOS A LA BIOLOGÍA MOLECULAR TODA INVESTIGACIÓN CON ADN HA SIDO Y ES APASIONANTE, EL HORIZONTE ABIERTO POR LA GENÉTICA SE PRESENTA COMO ALGO INFINITO Y MARAVILLOSO, SIN EMBARGO EL RIESGO PROFESIONAL ES CONSTANTE Y PERMANENTE PARA LA

V22

EL TRABAJO COTIDIANO QUE REALIZÁBAMOS EN EL LABORATORIO CON MUESTRAS DE ADN DE DISTINTOS ORÍGENES NOS LLEVO PASO A PASO A LA DETERMINACIÓN DE QUE ERA NECESARIO ENCONTRAR UN CAMINO ALTERNO AL USO DEL MÉTODO DE ELECTROFORESIS, NOS HICIMOS EL PROPÓSITO DE BUSCAR UNA TÉCNICA DE ANÁLISIS CON LA QUE PUDIÉRAMOS DESCARTAR O SUSTITUIR EL USO DEL BROMURO DE ETIDIO Y LA LUZ ULTRAVIOLETA, EL PRIMERO COMO COLORANTE DEL ADN Y EL SEGUNDO COMO REVELADOR DE ADN.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

4

SALUD DE LOS INVESTIGADORES AL ESTAR EXPUESTOS COTIDIANAMENTE A LA MANIPULACIÓN DE MATERIALES TÓXICOS Y CANCERÍGENOS. ESA CIRCUNSTANCIA APARENTEMENTE FATAL, NOS LLEVO A TOMAR LA DETERMINACIÓN DE BUSCAR UN SUSTITUTO AL BROMURO DE ETIDIO, UN NUEVO COLORANTE QUE FUERA BIODEGRADABLE, QUE SE ADHIRIERA A LA MOLÉCULA DE ADN Y QUE LO HICIERA VISIBLE A LA LUZ NORMAL SIN NECESIDAD DE UTILIZAR LA LUZ ULTRAVIOLETA. COMPARTIR CON USTEDES POR ESTE MEDIO, EL RESULTADO DE NUESTRAS INVESTIGACIONES , ES DARLE SENTIDO SOCIAL A NUESTRO ESFUERZO, QUE HASTA AHORA ABARCA UN PERÍODO DE 22 AÑOS Y QUE SIGNIFICA PARA NOSOTROS EL PRINCIPIO.

V22

HERMOSILLO, SONORA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

5

GENESIS INTRODUCCION

Estado del Arte A partir de que el holandés Antonio Van Leeuwenhoek dió a conocer el resultado de sus observaciones realizadas con un microscopio construido y perfeccionado por él mismo, ante los científicos

miembros de la Real Sociedad de Inglaterra,

entre los que se encontraban Robert Boyle, fundador de la química científica,

Isaac Newton y Regnier de Graaf entre

otros, el estudio de la naturaleza orgánica adquirió una nueva dimensión, un mundo microscópico desconocido para todos se reveló creando una gran conmoción en el mundo científico del siglo XVII, en ese tiempo no se aceptaba que hubiera organismos mas pequeños que los ácaros, pero el trabajo de observación minucioso y tenaz de Leeuwenhoek evidenció la existencia de organismos invisibles para los ojos humanos, en un siglo en el que aun persistían supersticiones y atavismos que dificultaban enormemente el trabajo de los hombres de ciencia, el descubrimiento de Leeuwenhoek tan importante y trascendente como el descubrimiento del fuego o de la rueda, habría de convertirse en un impulsor del desarrollo científico en los siglos siguientes, al igual que la teoría heliocéntrica de Copérnico que recibió un apoyo determinante en el siglo XV11, de otro sabio contemporáneo de Leeuwenhoek, Galileo Galilei que se interesó por la fabricación de los primeros telescopios, microcosmo

y

el

dosificada, sus enigmas.

macrocosmo

revelando

en

forma V22

el

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

6

La capacidad de poder ver organismos microscópicos se abrió paso en las ciencias biológicas aportando un elemento esencial de unidad en el estudio de los seres vivos e hizo posible

analizar

todos

los

organismos

en

sus

dos

caracterizaciones, o bien como un sistema de células o unicelulares, esto devino en la clasificación de los seres vivos en dos grupos bien definidos, el primero de ellos es el de los eucariotas con un núcleo que contiene los cromosomas con mayor

información

organismos

mas

genética,

complejos

lo

que

capaces

los

convierte

de

en

reproducirse

sexualmente y el segundo grupo al que pertenecen los procariotas que tienen su cromosoma o sus cromosomas en el citoplasma y que carecen de núcleo definido que caracteriza a las bacterias unicelulares.

A mediados del siglo XIX , dos investigadores

aportarían

nuevos elementos en el estudio de los organismos y de la herencia genética, el inglés Charles Darwin y el austriaco Gregor

Mendel.

En 1859 aparece la revolucionaria tesis de

Darwin al editarse “El Origen de las Especies”.

Darwin

descubrió que la descendencia tenía pequeñas diferencias con sus progenitores, de tal manera que los hijos son casi iguales a sus padres y ese “casi”, significa la nueva característica que permite la evolución de las especies. Gregor Mendel era un monje austriaco que al interior de su convento realizó importantes experimentos de polinización de semillas de guisantes por medio de los cuales descubrió las leyes de la herencia y acuñó términos aun vigentes como estadística

rudimentaria

predicción

para

la

al

establecer

descendencia,

ecuaciones conociendo

de las

V22

caracteres recesivos y caracteres dominantes y desarrolló la

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

7

características de los progenitores. De hecho con Mendel se desarrollo en 1860 el concepto de gen, aunque sería hasta el siglo siguiente que pasaría a formar parte

del paradigma

genético. No obstante, ellos nunca supieron que fueron los pioneros en el estudio del DNA,

tampoco los científicos de su época

reconocieron la importancia de los trabajos publicados y fue hasta principios del siglo XX, después de que ellos murieron, cuando se retomaron y reconocieron los postulados de Darwin y Mendel sobre la herencia y evolución . Un científico contemporáneo a Darwin y Mendel llamado Fiedrich Miescher descubrió en 1869 que un material extraído de núcleos celulares y de células del pus era diferente en su composición química a las proteínas sentando las bases de la química genética y al descubrimiento del DNA. Miescher aisló un compuesto que denominó nucleína hoy conocido como ácidos nucleicos. Un salto cualitativo muy importante y trascendente en la biotecnología se produjo en 1937 cuando el bioquímico sueco Arne Tiselius y el investigador P. Kônig inventaron el método de la electroforesis cuya aplicación en el estudio

de la

genética y del genoma humano ha sido muy determinante. Otro avance notorio en el campo de la microbiología sucedió en 1942 cuando el científico italiano Salvador Luria obtuvo la

<En 1944, el científico norteamericano Oswald Avery en compañía de

sus colaboradores Colin Macleod y Maclyn

V22

primera microfotografía de alta calidad de un bacteriófago.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

8

McCarty demostraron que las características hereditarias de los seres vivos, se debían al DNA y no a las proteínas

y lo

comprobaron al transformar una bacteria inocua en patógena, con

material

genético

que

extrajeron

de

otra

bacteria

virulenta. Cuando

Avery

anunció

a

la

comunidad

científica

su

descubrimiento, la reacción fue de burla y escepticismo , mas sin embargo, la curiosidad y la expectación creada propició que se iniciara un gran número de líneas de investigación, entre ellas la búsqueda de tecnologías para la purificación del DNA y la definición de sus componentes químicos que dio elementos

teóricos

y

experimentales

suficientes

para

establecer la unidad básica estructural del ADN. Max Delbruck, Salvador Luria y otros investigadores formaron en 1947 el grupo de Norteamérica,

sus

“Los fagos” en los Estados Unidos de investigaciones

fueron

ampliamente

difundidas y tuvieron una gran influencia. La investigación de bacteriófagos realizada en 1952 por Oswald Avery, Martha Chase y Alfred Hershey

probó que el

DNA era el portador de la herencia genética y puso de relieve los

factores químicos

y

moleculares de

la

composición

estructural del ADN. Por su parte, la investigadora Rosalynd

Franklin entre los

años 1953 a 1954, logro producir imágenes de rayos X de la

En 1953 James Watson , Francis Crick, Maurice Wilkins y Rosalynd Franklin descubrieron la estructura molecular del

V22

forma B de ADN.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

9

DNA lo que hoy se conoce como la doble hélice y lo publicaron en la revista Nature, con el titulo: “Una estructura para el ácido desoxirribonucleico” J. Watson reconoce en su artículo “La doble hélice” que el éxito de la propuesta se debió también a Linus Pauling. El modelo de Watson y Crick propone dos hélices enrolladas alrededor

del

mismo

eje

formada

por

residuos

de

D-

deoxiribofuranosa unidos por enlaces fosfodiester (en las posiciones 3 y 5). En cada hélice las bases quedan en el interior y los grupos fosfatos en el exterior. Las dos hélices se mantienen unidas por enlaces de puente de hidrógeno entre las purinas de una cadena y las pirimidinas de la otra, conforme quedan enfrentadas en pares (2 a 2). En 1956 el investigador Arthur Kornberg descubrió la enzima ADN polimerasa. La primera enzima de restricción fue aislada en 1971 y en 1984, el investigador Kary Mullis inventa la reacción de polimerasa en cadena PCR. Científicos más jóvenes que James Watson se opusieron en 1986 a la aprobación y financiamiento del “Proyecto Genoma Humano”, por considerarlo aún sin las suficientes bases científicas para su desarrollo, el objetivo de este proyecto era descifrar la secuencia completa del ADN del ser Humano. Watson fue uno de sus más tenaces impulsores y logró finalmente que se pusiera en marcha.

El epistemologo y filósofo norteamericano Thomas Samuel Kuhn (1922-1996) hizo en su obra preguntas fundamentales

V22

Los Nuevos Paradigmas

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

10

acerca del conocimiento científico, entre ellas las siguientes: ¿Como se lleva a cabo la actividad científica?, ¿Es el conocimiento científico acumulativo a lo largo de la historia?, las respuestas que da Kuhn a estas y otras preguntas en su libro “La estructura de las revoluciones científicas” (1962) significaron un gran cambio en las posiciones filosóficas acerca de la ciencia, el modelo formalista que imperaba hasta entonces (Círculo de Viena) fue desafiado por el enfoque historicista de T. S. Kuhn, según el cual la ciencia se desarrolla siguiendo determinadas fases: 1.-Establecimiento de un paradigma 2.-Ciencia normal 3.-Crisis 4.-Revolución científica 5.-Establecimiento de un nuevo paradigma Kuhn consideraba a los paradigmas como realizaciones del conocimiento

científico

universalmente

reconocidas

que

durante cierto tiempo proporcionan modelos de problemas y soluciones a una comunidad científica, los paradigmas son por tanto la suma de teorías, conocimientos y prácticas que se aceptan en forma universal por toda la comunidad científica y a

partir

de

las

cuales

se

realiza

una

determinada

investigación, a esta forma de investigación la llama Kuhn “Ciencia Normal” que significa que una investigación esta basada

firmemente

en

realizaciones

científicas

pasadas,

mismas que una comunidad científica particular reconoce durante cierto tiempo como fundamento valido para su la mayor parte del tiempo, de los investigadores que realizan trabajos rutinarios de comprobación de los conocimientos, que

V22

práctica posterior. Esta fase del conocimiento científico ocupa

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

11

han adquirido para poner a prueba la solidez del paradigma en que se basan, demostrar su amplio dominio sobre el mismo, pero sin atreverse a romper las concepciones de su tiempo, como sí lo hicieron Galileo , Einstein y tantos otros investigadores. Para Kuhn, se produce una revolución científica, cuando uno de los nuevos paradigmas sustituye al tradicional, como sucedió con la teoría heliocéntrica de Copérnico que sustituyó a la concepción geocéntrica de Tolomeo, o la teoría de la relatividad de Albert Einstein, que cambió totalmente la visión del universo propuesta por Isaac Newton, agrega Kuhn, “Las revoluciones científicas se consideran aquí, como aquellos episodios de desarrollo no acumulativo en el que un antiguo paradigma es remplazado, completamente o en parte por otro nuevo e incompatible, el progreso de la ciencia se produce solo en las fases de ciencia normal, pero no se puede hablar de un progreso continuo desde la época de los griegos hasta la actualidad porque las revoluciones científicas no son sino rupturas de esa continuidad. Cada revolución científica marca en cierto sentido un nuevo comienzo de la ciencia, un nuevo

LA DOBLE HELICE

V22

paradigma”.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

12

QUE ES EL ADN En términos del paradigma de la “Ciencia Normal” podemos definir el DNA como la molécula que contiene y organiza la vida, se encuentra en el núcleo celular y está compuesta por 2 cadenas complementarias, unidas entre sí por los pares de bases nitrogenadas. Cada cadena esta compuesta por unidades que se conocen como nucleótidos, que son como los eslabones de cualquier cadena. Hasta

la

actualidad

se

han

desarrollado

diferentes

metodologías para el análisis y conocimiento del DNA, todas basadas en el principio de que: “El DNA no se puede ver”, se ha establecido este principio como un dogma indiscutible, un límite a la visión al igual que lo fueron los ácaros del siglo XV11. La metodología de electroforesis utilizada actualmente en los laboratorios del mundo ha brindado conocimientos sobre el DNA muy importantes, sin embargo, sus resultados siempre son de interpretación por ser indirectos, ya que no ofrecen una imagen real y directa del DNA sino bandas, en todos los casos, independientemente

del

origen de

las

muestras.

BIOFOOD KITS Cat. No. 91.122 BIOTOOLS : Visualización de fragmentos de RFLP correspondientes a 14 especies diferentes, tras digestion con la Enzima 1. M: 100-bp molecular ladder (Cat. No. 31.006). Carriles 1 a 14: patrones de restricción de buffalo, conejo, caballo, gamo, vaca, cabra, ciervo, emu, canguro, avestruz, gato, perrro, ratón y humano.

V22

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

13

Del fenotipo al genotipo “Los genetistas moleculares pensamos en Genes y genomas, casi en términos visuales. Somos capaces de “Ver” con nuestros ojos Mentales el DNA y los esquemas de su Funcionamiento” Maxine Singer y Paul Berg, 1993.

En la investigación que durante 22 años hemos realizado, desarrollamos una metodología para aislar y extraer el DNA de células sanguíneas, estas muestras de DNA forman patrones perceptibles bajo un microscopio óptico. En el proceso de aplicación de la técnica, las células de la sangre son aisladas de la muestra mediante el procedimiento de remover el plasma, después las células aisladas, son tratadas con reactivos orgánicos con alta solución salina, para liberar el agregado de DNA sin perturbar su integridad, toda vez que los glóbulos rojos no tienen núcleo, el agregado de DNA es formado

de

los

glóbulos

blancos,

una

ultima

fase

del

procedimiento consiste en precipitar el agregado de DNA para facilitar la formación de patrones visuales, después la muestra es examinada en el microscopio. Haber encontrado esta nueva tecnología para estudiar el DNA, ha sido producto del trabajo experimental de muchos años. Inicialmente solo quisimos cambiar el bromuro de etidio, colorante utilizado en electroforesis, por otro que no fuera perjudicial para la salud y el entorno ecológico y además que no necesitara de iluminación con luz ultravioleta para poder probamos algunos por electroforesis en corridas de muestras

V22

ver las bandas de DNA. Buscando el colorante seguro y eficaz,

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

de DNA de bacterias, en una ocasión

14

por una omisión, el

buffer de TRIZMA se utilizó sin diluir, ya que se preparaba 10 veces concentrado (10 X), por lo que la muestra de DNA se comportaba diferente, decidimos observarla al microscopio y fue así como por vez primera, vimos la cadena de ADN. El 16 de enero de1991,

fecha inolvidable en la que

por

primera ocasión observamos una imagen de ADN en el microscopio óptico,

se inició

en Medio Oriente, la llamada

“Guerra del Golfo” o “Tormenta del Desierto”, no pudimos evitar

reflexionar

en

esos

momentos,

como

lo

hiciera

muchísimas décadas atrás, el escritor soviético Ilya Ehrenburg en tiempos similares, sobre esos dos polos extremos de la existencia humana que son la vida y la muerte. Ante lo contrastante

que

resultaba

el

estar

en

el

laboratorio

observando y analizando una muestra de DNA, origen y maravilla de la vida y por otra parte estar escuchando simultáneamente, de un televisor cercano, el estruendo mortífero de la destrucción de las bombas sobre Bagdad . Pasada la fuerte emoción de la experiencia indescriptible, de poder ver por primera vez de manera directa la imagen del ADN en el microscopio óptico y constatar, que lo que estaba viendo no tenia ningún precedente visual morfológico con microorganismo alguno, aun así entramos en duda sobre lo que observaba, ya que fuimos los primeros escépticos, influenciados por el peso del dogma vigente, de que “El DNA no se puede ver”, aprendido desde los años estudiantiles de nuestra formación profesional. Pensamos que una posibilidad durante su preparación y que lo que veíamos tenia ese origen, nos resistíamos a creer lo que veíamos en el portaobjeto del

V22

era que la muestra de DNA, se pudo haber contaminado

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

15

microscopio, un hilo claro y casi transparente, diferente a todo lo antes visto a través de un microscopio, una imagen hermosa y apabullante por su importancia y por lo que significa en el ciclo vital de todos los organismos vivos. Repetimos por tanto el experimento una y otra vez desde el principio, teniendo especial cuidado en la realización de cada paso del proceso, incluyendo la esterilización minuciosa de todo el material y el equipo utilizado, operación necesaria para llevar a cabo las repeticiones

necesarias siguiendo los

siguientes pasos: 1) Cultivar la bacteria 2) Extraer el ADN 3) Purificarlo 4) Precipitarlo 5) Observarlo al microscopio óptico Repetimos varias veces las pruebas con el DNA de la cepa de Escherichia. Coli, que fue la primera bacteria con la que trabajamos, después con el DNA de otras cepas y luego con otras bacterias y el resultado siempre fue el mismo, pero ya con la seguridad plena de que las muestras no estaban contaminadas, que la forma de extracción era correcta y de que efectivamente el DNA si se puede ver con un

microscopio óptico. Después de emplear varias semanas en repeticiones con diferentes cultivos de microorganismos y una vez que nos convencimos totalmente que el ADN de bacterias se puede un protocolo que nadie quiso escuchar o conocer, porque el

V22

ver en un microscopio óptico, elaboramos una hipótesis y

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

dogma

científico

afirma

que

era

algo

imposible

16

y

descabellado afirmar que el DNA se puede ver. Para no frenar nuestro propósito de continuar con esa línea de investigación y poder avanzar con el proyecto de desarrollar un nuevo método para analizar y estudiar el DNA,

solicitamos

ingresar

al

doctorado

en

biología

molecular, en el Instituto de Ingeniería Genética de la UNAM, que se encuentra en Cuernavaca Morelos. En

el

departamento

institución,

nos

de

biología

comunicaron

que

posgrado, pero no era admitido

molecular podía

de

esa

ingresar

al

que los aspirantes al

doctorado llevaran su propio proyecto de investigación, mas bien todos los estudiantes aceptados tenían que adscribirse a un proyecto ya existente y con presupuesto aprobado por tanto no estaba permitido desarrollar como tesis doctoral nuestro proyecto. Sin embargo el Director del área nos recibió y nos escuchó con mucha gentileza y atención cuando le hablamos de nuestra

investigación

entonces, fotografías

y

las

pruebas

realizadas

hasta

también vio minuciosamente nuestras primeras del DNA de 4 bacterias que le mostramos.

Nosotros escuchamos todas sus observaciones y tratamos de responder a sus preguntas de la manera más explicita. Al final de la entrevista nos causó gran sorpresa cuando nos recomendó que por considerar que valía la pena desarrollar un esfuerzo para continuar la investigación, lo primero que de análisis de DNA y patentarlo, en México y en Estados Unidos.

V22

teníamos que hacer es proteger la idea del nuevo método

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

17

Regresamos a Hermosillo felices y dispuestos a llevar a cabo la sugerencia, que nos hizo el entonces director

de

Biología Molecular de la Universidad Autónoma de México (UNAM),

que

una personalidad científica de su nivel,

estimara nuestro trabajo adecuado para patentarlo, fue un estímulo

absoluto

para

tratar

de

vencer

todas

las

dificultades que se presentaran. En octubre del mismo año (1991), solicitamos la patente en el IMPI (Instituto Mexicano de la Propiedad Industrial) en la ciudad de México, y en diciembre del mismo año viajamos a

Washington D,C, para solicitar la patente en Estados

Unidos. Pasaron 5 años sin recibir ninguna comunicación del IMPI, y sin que decayera el animo y el entusiasmo por la investigación continuamos

trabajando,

pasando de un

asombro a otro ante los resultados obtenidos en el laboratorio. En 1996 nos otorgaron la patente (182175) en México, D. F.

titulada:

“ Un Nuevo Colorante Para la

Tinción del DNA ” (de Rodríguez León Paz Gloria Elena 1996). La solicitud que realizamos en Washington no prosperó en ese primer intento,

porque ignorábamos en

ese tiempo que en Estados Unidos, existen despachos de abogados autorizados legalmente para llevar a cabo esos trámites y además no tuvimos los recursos económicos para contratar a los de abogados que nos llevaran el caso, le diera seguimiento y en su momento formulara las

V22

reivindicaciones de la solicitud de patente.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

18

Los Polímeros Naturales En 1966, 30 años antes de que nos concedieran el registro de esa patente,

presenté

mi examen profesional

Universidad de Sonora para

en la

recibir el titulo de Química

Industrial, con un trabajo de tesis titulado

“Obtención de

Extracto curtiente Libre de Almidón de la Cañagria (Rumex hymenosepalus)” por esta investigación me fue otorgada una mención honorífica por trabajo de tesis, y en 1980 obtuve la patente del Instituto de la Propiedad Industrial con el mismo trabajo., pero con el nuevo título de “Proceso Mejorado para Obtener Extracto Curtiente Libre de almidón a Partir de la Cañagria

(Rumex

Hymenosepalus)”,

(Patente

número

142378, otorgada el 8 de octubre de 1980) cuyos derechos doné a la Comisión Nacional de Zonas Áridas, CONAZA. Tuve

mis

primeras

prácticas

profesionales

(1967)

trabajando en el análisis de minerales de uranio en el Estado de Sonora con la Comisión de Energía Nuclear y tome un curso de actualización profesional en la UNAM en 1968.

Durante dos semestres realicé estudios con la

primera

generación

de

la

Maestría

en

Polímeros

y

Materiales, en la Universidad de Sonora, esos estudios de posgrado los abandoné al enterarme que el plan de estudios no contemplaba el trabajo con polímeros naturales, tenia en esa época un especial interés por esa clase de polímeros, puesto que el extracto de Cañagría con el que trabajé en mi tesis, es un polímero natural. No sabia en esos años que el futuro me guardaba una sorpresa en relación a esos V22

conocimientos.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

19

Desarrollo de un Método para la Determinación del Perfil Plasmídico en Escherichia coli En 1988, 22 años después de obtener mi licenciatura, me titulé de la Maestría en Ciencias, con la tesis ”Desarrollo de un Método para la Determinación del Perfil Plásmidico en Escherichia coli”, fue mi primer trabajo sistemático con DNA

y

nació

de

la

necesidad

de

tener

un

método

reproducible para conocer el perfil plásmidico de bacterias. Al inicio del estudio, en la revisión bibliográfica, encontré una gran cantidad de metodologías propuestas y al tratar de aplicarlas en el laboratorio, observé que el perfil bacteriano dependía del método utilizado, es decir, que un mismo microorganismo analizado para su perfil plásmidico por diferentes métodos presentaba resultados distintos. Por ejemplo,

la

importancia

del

perfil

plásmidico

de

un

microorganismo patógeno, que sea resistente a diferentes antibióticos, es debido a que los plásmidos se puedan correlacionar

con

el

tipo

de

microorganismo

que

lo

contiene, con diferentes toxinas producidas por él, con su serotipo y también con la resistencia

a antibióticos. Esto

hace pensar en la posibilidad, de

poder sustituir las

pruebas

bioquímicas,

por

el

perfil

plásmidico

para

caracterizar una cepa determinada, significando esto en detener

una

infección

y

hasta

una

epidemia.

Otra

V22

primer lugar, el ahorro de tiempo en el cual se podría

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

20

observación hecha durante la experimentación, es que algunas

cepas

independientemente

de

que

presenten

resistencia a antibióticos, no es posible detectar en ellas la presencia de plásmidos. Los trabajos de Poh y Col. (1988) y Tennet y Col, (1984) reportan respectivamente que únicamente al 20 y 30 % de la cepas con multiresistencia a antibióticos, se les detectó DNA plásmidico y en ambos casos se concluye,

que

seguramente la resistencia esta codificada en el cromosoma bacteriano. Por otra parte, McClenaghan y Col. (1988) comentan que la técnica de teñido con bromuro de etidio en gel de agarosa no es suficientemente sensible para detectar plásmidos con bajo número de copias, así pues por lo reciente de esta nueva fase de la genética no se había madurado

suficientemente

una

metodología

para

el

establecimiento del perfil plásmidico, por tanto, el trabajo que realicé tuvo como objetivo establecer un método de amplificación plásmidica que lleven genes que codifiquen resistencia a antibióticos, incluyendo a los de bajo número de copias. Estudié durante esa investigación 6 cepas de Escherichia coli , 4 de ellas resistentes a tetraciclina y las otras 2 resistentes a tetraciclina y carbencilina, esas bacterias

fueron

aisladas

de

heces

fecales

de

niños

enfermos con diarrea internados en el Hospital Infantil del Estado

de

Sonora

en

Hermosillo

Sonora.

El

método

propuesto consiste en 5 etapas principales: 1.- Cultivo de toda la noche de la cepa problema y de la 2.- Extracción del ADN plásmidico de la cepa problema con fenol-cloroformo

V22

cepa E. coli jm 101 ya caracterizada

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

21

3.-Transformación de E, coli jm 101 con el ADN de la cepa problema 4.- Cultivo y extracción del plásmido de transformadas 5.- Análisis del perfil por electroforesis. El perfil de las transformadas demostró que el plásmido que codifica resistencia al antibiótico tetraciclina, se amplifica al transformar la E. coli jm101 y tiene un peso molecular de 4.2 kb. En estas pruebas utilicé en repetidas veces la reacción de polimerasa PCR. Descubierta por el investigador y Premio Nobel norteamericano Kary Mullis. En

septiembre

investigación

de

1989

“Obtención

presentamos del

Perfil

el

trabajo

Plásmidico

de de

Escherichia Coli, por Transformación” en el III Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería, en Monterrey Nuevo León. El estudio del ADN a partir de este trabajo se convirtió en el centro de todo mi interés como investigadora, sin embargo y a pesar de los resultados tan satisfactorios obtenidos con el método desarrollado, el enfoque y la dirección que tomarían mis futuros trabajos con ADN. serían completamente distintos a los de esa inolvidable experiencia. Al regresar de Monterrey, después de nuestra participación en el III Congreso de Biotecnología y Bioingeniería, que sería muy importante para nuestra investigación, cuando al realizar el estudio bibliográfico

de colorantes,

V22

tuvimos la fortuna de encontrar una valiosa coincidencia,

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

22

nos encontramos con publicaciones en donde se reportaba el uso de taninos, como colorantes de DNA (Stockert J.C. 1989), (Naguro T. et al 1990). Conservaba aun una pequeña cantidad de extracto curtiente de cañagria (taninos),

que guardaba de recuerdo del

trabajo de tesis de licenciatura, mismo que utilizamos para probarlo

como

colorante

de

DNA.

Así

lo

hicimos

y

establecimos la concentración más adecuada, obtuvimos de esta

manera

el

resultado

esperado.

En

esta

forma

encontramos el nuevo colorante para DNA tanto tiempo buscado y estaba en casa. Al igual que el DNA, los taninos son polímeros, formados

V22

por unidades o eslabones.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

23

NUCLEOTIDOS

V22

TANINOS

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

24

Primer Trabajo Experimental del Nuevo Método de Análisis de DNA. Iniciamos la experimentación, utilizando 4 cepas bacterianas: A) Estafilococos Epidermidis, resistente a 4 antibióticos, tetraciclina (Tc), penicilina (Pc), eritromicina (Em) y ampicilina (Am). B) Escherichia coli con una resistencia a (Tc). C) Escherichia coli con una resistencia a (Tc) D) Escherichia coli con 2 resistencias a (Tc)

y carbencilina

(Cb.). Estas cepas se cultivaron y después se analizaron

de la

siguiente manera: 1) Cultivo de toda la noche y centrifugar. 2) El precipitado se resuspendió en un buffer 3) Se agregó fenol y cloroformo 4) Se centrifugó 5) A la fase acuosa se le añadió alcohol etílico absoluto, para precipitar el DNA y se incubó a -40º C x 30 min. o mas. 6) Se centrifugó, se descartó el sobrenadante y se dejó secar el precipitado 7) Al precipitado se le añadió colorante disuelto en buffer. 8) El DNA teñido se precipitó con alcohol etílico absoluto, se centrifugó y se dejo secar a temperatura ambiente. 9) Se agregó buffer TE 10)

Se tomó una alícuota, se colocó en un portaobjetos

y se dejo secar a temperatura ambiente. Se observó al microscopio. Se tomó la fotografía al DNA de las 4 cepas.. V22

11)

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

25

Se anexan las fotografías de las 4 cepas analizadas (anexo # 1), tomadas con el objetivo 4X. Las mismas muestras se analizaron por electroforesis, teñidas con bromuro de etidio, se anexan también las fotografías correspondientes. En los primeros años de la investigación de DNA, aplicando nuestro Método V22 que permite verlo en el microscopio de luz,

acostumbramos

anteriormente,

en

analizarlo,

forma

paralela

como con

el

decimos método

de

electroforesis, esto con la finalidad de estar seguros que lo que observamos en el microscopio era realmente DNA. Las diferencias que encontramos entre los 2 métodos son significativos y radicalmente distintos,

especialmente en

los resultados que se obtienen, mientras que con el método de electroforesis bandas,

lo que obtenemos invariablemente son

independientemente

del

origen

del

DNA,

y

adicionalmente se deben realizar una serie de cálculos e interpretaciones para poder establecer los resultados. En cambio con el Método

V22,

lo que obtenemos es una

imagen real con las características intrínsecas de cada DNA analizado, lo que permite al investigador cuando observa al microscopio la imagen del DNA de la muestra o bien la foto obtenida de la misma, saber a quien corresponde, como cuando observamos la foto de una persona o de algo conocido, se reconoce al instante. Es importante mencionar, que con las cepas B y D, hicimos pruebas de transformación, durante mi trabajo de tesis (León. Paz. G.E., 1988). En esas pruebas intentamos todos los antibióticos y está manipulada para ser receptora de DNA. Con la cepa B se realizo la transformación sin

V22

transformar la bacteria E. coli JM 101, que es sensible a

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

26

ninguna dificultad. En cambio con la cepa D, no logramos transformar la E. coli JM101. En ese tiempo del trabajo de tesis de maestría no pudimos explicarnos con certeza la causa. Con las fotos del DNA, se puede observar que el DNA de la cepa D es muy grande y seguramente no pudo pasar a la membrana de la JM101. En cambio el DNA de la cepa B, es muy pequeño y si pudo transformar a la JM 101 en

V22

resistente a TC.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

27

UNA INVESTIGACION INDEPENDIENTE

“No imité a los escépticos que dudan solo por dudar y simulan estar siempre indecisos; al contrario, mi intención era llegar a una certeza y excavar el polvo y la arena hasta llegar a la arcilla de abajo “ René Descartes

En 1991, renuncie a mi plaza de investigadora de tiempo completo en el Centro de investigación en Alimentación y Desarrollo CIAD en Hermosillo Sonora, para poder realizar con plenitud nuestro proyecto sobre el nuevo Método de Análisis

de DNA. Al disponer

de escasos recursos

económicos para iniciar la investigación por nuestra propia cuenta, solicité asilo “científico” en el Laboratorio Estatal de Salud Publica del Estado de Sonora, mismo que me fue concedido y en julio de 1992 , reinicié el estudio de DNA de bacterias, sin sueldo alguno, pero en condiciones óptimas en cuanto. a la magnifica infraestructura del laboratorio y el apoyo de directivos e investigadores a mi trabajo, la única indicación

fue

que

comprara mis propios

reactivos

,

materiales e instrumentos de uso perecederos. Al reiniciar el trabajo de investigación, en el Laboratorio Estatal de Salud Pública del Estado de Sonora, iniciamos una nueva etapa del proyecto, en el que no solamente trabajaríamos con DNA extraído por nosotros mismos, de de microorganismos, de cepas cultivadas en el laboratorio, sino que consideramos que era el momento para realizar y

V22

muestras de sangre obtenidas por donaciones voluntarias o

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

28

probar a la par el método con muestras comerciales de DNA purificado,

por

lo

que

adquirimos

DNA

purificado

y

liofilizado de virus lambda, del plásmido PBR322 y una cepa de Escherichia Coli liofilizada, con un peso molecular de 56 kb y con tres resistencias a antibióticos, esta cepa la guardamos

de

manera

especial

para

utilizarla

posteriormente. Otra nueva fase de la investigación, la enfocamos a la revisión del propio Nuevo Método de Análisis de DNA, que estaba aplicando, variamos concentración y temperatura , tiempos

de

aplicación

de

cada

parte

del

proceso

y

fundamentalmente reactivos y componentes del buffer utilizado en la reacción y probamos muchas variables y combinaciones posibles. Por las pruebas que anteriormente había realizado, pensaba entonces

que

los taninos integrados al buffer,

eran los que tornaban visible al DNA

y para tener

totalmente esa certeza y no quedarnos con alguna duda realizamos nuevas pruebas de DNA con taninos y sin ellos. Resultó ser solamente el buffer (BF), el factor principal de que el DNA se pueda ver. Sin embargo por el resultado obtenido y observado en las imágenes de las muestras de DNA., cuando han sido procesadas estando integrados los taninos en la reacción, decidimos continuar utilizándolos porque hemos observado que el DNA

teñido con los

taninos, ofrece una imagen de mayor tamaño que resulta muy

adecuada

para

determinados

objetivos

o

casos

V22

especiales de análisis del DNA.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

29

Sabia desde que decidimos continuar con el trabajo de investigación de nuestro proyecto que al afirmar que el DNA se puede ver con un microscopio óptico, lo que recibiríamos serian

pocos

apoyos

y

muchas criticas

de

parte

de

escépticos, que se dicen investigadores, que sin tener curiosidad por observar personalmente los resultados en el microscopio o preguntar en que consiste el nuevo método, simplemente negarían que eso pudiera ser posible, hubo inclusive algunos casos en los que se recomendó que no se nos apoyara y se vertieron criticas en la televisión y medios periodísticos. Pero en una ocasión en un hospital, al final de una conferencia sobre nuestro trabajo, un medico amigo nuestro, inesperadamente alabó el papel de los escépticos en la historia de la ciencia, porque, al decir de él,

“que

seria de la ciencia sin los escépticos, que son los que obligan a los investigadores a tener

certeza y ser muy

objetivos en lo que afirman”. Carl Sagan señaló en uno de sus libros que el filosofo y matemático Rene Descartes, propuso por primera vez consagrar la duda como una virtud principal de la mente inquisidora, pero también dejó claro que la duda era una herramienta y no un fin en si misma. Duda, escepticismo e intolerancia, indiferencia y fanatismo e inclusive intereses comerciales se han conjugado con ciertas dosis de soberbia para crear los “dogmatismos científicos” actuales y pasados, seguramente delineados por lo que Thomas S. Kuhn llama “ciencia normal”, que pretenden y han pretendido señalar caminos y poner límites paradigmáticos a la investigación y al desarrollo de la ciencia. En 1991 Thomas en su libro “El Proyecto Genoma Humano” escribió

“Debemos dejar atrás el mundo de la visión para encontrar a los genes”

V22

Lee

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

30

Mucho tiempo atrás, en 1871 Charles Darwin en su introducción a “La descendencia del hombre” afirmó “Con frecuencia la ignorancia engendra mas confianza que el conocimiento: Son los que saben poco y no los que saben mucho, los que aseveran tercamente que este o aquel

V22

problema nunca será resuelto por la ciencia”

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

31

UNA MODIFICACIÓN EN EL NUEVO METODO DE ANÁLISIS DEL DNA El 5 de octubre de 1993, al regreso de un viaje a Panamá, mi esposo me trajo de obsequio un libro sobre genética “Our Uncertain Peritaje: Genetic & Human Diversity” (Hartl L. Daniel, 1985), en el que entre otras cosas, se presenta una técnica sobre como se obtiene el cariotipo de una persona. Me dediqué a estudiar muy bien esa metodología, porque no estaba

completamente

satisfecha

con

los

resultados

obtenidos. En ese libro se indica que en el paso final del cariotipo, los cromosomas se precipitan con alcohol absoluto mezclado con ácido clorhídrico al 5%. Así que realicé nuevas pruebas, precipitando el DNA de nuestras muestras con esa misma

mezcla,

pero

directamente

en

el

portaobjetos,

modifiqué el porcentaje de concentración de ácido, pero por mas que lo reducía, las muestras no quedaban bien, pensé entonces que el ácido clorhídrico, era demasiado fuerte para los resultados que procuraba obtener con nuestra técnica, por medio

de

la

cual

buscaba

esencialmente

conservar

la

integridad del DNA. Decidí sustituirlo por ácido acético por ser un ácido débil. Lo probamos a diferentes concentraciones, hasta que los resultados que logramos, fueron óptimos,

V22

repetitivos y a nuestra entera satisfacción.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

32

Así nació el nuevo Método de Análisis de DNA. V22.

A partir de esas pruebas y los siguientes estudios de DNA, que realizamos con la nueva formula se inicia el Método V22, `por lo que las figuras que se presentan se numeran del numero 1 que corresponde a pBR322, en adelante.

DNA LIOFILIZADO DE VIRUS LAMBDA Y pBR322,

(de Rodríguez León Paz. G.E., 1998)

El Método V22, consta de los siguientes pasos: 1) 50 microgramos de DNA liofilizado 2) + 100 microlitros de buffer 3) Precipitar una alícuota (1-1.5 microlitros) + Alcohol-.Acido directamente en el Portaobjetos. 4) El portaobjetos se decanta y se deja secar a temperatura ambiente. 5) El DNA se analiza bajo el microscopio y se toman las fotografías. Se presentan las fotografías del DNA de virus lambda y el DNA del plásmido pBR322.. En la figura # 1 vemos un dibujo del plásmido pBR322 ( Singer M. and Berg P. 1991). En dicho diagrama se señalan 2 marcadores, uno es un gen que codifica resistencia a Tc y el otro el gen que lo hace a Am. En la figura # 2 observamos la foto del plásmido pBR322, salientes

del

circulo,

marcadores Tc y Am.

que

pueden

corresponder

a

los

V22

obtenida con nuestro Método V22, podemos apreciar 2

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

33

El trabajo experimental nos ha permitido conocer un poco más a fondo

las propiedades del DNA, por ejemplo hemos logrado

extenderlo y

compactarlo modificando las concentraciones.

De virus lambda presentamos 3 fotos, la figura # 3 ( Singer M. and Berg P. 1991) es una micrografía electrónica de virus lambda, que tiene un parecido con la figura # 4 obtenida con el Método V22. Por observaciones personales, que solo se logran obtener cuando el trabajo del investigador, se realiza de manera personal en todo el proceso y no se delega a pasantes

o

ayudantes,

porque

es

imposible

objetivamente lo que no se ha visto con nuestros

analizar propios

ojos. En una ocasión nos dimos cuenta que al precipitar con alcohol-ácido, el DNA se compacta en mayor o menor grado, en proporción directa al volumen utilizado. Dado que no existe aun bibliografía donde se pueda consultar, debemos ir generando el conocimiento necesario, que nos permita ir aprendiendo poco a poco todo sobre el DNA, en esta nueva fase visual de su forma, con ese objetivo realizamos pruebas de precipitación que nos llevaron a la conclusión de que: si agregamos un volumen determinado de alcohol, vemos que se compacta completamente (figura # 6 lambda), y si usamos un volumen mayor, el DNA se fragmenta y lo perdemos. En cambio si el volumen es menor de lo necesario, el DNA se observa difuso (figura # 5 lambda). Aprendimos que el DNA extendido es circular y cuando lo compactamos tiene una forma distintiva, dependiendo de su origen, lo que pudiera ser importante para identificar el organismo al que

V22

pertenece.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

fig.-6

V22

Fig.-5

34

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

35

DNA EXTRAIDO DE BACTERIAS CULTIVADAS METODO V22 Fueron estudiadas 6 cepas bacterianas, cuyas imágenes se presentan en el cuadro # 1 (de Rodríguez León Paz Gloria Elena.1998). 1) Todas las bacterias se inocularon, con una asada los cultivos líquidos y con una pizca los liofilizados, como es el caso de BCG Y la bacteria E. Coli adquirida en ATCC, en el medio de cultivo TY, se incubaron a 37ª C toda la noche, solo BCG se incubó por 15 días. 2) Centrifugar 3) Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en buffer BF 4) + fenol y cloroformo. 5) Centrifugar 6) Transferir

la

fase

acuosa

a

un

nuevo

tubo,

pera

almacenar el extracto de DNA. 7) Precipitar directamente en el portaobjetos, una alícuota del extracto de DNA, con una mezcla de alcohol etílico

V22

absoluto y ácido acético glacial.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

36

CUADRO # 1

CEPA

1) Vibrio cholerae O1 2) BCG (Bacilo de Calmette y Guerin) 3) Samonella tiphy 4) Staphylococcus aureus 5) Escherichia coli, Tc, 4.2 KB 6) Escherichia coli Tc, Am, Km, 56 KB

ORIGEN

Aislado de Vacuna Aislado de Aislado de Aislado de ATCC

un paciente un paciente un paciente un paciente

8) Se analizan los DNA precipitados, bajo un microscopio 9) Se toman las fotos Se presentan las fotos

de los DNA de las 6 bacterias

estudiadas, por el Método V22. Son 2 fotos para cada cepa, una de DNA extendido y la otra de DNA compactado. En las figuras 7, 9, 11, 13, 15 y 17 se presenta el DNA de las 6 cepas extendido y de aspecto circular y de cierta manera se parecen entre si. En cambio las figuras 8, 10, 12, 14, 16 y 18, podemos observar el DNA completamente compactado y fácilmente diferenciado uno de otro. En la figura # 8 vemos que el DNA de Vibrio cholerae O1 es circular, mientras que el de BCG es lineal (figura # 10), coincidiendo esto con los reportes bibliográficos. En la figura. 12 podemos ver que el DNA de Salmonella es lineal y en la figura 14 se observa un DNA circular de Estafilococcus. Estudiando las imágenes de los DNA, se aprecia

para

Estafilococcus un DNA más denso y pesado que el de Salmonella, que se observa este último muy delgado y ligero. de

los

DNA

extendidos

de

Salmonella

y

estafilicoccus

V22

Esas mismas diferencias se manifiestan en las figuras 11 y 13,

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

37

respectivamente, aunque la bibliografía reporta que el DNA de estafilococcus es menor (45 KB) que el de Salmonella (96 KB), calculados

los

electroforesis.

pesos Es

Estafilicoccus, sea

moleculares

posible

que

seguramente

realmente

el

por

DNA

de

de un peso molecular mayor que el de

Salmonella y que el cálculo por electroforesis, nos conduzca a errores, porque desconocemos la imagen real del DNA y porque los pesos moleculares estimados por electroforesis, son relativos a los pesos de los marcadores. Parece ser pues que los DNA lineales

serán más pesados que los circulares

utilizando el método de electroforesis, en cambio el Método V22, nos acerca a una lectura mas apegada a la realidad. Esta nueva tecnología V22, nos permite también estimar el tamaño del DNA, como es el caso de las fig. 16 y 18, que corresponden a 2 cepas de Escherichia Coli, una aislada de un niño enfermo y la otra adquirida en American Tissue Culture Collection

(ATCC).

Es

una

cepa

con

resistencias

a

3

antibióticos, Tc, Am y Km. Su peso molecular indicado por el proveedor es de 56 KB, el peso de la otra cepa lo calculamos por electroforesis y fue de 4.2 KB. En las imágenes vemos que el DNA de la figura 18 es mucho mayor que el de la figura 16,

V22

el cual lo podíamos haber calculado, comparando las 2 figuras. figuras.

38

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

39

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

40

PRIMERAS IMÁGENES DE DNA HUMANO

(de Rodríguez León Paz, Gloria Elena,1998)

Después de haber estudiado el DNA de bacterias y de virus lambda,

nuestro siguiente objetivo fue

el estudio del DNA

humano. Al iniciar los estudios de DNA humano establecimos primero

el

método

de

extracción

del

mismo,

de

un

concentrado leucocitario siguiendo los pasos siguientes: 1) 1.5 ml de concentrado leucocitario 2) Centrifugar 3) Resuspender el precipitado en buffer BF. 4) + fenol y cloroformo y homogenizar en vortex. 5) Centrifugar 6) Transferir la fase acuosa a otro tubo y almacenar hasta su uso. 7) Precipitar una alícuota con alcohol-ácido, directamente sobre el portaobjetos y secar a temperatura ambiente. 8) Observar al microscopio 9) Tomar fotografía. Se presenta la foto

que viene a ser la primera imagen

obtenida de DNA humano (fig.-19). Nuestro siguiente paso fue el de establecer un método de extracción de DNA, lo más sencillo posible y para lograrlo les pedimos a 4 voluntarios, una muestra de sangre y seguimos los siguientes pasos: 2) Se induce a que se separen los glóbulos rojos 3) Se toman 1.5 ml de plasma

V22

1) 8 ml de sangre periférica + EDTA como anticoagulante

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

41

4) Se centrifuga 5) Precipitado + buffer y vortex 6) + fenol y cloroformo 7) Centrifugar 8) Transferir la fase acuosa a otro tubo 9) Precipitar una alícuota de extracto de DNA con alcoholácido. 10)

Observar al microscopio

11)

Tomar fotografía.

Se presentan las 4 fotos del DNA de los voluntarios, son 2 mujeres y 2 hombres, los 4 son jóvenes entre 25 y 32 años de edad y son saludables. En las 3 primeras fotos (fig.-20), (fig.-21), (fig.-22), el DNA se observa como una cadena o hilo limpio, sin replicaciones, ni fragmentado. En cambio la foto (fig.-23), corresponde a un hombre de 32 años, al que 8 días antes que nos donara la muestra de sangre, le hicieron una vasectomía. Antes de saber de la cirugía, al ver en el microscopio esa imagen de DNA, pensamos que había un error en la aplicación de la técnica. Repetimos nuevamente la extracción de DNA de esa muestra, y esta de nuevo

presentaba esa imagen tan

diferente, tan replicada y tan grande, en comparación con las imágenes de DNA. de los otros voluntarios. Después pensamos que el DNA se replico por la agresión al tejido recibida durante la operación. Estudiando el DNA en la DNA

se replicó, para expresarse y reponer las proteínas

perdidas durante la cirugía, entre ellas, la hemoglobina, el

V22

imagen de la foto y en el microscopio, deducimos que el

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

tejido que se encarga de

42

reparar y cicatrizar y los

anticuerpos contra infecciones. En conclusión seguramente la reacción del DNA fue saludable y busca el equilibrio de nuevo del organismo, ante las agresiones y las infecciones y la imagen del DNA que obtenemos refleja esos cambios. Los resultados que obtuvimos, nos llevaron a reflexionar profundamente en las grandes expectativas, que podemos obtener si estudiamos el DNA humano

y el de todos los

seres vivos con el nuevo Método de Análisis de DNA V22. Pensamos que tal vez sea posible

encontrar el lugar que

ocupan los genes en la cadena de DNA. Sí comparamos por ejemplo, el DNA de una persona ciega o sorda, con el de una persona sana, seguramente descubriremos señal (un marcador), una diferencia,

alguna

o algo que nos

indique el lugar, en el que debe estar ese gen o grupo de genes en la cadena, que en la comparación encontremos

V22

alterada o distinta.

43

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

44

Pensando en esas posibilidades, solicitamos donaciones en varios hospitales de la ciudad

de muestras de sangre,

extraída de pacientes con alguna enfermedad para ver y analizar la imagen del DNA. La experiencia y los resultados que obtuvimos fueron magníficos por la forma tan singular y diferenciada que se presenta entre una y otra imagen de DNA analizada. En la figura 24 podemos ver el DNA de una adolescente con síndrome de Down. En la figura 25 el DNA, de un paciente con tuberculosis. En la figura 26 el DNA de un paciente con lupus eritematoso. En la figura 27 el DNA de una paciente con cáncer de mama. En la figura 28 el DNA de una paciente con Alzheimer y en la figura 29 el DNA de una paciente con artritis reumatoide. En las figuras 30 y 31, se presentan el DNA de mujeres embarazadas, en donde se observa

un

DNA

grande

unido

a

uno

pequeño

que

V22

determinamos es el del bebé por nacer.

45

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

46

Todo ese trabajo desde la figura 1 hasta la 31, lo presentamos el 8 de enero de 1998, ante el IMPI, con una solicitud

de

Cooperation

trámite Trade),

de en

patente Ginebra

en

el

Suiza.

PCT La

(Patent

fecha

de

publicación internacional se realizo el 20 de agosto de ese dinero para el pago de derechos respectivos, en los 20

V22

mismo año. Se hizo del dominio público, porque no tuvimos

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

47

países en los que solicitamos la autorización para la comercialización.

De

cualquier

manera

nos

sentimos

satisfechos porque nos protegieron los derechos de autor. Presentamos otras fotos de DNA, que no fueron incluidas en la solicitud de patente, pero que son de gran importancia en el avance del conocimiento del DNA. La foto (fig.-32), es de un paciente con una infección en las vías urinarias, estaba tan grande, que no cabía en el campo visual del microscopio. El paciente tenia 92 años de edad al tomar la muestra y cuando vimos tal cantidad de DNA, pensamos que podríamos calcular la edad al ver esas imágenes, pero el DNA no aumenta con la edad, pero si se transforma con algunas enfermedades y disminuye con

FIG.-32 DNA DE HOMBRE DE 92 AÑOS CON UNA INFECCION LEVE

V22

otras.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

48

Estudiando y reflexionando sobre la edad y su relación con el DNA, lo que nosotros hemos observado durante nuestra investigación,

es

que

el

DNA

pierde

capacidad

de

compactación, a medida que pasan los años. Con la edad vamos perdiendo algo que tienen los organismos jóvenes, que permite a su DNA, que se compacte con facilidad. Ese algo quizá sea la anhelada por muchos, “La fuente de la juventud” y tal vez, metafóricamente hablando, sea “la piedra filosofal” guardada en el núcleo de las células, que por tantos siglos buscaron sin éxito, Los Alquimistas. El tabaco daña indudablemente el DNA de los fumadores, como es el caso del DNA de una mujer que fumaba desde los 15 años, al momento de tomar la muestra tenia 42 años y su DNA presentó una gran cadena lateral (fig.-33).

FIG.- 33

Cuando ella vio la fotografía de su DNA, se preocupó mucho, nosotros le sugerimos que dejara de fumar unos 4 meses o

V22

DNA DE MUJER FUMADORA 42 AÑOS

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

49

más y después regresara al laboratorio para una segunda prueba. Cabe la aclaración que la paciente de tabaquismo, fumaba 2 o 3 cigarrillos diarios, muy poco comparado con lo que fuman los grandes adictos. Ella regresó a los 6 meses de que había dejado de fumar (fig.- 34).

FIG.-34 DNA MUJER RECUPERADA DE TABAQUISMO

Su aspecto era como de 10 años menor de la ultima vez que la vimos y cuando observó la nueva fotografía, se comprometió ante su familia a nunca volver a fumar. Una de las drogas mas agresivas y que provoca los mayores daños al ADN. es el alcohol (fig.-35), La fotografía, nos muestra el efecto ocasionado por el efecto de la bebida, al ver esa imagen no se puede evitar la pregunta, ¿cuanto tiempo un compuesto formado con moléculas muy pequeñas, al ser

V22

lleva la reparación del ADN.?, Sabemos que el alcohol por ser

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

50

ingerido no sigue los lineamientos del sistema digestivo, sino que instantáneamente invade al torrente sanguíneo, atraviesa las paredes de todos los órganos del cuerpo, llega al cerebro, al corazón, a los riñones, al hígado, al bazo y a cada una de nuestras células, por eso el efecto de euforia que se siente de inmediato al ingerirlo. Se calcula que el alcohol tarda en ser eliminado de la sangre de 6 a 8 semanas, sin embargo hay bebedores que lo ingieren a diario y otros con

cierta

periodicidad, de tal manera que la célula no tiene tiempo de concluir la reparación y antes de que pueda terminar su labor, le llega más alcohol. Como todas las drogas, el alcohol crea dependencia en el consumidor, pero lo mas grave es que es capaz de modificar funciones vitales del organismo e inclusive provocar cambios a nivel celular, y si en el núcleo de la célula, en el DNA se conserva la herencia genética de los organismos, el daño que un alcohólico puede provocar en su descendencia

FIG.- 35 DNA DE HOMBRE QUE INGIRIO

V22

es muy grave.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

51

BEBIDAS ALCOHOLICAS

En nuestro recorrido por los hospitales y centros de salud de Hermosillo, recibimos y luego analizamos una gran cantidad de muestras sanguíneas, de todo tipo de enfermedades y de pacientes de todas las edades, con ellas obtuvimos mucha información sobre el ADN, pero también nos percatamos que todo lo que hemos logrado saber es muy poco ante la inmensidad que nos falta por aprender del lenguaje de imágenes del ADN.

Patente del Nuevo Método aprobada en México En 1996

nos llegó una carta del Instituto Mexicano de la

Propiedad Industrial IMPI, en la que nos informaron que nuestra solicitud de patente había sido aprobada. La emoción que

sentimos

fue

indescriptible,

porque

era

algo

que

deseábamos vehementemente obtener después de muchos años de trabajo. Esa tarde fuimos toda la familia, mi esposo, mis 2 hijas y yo, a un supermercado y

casualmente nos

encontramos a la periodista Emilse Valencia, amiga nuestra y le platicamos la noticia recibida, hasta ese momento, nunca habíamos comentado fuera del círculo familiar y de los compañeros de trabajo en el laboratorio sobre la investigación que

realizaba.

Ella trabajaba en una publicación de amplia

difusión que se llama “Revista ASI”, que fundo y dirige el periodista Antonio Duarte García, nos hicieron una entrevista y en la siguiente edición publicaron un amplio reportaje sobre la investigación y la reciente aprobación en México de la patente, el artículo fechado el 15 de abril de 1996, suscitó muchas llamadas telefónicas de políticos y de periodistas de otras publicaciones, de la televisión y de la radio, entre las

V22

muchos comentarios unos a favor y otros en contra. Recibimos

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

52

llamadas estuvo una del gobernador del Estado de Sonora, que nos dio una cita para preguntarnos en que nos podía ayudar y gracias a su generosidad pudimos pagar los derechos de la patente por 20 años. Después de la primera publicación en la revista ASI, mucha gente nos empezó a visitar en el Laboratorio, todos deseaban ver

su

DNA

y

el

de

sus

familiares.

Eso

contribuyó

enormemente a que en el futuro inmediato obtuviera mucho material de investigación. En la figura 36, vemos el DNA, de una paciente con Alzheimer:

En este caso ( figura. 36) nosotros fuimos a domicilio, a tomar la muestra de sangre ya que la paciente, se encontraba

V22

Fig.-36 ig.-36 DNA DE PACIENTE CON ALZHEIMER

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

53

imposibilitada para salir de su casa. Nos ha tocado analizar varias personas con esta enfermedad y cuando vemos las imágenes, nos da la impresión de que el DNA, esta en total desorden (coloquialmente hablando parece despeinado). Pero si observamos en el microscopio con cuidado, podemos ver que la cadena de DNA se encuentra envuelta con pequeños hilos o fibras que

pudieran pertenecer

al

DNA de

un

microorganismo, que poco a poco va impidiendo que el DNA de la paciente, funcione con normalidad, tal vez a eso se deba el carácter progresivo pero irreversible de esta enfermedad. Algún día a través de terapia genética,

puede intentarse el

encontrar una forma de eliminar esos filamentos para que los pacientes con Alzheimer puedan recuperarse y mejor todavía, si la enfermedad pudiera ser diagnosticada antes de que aparezcan los síntomas, las personas no se enfermaran, cuando ya se haya encontrado

la forma de prevenirla. Para

esto sabemos que hace falta mucha investigación del ADN. especializada en esta patología. En la figura 37, vemos el DNA de un paciente con la enfermedad de Chagas (Tripanosomiasis americana) esta enfermedad la trasmite un insecto (Chinche) hematófago, y provoca una infección, ocasionada por el Tripanosoma cruzi, esa enfermedad

afecta y afectaba mayormente a las clase

social más pobre de la población, quizá por esa razón no se le daba mayor importancia a su estudio y clasificación. Fue hasta 1960 que se empezó a poner la debida atención a esa patología que anualmente afecta entre 15 a18 millones de una mortandad anual

de 50 mil personas. El

problema principal de la enfermedad, es que las personas infectadas pueden no presentar síntomas en lapsos de 10 o

V22

personas con

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

54

15 años después de haberla contraído, por lo que su detección por sistemas convencionales se hace más difícil.

V22

FIG.-37 DNA DE PACIENTE CON ENFERMEDAD DE CHAGAS

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

55

Fig.- 38: DNA DE PACIENTE CON CANCER OSEO

Pronostico del Sexo del Bebé En 1994 por la agenda de trabajo de investigación que planeamos inicialmente

desarrollar

durante

ese

año,

solicitamos

donación de sangre a 4 voluntarios, (dos

hombres y dos mujeres) una de ellas estaba embarazada y ella no lo sabía aun, ni nosotros tampoco, al analizar la imagen de su ADN. observamos una característica distinta a los ADN. hasta entonces estudiados, no era el de una persona enferma, sin embargo era diferente en su estructura, ( figura 30), se puede observar un DNA, con una pequeña cadena adicional y cuando la vimos en el microscopio, pensamos en la como

era

la

primera

muestra

observada

con

esta

V22

posibilidad de un embarazo y lo comentamos en familia, pero

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

56

característica, sin punto de comparación, nada le dijimos a ella, pero como bien dice la sabiduría popular “Ni el embarazo, ni la alegría se pueden ocultar” y al poco tiempo, ella misma nos informó muy contenta su estado de gravidez. En esa ocasión

anotamos

en

la

bitácora,

las

interesantes

observaciones obtenidas del análisis de la primera muestra de ADN. de un embarazo que apenas se iniciaba. Pero fue hasta 1995,

cuando

a

partir

de

los

resultados

obtenidos

y

estimulados por la fantástica posibilidad del pronóstico del sexo del bebé, desde los primeros momentos de su gestación, iniciamos el estudio de mujeres embarazadas. Durante el estudio realizado vimos y analizamos mas de 450 imágenes de DNA de mujeres en diferentes etapas de gestación, con ellas aprendimos que antes de las 11 semanas, el DNA de la madre, se observa diferente si el sexo del bebé es niña (fig.-39) comparado a la imagen obtenida cuando el sexo del bebé es de un niño. (figura,40) En los pronósticos del sexo del bebé que realizamos , antes de la onceaba semana de gestión, erramos únicamente en 20 casos,

algunas veces porque la

mamá estaba tomando medicamentos, otra porque tenia una infección, también por tener bajos los leucocitos. Nuestra observación es que cuando ciertas circunstancias, como los jarabes o infecciones están presentes al momento del análisis y el pronostico, el DNA se transforma y enmascara los

V22

resultados.

Fig.- 39 DNA DE MUJER CON 7 SEMANAS DE EMBARAZO (NIÑA)

57

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

58

En el caso de las niñas el DNA de la futura mamá, se presenta como una sola cadena con un lazo adicional, esto antes de las 11 semanas, después es otra la imagen.

Fig.- 40 DNA DE MUJER CON 9 SEMANAS DE EMBARAZO (NIÑO)

Los niños en cambio, se observan como 2 cadenas , el DNA de la futura mamá y una cadenita adicional, esta imagen se presenta hasta las 12 semanas, después cambia.

PRUEBAS DE PATERNIDAD En junio de 1998 un agente de investigaciones de la Procuraduría de Justicia del Estado de Sonora, nos preguntó si era posible realizar una prueba de paternidad con nuestro era necesario establecer la técnica

especifica para ese

V22

método, contestamos que seguramente si, solo que primero

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

59

análisis. El caso que necesitaban resolver, era el de un niño que

4

años

atrás,

estando

recién

nacido,

había

sido

secuestrado y necesitaban saber cual de los 2 matrimonios que

reclamaban al niño como suyo, eran los verdaderos

padres. El caso en si era todo un drama, la señora que robo al niño, estuvo en estado de embarazo casi al mismo tiempo que una vecina suya (la verdadera madre). Pero al poco tiempo tuvo un aborto natural, que ocultó a su esposo que se encontraba trabajando en Estados Unidos, así que fingió que su embarazo continuaba normalmente, pero cuando nació el niño de la vecina, ella lo sustrajo y se fue de Hermosillo a vivir a la ciudad de Tijuana, así que cuando su esposo regresó de Estados Unidos, creyó realmente que el niño era suyo y

lo trataron y cuidaron

como si fueran sus

verdaderos padres en los 4 años siguientes. Para establecer la prueba de paternidad con nuestro método V22, les pedimos a 10 familias de amigos y parientes, que nos dieran muestras de sangre, de los padres y de los hijos de cada familia, a lo que todas ellas cooperaron y se unieron al estudio. Iniciamos la investigación para establecer la técnica de paternidad, tomando las muestras acudiendo a cada domicilio y obtuvimos las muestras de sangre de : -El Padre -La Madre -Las Hijas

V22

-Los Hijos

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

60

En un principio la premisa fue la de comparar los DNA, de los padres con el DNA de las hijas y los hijos. Creímos

que los

DNA de una familia, por lógica elemental, deberían parecerse tanto que los identificaríamos con cierta facilidad, pero no fue así. Las cadenas se parecían mucho entre los miembros de una familia, pero también se parecían a las de otra familia. Unos y otros se confundían a simple vista, no fue posible la identificación de los padres y los hijos de una familia de esa manera, la broma que recibíamos en nuestra casa era que la confusión se debía a que todos los participantes en la prueba somos mexicanos. Buscando una solución mas objetiva y determinante pensamos entonces que si

uníamos directamente en la reacción las

cadenas de ADN de todos los miembros de una familia, que sucedería. Así lo hicimos y esto fue lo que pasó:

REACCIONES DE AFINIDAD Las reacciones de afinidad de las proteínas, consisten en el reconocimiento

de

una

molécula

con

otra,

con

una

especificidad asombrosa. Este tipo de reacciones de afinidad, se utilizan mayormente en una gran cantidad de análisis bioquímicos, como por ejemplo el uso de reacciones de ELISA (Ensyme Linked Inmunoassay) en virología. Lo mismo las reacciones de afinidad entre las hormonas y sus receptores o las de las enzimas con sus sustratos. En la tecnología de PCR (Polymerase Chain Reaction), se “primers” y el fragmento de DNA que se desea amplificar, por

V22

utiliza la reacción de afinidad del DNA entre los iniciadores o

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

61

acción de la enzima DNA polimerasa. El requerimiento del iniciador es que su secuencia de bases. sea igual a la secuencia inicial de la cadena de DNA, que se desea replicar. Mezclamos las muestras de DNA, de los padres y los hijos o las hijas y de los padres con los no hijos o no hijas, siguiendo los siguientes pasos: En esta prueba participaron 5 personas 2 adultos y 3 niños: 1) El padre (fig.- 41), 2) La madre (fig.- 42), 3) La hija (fig.-43), 4) El no hijo (fig.- 44) y 5) La no hija (fig.45). 1)

Se

tomó

la

muestra

de

sangre,

con

EDTA

como

anticoagulante. 2) Se centrifugó para separar el plasma y se descarta. 3) Se adiciona buffer BF 4) Se agrega fenol y cloroformo 5) Centrifugar 6) Volver a agregar fenol y cloroformo y centrifugar 7) Precipitar el DNA de las 5 muestras y se tomaron las fotografías correspondientes 8) Reacciones de afinidad del DNA: Se mezclaron los DNA de la forma siguiente: a) EL PADRE + EL NO HIJO (fig.- 46) b) EL PADRE + LA NO HIJA (fig.- 47) c) EL PADRE + LA HIJA (fig.- 48) d) LA MADRE + EL NO HIJO (fig.- 49) e) LA MADRE + LA NO HIJA (fig.-50) f) LA MADRE + LA HIJA (FIG.- 51) g) EL PADRE+ LA MADRE + EL NO HIJO (fig.- 52) h) EL PADRE + LA MADRE + LA NO HIJA (fig.- 53) MADRE (fig.- 55):

V22

i) EL PADRE + LA MADRE + LA HIJA (fig.- 54)j) EL PADRE + LA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

62

FIG.- 41 EL PADRE

V22

FIG.- 42 LA MADRE

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

63

FIG.-43 LA HIJA

V22

FIG.-44 EL NO HIJO

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

64

FIG.- 45 LA NO HIJA

V22

FIG.-46 EL PADRE + EL NO HIJO ( 2 CADENAS separadas)

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

65

FIG.- 47 EL PADRE + LA NO HIJA ( 2 CADENAS)

V22

FIG.- 48 EL PADRE + LA HIJA ( 1 CADENA)

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

66

FIG.-49

LA MADRE + EL NO HIJO ( 2 CADENAS)

FIG,. 51 LA MADRE + LA HIJA ( 1 CADENA)

V22

FIG.-50 LA MADRE + LA NO HIJA ( 2 CADENAS)

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

67

FIG.-52 EL PADRE + LA MADRE + EL NO HIJO ( 3 CADENAS)

V22

FIG.-53 EL PADRE + LA MADRE + LA NO HIJA ( 3 CADENAS)

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

68

FIG.- 55 EL PADRE + LA MADRE ( 2 CADENAS)

V22

FIG.- 54 EL PADRE + LA MADRE + LA HIJA ( 1 GRANCADENA)

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

69

Estos resultados obtenidos de la prueba de paternidad, muestran uno de los alcances que puede ofrecer esta nueva metodología V22. Realmente fue para nosotros una sucesión de encuentros y sorpresas, al ir viendo y analizando las imágenes que Íbamos obteniendo en las combinaciones, de los padres y los hijos y los no hijos. Cuando vimos las dos cadenas al juntar el padre o la madre con el no hijo o la no hija, de las figuras 46, 47, 49 y 50.

Podemos afirmar que cuando mezclamos 2 cadenas de

DNA, con secuencias distintas

quedan separadas en la

precipitación, seguramente porque no se reconocen. En cambio, cuando se unen 2 DNA de padres e hijos o hijas, las cadenas se reconocen en una reacción química de AFINIDAD, formando una sola cadena, figuras 48 y 51. Al poder ver esto, nos pareció que era algo que otorga a la ciencia su aureola mágica pero lógica y que la naturaleza y la vida está formada de acertijos y enigmas que habremos de ir descubriendo, con el trabajo experimental continuo, utilizando y aplicando los conocimientos adquiridos con sentido crítico, realizando lo que

cada quien podemos y nos corresponde

hacer. Todavía algo más sorprendente sucedió cuando unimos los DNA de los 3, los padres con los no hijos y con la hija. Con el no hijo y con la no hija figuras 52 y 53, obtuvimos después de la precipitación 3 cadenas separadas, debido a que no hay

Algo maravilloso sucede cuando se unen los padres con la hija, se obtiene una gran cadena, por una reacción de AFINIDAD,

V22

reconocimiento y por tanto no hay unión.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

70

porque las cadenas de DNA tienen secuencias iguales figura 54. Tratando de comprender la reacción de afinidad entre los padres

y

los

hijos

sería

la

siguiente:

Los

hijos

son

genéticamente hablando, la mitad exacta del padre y la mitad de la madre, cuando las cadenas se unen, el padre y la hija o la madre y la hija, se forma una cadena, aunque queda un sobrante por el que falta. En cambio cuando se unen los 3, el padre, la madre y la hija o el hijo, obtenemos una enorme cadena de DNA, porque el hijo o hija son la mitad de cada uno y al unirse los 3, la cadena queda completa al unirse las mitades faltantes, por ser DNA de secuencias iguales. Por último cuando se juntan los padres sin el hijo o la hija, se obtienen 2 cadenas separadas figura 55, ya que falta el lazo de unión, que son los hijos, a los que mucha gente llama intuitivamente pero atinadamente “LAZOS DE AMOR”. Para el analista será muy sencillo reconocer el resultado de las pruebas

de

paternidad,

no

tiene

que

interpretar

subjetivamente nada, únicamente observar la reacción de las cadenas de DNA , si ve cadenas separadas reportar

negativo y si ve una sola cadena reportar positivo. Nuestro reporte de prueba de paternidad del DNA, fue aceptado como prueba pericial por el juez calificador, y coincidió plenamente con las otras pruebas

(que nosotros no

conocíamos), realizadas por el cuerpo de investigadores del ministerio público, ante las evidencias, la señora que había robado al infante confesó como sucedieron los hechos y el

V22

niño fue reintegrado a sus verdaderos padres.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

71

Hipótesis, Teorías y Experiencia Científica El filosofo y matemático Imre Lakatos consideraba que la ciencia es incapaz de alcanzar la “verdad”, en otras palabras pensaba que no hay verdades absolutas, pero en su obra “Programa de investigación Científica” sugirió que “cada nueva teoría deberá ser capaz de explicar mas cosas que la anterior y sobre todo ha predecir hechos nuevos que nadie antes se había planteado “.

Su “Programa de Investigación

Científica”, consiste en una sucesión de teorías relacionadas entre sí, de manera que unas se generan partiendo de las anteriores. Para Lakatos el desarrollo

de la ciencia consiste en el

enfrentamiento de teorías rivales con la experiencia del investigador, bajo esa circunstancia una teoría es aceptada y otra es refutada, generándose un proceso dialéctico continuo de afirmación- negación - afirmación, con este criterio Lakatos parece estar de acuerdo con la teoría de su maestro Karl Popper que asegura que la ciencia esta en una constante “Revolución Científica”, lo que confronta la teoría de Thomas Kuhn,

que afirma que antes de romperse un paradigma

científico existe un período de ”Ciencia Normal”, que precede a la aparición de una “Revolución Científica” que significa en sí, una ruptura. En el método científico

de las ciencias empíricas ha

prevalecido la inducción como única manera de validación de suma de casos, pruebas y hechos que reafirmen y apoyen las tesis formuladas, lo que dificulta la validación de hechos

V22

las ciencias, con un sentido de verificación permanente de la

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

72

científicos, que rompan y tengan un comportamiento y resultados diferentes, porque son analizados del punto de vista de la ciencia y los paradigmas establecidos. En 1970, Thomas Kuhn hizo la siguiente observación “Cuando se produce un cambio de paradigma, cambia la naturaleza misma de lo que importa como explicación. Las explicaciones bajo dos paradigmas

diferentes, no son solo disimiles; son

inconmensurables “. Todo descubrimiento científico es parte de experiencias que lo preceden, por línea directa, por ruptura o por contradicción, entre la afirmación y la negación media la objetividad de la observación posibilidad

del de

investigador un

nuevo

y

la

mente

paradigma.

realizado en el laboratorio da origen a

Cada

abierta

a

la

experimento

otro experimento,

negación y afirmación tienen igual validez e importancia metodológica para el desarrollo o la innovación científica. Mi maestro el Doctor en química orgánica Edward Berka, un científico alemán asilado en México, que en mi formación profesional estimuló en mayor medida mi interés por la investigación recomendaba

científica

y

constantemente

el

trabajo

que

en

experimental,

los

reportes

o

anotaciones en la bitácora, se les concediera igual importancia y se registraran a detalle los resultados positivos y negativos. Para el Doctor Berka la observación y participación personal, “Con nuestros propios ojos y nuestras propias manos” en forma acuciosa y analítica en cada parte del proceso de un experimento, es el material mas importante e invaluable para

Teoría

y

práctica

investigación

pero

se

conjugan

y

indudablemente

complementan la

mejor

en

forma

la de

V22

un investigador científico.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

73

confirmar o refutar una teoría es la empírica con un profundo sentido critico y autocrítico, por esa razón mi maestro Edward Berka consideraba que un investigador debería estar siempre en el laboratorio, observando, analizando y comparando cada reacción y cada cambio ocurrido en los experimentos y estar presentes y atentos a cuanto se produzca y pueda abrir el camino a un descubrimiento. Decía el maestro Berka que un investigador

debe tener

siempre las manos ocupadas por el trabajo cotidiano que realiza y guardar oportunamente en el bolsillo de su bata una pequeña toalla para limpiar sus manos y saludar a eventuales visitantes de su laboratorio.

EL FINANCIAMIENTO DE PROYECTOS CIENTÍFICOS EN MÉXICO En México la inversión en Ciencia y Tecnología no ha alcanzado los niveles de crecimiento necesarios para impulsar el desarrollo de la investigación y la aplicación tecnológica, al principio del sexenio correspondiente a los años, 2000- 2006, fue de 0.40 % del PIB y no ha variado sustancialmente en los siguientes años, el porcentaje de participación del PIB en la investigación científica de México esta muy por debajo de los países altamente industrializados, como Alemania, Estados Unidos, Canadá, Japón, etc . México ocupa el último lugar en porcentaje del PIB invertido en investigación y desarrollo la Cooperación y el Desarrollo Económico)

V22

entre los 30 países miembros de la OCDE. (Organización para

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

74

Es indudable que los proyectos científicos requieren de recursos financieros que están muy lejos de la capacidad económica del ciudadano promedio de nuestro país, de allí que la mayor parte de la investigación científica y tecnológica se realiza en instituciones oficiales y escasamente en el sector privado que condiciona su participación a que la investigación sea comercialmente muy redituable. Luego entonces hablar de una investigación científica, independiente del sector oficial, como la nuestra, que aspiraba a desarrollar un proyecto de investigación

de

ingeniería

genética

y

que

pretendía

establecer un nuevo método de análisis del DNA, sonaba a utopía de alta pureza o ingenuidad, y sin embargo, hay una razón de peso para ello, como bien señala el escritor Eduardo Galeano en su pregunta- respuesta : “¿Para que sirven las utopías?” y se responde -“Sirven para caminar, para abrir caminos”-. Y en un país como el nuestro cuya inversión en ciencia y tecnología no alcanza ni siquiera el promedio de lo que se invierte en América Latina, había que abrir camino a la investigación

independiente

ante

la

indiferencia

de

las

burocracias científicas oficiales de aquel tiempo en el que iniciamos

nuestra

financiamiento

aun

investigación, para

que

proyectos

dificultaban de

el

investigación

enmarcados en lo que Thomas Kuhn llama “Ciencia normal”. Y vaya que hemos caminado desde aquel día que dejamos la comodidad del cubículo y el cheque quincenal de aquel Centro de Investigaciones, en el que trabajaba para emprender de manera independiente el camino de lo que era una bella utopía, sin mas recursos que el apoyo familiar y la voluntad y la tenacidad personal para tratar de lograr realizar nuestro parece que caminando nos acercamos al horizonte de ese “No

V22

proyecto de investigación. Desde entonces cada vez que

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

75

lugar” que define a las utopías, el horizonte de nuevo se aleja y nos obliga a seguir caminando.

LA ENFERMEDAD DE LAS VACAS LOCAS En 1996, el llamado síndrome de la “vacas locas” BSE (Bovin Spongiform Encefalithy) en Inglaterra, fue motivo de la atención mundial, al conocerse que la detección de este mal se realizaba cuando el estado de la enfermedad estaba en su fase terminal o la res este muerta, esto llenó de temor a los consumidores de carne de res en el Reino Unido, en el resto de Europa

y

otros

países

a

los

que

Inglaterra

exportaba

productos cárnicos. La mayoría de estas naciones cerraron el mercado a las importaciones y establecieron cercos sanitarios a la enfermedad. Inglaterra estuvo obligada a sacrificar miles de vacas que manifestaban el principio de la enfermedad e inclusive tuvo que eliminar a las reses aparentemente sanas pero que formaban parte de los hatos ganaderos infectados. En el estado de Sonora que es una entidad ganadera, la enfermedad de las vacas locas fue noticia de primera plana en todos los medios de comunicación. Un hermano nuestro, Fausto León Paz, atento a esas noticias y a cabo con el DNA, nos aconsejó que le escribiéramos al Primer Ministro de Inglaterra John Major y le propusiéramos

V22

enterado con todo detalle de las investigaciones que llevamos

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

76

nuestro método de análisis como una posible solución para la enfermedad de las vacas locas, pero al ver cierta indecisión de nuestra parte nos dijo: “total si contesta que bueno y si no, no pasa nada”. Escribimos entonces a

John Major al 10 Downing Street;

London Inglaterra, proponiendo nuestra técnica y cual seria nuestra sorpresa, que en el lapso de dos semanas recibimos una

carta

de

la

oficina

del

Primer

Ministro

inglés

comunicándonos su interés por conocer mas detalles del método,

para

esto

nos

informó

que

nos

pondría

en

comunicación con el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación de Gran Bretaña. MAFF. A partir de abril de 1996 iniciamos una serie de intercambios de información epistolar con el departamento de BSE del MAFF, creado especialmente para atender el problema de la “vacas locas” nuestra experiencia con DNA de ganado vacuno en ese tiempo se concretaba a un único caso de detección de brucelosis, podíamos

sin

embargo

establecer

un

confiábamos método

de

plenamente diagnostico

de

que la

Encefalitis Espongiforme, trabajando con un buen numero de muestras de vacas sanas y enfermas. Para esto formulamos un plan de trabajo que incluía la extracción de DNA de la sangre de las reses y su posterior análisis con nuestro método. Entregamos nuestra propuesta en la embajada de Inglaterra en la ciudad de México y se nos comunicó, que los documentos diplomática y que ellos se comunicarían nuevamente con nosotros después de estudiar la propuesta.

V22

serían enviados esa misma semana a Londres en la valija

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

77

Poco después, en 1997 se efectuaron elecciones en Gran Bretaña y el Primer Ministro John Major fue derrotado por el miembro del partido laborista Tony Blair. A partir del arribo de la nueva administración perdimos todo contacto con el MAFF de

Inglaterra,

pero

un

año

después

recibimos

una

comunicación de los nuevos funcionarios ingleses informando de su interés por la propuesta que habíamos hecho a fines de 1996, la propuesta de ellos consistía que en la primera fase del estudio recibiríamos en México (Hermosillo), muestras codificadas de DNA de vacas afectadas por la enfermedad, para esto teníamos que contar con el permiso aduanal mexicano del Departamento de Agricultura y

Ganadería del

Gobierno Federal, hicimos los tramites respectivos ante el gobierno de México y simultáneamente comunicamos al MAFF que pronto enviaríamos el permiso aduanal respectivo. Pero pasaron los días y los meses y el acuse de recibo, el permiso o una notificación negativa jamás llegó, por tanto nos olvidamos del asunto (usos y costumbres, dijimos por todo comentario) y casi un año después (1999) de haber realizado la

solicitud,

un

funcionario

federal

nos

llamó

para

comunicarnos que el permiso estaba listo y podíamos pasar a recogerlo. Naturalmente que aquello quedo cómo una anécdota, de la ineficiencia administrativa que nos privó de la oportunidad de probar la metodología en un país del primer mundo, contando con todos los recursos que hasta ese momento, no habíamos dispuesto en México para desarrollar y aplicar nuestra

V22

investigación.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

78

MACROMOLECULAS HABANA 97

INTERNACIONAL MEETING ON POLYMERS UNIVERSIDAD DE LA HABANA CUBA En octubre de 1997 fuimos invitados a participar con nuestro trabajo de investigación “Desarrollo de un Nuevo Método para Ver, Analizar y Manipular DNA Utilizando un Microscopio Óptico “, en el Congreso Internacional de Macromoléculas en la Habana Cuba, la sede del evento durante la semana del 1 al 5 de diciembre del mismo año, fue la universidad de la capital de ese país. Previo ha nuestro registro remitimos a los organizadores el resumen (abstract) de la investigación que presentaríamos en Cuba. Fuimos aceptados inicial fue

y el problema

gestionar en muy poco tiempo los recursos

necesarios para el viaje y estancia en Cuba. Afortunadamente el Secretario de Salud del Estado de Sonora, Doctor Manuel Robles Linares, conocía de tiempo atrás nuestra investigación y fue sensible a la necesidad económica que afrontábamos para poder asistir al congreso científico. Por lo que nos brindó boletos de viaje redondo México-la Habana, la Habana – México, eso nos solucionó parcialmente el problema porque había que viajar primero de Hermosillo a México y de México a Hermosillo de regreso, pero nuevamente la suerte estuvo de nuestra parte y la generosidad de unos amigos periodistas, se hizo patente y lograron que un periódico local nos financiara el viaje redondo, a la ciudad de México. La estancia en la ciudad de la Habana nos permitió conocer a investigadores europeos y latinoamericanos que con sus la diversificada aplicación de los polímeros en esos trabajos, desde el campo de la

industria, la biotecnología

y la

V22

trabajos de investigación concurrieron al Congreso científico,

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

79

odontología, revelo a plenitud ante nuestros ojos el uso de los polímeros, como un factor o un elemento estructural muy importante de las sociedades modernas

(o posmodernas) del

siglo XX y de inicios del siglo XX1, de hecho es difícil imaginar la existencia de estas sociedades sin el uso de los polímeros. Su uso en todos los campos de la actividad humana, como en las llantas para automóviles, mangueras, suelas de zapatos, aislantes eléctricos, aparatos de radio, teléfonos, partes de televisores,

pelotas

nanobiotecnología

la

de

golf,

aplicación

etc. de

También nuevos

en

la

polímeros

termoplásticos tiene un amplio campo de aplicación al igual que

en

los

sorprendentes

procesos

de

nanoimpresión,

nanoelectrónica, etc.. Naturalmente que para nosotros el mayor interés estaba enfocado en el uso de los polímeros naturales, de los que la mayor parte de ellos se obtienen por reacciones de condensación o adición, algunos de esos polímeros tienen contacto directo con el medio fisiológico y poseen la ventaja de que son biodegradables. El uso de las membranas de polímeros en la medicina, ha adquirido una enorme importancia en procesos de purificación sanguínea, en la diálisis y en las técnicas de ultrafiltración para la separación de microorganismos, las membranas de separación ocupan un lugar muy destacado en la industria alimenticia, en la fabricación de quesos y de determinadas bebidas como la cerveza, fermentados diversos, empaque de alimentos par disminuir o evitar su oxidación en fin, la experiencia obtenida en el Congreso de macromoléculas en la Habana, reafirmó nuestro interés por el uso de lo polímeros una mayor importancia, quizá por eso quedaron grabadas en nuestra mente las palabras de un investigador que dijo:

V22

naturales que de entonces (1997), a la fecha han adquirido

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

80

“Los polímeros y su contribución invisible, tienen un éxito muy visible en el mundo moderno”

OPTOGENETICS.INC En agosto de 1998 nos invitaron del Periódico “El Imparcial” de Hermosillo Sonora, a ofrecer una platica de presentación de nuestro trabajo de investigación, dentro de un programa anual de conferencias y actividades culturales que realizan y denominan “Charlas de Verano”. Después de la platica

El

Imparcial publicó un gran reportaje, que tituló “De Hermosillo al Nobel” esto motivó a que unos empresarios mexicanos y norteamericanos,

nos

invitaran

a

presentar

nuestra

investigación en San José California, aceptamos y fue de esta manera como el 22 de septiembre de 1998, ante la comunidad de

científicos

norteamericanos

de

Silicon

Valley

y

empresarios, presentamos en esa ciudad californiana las experiencias en la investigación del DNA. Con nuestro nuevo método, mostramos además las fotografías obtenidas. Hubo mucha discusión y dudas, pero para nosotros lo significativo de esa reunión era que por primera vez investigadores científicos, se interesaban por escuchar los resultados de un proyecto de investigación, que médicos e investigadores mexicanos de Hermosillo, habían calificado de descabellado sin siquiera conocerlo. Finalmente, científicos y empresarios mexicanos y norteamericanos decidieron formar una empresa de biotecnología a la que pusieron por nombre OPTOGENETIC INC. Partiendo del hecho de que la nueva técnica de análisis en el microscopio . En el lapso de gestión de los abogados para el registro legal de la empresa en el Estado de California,

V22

de DNA esta basada en un fenómeno óptico, que permite verlo

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

81

la Doctora en Genética Xi Zhao, una connotada investigadora norteamericana de origen Chino, estuvo en Hermosillo

por

acuerdo y solicitud de los miembros de la nueva empresa de la que ella misma formaba parte, el objetivo de su visita era para presenciar de manera directa en el laboratorio la aplicación de la nueva tecnología. Ella dio su aprobación e hizo interesantes observaciones sobre el método, pero lo que mas recuerdo fue que en ese primer contacto con el método, ella comentó que le era difícil aceptar que estaba viendo el DNA y tal vez lo que veíamos era algo que nadie en el mundo se puede imaginar que existe. El 2 de diciembre de 1998 se aprobó el registro legal de la empresa de biotecnología Optogenetics Inc. en el Estado de California, con el número 2073727, firmada por el Secretario de Estado del Estado de California Bill Jones, la dirección de la corporación quedó establecida en San José California, USA. Fundada por inversionistas mexicanos y norteamericanos. La empresa recibió autorización para la emisión de 25.000.000 de acciones de las cuales el 45 % serian para la autora de la invención.,

mas

US$100.000

dólares

anuales

por

la

transferencia de tecnología de la patente mexicana (182175) y la patente en PCT (mx98/00003), la entrega de todos los descubrimientos futuros y un convenio de no competencia con los intereses de la compañía Optogenetic Inc. El capital inicial fue fijado en US$1.500.000 dólares., Los abogados encargados fueron el despacho Wilson Sonsini Goodrich &Rosati de Palo

Desde el principio la compañía tuvo como Director Ejecutivo al Doctor Víctor Virpullat, científico norteamericano, miembro y

V22

Alto California.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

82

ex-presidente de la organización internacional que agrupa a las personas de mas alto coeficiente intelectual (CI) en el mundo (MENSA) y al que pertenecen la mayoría de

los

científicos mas destacados de los Estados Unidos y de otros países. A Optogenetic se incorporarían, además de la Doctora Xi Zhao, el Doctor en Biología Celular Gin Wu y el promotor y asesor financiero Arthur Lipper III. Después de que se formó la compañía Optogenetic, los empresarios mexicanos hicieron gestiones en Hermosillo con la Secretaria de Salud para que nos concedieran un espacio en el Hospital Oncológico del Estado de Sonora, en esa institución de salud montamos un pequeño laboratorio, en el que empezamos a trabajar de nuevo, prácticamente en un nuevo “asilo científico”. Por otra parte, en California empieza el proceso de solicitud de patente en los Estados Unidos. La perspectiva

muy atractiva para trabajar en el Hospital

Oncológico fue que

en ese lugar obtendríamos muestras

sanguíneas de enfermos de cáncer recién diagnosticados, nos interesaba particularmente empezar a estudiar el DNA de pacientes con cualquier tipo de cáncer que no hubieran iniciado su tratamiento de quimioterapia y radioterapia, enfermos de cáncer Cervico-uterino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer óseo, cáncer de pulmón, etc. La posibilidad de sustituir el examen papanicolau de cáncer Cervico-uterino, con la sencilla extracción de una muestra de sangre, como en cualquier biometría, haría que muchas mujeres que evitan el examen por pudor, cuestiones morales , de manera rutinaria y sobre todo con la posibilidad de detección temprana. Todos los oncólogos saben que cuando

V22

culturales o religiosas acudieran a hacerse las pruebas de DNA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

83

un cáncer es detectado o manifiesta sus primeros síntomas, la enfermedad ya tiene algunos años de haberse incubado, así que

si

tomamos

en

consideración

que

en

cualquier

enfermedad el primero que cambia es el DNA, al registrar la presencia de agentes patógenos, y los genes del sistema inmunológico se replican e inician la defensa del organismo, un análisis del DNA, detectaría oportunamente esos cambios, esa información en manos del oncólogo permitiría la terapia adecuada cuando la enfermedad apenas se inicia, con la ventaja adicional de que se le puede dar seguimiento al efecto de los medicamentos y los resultados de la terapia. Años atrás, cuando la investigación la realizaba en el Laboratorio Estatal de Salud Pública, hubo una ocasión que una de las muestras de DNA que analizaba y que pertenecía a una joven compañera del laboratorio, presentó un aspecto extraño muy diferente a las muestras de DNA que a ella misma le habíamos realizado meses antes y diferente también a otras muestras de DNA hasta entonces estudiadas,

no

sabíamos de que se trataba pero por prevención se lo comentamos a ella y entonces consultó a su medico, que muy profesionalmente agotó todo tipo de pruebas y al hacer la prueba de Papanicolau, le diagnosticaron cáncer cérvico uterino incipiente, otras pruebas adicionales confirmaron el diagnostico y el doctor inició en la paciente, una terapia con interferón. Terminado el tratamiento ella nos dio una nueva muestra sanguínea para extraer el DNA y repetir el análisis, la sorpresa fue que la imagen de su DNA había recuperado su aspecto normal, ya sin el aspecto replicado y desordenado,

V22

que presentaba antes de su tratamiento.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

Con

ese

antecedente

sistemático

de

cáncer

en

mente,

en

el

el

iniciar

hospital

al

un

estudio

que

acudían

diariamente enfermos de todo el estado de Sonora,

84

me

parecía una gran oportunidad de consolidar una investigación que ayudara a resolver la erradicación de esa terrible enfermedad, por su parte, a la compañía Optogenetic les pareció muy adecuado que iniciáramos con cáncer la nueva etapa de la investigación de DNA, considerando que solamente en Estados Unidos esa enfermedad provoca el mayor índice de decesos. Hicimos un protocolo de investigación que entregamos al director del nosocomio, pero extrañamente las muestras nunca llegaron a nuestro laboratorio, por cuestiones casuales obtuvimos dos o tres muestras de enfermos que eran conocidos nuestros, ellos o sus familiares, y aunque algunos médicos

en

lo

personal

nos

prometieron

amablemente

conseguirnos algunas muestras de los pacientes que ellos trataban, estas tampoco nunca llegaron. La compañía decidió entonces poner un anuncio de media página en un periódico local solicitando muestras voluntarias de enfermos de cáncer y por ese medio conseguimos otras tres muestras pero de enfermos que ya habían iniciado el tratamiento o estaban en fase terminal. Al no contar con el suficiente número de muestras que nos permitieran realizar repeticiones y comparaciones estadísticas entre los diferentes tipos de cáncer y distintas etapas de su evolución y al constatar que en México difícilmente podríamos las

muestras

necesarias

para

el

proyecto

de

investigación, recordamos la experiencias obtenidas cuando establecimos el método para la obtención del perfil plásmidico

V22

obtener

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

85

de E. coli y las pruebas de paternidad por afinidad, de repente nos pareció que era lógico pensar que si poníamos dos muestras de DNA iguales , las cadenas se unirían por afinidad, por ejemplo Cáncer de Mama (Cam.), con

cáncer de mama

(Cam) y si reuníamos DNA de cáncer Cervico-uterino (Cacu) y

cáncer

de

mama

(Cam)

las

cadenas

permanecerían

separadas, por ser dos tipos de cáncer con origen diferente, entonces y siguiendo esta misma secuencia lógica, si uníamos el DNA de una persona sana con el DNA de Cáncer de cualquier tipo, las cadenas permanecerán separadas porque no hay afinidad, pero si el DNA de una persona aparentemente sana, se une al DNA de cáncer con el que estamos realizando la prueba, seria evidencia que la enfermedad ha iniciado el proceso de incubación . Realizamos algunas pruebas con las escasas muestras de cáncer disponibles, hicimos todas las combinaciones posibles con ellas y luego combinándolas con DNA de personas sanas, DNA de embarazadas, DNA de enfermos de Alzheimer, DNA de tuberculosis (BCG), etc, y en todos los casos los resultados fueron

como

lo

habíamos

teorizado.

Para

agotar

las

posibilidades de otro tipo de combinaciones, necesitaba

de

cualquier forma obtener muchas muestras de DNA del mayor numero de tipos de cáncer, sobre todo los de mayor incidencia y del mayor numero de otros tipos de enfermedades. A todo esto se une la necesidad de establecer control, sobre las condiciones

de

extracción

misma

del

realización de la prueba y diferencia

DNA,

tiempo

de

con el tiempo de

extracción del DNA, condiciones de conservación de la lugar de extracción de la muestra de DNA y lugar de realización de la prueba, origen de la muestra de DNA, todo

V22

muestra (congelada, liofilizada, a temperatura ambiente etc, ),

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

86

esto para establecer las adaptaciones necesarias a la técnica, observar los resultados en cada caso hasta obtener resultados óptimos. Esto implicaba además la necesidad de disponer de todas las muestras de DNA necesarias para las pruebas, disponer de un largo tiempo de investigación, de reactivos y equipo e instrumental adicional con el que no contábamos. Por otra parte, no podíamos tampoco contratar ayudantes porque según la compañía Optogenetic, todos los recursos disponibles estaban enfocados a pagar a los abogados y los altos costos en la gestión de registro de patente en los Estados Unidos y eso mismo limitaba el compartir el secreto de patente, con otras personas ajenas al proyecto.

Financiamiento y Comercialización La compañía Optogenetic obtuvo inicialmente recursos para su operación

de

la

venta

de

acciones

principalmente

a

destacados empresarios de Sonora, de Nuevo León y de San Diego California, que veían, unos con cierta simpatía los objetivos humanitarios de la investigación, otros porque el plan de negocios incluía el ingreso de la compañía a la bolsa de valores de Nueva York, por otra parte los estudios de mercado realizados por el Dr. Jefrey Níkel (Executive VP) eran muy

optimistas

en

cuanto

a

las

posibilidades

de

comercialización del descubrimiento, un elemento más que ayudó a consolidar la imagen de la compañía eran las personalidades del Presidente de Optogenetic Inc. Dr. Victor Vurpillat (CEO), Dr. XI Zhao (CTO), John Gorsich (CEO) Brenda el Dr, Gin Wu como Presidente científico de la V22

Fox (CIO),

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

87

Compañía y el (Chairman) Arthur Lipper III como Director de las operaciones financieras de la compañía.

Arthur Lipper III (Chairman de British Far East Holding Ltd. Y de Environmental Technologies Corporation of America ) es un destacado financiero , consultor y banquero, autor de varios libros, conferencista y columnista de varias publicaciones de Estados Unidos, con amplias relaciones en el medio cultural, educativo y científico, su colaboración en Optogenetic

hizo

posible la difusión en varias compañías y universidades norteamericanas la tecnología del nuevo método de análisis del DNA. Para Arthur Lipper, una de las principales dificultades para aceptar y aplicar la tecnología de Optogenetic en Estados Unidos, aparte de ser un descubrimiento muy polémico por retomar el campo de la visión en el estudio del ADN, campo abandonado

por

los

genetistas

moleculares,

es

que

el

descubrimiento procede de un país del tercer mundo (México), fue hecho en una provincia de ese país (Sonora) y la investigadora es una mujer mexicana y agrega, “Si ella fuera Noruega, inglesa o alemana hace mucho tiempo la atención del mundo científico estaría puesta en su descubrimiento, pero no es así, por lo que tenemos que ser doblemente eficaces en la argumentación y comprobación de la ciencia, que sustenta este descubrimiento“. El Dr. V. Virpullat, presidente de la compañía Optogenetic opinó: “Hace aproximadamente medio siglo, las ciencias importancia. Los estudios del material genético fueron más intensos y aceleraron descubrimientos genéticos nuevos. Los

V22

química y bioquímica modernas empezaron desarrollos de

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

88

investigadores se dieron cuenta que los genes se formaban de macromoléculas extremadamente largas y delgadas, llamadas ahora ADN. Sin embargo, la visualización de los genes con el microscopio óptico es virtualmente imposible. La investigación moderna abandonó la idea de estudiar el ADN con microscopios ópticos, hasta el descubrimiento de la Doctora Gloria Elena León Paz, las investigaciones actuales enfocan la estructura lineal del ADN por medio de métodos bioquímicos. Al inicio de la biología

molecular

moderna

se

empleó

el

microscopio

electrónico, para estudiar la estructura microscópica del ADN. Hace varios años habían fallado los intentos por ver los genes individuales en las moléculas del ADN. Hay muy pocos investigadores que estudian la estructura topológica del ADN y estos son una minoría, entre los investigadores genéticos. Sin embargo, en la actualidad sabemos que el ADN funciona no solo mediante la estructura lineal de sus genes, sino que se ve afectado por su estructura tridimensional. Debido a la complejidad extrema de su estructura tridimensional y la limitación de la tecnología actual y además, debido a la técnica obsoleta del microscopio óptico utilizando conceptos modernos, a excepción de la Doctora Gloria Elena León Paz. El concepto muy importante de Optogenetic desarrollado por la Doctora, en relación a la observación del ADN mediante el microscopio óptico, fue para establecer una comparación entre los agregados del ADN de pacientes. Esta tecnología no es con el propósito de estudiar el ADN normal. En otras palabras la

V22

los cambios morfológicos de los agregados del ADN normal y

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

89

tecnología de Optogenetic, es una tecnología que enfoca las aplicaciones médicas y no el estudio genético puro, aunque podría ser una herramienta útil para el estudio genético en el futuro. La Doctora León Paz encontró que mediante el procedimiento de extracción especial del ADN (o aislamiento), el ADN agregado

de

los

glóbulos

blancos

mostraba

patrones

diferentes en la sangre normal y anormal (enfermedad, incluso embarazo) de los pacientes. Usando esta tecnología, podía determinarse el sexo de un feto tan solo una semana después de su concepción. La Doctora León,

ha estudiado

unos cuantos cientos de especímenes casi con exactitud completa (debido a que no se tuvo un informe final después del parto, a causa de la reubicación de los pacientes fuera del área). Así mismo se observaron patrones entre las personas normales y los pacientes con cáncer. Pero debe tenerse en mente que los cambios en el patrón de ADN en esta aplicación se basan en los cambios del sistema inmune. No se trata de cambios en el feto o en las células cancerosas. En nuestra opinión, la idea de la Doctora Gloria Elena León Paz, creará una industria de diagnóstico médico, de gran importancia”.

La investigación del ADN con Optogenetic La relación de trabajo con la compañía Optogenetic tuvo una personas ampliamente relacionadas con el mundo científico,

V22

motivación importante, en cuanto que estaba integrada por

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

90

de Estados Unidos y con promotores financieros de primer nivel de ese país, bastó con la promesa de que asumirían los gastos concernientes de la solicitud y registro de patente en los Estados Unidos del Nuevo Método de Análisis del ADN y la

promoción

a

convencernos

nivel

de

mundial

de

asociarnos

la

con

tecnología, esa

para

compañía

norteamericana. El contrato que nos ofrecieron (Según el agente que nos representaba), era el más ventajoso que haya sido propuesto a cualquier inventor en los Estados Unidos, aunque a cambio pidieron firmar un convenio de transferencia total de la tecnología y de todos los descubrimientos futuros que realizáramos en el campo de la genética. La propuesta económica era deslumbrante y por lo tanto increíble (no creíble), sin embargo aceptamos firmar ese contrato porque lo que en realidad nos interesaba era poder continuar la investigación

y

consolidar

los

resultados,

promocionarla en todos los laboratorios

difundirla

y

y centros de

investigación del mundo, la posibilidad de que cientos o quizá miles

de

investigadores

aplicaran

el

método

en

temas

específicos de la salud y encontraran formas de diagnostico y vacunas

genéticas

para

cada

enfermedad,

desborda

la

imaginación. Todos los que nos dedicamos a la investigación científica sabemos que los procesos de desarrollo de la ciencia rebasan el corto lapso de vida productiva de un investigador y que únicamente cuando el conocimiento es compartido y se aplica el ingenio y la creatividad de muchos investigadores, es cuando una generación puede ver y disfrutar de los resultados campo de la salud, difícilmente puede

ponerse precio a un

valor que pertenece por derecho propio a toda la humanidad.

V22

de los descubrimientos científicos y cuando estos son en el

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

91

Sí bien es cierto que un descubrimiento científico aunque tenga un autor es producto de la inquietud, el esfuerzo y el conocimiento

generado

y

trasmitido

de

generación

en

generación por miles de seres humanos, cuando se produce una “Revolución Científica” como a la que se refiere Thomas Kuhn, se produce también un salto histórico, en el cual un descubrimiento crea un nuevo eslabón en la cadena del desarrollo y transformación de la realidad, al igual de las sociedades humanas, que se transforman y renovan en la clausura de sus viejas instituciones y significaciones, esto es de cierta manera, similar al fenómeno de replicación de una célula, cuando la cadena se abre para encontrar sus nuevos pares y crear una nueva unidad de vida, así es el conocimiento científico y difícilmente puede tener un equivalente en el mundo del dinero. Nuestro trabajo tuvo con Optogenetic, una expectativa nunca imaginada, después de muchos años de investigación solitaria en la que en muchas ocasiones se vio interrumpida por falta de reactivos o laboratorio en el cual realizar nuestro trabajo y de una gran cantidad de cartas, dirigidas a presidentes de la república, diputados y senadores de varios sexenios, rectores de universidades y gobernadores tuvo como respuesta la indiferencia, a excepción de un gobernador (que nos apoyó para realizar el pago de derechos de la patente en México) y de un Rector de la UNAM que amablemente contestó nuestra carta. Siempre deseamos que el derecho de explotación de la pertenecer al Sistema Nacional de Investigadores (SNI) y de no pertenecer a alguna de las instituciones oficiales de

V22

patente perteneciera a nuestro país, pero el hecho de no

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

92

investigación, limitó nuestras posibilidades de publicar y de recibir financiamiento de CONACYT, así que cuando la empresa norteamericana, nos propuso el año 2004, realizar una validación de la metodología, en el estado de Arizona de los Estados Unidos,

consistente en pruebas ciegas de muestras

de ADN, que serian extraídas y congeladas en el Arrowhead Regional

Medical

posteriormente

Center,

empacadas

en y

Colto

enviadas

California

por

avión

y y

vía

terrestre al laboratorio instalado en el Holy Cross Hospital en Nogales Arizona, cambiando por completo el protocolo con el cual habíamos obtenido buenos resultados en México, proceso en el cual aplicando personalmente nuestro método y en un tiempo

preciso

de

realización,

extraíamos

el

ADN,

lo

congelábamos a determinada temperatura y aplicábamos el método que hace posible verlo en el microscopio óptico, sin embargo aceptamos porque no teníamos otra alternativa, ante el argumento esgrimido por el consejo científico de la compañía, de que el ADN no se altera ante variables de temperatura, tiempo de conservación o traslados a grandes distancias. Con todo y nuestras dudas, durante 10 meses realizamos pruebas ciegas de cáncer Cervico-uterino, cáncer de mama y de mujeres embarazadas. Teníamos

que

acertar

y

decir

que

muestras

de

ADN,

pertenecían a mujeres sanas o afectadas por un tipo de cáncer determinado, en el caso de lo embarazos se trataba de predecir con exactitud el sexo del bebé, sin mayor información que el que proporcionara la muestra marcada con una clave.

los resultados alcanzados en aciertos fueron 70 que la hace

V22

A pesar de esas circunstancias (En calificación del 10 al 100 )

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

93

una tecnología viable, pero sin alcanzar el mínimo deseable de 85, que la convierte en comercializable. El Doctor Raymond Cestero, uno de los doctores que participó en la prueba,

marcando las claves de cada muestra y en la

extracción del ADN en California, opinó que en Estados Unidos regularmente

la

validación

de

un

medicamento,

o

descubrimiento generalmente pasa por varios intentos de validación, antes de obtener su aprobación y que en nuestro caso se trataba de volver a la mesa de diseño, revisar los factores que impidieron el total de aciertos, invertir un poco mas

en investigación y volver a intentarlo hasta lograr el

objetivo. Resultó obvio que la forma de extracción, el congelamiento a una temperatura distinta a la empleada en nuestro método y el desplazamiento a grandes distancias, afectó seriamente los resultados, posteriormente nos enteramos que muchas de las muestras estuvieron varios años guardadas en congelación, al contrario de las pruebas realizadas en Hermosillo en las que siempre trabajamos con muestras nuevas y realizando todo el proceso en el mismo lugar de manera continua. Sin embargo el trabajo realizado en Arizona, tuvo una aportación importante en el largo proceso de investigación, logramos elaborar una valiosa tabla de concentraciones de ADN para lograr en menor tiempo, determinados procesos en el análisis del DNA, esta tabla será en el futuro un elemento muy importante para los investigadores que no tendrán que adecuada de ADN, esto les permitirá poder estudiar un mayor número de muestras en una jornada o servirá de base para la

V22

hacer determinados cálculos para obtener la concentración

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

94

automatización del método, que seria uno de los pasos siguientes por hacer.

Desarrollar un nuevo proyecto de investigación en base a la experiencia vivida en Arizona seria el camino a seguir si se quiere aprovechar la información positiva y negativa obtenida, el estudiar las múltiples variables de temperatura a la que puede estar expuesta una muestra de ADN, el tiempo de antigüedad de la extracción del mismo, si fue empacado en forma adecuada y recorrió determinadas distancias por vía aérea o terrestre y poder establecer los ajustes necesarios en el método de análisis para obtener el control sobre los resultados, y responder las preguntas siguientes : ¿Qué tanto cambia el ADN bajo determinadas condiciones como las mencionadas?, ¿Qué tanto varia la imagen de una muestra de ADN en condiciones variables?. Es indudable que así como reacciona de inmediato el ADN ante cualquier agente o factor que perturbe el sistema inmunológico, así mismo es sensible a

V22

cambios a los que es sometido.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

95

La Patente en Estados Unidos Entre el largo período de la búsqueda de comercialización y alianzas estratégicas de Optogenetic con grandes compañías de biotecnología en Estados Unidos, hubo algo afortunado, la solicitud de patente realizada

el 17 de enero del 2001 en

Estados Unidos, fue aprobada y otorgada el 16 de agosto de 2005 con la modalidad de expediente abierto, es decir que de presentarse un nuevo descubrimiento se anexa al ya aprobado sin mayor trámite. El

titulo

de

la

patente

aprobada

es:

“METHOD

FOR

PROCESSING BLOOD SAMPLES IN ORDER TO PRODUCE DNA COMPLEX PATTERNS FOR DIAGNOSTIC APPLICATIONS”. PATENT No. US 6,929,908 B1 INVENTORS: Gloria Elena León Paz de Rodríguez And Gin Wu, San José Ca. (US). Una

importante

compañía

farmacéutica

de

Nueva

York

consultada, calculó un precio de salida de la patente al mercado entre un millón a dos millones de dólares. Después del trabajo realizado en Arizona, la compañía Optogenetic nos comunicó que estaba descapitalizada y que el consejo

de

administración

estaba

estudiando

vender

la

patente para compensar a los inversionistas, ignoramos que decisión tomaron, desde el año 2004 dejaron de pagarnos la mensualidad

de tres mil dólares mensuales que recibíamos,

(tres

menor

transferencia

de

a

lo

convenido

tecnología).

Las

en

el

contrato

anualidades

de

pactadas

V22

veces

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

96

tampoco fueron cubiertas y el único pago realizado fue de $50.000 dólares por la firma del contrato. A fines del año 2007 recibimos comunicación de la compañía Optogenetic de que el Doctor Mark Talamini especialista en cáncer de la Universidad de San Diego California,

estaba

interesado para que en los laboratorios de esa institución se realizara un nuevo protocolo, para un segundo intento de validación de la técnica, con algunos tipos de cáncer que son su especialidad como oncólogo, y que se estaba gestionando con la institución, los aspectos referentes a nuestra estancia en esa Universidad. Pero después se hizo el silencio de nuevo. El equipo de laboratorio con el que realizamos las pruebas ciegas en Arizona, quedó depositado en una bodega de ese estado,

por lo que no hemos podido regresar a trabajar al

laboratorio

y

temporalmente

continuar

con

trabajamos

la

investigación

como

docentes

del

DNA,

en

una

Universidad local, en el lapso que hicimos una solicitud ante la Secretaria

de

Economía

del

Gobierno

Federal

para

la

formación de una empresa de biotecnología y nos remitieron a la incubadora de empresas Tx- Tec en la Universidad de Sonora,

después de una serie de requisitos, consultas y

entrevistas

nuestro

proyecto

fue

considerado

viable

y

recomendable para invertir en él, pero sabemos que hasta el momento en México ninguno de los grandes empresarios mexicanos (exceptuando a Ignacio Romo de Monterrey y Juan Enríquez Cabot, en Boston), se han atrevido a invertir en Maestro Emérito y ex coordinador de investigación en la UNAM, los investigadores mexicanos no reciben de CONACYT

V22

biotecnología . En palabras del Doctor René Druker Colín,

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

97

el apoyo económico adecuado para el desarrollo de grandes proyectos de investigación que contribuyan al desarrollo del país . Lo poco que se invierte esta destinado a salarios y si se apoyan proyectos de investigación están condicionados a resultados rápidos y publicables como artículos científicos, adecuados

para

obtener

estímulos

académicos

en

la

instituciones de Educación Superior. Es de conocimiento público que los países miembros de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico OCDE,

son

dueños

del

97%

de

la

patentes

y

las

corporaciones globales poseen 90% de toda la tecnología y los productos patentados. Nuestro trabajo de investigación del DNA, desarrollado totalmente en México

y patentado en los

Estados Unidos y en el PCT esta dentro de esa categoría, por la indiferencia

y la falta de apoyo al trabajo que podemos

V22

desarrollar los investigadores mexicanos.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

98

AQUELLOS QUE PIENSAN QUE LA TIERRA ES PLANA DEBEN QUEDARSE EN LA ORILLA PERO NO DISUADIR A OTROS DE NAVEGAR. Arthur Lipper III

A lo largo de la historia del conocimiento humano y del desarrollo de la ciencia, todas aquellas personas que han dedicado

sus

esfuerzos

a

buscar

respuestas

sobre

la

naturaleza y el mundo físico y social que percibimos, han sido confrontados y

poco comprendidos por personas que por

temor a lo desconocido prefieren evitar que se produzcan los cambios, sin embargo, la estructura misma de todo el universo conocido y todo lo que este contiene,

esta en un proceso

permanente de transformación y cambio, la misma naturaleza del ser humano a partir del momento en el que se unieron los genes que le dieron vida, esta en un proceso de cambio permanente, y así como un organismo que esta desnutrido se ve afectado en su desarrollo pleno , así , de la misma manera, las sociedades que permanecen al margen del desarrollo científico

y

tecnológico,

son

sociedades

desnutridas

de

conocimientos y de los cambios que estos generan. Un investigador científico, es una persona que ha logrado preservar para sí la curiosidad y el interés primigenio por el mundo que lo rodea y nada puede calmar su inquietud, mas que encontrar las respuestas a los muchos enigmas que aún esta la propia naturaleza y lo que ignoramos de ella.

V22

guarda la naturaleza pues sabe que más allá de la naturaleza

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

99

La decisión de investigar territorios inexplorados llevo a los navegantes

a

descubrir

nuevos

mundos,

los

territorios

estaban allí desde siempre, pero ellos y sus sociedades no los conocían, fue necesario convencer a los escépticos y vencer el temor y las dificultades para llegar a la otra orilla. Las mentes cerradas siempre han existido, en países pobres y en países ricos y son esas mentes las que frenan el desarrollo y obstaculizan la investigación y frustran la curiosidad infantil por el conocimiento con programas educativos que imponen la disciplina y la obediencia como factores para lograr la eficiencia productiva, sin importar el aprender, usar la imaginación y aportar algo nuevo. La investigación científica como profesión y motivo de vida es una experiencia excepcional que nos da acceso de manera privilegiada al conocimiento y

realizar investigación del

DNA es como abrir una puerta al futuro y vislumbrar que todo esfuerzo que realicemos valdrá la pena a pesar de cualquier dificultad que hayamos encontrado en el camino. El trabajo de investigación que hemos realizado a lo largo de varios años y que ahora hemos presentado tiene la intención de que todos los que tengan acceso a él y lo lean compartan la emoción de poder ver por vez primera las imágenes del DNA y valorar y agradecer el

esfuerzo de mucha gente que

generosamente ha colaborado para que esto haya sido posible. Familiares, amigos, enfermeras, químicos biólogos, médicos, señoras embarazadas, enfermos y personas sanas, mexicanos

y

norteamericanos,

periodistas,

maestros y jóvenes estudiantes que nos han comunicado sus

V22

empresarios

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

100

deseos de ser investigadores después de escuchar nuestras pláticas. Del

DNA

hemos

aprendido

que

el

equilibrio

de

sus

componentes, en sus múltiples posibilidades de combinación, es lo que define su perfección, cada DNA de cada ser vivo es igual a otros DNA, pero también es diferente. comparte genes con otros individuos, pero posee otros que le confieren su singularidad.

Es

como

la

historia

de

la

cultura

de

la

humanidad, de la que bien sabemos todos que su riqueza y su universalidad radica en su diversidad. La aportación de cada persona,

de

cada

cultura

para

alcanzar

el

progreso

y

desarrollo, sin desigualdades sociales es lo que puede hacer posible

que

el

conocimiento

científico

pueda

encontrar

condiciones adecuadas, para dar y proporcionar las respuestas y soluciones a las necesidades de todos los seres humanos. Nuestro deseo es continuar investigando, por ahora no tenemos laboratorio, ni patrocinadores, ni sueldo, ni recursos, pero intentaremos seguir investigando, tenemos de capital para empezar de nuevo, la autoría de 4 patentes que nos han aportado la mayor riqueza a la que puede aspirar un ser humano, que es el conocimiento mismo.

V22

FIN

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

101

Posdata Iconográfica Mostraremos a continuación unas fotografías del DNA, de una familia que acudió al Laboratorio por iniciativa de la abuela Ramona, que al enterarse del estudio que estaba realizando, convocó con todo entusiasmo a 3 de sus nietas a sumarse a nuestro esfuerzo y cooperar en el conocimiento del DNA.

Fig.- 56

la señora Ramona de 83 años. Podemos ver un DNA difícil de

V22

En la figura 56 se presenta la fotografía del DNA, de la abuela,

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

102

compactar, aunque ella esta saludable y muy emocionada de poder participar en el estudio. Para nosotros todos estos gestos de solidaridad es uno de los factores más importantes para mantenernos cautivos, dentro de este proyecto. Las figuras 57, 58 y 59, corresponden a 3 nietas de la señora Ramona, ellas son primas entre si.

Fig.- 57

En la fig 57 vemos el DNA de Clara, una estudiante de artes a su abuela Ramona lo que su maestro , mi esposo, les platicó

V22

plásticas en la Universidad de Sonora , ella fue la que le contó

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

103

acerca del proyecto del DNA. Clara tiene 35 años y su DNA se ve normal y bien compactado.

Fig.- 58

En esta fotografía figura-58, vemos el DNA de Bricia, es nieta

de

la

señora

Ramona.

Ella

tiene

lupus

eritematoso y su DNA casi no lo podíamos ver de tan delgado que estaba, por lo que decidimos agregar taninos (polímeros )

V22

también

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

104

al buffer de extracción de DNA y como se observa, el DNA de Bricia se reveló y se puede estudiar la cadena con toda comodidad. Creemos que el uso de taninos, deberá ser esencial en las aplicaciones de esta tecnología V22.

Fig.- 59

La fig.- 59 nos presenta el DNA de Carolina, la otra nieta de la señora Ramona , ella tiene 20 años y esta saludable. De cierta manera los DNA de Carolina y Clara se parecen entre si, probablemente sean del mismo tipo sanguíneo o por ser

V22

primas seguramente tienen genes en común.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

105

Otras fotografías de DNA que se tomaron estudiando la compactación del DNA, se presentan a continuación:

MARTHA C DNA. EXTENDIDO FIG.-60

En la fig 60 vemos el DNA extendido de Martha Cecilia, una joven voluntaria y en la fig.- 61 el mismo DNA, solo que

V22

compactado.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

106

FIG.- 61 DNA COMPACTADO

En la fig.- 62 se nos presenta el ADN extendido de Mirna, una

FIG 62 DNA EXTENDIDO

V22

joven voluntaria

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

107

FIG.- 63 DNA COMPACTADO

El estar estudiando el DNA, nos ha ofrecido sorpresa tras sorpresa, Mirna es gemela monocigoto, su DNA extendido lo vemos muy grande, figura 62, comparado con el de Martha Cecilia, figura 60. Al compactar el DNA de Mirna, se observan 2 “ovillos” figura 63, en lugar de uno solo como el de Martha Cecilia, figura 61. Así que estamos seguros, que cuando aprendamos el idioma de imágenes del DNA, con solo verlo al

microscopio

o

estudiando

su

fotografía,

inmediatamente conoceremos el origen de ese DNA y todas sus características.

V22

directo

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

108

Ya por ultimo les ofrecemos una prueba de compactación de DNA de un señor de 56 años:

V22

Fig.- 64 DNA EXTENDIDO

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

109

FIG.-65 DNA COMPACTADO

En la figura 65, se observa una compactación incompleta, nos aventuramos a decir que el DNA está perdiendo ya su capacidad de compactarse, son deducciones que vienen a nuestra mente, cuando estamos estudiando las imágenes del

V22

DNA.

110

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

111

ANEXO # 2 VISION22

AGRADECIMIENTOS A MI AMADO ESPOSO ENRIQUE, POR DARNOS TANTA FELICIDAD A MI Y A NUESTRAS HIJAS. A MIS ADORADAS HIJAS ERICKA Y SU ESPOSO RAMÓN Y A NUESTROS NIETOS FELIPE, ALEJANDRO Y MARCOS, A MI ADORADA CRISTY Y SU ESPOSO ROBERTO Y A SU DESCENDENCIA POR VENIR. A MIS AMADOS PADRES JUAN Y CLOTILDE, POR LA FELIZ INFANCIA QUE NOS DIERON. A MIS QUERIDOS HERMANOS Y HERMANAS: FAUSTO, YOLANDA, JESÚS, ADELIZA, JUAN, ROSA MARIA, MARTHA, JESÚS MATIAS, SILVIA, RENE, PEPE Y A TODOS MIS QUERIDOS SOBRINOS Y SOBRINAS. A MIS QUERIDOS SUEGROS: IGNACIO Y HERLINDA Y QUERIDAS CUÑADAS Y CUÑADO, MARIA DEL CARMEN, OLIVIA Y OSCAR. A MI ADMIRADO Y QUERIDO SOBRINO JESÚS Y SU ESPOSA LLUVIA Y SU BEBITA. A MIS QUERIDAS TÍAS Y TIOS: LUCILA, GUILLERMO, ROSA, JOSÉ MARIA, ADELA, ARMANDO, QUELITA, RENE Y A TODOS MIS QUERIDOS PRIMOS Y PRIMAS. A MIS INOLVIDABLES MAESTROS: ARMIDA MACALPIN, FERNANDO ARAGÓN, ERNESTO LÒPEZ RIESGO, ALEJANDRO DUEÑAS, LUIS GOMEZ DEL CAMPO, VIRGILIO RÍOS AGUILERA, GILBERTO GUTÍERREZ QUIROZ, CARLOS ENRIQUE PEÑA LIMÓN, RAÚL PETERSON, CARLOS ROMBOLD, MANUEL PUEBLA PERALTA Y EDWARD BERKA, A MIS AMIGAS DE SIEMPRE: MARISSA , MELIDA, MARTHA ELISA, MARIA ANTONIETA, MARIA JESUS, PUPI MARTINEZ, CHEPI OCHOA, CHAYO ORTEGA, CARMEN ALICIA. A LA DRA. LUZ VÁZQUEZ MORENO, POR SU IMPORTANTE Y VALIOSA ASESORÍA EN MI TESIS DE MAESTRÍA.

NUESTRO PROFUNDO AGRADECIMIENTO A NUESTROS AMIGOS ROSA MARÍA Y ALAN SOTELO CRUZ, POR SU SABIDURÍA Y SU VALIOSA ASESORÍA.

V22

A NUESTRO ADMIRADO Y GRAN AMIGO ALBERTO HIJAR SERRANO. A LA DRA. IFIGENIA MARTÌNEZ POR SU APOYO SOLIDARIO. AL LIC. ANDRES MANUEL LOPEZ OBRADOR CON RESPETO Y ADMIRACION.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

112

A NUESTROS BUENOS AMIGOS, MARTÍN CRUZ ALONSO, SOCORRO TRUJILLO MORENO Y GUSTAVO OZUNA GONZÁLEZ , NUESTRO AGRADECIMIENTO POR SU AMISTAD SOLIDARIA. AL LIC. MANLIO FABIO BELTRONES RIVERA, AL ING. VERNON PEREZ RUBIO, AL DR. JOSÉ LUIS NAVARRO HELSEN,AL DR.FILIBERTO PERÉZ DUARTE, AL LIC. MIGUEL QUIROS, AL LIC. ALVARO OBREGÓN Y DORA LUZ OBREGÓN Y A SUS HIJAS CLAUDIA Y DORA LUZ, POR SU IMPORTANTE Y VALIOSO APOYO. ASI MISMO QUEREMOS AGRADECER LAS GENTILEZAS DE LOS DESTACADOS PERIODISTAS Y COMUNICADORES QUE NOS HAN BRINDADO SU VALIOSA ATENCIÓN , EMILSE VALENCIA, ANTONIO DUARTE GARCIA, FAUSTO SOTO SILVA, MARTHA OBESO, MARTIN OLGUIN, CARMEN ALICIA ESPINOZA ORTEGA, GILDA VALENZUELA PICOS, LUPITA PEREZ RIOS, ELSA NUÑEZ ESQUER, SILVIA MANRIQUEZ, NOHEMI GONZÁLEZ, SILVIA DUARTE, RICARDO ACEDO SAMANIEGO, CRISTINA PACHECO, JOSÉ GUTÍERREZ VIVÓ, FORTINO LEÓN ALMADA, AMALIA ESCOBAR, ROGELIO MORENO COTA, EDUARDO GÓMEZ TORRES, RUBÉN PARODI, MANUEL BORBÓN MONTAÑO, SONIA DOMÍNGUEZ J.,RAFAEL RENTERÍA ROSALES, ROCÍO BANDA, MARÍA JESÚS ROMERO, AZUCENA MEZA, PATRICIA ANTILLÓN, GUADALUPE CENTENO, MARIO MUNGUÍA, CARMEN CHÁVEZ MADA, ALMA AYÓN LÓPEZ, LOURDES SARRACINO, CINTHYA DEL VILLAR, NORMA ALICIA PIMIENTA, SOLEDAD DURAZO, ANA LUISA PACHECO, JESUS RUIZ, BETTY ESTRADA Y LOS DISTINGUIDOS MIEMBROS DE “ AMIGOS DE LA RADIO”.

A TODAS LAS EMBARAZADAS QUE FUERON AL LABORATORIO, POR EL PRÓNOSTICO DEL SEXO DE SU BEBÉ. A TODA LAS PERSONAS QUE TUVIERON LA GENTILEZA, DE DARNOS UNA MUESTRA DE SU SANGRE, PARA TENER LA FOTOGRAFÍA DE SU DNA.

V22

A LAS FAMILIAS QUE NOS APOYARON EN EL ESTUDIO PARA ESTABLECER EL MÉTODO DE PATERNIDAD: 1) FAMILIA CÁZAREZ LEÓN, 2) FAMILIA ANDRADE LEÓN, 3) FAMILIA LEÓN CERVANTES, 4) FAMILIA SILVA PALOMARES, 5) FAMILIA BURGOS CALLEJA, 6) FAMILIA MORENO QUINTANA, 7) FAMILIA PARADA LOAIZA, 8) FAMILIA GIL GARZA, 9) FAMILIA AYALA LENDO, 10) FAMILIA GÓMEZ FRANCO, 11) FAMILIA RAMÍREZ VALDEZ, MUCHAS GRACIAS A TODOS.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

113

ANEXO # 3 PERSONAS VOLUNTARIAS QUE HAN PARTICIPADO EN EL DESARROLLO DE ESTA NUEVA TECNOLOGIA V22, NUESTRO PROFUNDO AGRADECIMIENTO A TODAS ELLAS. 1994 1) MARTHA BEATRIZ MATY ORTEGA 2) ALMA ROSA BOJORQUEZ V. 3) COYITO BLANCO 4) GRACIELA LIMÓN O. 5) DRA. SAGUCHI 6) ALBERTO RAMIREZ 7) LUIS F. PLATA 8) MARTIN R. ZAMUDIO 9) MANUEL LOPEZ E. 10) EMA DELIA VEGA 11) LUPITA DEL VALLE 12) DANIEL ARIAS 13) RITA A. YAÑEZ 14) EDUARDO BERNAL 15) DRA. NAVARRO

16) 17) 18)

1997 19) 20) 21) 22) 23) 24) 25) 26) 27) 28)

RUTH CHAPARRO PEÑA AIDA CHAPARRO PEÑA JOSEFINA MARQUEZ

ANGELITA GARCIA BALDENEGRO YOLANDA DE CARLON MARIA ISABEL CAZARES DE ACOSTA IRENE DE LEON FAUSTO RICARDO LEON C. CLARA ZAMBRANO GIL ERICKA RODRIGUEZ LEON RAMON IÑIGUEZ P. ROSALINDA GIL TORRES MIRNA GIL TORRES

V22

1995

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

1998 72) 73)

ELISA GIL TORRES RAMONA TORRES D. BRICIA OSUNA LUIS FRANCISCO ROMERO URBALEJO LUIS FRANCISCO ROMERO MUNGUIA ALINE MIRAZO MONICA MIRAZO MOISES MIRAZO MAVY ETHEL SANCHEZ CAROLINA BURGOS CALLEJA PANCHITA CALLEJA DE BURGOS CLAUDIA IÑIGUEZ P. JEAN MCLAURIN YOLANDA GARCIA PINA CAMPA ANA GLORIA CAZARES LEON MATIAS LIMON CAZARES MAGDA IÑIGUEZ P. AGUSTIN MANING JUAN ALVARADO PAULINA MIRANDA CAZARES CELIA MORENO D. SORAYA PLATT LLITERAS GUILLERMO DIAZ BORCHARDT DALILA GARCIA V. GUILLERMO DIAZ MELO ANGELINA BORCHARDT DE DIAZ EVA ALICIA ACOSTA R. MA. MERCEDES ESCARCEGA VILLEGAS BRICIA OSUNA GIL MARIO SANTANA ANA CRISTINA RODRIGUEZ LEON LINELBA GIL TORRES MA. SOLEDAD MARTINEZ BERTHA ALICIA STEMPLESCA V. SANDRA MARTINEZ MARTHA CECILIA SIQUEIROS T. MIRNA ANABEL MORENO G. JUAN MORENTES MA. EMA SANTILLANEZ ADOLFO ENRIQUE LANDAVAZO CARMEN GUADALUPE GODINEZ V. ADOLFO RIVERA

GEMA VERONICA PARADA L. EDUARDO FLORES

V22

29) 30) 31) 32) 33) 34) 35) 36) 37) 38) 39) 40) 41) 42) 43) 44) 45) 46) 47) 48) 49) 50) 51) 52) 53) 54) 55) 56) 57) 58) 59) 60) 61) 62) 63) 64) 65) 66) 67) 68) 69) 70) 71)

114

74) DOLORES VELAZCO 75) TANIA GIL GARZA 76) CARMEN LETICIA SORIA 77) MA. ELENA GIL ALCANTAR 78) VELIA VEGA GIL 79) LARISSA VEGA GIL 80) FERNANDA GARZA ORTEGA 81) MA. HORTENCIA GARZA ORTEGA 82) ALBERTO OROZCO GARZA 83) LUZ OTILIA GRIJALVA T. 84) MAGDA BALLESTROS RAMIREZ 85) MELISSA JASSO ESPINOZA 86) CARMEN ALICIA ESPINOZA ORTEGA 87) MARINA ZAZUETA NORIEGA 88) CONSUELO ROSAS ELIZALDE 89) ARNULFO OCHOA 90) LETICIA INDART 91) LUIS TERAN 92) RAQUEL TIRADO ALVAREZ 93) MARINA NORIEGA DE ZAZUETA 94) EDUARDO SILVA PEÑUÑURI 95) ELDA CAZARES SALCIDO 96) ELDITA MURRAY CAZARES 97) JUAN PABLO MURRAY CAZARES 98) ROMAN FELIX NAVARRO 99) EDITH RUBIO 100) MARIA CORDOVA QUIROZ 101) ZOILA BERNAL 102) MARTHA PIÑA ANDRADE 103) ELVIA MARINA MUNGUIA 104) CAROLA ALCARAZ 105) RICARDO RODRIGUEZ 106) IVONNE CANDIANI 107) JOEL GOMEZ 108) ANA CATALINA 109) JULIO DIEGO DAVILA 110) ROCIO GUADALUPE MARTINEZ PALOMARES 111) GIBRAN JALL VALENZUELA 112) MIRIAM GUADALUPE BARNETT MEZA 113) FERNANDA FRAIJO 114) OLGA LILIA FELIX SOTO 115) ANGELICA LOPEZ DE CARRANZA 116) ANA IRMA RASCON 117) ALMA BELIA RASCON DURAN 118) ROSA ELENA DURAN ENCINAS 119) ALMA DELIA DURAN DE RASCON 120) MARGARITA LOPEZ CRUZ

115

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

121) MONICA MARTINEZ 122) TERE DURAN TELLEZ 123) ADRIANA CASTELO DE PARADA 124) CAROLINA MORALES DE GARCIA 125) JESSICA CRUZ QUINTERO 126) MARIA JESUS ROMERO 127) LAURA ELENA DURAZO DE LEON 128) MARIA EVA DURAZO ARMENTA 129) LORENIA RIOS GONZALEZ 130) DORA GUADALUPE RIOS 131) IMELDA VAZQUEZ MEZA 132) CARMEN MEZA HERRERA 133) OTILIA ALMAZAN 134) JESUS ARMANDO CONTRERAS 135) JESUS RUIZ ROMERO 136) SOLEDAD R. DE CARRANZA 137) ANGELICA LOPEZ DE CARRANZA 138) JAVIER R. IRACHETA 139) ANA MARIA VAZQUEZ MEZA 140) EDGARDO LOPEZ VAZQUEZ 141) ANGELICA MOLINA DE AYALA 142) RAFAEL BURRUEL MONTIJO 143) RUTH BURRUEL 144) MARIBEL ROMERO PABLOS 145) JESUS ANTONIO RAMIREZ VALDEZ 146) JESUS RAMIREZ OZUNA 147) ROSA ARMIDA RAMIREZ VALDEZ 148) CLARA RAMIREZ VALDEZ 149) BRENDA PATRICIA VAZQUEZ 150) MARTIN VAZQUEZ RAMIREZ 151) MA. ERNESTINA RAMIREZ VALDEZ 152) JOSE ANTONIO GARCIA GUERRERO 153) MARIA DORA FIGUEROA 154) DORA MARIA BURRUEL FIGUEROA 155) ANA CAROLINA BURRUEL FIGUEROA 156) PEDRO RAMIREZ VALDEZ 157) DULCE MARIA RAMIREZ LORETO 158) LILIAN OFELIA RAMIREZ LORETO 159) FERNANDO RAMIREZ LORETO 160) ABELINO HERNANDEZ 161) KARLA LOZANO 162) CECILIA NENINGER 163) MARTHA NAVARRO 164) LOURDES CAMPILLO 165) MARIA ESTER MORENO SARABIA 166) LUZ ARACELI MOLINA GALINDO 167) BEATRIZ GOMEZ FRANCO

116

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

168) ALFONSO TIRADO OCHOA 169) FRANCISCO RAMIREZ VALDEZ 170) JOSE LAURO RAMIREZ VALDEZ 171) JUAN BOSCO RAMIREZ 172) MARTHA CRISTINA RAMIREZ VALDEZ 173) IVAN RAMIREZ VILLA 174) SERGIO RAMIREZ VILLA 175) MARICELA VAZQUEZ RAMIREZ 176) ISRAEL RAMIREZ DUARTE 177) ABRAHAM RAMIREZ DUARTE 178) SARAHI RAMIREZ DUARTE 179) LUZ IMELDA RAMIREZ DUARTE 180) ERICKA ALEJANDRA RAMIREZ ALATORRE 181) KAREN GUADALUPE RAMIREZ ALATORRE 182) EDNA ROSARIO RAMIREZ ALATORRE 183) TANIA BERENICE RAMIREZ ALATORRE 184) THELMA EUNICE RAMIREZ ALATORRE 185) MARTIN R. RIVERA MARTINEZ 186) JUAN BOSCO RAMIREZ LOPEZ 187) GERALDINE RIVERA RAMIREZ 188) MARIA DE LOS ANGELES RAMIREZ LOPEZ 189) VERONICA ARNOLD 190) KENA RAMIREZ DE MARTINEZ 191) MOISES MIRAZO GARCIA 192) DIANA BUSTAMANTE 193) GLORIA MOSQUEIRA 194) CLAUDIA ZEPEDA 195) LUZ MERCEDES DUARTE DE RAMIREZ 196) OFELIA LORETO DE RAMIREZ 197) MARIA DE LOS ANGELES LOPEZ DE RAMIREZ 198) JULIO CESAR RAMIREZ LORETO 199) CINTHYA DEL VILLAR 200) GREGORIO RAMIREZ 201) LUCIA GUADALUPE ARTEAGA 202) J. GREGORIO RAMIREZ 203) JONATHAN RAMIREZ A. 204) JONATHAN MARIO RAMIREZ 205) ADAN GUTIERREZ 206) GUADALUPE CORDOVA MORALES 207) REBECA LEYVA GARCIA 208) FLORENTINO SERRANO 209) JUAN ALDECOA ACOSTA 210) JOAQUIN LOZANO CORONA 211) MARISSA SOTO ZAVALA 212) NOHEMI AGUIRRE 213) SONIA CORDOVA CORRAL 214) LUZ ELBA PEREZ

117

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

118

215) AMELIA ARAQUE 216) FRANCIS RODRIGUEZ ENRIQUEZ 217) OCTAVIANO ROJAS GUTIERREZ 218) DORA CELIA MORENO 219) LUZ ELENA RAMIREZ CORDOVA 220) RAMON OZUNA

221) SILVIA AGUILAR 222) JUAN CASANOVA 223) SANDRA URBALEJO 224) ROSARIO VALDEZ ORTEGA 225) ANA CECILIA BUJANDA 226) ANA CECILIA DE BUSTILLO 227) DOLORES VELAZCO OLMOS 228) LUZ DEL CARMEN RODRIGUEZ 229) IRENE HERNANDEZ 230) LIDIA DE MANCILLAS 231) MARIA DE LOS ANGELES CAMPOY 232) ALMA GUTIERREZ DE DURAZO 233) FRANCISCO SILVA 234) ADRIANA VALDEZ 235) EDITH MORALES 236) CLAUDIA MIRANDA 237) ELSA RINCON DE ZEPEDA 238) LILIAN BUJANDA 239) HUGO FIMBRES G. 240) MARIA TERESA VAZQUEZ DE OCHOA 241) PATRICIA ARAIZA 242) ELSA SANCHEZ 243) CARLA NAVARRO 244) XOCHITL RODRIGUEZ 245) KITTY GUTIERREZ 246) GILBERTO CAÑEZ 247) MARIA REFUGIO GRACIA DE CAÑEZ 248) MARCOS ALAN MIRANDA CAZAREZ 249) MARTHA CECILIA CAZARES 250) ANA ELSA ALVIDREZ 251) MARIA DOLORES MARTINEZ DE TAPIA 252) ROSA ELENA FIEL PRADO 253) MARIA ELSA GUTIERREZ FONTES 254) BRENDA FRAGOSO 255) ISABEL CHAVEZ 256) KAREN DENISSE SIQUEIROS AVILA 257) MARIA ANTONIETA MATUS 258) EMA DELIA VEGA 259) CAROLINA ANDRADE LEON

V22

1999

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

119

260) RAFAEL C. 261) PERLA RODRIGUEZ QUIÑONEZ 262) ROSA MARIA GARCIA 263) DIANA PLATT 264) MONICA MORALES PARADA 265) SOFIA CARRANZA DE LLAMAS 266) VLADIMIR LEON DURAZO 267) MARIA DEL CARMEN RODRIGUEZ ZAZUETA 268) EDGAR ARAIZA CASTRO 269) SOFIA VAZQUEZ 270) ROSALIA PLATT ORTEGA 271) LISSETTE DE GUTIERREZ 272) MA TERESA VAZQUEZ 273) SANDRA SALAZAR 274) JANETTE PUJOL 275) GUILLERMINA DE ALLEGRE 276) FRANCISCA MONGE 277) FEDERICO AGUSTIN VARELA M. 278) ANA CRISTINA RODRIGUEZ LEON 279) RAQUEL TORRES PERALTA 280) RITA ELIA CORONADO 281) ANITZA PERALTA DE ARAIZA 282) SANDRA MARTINEZ MOLINA 283) ALMA DE CRUZ 284) EVANGELINA CUEVAS 285) IRMA LAURA M. DE CARDENAS 286) ABEL CARDENAS 287) GRACIELA PEREZ RAMIREZ 288) PATRICIA ROMERO ORTIZ 289) ADRIANA SANTELIZ 290) VERONICA NORIEGA DE HERNANDEZ 291) ROSY BERNAL 292) BEATRIZ FRAGOSO 293) PATRICIA RUBIO DE QUIHUI 294) SANDRA GOEHRINGEK DE AYALA

295) ALMA IRENE SALAZAR 296) ELIA VERONICA SILVA 297) LORD EMI CAMACHO MURILLO 298) MARTIN FRANCISCO CORDOVA MENDOZA 299) ANA VENCY AVENA SOTO 300) ERICKA JIMENEZ CRUZ 301) ANITA AHUMADA TANORI 302) JORGE CORDON 303) EFRAIN VEGA 304) ANTONIO TEON GUTIERREZ

V22

2000

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

120

339) 340) 341) 342) 343) 344) 345) 346) 347) 348) 349) 350) 351) 352) 353)

MARIO YADIR RENDON SALLARD TANIA RENDON SALLARD MANUELITA GOMEZ CAMOU AURORA HERRERA LUJAN FRANCISCO JAVIER RUIZ OCHOA GUADALUPE HERNANDEZ GONZALEZ ROSARIO GARCIA AGUILAR JORGE GALINDO PLACENCIA MARIA DE LA LUZ LOPEZ C. GLORIA OCHOA SANCHEZ MARIA DOLORES ESCOBEDO O. MANUELA GUADALUPE FLORES D. SILVIA DUARTE DE SODI CARMEN GLORIA DUARTE GAMBOA IRENE DE LEON

V22

305) MARIA DEL CARMEN GOMEZ C. 306) JULIETA GALVEZ LOPEZ 307) RAMON ANTONIO PARRA ALVAREZ 308) KARLA JULIETA MUÑOZ MADRID 309) YOLANDA GARCIA MORALES 310) SONIA PATRICIA MENDOZA R. 311) PATRICIA PEÑA ALARCON 312) PAOLA OTHON ONTIVEROS 313) RAMONA PEREZ ALVAREZ 314) FRANCIS MARQUEZ 315) RUTH ELIZABETH FAVELA 316) JUAN ANTONIO MALDONADO 317) MARTHA BEATRIZ ANTUNEZ DOMINGUEZ 318) INEZ CORTEZ LARA 319) LAURA MIRANDA LEYVA 320) ERITZEL LEON NUÑEZ 321) ATZIN LEON NUÑEZ 322) ANA ELSA NUÑEZ DE LEON 323) ALMA CANDELARIA HERNANDEZ 324) ANA MELISSA VALENZUELA FLORES 325) MARIA DE LOURDES FEDERICO 326) MARTHA TELLEZ MONTAÑO 327) ALTAGRACIA BURGOIN 328) ADRIANA ORTIZ GONZALEZ 329) SINDY VILLAREAL GARCIA 330) MARIA DOLORES MORENO VAZQUEZ 331) MARIO CARVAJAL VILLA 332) ROSA GUADALUPE QUINTANA DE MORALES 333) MARIA DE LOS ANGELES SALLARD SOLIS 334) YOLANDA SALLARD SOLIS 335) JOSE FELIX DIAZ DE LEON 336) AMADA DEL CARMEN GUTIERREZ CASTRO 337) KARLA ANTUNEZ DOMINGUEZ 338) FRANCISCO JAVIER ANTUNEZ DOMINGUEZ

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

354) 355) 356) 357) 358) 359) 360) 361) 362) 363) 364) 365) 366) 367) 368) 369) 370) 371) 372) 373) 374) 375) 376) 377) 378) 379) 380) 381) 382) 383) 384) 385) 386) 387) 388) 389) 390) 391) 392) 393) 394) 395)

121

BERTHA ELVIA LOPEZ GABRIELA SALLARD SOLIS BLANCA LIDIA SALLARD SOLIS MERCEDES DE PANTOJA MARIA DEL CARMEN MELLADO DE NUÑEZ MARIA TRINIDAD PICOS BELTRAN ARACELI LOPEZ DIAZ MARIA LUISA NAVARRO FILIBERTO VERDUGO LUCERO RAMONA ALCANTAR MEDINA ESTER LUCINA PACHECO RODRIGUEZ ALMA ESTELA RAMIREZ ARMENDARIZ JESUS `PLACENCIA ANA KARINA FELIX PICOS LAURA ELNA ZUBIA M. CLARISA VALENZUELA DE VAZQUEZ EDUVIGES LUZANIA LOPEZ MARGARITA QUIHUIS LOPEZ ALEJANDRO HERRERA MONGE BEATRIZ PONCE DE LEON DE GOMEZ YOLANDA SARABIA DE ZUBIA ALMA ROSA SOSA LOPEZ MANUELITA SOSA LOPEZ PATRICIA DURAZO MOSQUEDA MARCO ANTONIO MENDIVIL VEGA MARGARITA ANDRADE LEON KARINA JACOBO PALOMA ACOSTA DE SUAREZ HECTOR FIGUEROA CONSUELO GARCIA YAÑEZ PENINA JIMENEZ GARCIA JESUS FEDERICO MARTINEZ GUADALUPE MIRANDA VALENZUELA MARIA LOURDES GOMEZ TERAN FRANCISCO BENITO RUIZ MARQUEZ MARIA ELENA JAIME VALENZUELA GUADALUPE JAIME VALENZUELA NORMA GLORIA CABALLERO DE OCEGUERA MARCELA OCEGUERA CABALLERO ZARINA MORENO VALENZUELA MARIA TERESA POMPOSO BANDA MARIA CANDELARIA LOPEZ DE MORENO

2001

397) ALMA DELIA LOPEZ NAVARRO 398) JANETTE ZUBIA DE ANAYA 399) GUADALUPE ALCARAZ FELIX 400) YESENIA GALAZ 401) NADIA ARREDONDO

V22

396) RAMIRO CRUZ VERGARA

402) GRACIELA MIRANDA DE MARTINEZ 403) HECTOR E. LOZANO CARVAJAL 404) MARIA JESUS CARVAJAL DE LOZANO 405) MARCELA GARCIA 406) ABAD NAVARRO 407) MIRIAM RAMONET BUSTILLO 408) ANGEL BUSTAMANTE 409) IGNACIO MALDONADO 410) KARLA MARGARITA SORIA URQUIDEZ 411) RAFAEL LEON MONGE 412) CLAUDINA GONZALEZ 413) ELIA SILVA 414) ANA MARIA BERNAL CAÑEZ 415) MARIA TERESA CHON GOMEZ 416) MARINA DE LEON 417) ANA ALICIA DE BERNAL 418) ANA MARIA GARCIA BUSTILLOS 419) LUIS MIGUEL DUARTE BUSTILLOS 420) MARIA ESTELA BUSTILLOS DE DUARTE 421) RAUL PLASENCIA CAMACHO 422) SANTOS ALCARAZ NOGALES 423) MARIA FLORES DUARTE 424) BENIGNO ALCARAZ FLORES 425) MARIA AMPARO ALCARAZ FLORES 426) AMANDA ALCARAZ FLORES 427) FACUNDO ALCARAZ FLORES 428) CALITA ALCARAZ FLORES 429) CLAUDIA GONZALEZ 430) MARIA ESTELA SALLARD LOPEZ 431) BERTHA SALLARD LOPEZ 432) BERTHA P. ALDANA BARRON 433) EMA LOURDES CAMPILLO ROMO 434) ANA LILIA VARELA 435) EVANGELINA SALLARD LOPEZ 436) ABIGAIL SALLARD 437) IMELDA GONZALEZ DE CORONA 438) OMAR CORONA 439) EDGAR GIL GARZA 440) SANDRO DE LA FUENTE 441) YADIRA FELIX 442) VICTOR FELIX LEYVA 443) MARIA DOLORES CABALLERO 444) ALMA LORENA ECHAVE 445) TADEO RAMIREZ LANDAVAZO 446) JOSE GERARDO RAMIREZ LANDAVAZO 447) JORGE MORENO SCOTT 448) JOSE MARTIN SERRANO SANTIAGO

122

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

123

474) LORENA GUADALUPE NORIEGA 475) LIRIO ELIZABETH NAVARRETE 476) ALAN MONTOYA 477) BERTA ELVIA LOPEZ MORENO 478) LAURA LOPEZ 479) JAVIER ANDRADE 480) MARIA DEL CARMEN ROMERO LLAMAS 481) SANDRA DE LA FUENTE BECERRIL 482) EDGAR GIL GARZA 483) CLUDIA CERVANTES DE PEINADO 484) BERENICE JOHNSTON DEL TORO 485) CRISTINA MARTINEZ MARTINEZ 486) JOSEFINA GONZALEZ 487) LUPITA MARIN RODRIGUEZ 488) MARIBEL ESQUER QUIÑONEZ 489) SELENE ESTRADA DE CORONA 490) CLAUDIA VALDEZ CONTRERAS 491) GUADALUPE ALVAREZ VAZQUEZ 492) JUANA MARIA RODRIGUEZ ARMENDARIZ 493) MAGDALENA PEREZ MORENO 494) ROSALVA SUAREZ M.

V22

449) ILDEBRANDO BARRIOS GARCIA 450) BLANCA ESTELA LEYVA VELAZQUEZ 451) SERGIO ALBERTO PAZ SMITH 452) LUPITA BURGOIN HERNANDEZ 453) ALICIA ORTIZ SEGUNDO 454) CECILIA CASTELO DE CARDENAS 455) FERNANDA OSIO DE ESCALANTE 456) RAUL PLASCENCIA CAMACHO 457) VENUS RICO DE CASTELLANOS 458) MIGUEL ANGEL CASTELLANOS 459) RUTH GUERRERO VALENZUELA 460) OMAR ROBERTO MARTINEZ VALENZUELA 461) FABIOLA GODOY RIOS 462) ISABEL CRISTINA SALAZAR LOPEZ 463) MARIA ELENA RODRIGUEZ MIRANDA 464) SILVIA SOTO MARIN 465) MARIA MAGDALENA SALAZAR 466) ALMA LIDIA HUGUEZ CANIZALES 467) LISETTE SALCIDO DE GUTIERREZ 468) JOSEFINA GONZALEZ GALLEGO 469) IRMA EMILIA ARAMBULA CHON 470) JUAN FRANCISCO ESPINOZA GRACIA 471) SANDRA LUCIA VELASCO JIMENEZ 472) RUTH GUERRERO 473) KARLA FERNANDA VILLAESCUSA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

124

495) JORGE FRANCISCO RUIBAL COCKER 496) MILDRED GUADALUPE NUBES ROMO 497) DHARMA RUIBAL NUBES 498) LUAN LUIS VARGAS MAGOS 499) CESAR JAVIER PRECIADO 500) RAMIRO CAMPA CAMPA 501) OMAR DAVID SOTO MARIN 502) ROBERTO ESTRELLA GIL

503) MAGALY DELGADO DE GUILLOTH 504) MAYRA SALAZAR 505) ANA ESQUER 506) MARIA TERESA RAMIREZ 507) OSCAR GUSTAVO VALDEZ 508) MARIA EULALIA CORRAL LEON 509) RAFAELA CORRAL LEON 510) VICTOR VIRPULLAT 511) ARTHUR LIPER III 512) GIN WU 513) MARIA DE LOURDES GARCIA DE MARTINEZ 544) JOSE FERNANDO TAPIA C. 545) ARMANDO RODRIGUEZ MOLINA 546) KARLA SOFIA HERAS 547) ANA LUGO RIVERA 548) SOCORRO FRIAS 549) TANIA FRAGOSO 550) LOREMI CAMACHO MURILLO 551) DIANA SOSA 552) FERNANDO RIOS 553) SANDRA VILLALOBOS DE HERRERA 554) SILVIA VILLALOBOS PEÑA 555) MARTHA ALMADA DE ASTIAZARAN 556) PAOLA VALENCIA 557) LUPITA SUASTEGUI 558) FATIMA FLORES 559) LUISA LOURDES RODELO GOMEZ 560) ELVIA SALAZAR 561) DORA LUZ OBREGON PINTO 562) YOLANDA GARCIA BALDENEGRO 563) GABRIELA MIRAZO GARCIA 564) CASANDRA AELLO GARCIA 565) MONICA ALEJANDRA MIRAZO GARCIA 566) AMANDA VALENZUELA DE SALAZAR 567) CARMEN ROMO CONTRERAS

V22

2002

568) CLAUDIA CORDOVA VALDEZ 569) MARTHA LOPEZ MILLAN 570) PATRICIA POSADA CASTILLO 571) MIRIAM FELIX DE SOTELO 572) ANDRES SOTELO 573) MARTHA LILIA MUNGUIA 574) MARTHA RIVAS SALAZAR 575) MARIA DOLORES TAPIA MARTINEZ 576) ROSINA MORENO 577) KARLA PAZ Y PUENTE 578) MARIA JESUS ESPINOZA 579) CLAUDIA MARIA MENDOZA MONTAÑO 580) ADRIANA SANCHEZ SOTO 581) JOSEFINA DEWAR VALENZUELA 582) SANDRA CONSILION VILLA 583) ADRIANA CARREÑO QUIJADA 584) MARTHA VERONICA MARTINEZ 585) MONICA ISABEL GAMEZ LEON 586) NORMA CAMPOY ROSS 587) MAYRA LETICIA ARELLANO FELIX 588) DORA CELIA ROSS ARGUELLES 589) MARTHA ELENA CONSILION 590) KARINA LEDGAR 591) PATRICIA FELIX 592) ANA LOURDES MOLINA 593) ELIA SILVA B. 594) KARLA LIDIA PRECIADO 595) AURORA HERRERA 596) RODRIGO MEXIA LEAL 597) OMAR SILVA CARLON 598) EDGAR IVAN ENCINAS VELARDE 599) MANUELITA GAMEZ 600) MARIA LUISA DELGADO MORENO 601) SILVIA CAROLINA MOLINA DELGADO 602) GABRIELA PERALTA MORALES 603) JOSE ALFREDO MURILLO 604) DANIEL LOPEZ PERALTA 605) LUPITA NUÑEZ NAVARRO 606) MIGUEL SALAZAR 607) ADELA BALLESTEROS 608) ANNI LIPPER 609) BRADLEY MONK 610) RAY CESTERO 611) LIDIA RODRIGUEZ GONZALEZ 612) GUADALUPE GOMEZ RODRIGUEZ 613) MARIA GUADALUPE GARCIA TANORI 614) LUZ DEL CARMEN JUAREZ RAZO

125

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

615) FRANCISCO ALBERTO OTHON CONTRERAS 616) RAQUEL ROBLES PACHECO 617) JESUS MANUEL COSIO RIVAS 618) MARINA BERENICE OCHOA CASTRO 619) CONSUELO GALLARDO 620) ROSA MARIA VALENZUELA 621) LORENA VALENZUELA 622) ROCIO ACEVEDO 623) ARLENE HIGUERA 624) GUADALUPE ARACELI NAVARRO 625) ARMANDO RODRIGUEZ MOLINA 626) MARCO ANTONIO RODRIGUEZ MOLINA 627) ANA CRISTINA MOLINA 628) DINORA MALDONADO RICARDEZ 629) VERONICA HERNANDEZ 630) VICTOR HUGO MARTINEZ 631) GABRIELA GARCIA 632) BERTHA ALCARAZ 633) ELIZABETH LEAL OJEDA 634) PATRICIA FRANCO AZUNA 635) MARIA JESUS VAZQUEZ 636) SOCORRO DE RIOS 637) ANA ALICIA GARCIA CAMPA 638) MIGUEL PESQUEIRA LOPEZ 639) DALIA ACOSTA 640) SOCORRO VAZQUEZ 641) NORMA ALICIA CONTRERAS 642) BELEM CAÑIZALEZ 643) EVA AMAYA GARCIA 644) DIANA CONTRERAS AMAYA 645) AIDA GIL CORDOVA 646) AIDA VAZQUEZ GIL 647) FLORA DE DIAZ 648) MIGDALIA MATUS 649) CINTHYA MARIA FELIX GARCIA 650) PABLO JOSE NAVARRO ARAGON 651) CLAUDIA GARCIA 652) SIMONA GARCIA 653) ROMAN GASCA 654) BERNARDETTE BONNASOUX ALCARAZ 655) MARCO ANTONIO TRUJILLO SILVA 656) GLORIA MARIA QUIROZ QUIJADA 657) RAQUEL DEWAR 658) MARCO ANTONIO CASTILLO 659) DAVID RODRIGUEZ 660) ESPERANZA BENITEZ 661) HECTOR VILLASEÑOR

126

V22

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

127

662) MONICA RAMIREZ 663) MARCO ANTONIO RIVERA 664) SOLEDAD DURAZO 665) ANGELICA NAVA ANDRADE 666) JOSE ALBERTO GONZALEZ 667) ALIDA MARIANA BECERRA 668) EDNA MARIA JIMENEZ DE DIAZ 669) CONCEPCION VALDENEGRO LOPEZ 670) NORMA NEGRETE MUÑOZ

671) CARLOS GUTIERREZ FELIX 672) LUIS MENDOZA ARREOLA 673) MARICELA MUNGUIA FLORES 674) MARIA DE LOURDES HERRERA SANCHEZ 675) NANCY LEON BLANCO 676) LAURA ANGELICA GONZALEZ 677) ANY TORRES 678) LUZ DEL CARMEN PACHECO GALINDO 679) IRMA MOLINA MUNGUIA 680) CLAUDIA RAMOS 681) MARIANA MENDOZA LUNA 682) WENDY ELLIS MENDOZA 683) LETICIA SABIÑON 684) AIDA QUIROZ CHAPARRO 685) EMILIANO MARTINEZ VILLALOBOS 686) MARIAN ELLIS MENDOZA 687) PATRICIA RAMOS C. 688) BRIGIDA ANTUNEZ ORTEGA 689) MARIANA MEDINA ANTUNEZ 690) MARIA DE LOS ANGELES CANEVETT 691) ALEJANDRA RAMOS 692) MARIA ROSARIO CUEVAS 693) MARIA MEDRANO GUTIERREZ 694) MARIA DEL ROSARIO TRUJILLO GARCIA 695) ANA MARIA CRUZ DE ESTRELLA 696) LAURA PATRICIA SANCHEZ NAVARRO 697) PAULA GONZALEZ PALACIOS 698) FERNANDO LEAL 699) BLANCA SUSANA ROBLES DE GARCIA 700) MARTHA ALICIA GASTELUM VALENCIA 701) VICTORIANO SALCIDO VALENZUELA 702) MARIA DEL CARMEN MARTINEZ PAZ 703) MARICELA SANCHEZ VALENCIA 704) ROBERTO TORRES

V22

2003

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

128

705) ROBERTO ELLIS MUÑOZ 706) LISETTE RODRIGUEZ 707) LIDIA CAMOU 708) GABRIELA PAULA DUARTE GONZALEZ 709) IRIS PAULINA DUARTE GONZALEZ 710) ANABELLA AVILA QUIROZ 711) ARCELIA QUIROZ 712) LETICIA MARTINEZ P. 713) MELISA RUIZ DE PADILLA 714) MARIA ZEPEDA ROMO 715) PATRICIA SANCHEZ 716) ALMA ALICIA CORONADO E. 717) PATRICIA SORTILLON 718) ALEJANDRO MORALES VILLALOBOS 719) CARMEN JULIA DE HERRERA 720) ENEDINA BAUTISTA GONZALEZ 721) ALMA ROSA CAZARES 722) ELSA VALENCIA 723) MARGARITA ANDRADE CAÑEZ 724) JUAN CORRALES 725) DIANA MIRANDA 726) ENRIQUE RODRIGUEZ 727) CAROLINA QUIROZ 728) MIGUEL RODRIGUEZ 729) BETTINA PESQUEIRA DE ESCALANTE 730) GLORIA MAGDALENA MENDOZA RUIZ 731) ROBERTO CALVO RUIZ 732) MARGARITA CASTRO VALENCIA 733) BLANCA SOSA AGUILAR 733) VIRGINIA PALACIOS HUIZAR 734) CLAUDIA OBREGON 735) BRENDA DINORA DURAZO QUIJADA 736) MARIA TERESA FLORES DE OROZCO 737) ALBERTO OROZCO GARZA 738) ERICKA JIMENEZ CRUZ 739) OSWALDO SILVA PALOMARES 740) BLANCA ROSA GASTELUM MENDEZ 741) SAGRARIO GALLARDO DE GAMEZ 742) HIPOLITA PINEDA FELIX 743) MARIA AMPARO TAPIA DE IBARRA.

744) IRMA VILLEGAS DE CANSECO 745) JAVIER EDUARDO CANSECO GIRON 746) KARLA MURGUIA DE FONTES 747) ANA JULIA CAMPILLO

V22

2000 (CONTINUACION)

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

129

V22

748) MARIA GUILLERMINA CASTILLO VILLEGAS 749) LOURDES URUCHURTU 750) CARMELITA QUEVEDO 751) JIM HUISH 752) ANGELICA OROZCO DE PERALES 753) ANA JULIA LOPEZ CAMPILLO 754) BERENICE LIZARDI DE DUARTE 755) ALMA LORENA BUSTAMANTE 756) ANA LORENA CASTILLON BARRAZA 757) LIDIA DE MANCILLAS 758) MARCELA DIAZ FIGUEROA 759) MARIA LUISA SEPULVEDA MENDEZ 760) CLARISA VALENZUELA DE VAZQUEZ 761) IRENE GARCIA DE LEON

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

130

BIBLIOGRAFIA 1) AVERY O. T., MC LEOD C. M.., MCCARTY J. (1944), EXP. MED. , 79, PGS 137-158. 2) DE KRUIF (2002), “LOS CAZADORES EDITORES MEXICANOS UNIDOS S.A.

3)

DE

MICROBIOS”,

FRANKLIN R. E.GOSLING R.G. (1953), “MOLECULAR CONFIGURATION IN SODIUM THYMONUCLEATE” NATURE.

4) HARTL DANIEL (1985), “OUR UNCERTAIN HERITAGE: GENETICS & HUMAN DIVERSITY”, SECOND ED. , HARPER & ROW PUBLISHERS, INC. 5) HIJAR ALBERTO, ARGÛELLO A., HIJAR G. CRISTINA, RIUS CASO LUIS, ESQUIVEL MIGUEL ANGEL, (2000), “ARTE Y UTOPIA EN AMERICA LATINA”, PRIMERA ED. INSTITUTO NACIONAL DE BELLAS ARTES. 6) KHUN T.S., (1991), “LA ESTRUCTURA DE LAS REVOLUCIONES CIENTÌFICAS”, ED. FONDO DE CULTURA ECONOMICA, MEXICO D.F. 7) LEE THOMAS (1991), “THE HUMAN GENOME PROJECT”, ED. PLENIUM PUBLISHING CORP. 8) MADDOX B. (2002), “ROSALIND FRANKLIN, THE DARK LADY OF DNA”. HARPER COLLINS ED.

9) NAGURO T. ET AL. (1990), VOL. 39 (6), PGS. 511-513.

“ELECTRON MICROSC TOKYO”,

11) SINGER MAXIME AND BERG PAUL (1993), “GENES Y GENOMAS, UNA PERSPECTIVA CAMBIANTE”, ED. OMEGA, BARCELONA ESPAÑA.

V22

10) SAGAN CARL (1997), “EL MUNDO Y SUS DEMONIOS”, ED. PLANETA, BARCELONA ESPAÑA.

GLORIA ELENA LEÓN PAZ ENRIQUE RODRÍGUEZ ZAZUETA

131

12) SOKAL A., BRICMONT J. (1999), “IMPOSTURAS INTELECTUALES”, ED. PAIDOS, BARCELONA, BUENOS AIRES, MEXICO.

V22

13) STOCKERT J.C. (1989), “ACTA-HISTOCHEM” VOL 87(1), PGS. 33-42.