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TRABAJO PRÁCTICO N°1 DIVERSIDAD DEL MUNDO MICROBIANO: MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA Y MACROSCÓPICA DE MICROORGANISMOS OBJETIVOS Ejemplificar la diversidad del mundo microbiano: hongos, bacterias, protozoos y virus. Introducir al alumno en la aplicación de normas de bioseguridad y de técnicas asépticas. Uso del microscopio de campo claro. Familiarizar al alumno con las técnicas de estudio de la morfología microscópica y macroscópica de bacterias y hongos (miceliares y levaduriformes). AL FINALIZAR EL TP LOS ALUMNOS HABRÁN ADQUIRIDO LAS SIGUIENTES HABILIDADES: Extraer muestras de cultivos mediante técnica aséptica. Realizar preparaciones en fresco y tinciones simples y diferenciales de bacterias y hongos levaduriformes. Utilizar correctamente un microscopio de campo claro. Individualizar las características microscópicas de bacterias y hongos (miceliares y levaduriformes). Individualizar las características macroscópicas de cultivos de bacterias y hongos (miceliares y levaduriformes). Aplicar normas de bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología. CUESTIONARIO DE ORIENTACIÓN 1- Compare los tamaños de los siguientes microorganismos: paramecio, levaduras (Saccharomyces cerevisiae), bacterias (Escherichia coli), adenovirus, bacteriófago . 2- ¿Cuáles de los microorganismos antes mencionados podría observar en un microscopio de campo claro, empleando el objetivo de 10X, 40X y 100X? 3- Ubique los microorganismos mencionados en los dominios (Bacteria, Archaea, Eukarya). 4- ¿Qué información acerca de la estructura bacteriana le brindan la microscopía de campo claro (preparaciones en fresco y tinciones diferenciales y no diferenciales), de campo oscuro, de fluorescencia, de contraste de fase y electrónica en la observación de microorganismos? Ver anexo microscopía. 5- ¿Cuáles son las principales diferencias entre una célula procariota y una eucariota?. Compare la ultraestructura de cada tipo celular. 6- ¿Qué formas y tamaños pueden presentar las bacterias? 7- En el estudio microscópico de bacterias se utilizan las tinciones de azul de metileno, Gram, Ziehl-Neelsen. ¿Qué información brindan dichas tinciones? 8- ¿Cuáles son las principales diferencias en las envolturas de bacterias Gram positivas y Gram negativas?. 9- ¿Cuáles son las principales diferencias en la composición de la pared y membrana citoplasmática de bacterias y levaduras? 10- ¿Qué características morfológicas de los hongos miceliares pueden distinguirse con un microscopio óptico de campo claro (hifas, conidios, etc.)? Ver anexo. 11- ¿Qué es un virus? ¿Cuál es su composición química? Discuta el requerimiento de células vivas para replicarse. 12- ¿Cuáles son las principales diferencias entre virus y clamidias?

13- ¿Qué entiende por Técnica aséptica en el laboratorio de microbiología? 14- Introducción a las normas de bioseguridad. Ver anexo Bioseguridad. BIBLIOGRAFÍA Brock, Biología de los Microorganismos 8a y 10a Ed. Pearson Prentice Hall. Madigan, Martinko, Parker. Capítulos (8a Ed.): 1, 3, 8 (8.1 al 8.4 y 8.7), 16 (16.23 y 16.31) y 18 (18.2 y 18.4). Capítulos (10a Ed.): 2, 4, 9 (9.1, 9.8 y 9.11), 12 (12.23 y 12.27) y14 (14.8 y 14.9). DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO Primer día Ejemplos de la diversidad del mundo microbiano: Hongos, bacterias, protozoos y virus a- Hongos miceliares: Ej.: Penicillium sp., Aspergillus sp., Geotrichum sp., Fusarium sp. y Rhizopus sp. Observación microscópica (40X) de preparados coloreados con Azul de lactofenol: Tipos de micelio, conidios, formas de fructificación. Observación macroscópica de colonias gigantes en medio Sabouraud y Czapek: Color de la superficie y del reverso, tamaño, textura y bordes. b- Bacterias ácido-alcohol resistentes. Ej. Mycobacterium tuberculosis Observación microscópica (100X) de preparados teñidos con Ziehl Neelsen. c- Bacterias que requieren células vivas para su replicación: Clamidias. Observación microscópica (40X y 100X) de células infectadas con Chlamydia trachomatis teñidas con Giemsa. d- Virus. Observación macroscópica de placas con células eucariotas infectadas por virus animales(efecto citopático: placas de lisis), y de cultivos de bacterias sensibles infectadas por producidas por bacteriófagos (placas de lisis). e- Protozoos. Observación microscópica (40X) de preparaciones de un protozoo flagelado (Ej.: Trichomonas vaginalis) teñidas con Giemsa. Segundo día Bacterias y hongos unicelulares a- Observación macroscópica del crecimiento de bacterias y levaduras en un medio de cultivo líquido Ud. recibirá cultivos en caldo tripteína soja (TSB) correspondientes a la muestra analizada y un caldo TSB sin inocular. Observe las características del desarrollo microbiano en medio líquido: turbidez uniforme, formación de película, sedimento. b- Morfología microscópica. (Microscopía de campo claro) Usted recibirá 1 muestra líquida para observar la presencia de microorganismos (bacterias y/o levaduras) en: 1-preparaciones en fresco (40x) 2-extendidos teñidos con Azul de Metileno (100x) 3-extendidos teñidos con colorantes de Gram (100x)

Materiales y Métodos Usted dispondrá de 1 asa 3 portaobjetos 1 cubreobjetos Solución de Azul de metileno Colorantes de Gram Antes de cada procedimiento agite la muestra (cultivo en medio líquido) para homogeneizarla. Utilizando la técnica aséptica que le indicará el docente, tome una gota de la muestra con el asa previamente esterilizada a la llama y enfriada y extiéndala sobre el portaobjetos convenientemente rotulado. Realice las coloraciones como se indica en el Apéndice Técnico. Para la observación en fresco coloque 2 ó 3 gotas de la muestra sobre el portaobjetos y deposite sobre ellas un cubreobjetos Cada alumno analizará una muestra en forma individual y observará los resultados correspondientes a otras 2 muestras analizadas en su mesada. c- Morfología macroscópica. Observación de colonias de bacterias y levaduras en un medio de cultivo agarizado. Ud. recibirá un aislamiento por agotamiento en superficie en agar tripteína soja (TSA) correspondiente a la muestra analizada en el punto anterior. Observe y describa las colonias, utilizando los siguientes criterios y terminología: Forma: puntiforme, circular, irregular. Bordes: enteros, ondulados, dentados. Tamaño: grande (aprox. 5 mm), mediana (2-3 mm), pequeña (1-2 mm). Superficie: lisa, rugosa. Aspecto: mucosa, seca, opaca, brillante, transparente. Color: blanco, amarillo, rojo, etc. Tenga en cuenta que las características macroscópicas de los microorganismos que van a ser observadas pueden ser diferentes si estos mismos microorganismos crecen en otro medio de cultivo. Este concepto será desarrollado en futuros Trabajos Prácticos. d- Discusión de los resultados y Elaboración del informe

ANEXO METODOLÓGICO Microscopía 1- Rotular convenientemente los portaobjetos y realizar los extendidos como se indicó previamente. Dejar secar al aire Fijar por calor, pasando el portaobjeto a través de la llama del mechero Colorear Coloración de Azul de Metileno Cubrir el preparado con Azul de Metileno. Dejar actuar 1min Lavar con agua de la canilla Secar y observar con objetivo 100x con aceite de inmersión. Coloración de Gram Cubrir el preparado con Violeta de genciana. Dejar actuar 20 s Lavar con agua de la canilla Cubrir con lugol (mordiente). Dejar actuar 30 s. Decolorar con alcohol-acetona (3:1) 10 s Lavar con agua Cubrir con safranina (contracolor). Dejar actuar 20 s Lavar con agua. Secar y observar con objetivo 100x con aceite de inmersión. Coloración de Ziehl Neelsen Cubrir el preparado con fucsina fenicada. Dejar actuar 5 min, calentando con un mechero hasta la aparición de vapores blancos. Repetir este procedimiento 3 veces con la precaución de que no se seque el preparado. Cubrir con alcohol-ácido (etanol-HCl 97:3), repetir hasta que no aparezca un color rojo al lavarlo. Lavar con agua Cubrir con azul de metileno (contracolor). Dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua. Secar y observar con objetivo de inmersión. 2- Coloración de Azul de lactofenol Observación microscópica de hongos miceliares cultivados en los medios Sabouraud o Czapek. Se realiza un preparado entre portaobjeto y cubreobjeto con un fragmento de micelio colocado en el líquido de montaje (Azul de Lactofenol). Fenol cristalizado 20g Acido Láctico 20 g Glicerina 40g Agua destilada 20 ml Azul de algodón 0,1 g Para prepararlo se disuelven los componentes y se calienta suavemente. El Azul de algodón se agrega al final. Medios de cultivo Agar glucosa 4% según Sabouraud (Merck) Peptona 10 g/l D (+) glucosa 40 g/l Agar-agar 15 g/l pH final 5.6 +/- 0.2 a 25°C

Medio Czapek. Medio químicamente definido. Nitrato de Sodio 2 g/l Fosfato bipotásico 1 g/l Cloruro de potasio 0,5 g/l Sulfato de magnesio heptahidratado 0,5 g/l Sulfato de hierro heptahidratado 0,01 g/l Sacarosa 30 g/l Agar-agar 15 g/l pH final 4.2 +/- 0.2 a 25°C Agar trepteína soja (TSA, "tryptic soy agar") (Merck) Peptona de caseína 15 g/l Peptona de harina de soja 5 g/l Cloruro de sodio 5 g/l Agar-agar 15 g/l pH final 7.3 +/- 0.2 a 25°C Caldo tripteína soja (TSB, "tryptic soy broth") (Merck) Peptona de caseína 15 g/l Peptona de harina de soja 5 g/l Cloruro de sodio 5 g/l pH final 7.3 +/- 0.2 a 25°C

ANEXO BIOSEGURIDAD El objetivo de la Bioseguridad es dictar normas, desarrollar procedimientos o promover el uso de instrumentos que permitan evitar accidentes. Se debe considerar el riesgo real que enfrenta el operador en la labor con distintos microorganismos o con material biológico potencialmente infeccioso para determinar el nivel de bioseguridad con el que debe trabajar. Según el nivel de bioseguridad se fijan los procedimientos y los dispositivos de protección necesarios correspondientes.

Grupos de riesgo de los microorganismos. Clasificación de la OMS •

Grupo de riesgo 1: Riesgo individual y comunitario escaso o nulo. Grupo de riesgo constituido por microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en humanos o en animales.

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Grupo de riesgo 2: Riesgo individual moderado, riesgo comunitario bajo. Grupo de riesgo constituido por agentes patógenos que pueden provocar enfermedades en humanos o en animales, pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal del laboratorio, la comunidad, los animales o el ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección, pero aplicando medidas eficaces de tratamiento y profilaxis, el riesgo de propagación es limitado.

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Grupo de riesgo 3: Riesgo individual elevado, riesgo comunitario moderado. Grupo de riesgo constituido por agentes patógenos que pueden provocar enfermedades graves en humanos o en animales, con bajo riesgo de propagarse en la comunidad. Se aplica al diagnóstico, investigación y producción en los cuales se trabaja con agentes que pueden causar una enfermedad grave o potencialmente letal, principalmente como resultado de la exposición a aerosoles. Puede disponerse o no de medidas eficaces de tratamiento y de profilaxis.

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Grupo de riesgo 4: Riesgo individual y comunitario elevado. Grupo de riesgo constituido por agentes patógenos que pueden provocar enfermedades graves en las personas o en los animales, con alto riesgo de propagarse en la comunidad. No suele disponerse de medidas eficaces de tratamiento y profilaxis.

Niveles de bioseguridad Nivel de bioseguridad 1 El trabajo se realiza generalmente sobre mesadas abiertas y se usan técnicas microbiológicas adecuadas. No se requiere equipamiento de contención ni diseño especial de infraestructura. El personal de laboratorio debe tener capacitación continua y supervisión de un profesional habilitado. El personal debe usar indumentaria de protección adecuada. Nivel de bioseguridad 2 El personal de laboratorio debe tener entrenamiento específico para manipular agentes patógenos y estar supervisado por un profesional habilitado. El acceso al laboratorio debe estar restringido al personal autorizado. Se deben tomar precauciones extremas con elementos corto punzantes Las operaciones generadoras de aerosoles potencialmente infecciosos deben ser realizadas con equipamiento y/o procedimientos de contención física (ej. flujos laminares). El personal debe usar indumentaria de protección adecuada. Nivel de bioseguridad 3 (Laboratorios de contención) La capacitación debe ser específica. Todos los procesos que involucran manipulación de este nivel de material infeccioso deben ser realizados en gabinetes de seguridad biológica. El personal debe usar indumentaria de protección adecuada y disponer de vestuario “doble” con ducha. El laboratorio debe tener diseño e instalaciones adecuadas para la contención. Es necesario el tratamiento de los efluentes líquidos. Se debe usar filtración absoluta HEPA del aire extraído y aplicar presión negativa en el laboratorio. Nivel de bioseguridad 4 El laboratorio debe estar aislado del resto de las instalaciones y el acceso al mismo debe ser estrictamente controlado (ingreso y egreso documentados). Dentro de las áreas todas las actividades deben estar confinadas a gabinetes de seguridad biológica Tipo III o gabinetes de seguridad biológica Tipo II con traje presurizado para el operador. Se debe realizar el tratamiento “in situ” de los efluentes. Se debe usar filtración absoluta doble HEPA del aire extraído, y aplicar presión negativa en el laboratorio.

Gabinetes de seguridad biológica Los gabinetes de seguridad biológica son dispositivos destinados a la manipulación segura de material biológico. Gabinetes de seguridad biológica Es un gabinete de presión negativa en el cual el aire ingresa por una abertura frontal. El aire ingresado sale al laboratorio o al exterior después de haber pasado, en su totalidad, a través de un filtro HEPA. Protege al operador pero no al producto. Este tipo de gabinete tiene un diseño que protege: a) al operador. Posee presión negativa e ingresa aire por su parte Tipo II anterior a velocidad adecuada. b) al producto, mediante un flujo laminar hacia abajo de aire filtrado con HEPA. c) al ambiente, ya que el aire se elimina después de pasar a través de un filtro HEPA. Este tipo de gabinetes se subdivide en varios subtipos. Dan el mayor nivel de protección al operador, al producto y al ambiente. Tipo III Son herméticamente cerrados. Para la manipulación se usan guantes sellados a la pared frontal de la cabina. Funcionan también con presión negativa El aire ingresante pasa a través de filtro HEPA y el egresante pasa por dos filtros HEPA colocados en serie o a través de un filtro HEPA y posterior tratamiento con calor. Tipo I

PRECAUCIONES GENERALES EN EL LABORATORIO. NORMAS BÁSICAS PARA EMERGENCIAS, ACCIDENTES O CONTAMINACIONES • • •

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El laboratorio es un lugar de trabajo y un área de acceso restringido. Las mesas de trabajo, suelos y paredes deberán ser de materiales de fácil limpieza y desinfección. El personal deberá conocer la localización y el manejo de los dispositivos e instalaciones de prevención de riesgos, de evacuación y las normas de actuación en caso de incidentes o accidentes. Deberá haber instrucciones básicas informadas, comprendidas y fácilmente accesibles para los casos de accidentes con productos biológicos o químicos (lavado de ojos, limpieza de derrames, eliminación de residuos, primeros auxilios, teléfonos del medico de medicina laboral, urgencias, evacuación, etc.). En el laboratorio se debe respetar la regla de los cuatro “NO”: No fumar. No comer. No beber. No maquillarse. Todo el personal usará obligatoriamente guardapolvos (abrochado) de mangas largas y zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes. Cuando sea necesario trabajar con guantes, deberá lavarse las manos antes de colocarse los guantes y al quitárselos. Lo hará con jabón y tantas veces como sea necesario. Con los guantes puestos sólo se deben tocar los elementos necesarios para la tarea que se esté realizando. Se evitará tocar los elementos de uso común con la mano enguantada. Si esto debiera hacerse, se quitarán previamente los

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guantes, efectuando el lavado y antisepsia de manos conveniente. Al comenzar y al abandonar la tarea se lavarán las manos con agua y jabón. Todo el material biológico debe considerarse como potencialmente contaminante y por lo tanto, tomar todas las precauciones y cumplir todas las instrucciones documentadas para su manejo, conservación, uso, almacenamiento o archivo y eliminación. Higiene ambiental: Se usarán siempre guantes impermeables gruesos de tipo industrial. Pisos, baños y superficies: se deben lavar con hipoclorito de sodio al 0,1% dejándolo actuar durante 20 minutos. Los elementos para efectuar la limpieza se desinfectarán con solución de hipoclorito de sodio al 0,1 % y serán usados exclusivamente para el laboratorio. Los baldes se vaciarán y limpiarán después de su uso. Los residuos de la limpieza (toallas descartables y materiales absorbentes) se eliminarán como residuos patogénicos evitando arrojar sin precauciones elementos cortantes o punzantes. Mesas de trabajo: se limpiarán al terminar la tarea, con hipoclorito de sodio al 0,5 % durante 30 minutos. En caso de derrames de líquidos patogénicos se deben absorber con algodón embebido en hipoclorito de sodio al l %, dejándolo actuar 30 minutos para descontaminar. Posteriormente se limpiará la superficie como se ha indicado. Jamás se pipeteará con la boca. Se usarán siempre los dispositivos aspiradores o dispensadores convenientes en cada caso. Accidentes con corto-punzantes: se favorecerá el sangrado de la herida y se efectuará un prolijo lavado con solución jabonosa de iodopovidona al 5 % durante no menos de 10 minutos. Salpicaduras en mucosa: se procederá al arrastre mecánico, por lavado con abundante agua corriente, durante no menos del 20 minutos. Salpicaduras en piel: se lavará con iodopovidona al 5 % durante el mismo lapso. Personal con heridas cortantes, lesiones exudativas o dermatitis activa. No manipulará equipos o materiales con los que pueda contaminarse. Se evitará todo procedimiento que pueda producir aerosoles (soplado del resto del contenido en pipetas, centrifugado sin tapones, etc.).

Además en el desarrollo del TP recuerde: 1- Mantener dedos, lápices o biromes lejos de la boca. 2- Utilizar el mínimo de elementos para registrar los experimentos y mantenerlos en un extremo de la mesada. 3- Ante cualquier duda consulte con el docente. Referencias bibliográficas 1- Micucci HA. Bioseguridad como epidemiología del accidente y las condiciones de trabajo como causas del mismo. En Temas de Zoonosis II. Editores Cacchione R, Durlach R y Larghi O. Edición Asociación Argentina de Zoonosis. Buenos Aires. 2004, p. 423-428. 2- de Torres RA. Niveles abordables de bioseguridad. Bioseguridad en el laboratorio. Acta Bioquim Clin Latinoam., Suplemento 4. 1988. p. 1-4.