The Role Of Astrocytes In Neural Regeneration

University of Colorado at Boulder

THE ROLE OF ASTROCYTES IN NEURAL REGENERATION  OF THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM

Troy S. Knapp

Introduction to Neuroscience 11:00­12:00 M/W/F Dr. Tim Smock December 11, 1995

ABSTRACT Astrocytes display properties that are both inhibitory and  beneficial to neural regeneration.  Unfortunately, the exact  nature of these inhibitory properties as of yet are unknown.  Two  hypotheses have been offered.  One is based on the mechanically  inhibitory properties of astrocyte scars.  The other is based on  the chemically inhibitory properties of a yet unknown substance.  Fortunately, a great deal more is known about the beneficial  properties of astrocytes.  The goal of this paper is threefold:  First, to review both the inhibitory and beneficial properties of  astrocytes in neural regeneration.  Second, to critique the  strength of the more prevalent arguments found in the literature  that deal with these inhibitory and beneficial properties.  Third, to propose an experiment designed to draw out yet another  beneficial property of astrocytes.   REVIEW OF THE CURRENT LITERATURE Almost a century ago the German anatomist Rudolf Virchow  recognized that brain cells could be divided into two distinct  categories: (1) Neurons and (2) Neuroglia (Levitan et al, 73)  Neuroglia is by far the most numerous of the cell types, out  numbering neurons by a factor of approximately ten to one  (Bignami et al, 1.)  In fact, according to an anonymous  corespondent in Nature about half of the volume of the vertebrate  brain is composed of glial cells (Bignami et al).  Until the  1920's neuroglia was believed to be a single functional unit that  served only as a putty providing structural support to adjoining 

neurons (Streit et al, 54.)  At this time Pio del Rio­Hortega  developed a silver carbonate stain that made possible  differentiation of the three types of glial cells, astrocytes,  oligodendrocytes and microglia (Streit et al).  Each type of  glial cell has a specialized function relatively independent of  the other.  Here we are most interested in the actions of  astrocytes and their contribution to neural regeneration in the  CNS.   Astrocytes perform a myriad of functions in the CNS,  including, maintaining a stable neuronal microenvironment, uptake  of amino acids, production of growth factors, and protection from  oxygen toxicity. Astrocytes also seem to play an inhibitory role  in the neural regeneration of the CNS. Whether this role is  mechanical or chemical is still a matter of debate.   The main function of astrocytes is to assure the stability  of the neuronal micro­environment (Bignami et el, 31).  In both  gray matter and white matter we find that astrocytes are ideally  located for carrying out this task.  In gray matter astrocytes  surround neurons and their processes, while in white matter  astrocytes mainly surround the oligodendrocytic product, myelin.  Further, astrocyte processes form a continuous lining on the  surface of the brain and of blood vessels entering the brain from  the leptomeninges.  Astrocytes exhibit gap junctions with other  astrocytes in both white and gray matter, forming a functional  syncytium equilibrating changes in concentrations of ions and  small solutes (Bignami et al, 36).  These gap junctions  facilitate astrocytes in maintaining the neuronal 

microenvironment. 

Potassium homeostasis is the clearest example 

of astrocytes maintaining the neuronal microenvironment.  The  amount of potassium [K+] released during neuronal activity, such  as an action potential, is relatively small, though it results in  a significant increase in extracellular [K+].  These excess  levels of [K+] are taken up by the astrocyte and dispersed  through the syncytium (Bignami et al, 36).  The effectiveness of  this syncytium is evidenced by an increase in local extracellular  [K+] being redistributed through the syncytium to distant areas  where extracellular [K+] is lower (Brightman et al, 113). Research indicates that this syncytium may be responsible  for the protection astrocytes seem to receive from some types of  neuronal toxicity. Investigators found, using L­trans­pyrolidine­ 2, 4­dicarboxlic acid (trans­PCDA), that astrocytes were  generally neuroprotective under excitotoxic conditions (Dugan et  al, 3). The rational being that the functional syncytium easily  dissipated the toxicity away from the region of highest  concentration.  Astrocytes also mediate toxicity by uptake of amino acid  neurotransmitters.  For example, astrocytes show a much grater  uptake capacity for glutamate, one of the main excitatory  neurotransmitters in the brain, then do neurons. Regional  differences do exist in this respect however.  This uptake  capacity for glutamate is not surprising as this amino acid, like  many other acidic amino acids, are neurotoxic (excitotoxins)  (Bignami et al, 36).  

The glutamate that astrocytes uptake is used for ammonia  detoxification, yet another example of astrocytes maintaining the  neuronal microenvironment.  The evidence supporting this is  twofold.  First, the brain enzyme responsible for the formation  of glutamine from glutamate and ammonia is exclusively localized  in astrocytes (Murphy et al, 383).  Secondly, the swelling and  vacuolation of astrocytic nuclei is the most prominent finding in  patients dying of hepatic coma, believed to be caused by excess  levels of blood ammonia (Murphy et al). As Bignami discussed the requirements of maintaining the  neuronal microenvironment are so much more stringent in gray  matter than in white matter that one would expect gray matter and  white matter astrocytes to be different in this respect.  Synaptic activity in the integrating zone of neurons found in  gray matter are presumably more sensitive to small changes in the  microenvironment then the conduction of action potentials found  in white matter.  Bignami therefore concluded that cerebral white  matter is more comparable to peripheral nerve then to gray matter  in respect to maintaining neuronal microenviroments.  Astrocytes exhibit receptors for several types of growth  factors as well as appear to produce both Nerve Growth Factor  (NGF) as well as Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF).   bFGF is  *

known to promote not only the survival of neuronal cells, but  * More specifically bFGF has a wide range of tissue distribution and 

the broadest spectrum of biological activities.  Due to striking  physiochemical properties several different factors are lumped under  the term bFGF.  They include: Astroglial growth factor , Heparin­binding  growth factor class II and tumor angiogenesis factor. 

also the proliferation and differentiation of non­neuronal cells  like astrocytes (Enokido et al, 106).  Since bFGF is found to  have a positive growth action in both astrocytes and neurons the  question is raised as to which cell is exhibiting an influence on  the other. Bignami notes that two possibilities exist as to the source  of these neurotrophic factors.  They are either produced by the  innervated target or by the glial cells responsible for these  targets (p, 34). Some confusion exists in the literature as to  this point.  The uncertainty being what quantity of neurotrophic  factors are produced in astrocytes verses neurons. It is well  established, however, that neurons are the main site of NGF  expression in normal CNS tissue. Though, tissue evidence suggests  that astrocytes may by the source of NGF in damaged CNS tissue  (Bignami, 34).  The rational for this being that NGF mRNA levels  have been found to be increased in primary astrocyte cultures  stimulated by several cytokins and bFGF.  Furukawa, however,  asserts that healthy astroglial cells are known to synthesize NGF  (p.42).   In addition to the production of NGF and bFGF astrocytes  have been found to contain receptor sites for epidermal growth  factor (EGF) (Huff, 659).  The investigators found that binding  of EGF by the astrocytes was saturable, specific and not competed  by NGF or bFGF.  They did find, however, a 70% reduction in EGF  binding when the astrocytes were pretreated with bFGF for an 18  hour period.  This lead them to the conclusion that bFGF may 

serve as an off switch for the EGF mitogenic signal in  astrocytes.    While the exact physiological significance of neurotrophic  synthesis (whether in healthy or damaged CNS tissue) is unclear,  it is clear that astrocytes are one of the sources providing  neurotrophic factors to neurons.        Regardless of the conditions under which astrocytes produce  trophic factors, it has been securely documented that neurons  require a glial environment to grow.  Dugan and colleagues found  this by developing "pure" neuronal cultures from mouse neocortex  to study the effect of glial cells on the response of neurons to  injury.  They found that neuronal cultures grew best on a glial  base, coming to the conclusion that cortical neurons require a  glial conditioned medium in order to survive (p, 4545).  Mark  Noble came to the same conclusion in his study on the  developmental biology of the optic nerve.  Noble compared the  growth of optic neurons on a variety of substrates including,  optic astrocytes, schwann cells, skin fibroblasts, and cardiac  myocytes. He found that dissociated neurons plated onto  astrocytes grew as if they preferred the astrocytic surface to  any other surface availalbe (p, 9).   Noble saw extensive  crossing over of neuronal processes, and an occasional instance  of processes running in parallel for short distances (p, 9). Growth factors are not the only astrocyte product that are  beneficial to neuronal survival.  Astrocytes have been found to  release pyruvate which has also been determined to have a  positive effect on neuronal survival (Selak et al, 23).

Astrocytes also seem to play a role in protecting CNS  neurons from oxygen toxicity, some of which is thought to be  produced by microglia.  These reactive oxygen species are  believed to have the beneficial effect of damaging microbe  membranes, proteins and DNA.  Unfortunately, reactive oxygen  species damage healthy cells in the same way (Streit et al, 61).  These oxygen free radicals have been implicated as a potential  cytotoxic mechanism responsible for nigral cell death in  Parkinson's disease (Jovoy­Agid, 92).  There are several enzymes  in the CNS that act in concert to defend against this oxygen  toxicity.  Fist the superoxide radical is mutated to hydrogen  peroxide by superoxide dismutase (SOD).  The hydrogen peroxide is  then decomposed to water or removed by glutathion peroxidase  (GPX) which uses hydrogen peroxide to oxidize the reduced  glutathion (Jovoy­Agid).  Through immunocytochemical studies on  human mesencephalon Jovoy­Agid found that GPX is found  exclusively in astrocytic cells, showing that astrocytes are  responsible for mediating oxygen toxicity.     Knowing the functions of astroglial cells we now turn our  attention to their role of neural regeneration in the CNS. A  profound difference exists in the ability of neural regeneration  in the CNS and the peripheral nervous system (PNS).  This is  demonstrated by the following, if an efferent dorsal root  ganglion is cut the axon will regenerate normally reaching its  peripheral target allowing functional recovery.  However, if a  CNS axon is severed the regenerative attempt will be abortive and  non functional.  A regenerating PNS axon will stop at the PNS­CNS 

junction.  This apparently happens for one of two reasons.  First, the lack of CNS regeneration is due to an active  inhibition on the part of the CNS.  Second, the CNS lacks  regenerative factors normally found in the PNS.  Astrocytes at  the PNS­CNS junction would share responsibility for the lack of  neural regeneration in either of these two cases. One of the longest held hypothesis for the lack of neural  regeneration in the CNS is astrocyte scar tissue resulting from  CNS injury.  The major mass of astrocytic scar tissue is formed  from bundles of cytoplasmic intermediate filaments which are made  of GFAP, an astrocyte­specific protein (Bignami, 84).  Upregulation of GFAP production is a main factor in the formation  of glial scars.  In this case astrocyte proliferation also occurs  but is limited and confined to the area of injury. These  astrocytic scars have been believed to be responsible for  inhibition of neural regeneration (Bignami, 85).  It has been suggested that increased GFAP expression by  astrocytes is the most sensitive indicator of neural damage in  the CNS.  Farooque and colleagues found this to be true in rats.  The investigators used immunohistochemistry to detect changes in  the expression of GFAP in spinal tracts after using blocking­ weight techniques to induce spinal cord compression at the level  of the eight and ninth thoracic vertebrae (Farooque et al, 41).  The investigators found that within 24 hours post compression  widespread astrocyte reaction occurred.  Even mild compressions  that did not produce any signs of dysfunction induced widespread  astrocytic alterations.  Further, the astrocyte response was more 

marked in rats with more severe compression leading to more  pronounced neurological deterioration (Farooque). Recent research has indicated that this astrocyte injury  response is not entirely local.  Studies by Janeczko point to the  possibility that astrocytes migrate from peripheral areas to  participate in the process.  His evidence for this is that  [3H]thymidine­labeled astrocytes at first scattered over a  relatively wide area later became concentrated around CNS lesions  (p, 236).  According to Bignami several publications now suggest  that normal glial cells (astrocytes and oligodendrocytes) have  the ability to migrate in CNS tissue (p, 85).     Astrocytes are found to exhibit scaring in both injuries  that produce dysfunction and in injuries that do not.  Yamada and  colleagues have found the formation of astrocyte scar tissue does  not create a major barrier in CNS neuronal regeneration in lower  vertebrates. The researchers investigated axonal regeneration in  the CNS using fine structural and histochemical aspects of the  carp spinal cord, which was completely transected at the level of  the dorsal fin.  Fusion of the transected region and regeneration  of axons was apparent at 26 days post lesion.  By 115 days post  lesion the rostral and caudal portion of the transected spinal  cord were completely connected by the regeneration nervous tissue  (p, 324).  Horseradish peroxidase injected in the spinal cord at  the portion caudal to the transection site was detected in the  cytoplasm of large neurons located in the reticular formation of  the midbrain (p, 325).  This demonstrates that long axons  regenerated through the ablation gap, indicating that 

regenerating axons in carp spinal cord can pass through the glial  scar bundle formed in the transected portion. Many of these  regenerating axons were found to be in contact with astrocytes,  indicating that glial cells do not play a major role as an  obstacle for the prolongation of axons in the carp spinal cord  (p, 325).  Unfortunately, several observations are not readily  explained by the scar hypothesis.  First, extensive axonal growth  may be observed in glial scars, as noted by Yamada and  colleagues.  Secondly, a study performed by Chi and Dahl on nerve  grafting found that glial scars formed as the result of damage  done during surgery at the interphase between brain and  peripheral nerve implants do not prevent axons growing from the  brain into the graft (p, 245).  These inconsistencies are best accounted for by a second  hypothesis. A chemical mechanism has been proposed by Liuzzi and  Tedesch as the barrier to CNS neural regeneration. Knowing that  regeneration of a peripheral axon stops at the junction to the  CNS they proposed that astrocytes transmit some sort of 'stop'  signal when contacted by a growing axon (Liuzzi, 4783).  This  signal would be similar to the physiological mechanisms that stop  growth when axons reach their destination in development, except  that in the first case the message is delivered by the astrocyte  membrane and in the second case by the post­synaptic membrane  (Bignami, 95).  Unfortunately, this signal has not been found or  identified.  Oligodendrocytes however seem to exhibit a sort of  stop signal on their surface that act as an axonal repellent 

(Bignami et al, 95).  This was observed when dorsal root ganglion  (DRG) axons are put in contact with sciatic nerve (a PNS nerve)  and an optic nerve (a CNS nerve) in vitro.  The DRG grows inside  the sciatic nerve and avoids the latter optic nerve.  This lead  to the isolation of two inhibitory proteins fractions at 250 and  35 kD and to the demonstration that antibodies to these proteins  promote axonal growth in the spinal cord (Schnell et al, 269). We have found that astrocytes perform a variety of functions  in the CNS.  Including maintaining a stable neuronal  microenvironment, uptake of amino acids, production of growth  factors, and protection from oxygen toxicity.  Unfortunately, none  of these functions elucidate hints as to why astrocytes appear to  have an inhibitory effect on neural regeneration in the CNS.  Both a mechanical and chemical hypothesis have been explored.  The glial scar hypothesis has several unresolved contradictions.  Therefore, the chemical hypothesis seems more solid.  CRITIQUE OF THE LITERATURE Within the reviewed literature there are three areas lacking  clarity.  First, the effect of bFGF on astrocytes is unclear.  Second, there is confusion in whether we find greater NGF  production in healthy or damaged astrocytes.  Third, though a  physiological mechanism seems to prevent regenerating axons from  crossing the PNS­CNS barrier, none has been found or identified.  As stated before bFGF is known to promote not only the  survival of neuronal cells but also the proliferation and  differentiation of non­neuronal cells like astrocytes (Enokido et  al, 106).  Both neurons and astrocytes express receptors for and 

produce bFGF.  Further, Enokido found that astroglia fibers  increased in number with the addition of bFGF.  Because we find  both astroglia and neurons responding to and producing bFGF the  question is raised as to which cell is having an action on the  other.  Or, does the possibility exist that they share a mutually  beneficial relationship. It appears that the literature is silent  on any mutually inclusive action bFGF may have on astrocytes and  neurons.  Secondly, uncertainty exists as to the production of NGF in  astrocytes.  Bignami has cited tissue evidence suggesting that  astrocytes may be a source of NGF in damaged CNS tissue (Bignami  et al, 34).  His rational for this is the finding of NGF mRNA in  primary astrocyte cultures.  Furukawa states very clearly that  healthy astrocytes are known to synthesize NGF in cultures.  His  evidence for this is that murine astrocytes synthesize and  secrete molecules identical to murine submaxilary gland derived  NGF with respect to molecular weight, isoelectric point,  antigenicity and neurite promoting activity (Furukawa, 62).  The  question as to whether healthy or injured astrocytes produce NGF  is of importance. If healthy astrocytes produce NGF then they  could be considered to have a maintenance role in the CNS.  If  injured astrocytes produce NGF then they could be considered to  have restorative role. The answer to this question goes to the  very basis of defining the role astrocytes play in the CNS.  Thirdly, Bignami asserts as a reasonable hypothesis that  astrocytes possess on their surface a chemical that transmits a  signal to growing axons that in effect tells them to stop their 

regeneration.  Bignami puts forth this hypothesis though he is  unable to provide any information as to the nature of this  chemical signal.  This chemical hypothesis is found elsewhere in  the literature though in no place is the structure or action of  the chemical signal elucidated.  The basis for Bignamis'  hypothesis seems to be that oligodendrocyte appear to possess  this chemically inhibitory property.  Bignami states that in  oligodendrocytes these inhibitory proteins, as well as antibodies  for them have been identified (p, 95).  Bignami is the only place  in the literature that I have found a statement that the  inhibitory proteins in oligodendrocytes have been identified.  While the chemically inhibitory hypothesis appears reasonable it  seems directly opposed to the other actions of astrocytes.  We  find astrocytes playing a variety of beneficial roles in relation  to neurons.  For example, the literature is very secure that  astrocytes produce and maintain several types of neurotrophic  factors, as well as protect neurons from oxygen and ammonia  toxicity.  In light of these beneficial aspects stating that  astrocytes also possess a strong repellent to neuronal growth is  difficult.   This dilemma goes back to the previous dilemma raised by  Bignami and Furukawa.  Bignami felt that injured astrocytes were  the source of astrocytic NGF production, while Furukawa believed  that healthy astrocytes produced this NGF.  This lead us to the  question of whether astrocytes play a maintenance or restorative  role in the CNS.  The answer to this question in turn will  provide hints as to which hypothesis against neural regeneration 

(mechanical or chemical) is correct.  If the role of astrocytes  in the CNS is found to be restorative then the chemical  inhibition hypothesis against neuronal regeneration seems out of  place.  The reasoning here being that a restorative role would be  in opposition with a chemically inhibitory signal.  If the role  is indeed one of maintenance then the chemically inhibitory  hypothesis of neuronal regeneration would appear valid.  The  thought here being that a chemically inhibitory signal on  astrocytes provides a balance system against the neurotrophic  factors, while the neurotrophic factors provide a check system  against the chemically inhibitory signal.  This arrangement would  create a homeostatic state in which neither influence could exert  its will unchecked.  This would be in keeping with a maintenance  role.  Unfortunately, experimental verification of this check and  balance theory of astrocyte chemical message and neurotrophic  factor homeostasis would be difficult to carry out without  knowing the make up or antibody factors of the chemically  inhibitory signal.  If NGF production was inhibited in a  controlled environment one would expect the inhibitory chemical  signal on the astrocyte to be free to express its action.  This  action would be to inhibit neuronal growth.  However, it would be  difficult to determine if any decrease in axonal sprouting or  growth was due to the inhibitory chemical signal, or if it was  due to a lack of NGF. If antibodies to the inhibitory chemical were known then an  experiment to test this theory could most likely be carried out. 

If the inhibitory chemical signal could be inhibited then NGF  would be expected to express its effect unchecked.  This could be  easily checked by looking for any increases in axonal growth or  sprouting in a controlled environment.  The answers to a great  many questions are resting on the discovery of the structure of  the proposed inhibitory chemical signal on astrocytes. The most exciting discovery in recent literature is that of  astrocytes having the ability to migrate in the CNS from  peripheral areas to lesion areas as discovered by Janeczko and  verified by Bignami (p, 236: p, 85).  In light of the many  beneficial aspects that astrocytes have been shown to exhibit in  neuronal maintenance, and possibly in neural regeneration, this  discovery is even more exciting.  Naturally, the question is  raised, if astrocytes migrate to injured areas and exhibit their  beneficial properties can they be placed at the site of injury  and remain viable so as to exhibit their beneficial properties?   PROPOSED EXPERIMENT In hopes of gaining further understanding of the potentially  beneficial aspects of transplanted astrocytes I propose the  following experiment.  In fifteen male Wistar rats of the same  age (approximately 90 days) create a 1mm lesion in the white  matter of the right cerebral hemisphere underlying the cerebral  cortex.   At 30 minutes post lesion inject .25mL of pure cultured  *

* The rational for creating a lesion in the white matter is based on 

Bignami's hypothesis that cerebral white matter is less sensitive then  gray matter to small changes in the microenvironment. Because white  matter is more robust to changes in the microenvironment accidental  contamination due to the surgery will play less of a role as a  confounding variable. 

astrocytes (as derived by Dugan and colleagues (p, 4546)) that  have been labeled with [3H]thymidine.  At 40 days post lesion  kill the animals and fix the brains in Bouins's fixative and  section at    5 µm intervals in the coronal plane.  Label 5 of  the coronal sections according to the method developed by  Janeczko and Bignami 

                                                         Knapp 1

(Janeczko, p. 237).   Examine a 100 x 100 µm area of lesion in  #

each of the 5 coronal sections.  Tally both the number of labeled  and unlabeled astrocytes in these sections as well as the number  of astrocytes in the corresponding contralateral unlesioned area.  Further, estimate the number of labeled astrocytes placed into  the lesion area.    From these numbers perform a Students two tailed t­test to  determine the following:  (1) If there is a significant  difference between the number a labeled astrocytes added to the  lesion area verses the number of labeled astrocytes found in the  lesion area after the animal was killed.  A significant  difference here would suggest one of two things.  First, that the  astrocytes are incapable of growing into the lesion area.  Second, that there is some maximum number of astrocytes that the  area is able to support and that number had been exceeded.  Finding no significant difference would suggest that the labeled  astrocytes are capable of growing into the existing neural  structure.  (2) If there is a significant difference between the  total number of astrocytes on the lesion side verses the  unlesioned side.  A significant difference may indicate that the  labeled astrocyte culture was able to grow into the existing  structure.  No significant difference between the two sides may  indicate that there is some maximum level of astrocytes that a  # The method is as follows:  stain the coronal sections 

immunocytochemically by the peroxidase­antiperoxidase method according  to Van Noorden.  Then prepare autoradiographs from the  immunocytochemically stained sections by the dipping technique using  illford K­2 emulsion, expose for 21 days, develop and stain with Harris'  hematoxylin and eosin. 

                                                         Knapp 2

given area can support, based on the assumption that the  unlesioned side is close to this maximum density.  The optimal  results would be to find after analysis of the data that no  significant difference was found in the first case while a  significant difference was found in the second case.  This would  indicate a probability that astrocytes are capable of being  placed into a damaged neuronal environment and surviving.       

                                                         Knapp 3

                             Work Cited  Bignami, Amico, and Dahl, Doris. Medical Intelligence Unit: Glial  Cells in the Central Nervous System and their Reaction to  Injury.  Austin: R.G. Landes Company, 1994. Brightman, Milton and Tao­Cheng, Jung­Hwa. "Mutually Imposed  Structural Changes in Plasma Membranes of Astroglia and  Brain  Endothelium." Neurology and Neurobiology:  Differentiation and  Function of Glial Cells. Vol 55. New York:  Alan R. Liss,  Inc., 1990. Chi, N, Dahl, D. "Autologous Peripheral Nerve Grafting into  Murine  Brain as a model for Studies of Regeneration in the  Central  Nervous System." Experimental Neurology. 79 (1983):  245­264. Dugan, L, Bruno, V, Amagasu, S, Giffard, R. "Glia Modulate the  response of murine cortical neurons to excitotoxicity: Glia  exacerbate AMPA neurotoxicity." Journal of Neuroscience  15(6)  (1995): 4545­4555. Enokido, Y, and Hatanaka, H. "Neurotrophic Factors Rescue  Neuronal  Cell Death caused by Oxygen Toxicity in Culture."  Neurotrophic Factors. Taniguchi Symposia on Brain Sciences,  No. 15. Bocca Raton: CRC Press, 1992.  Farooque, M, Badonic, T, Olsson, Y, and Holtz, A. "Astrocytic  Reaction after Graded Spinal Cord Compression in rats:  Immunohistochemical Studies on Glial Fibrillary Acidic  Protein and Vimentin." Journal of Neurotrauma 12(1), 1995:  41­45. Furukawa, Yoshiko. "Regulation of Nerve Growth Factor Synthesis  by  Caechol Derivatives." Neurotrophic Factors. Tanigachi  Symposia on Brain Sciences, No 15. Bocca Raton: CRC Press,  1992. Huff, K. "Astrocyte Binding of Epidermal Growth Factor." Neural  Development and Regeneration: Cellular and Molecular  Aspects.  NATO ASI Series H: Cell Biology, Vol 22. 1987. 

                                                         Knapp 4

Javoy­Agid, F. "Factors Associated to Dopaminergic Cell Death in  Parkinson's Disease." Trophic Regulation of the Basal  Ganglia: Focus on Dopamine Neurons. Wenner­Gren  International  Series, Vol 62. Britan: Butler and Tanner, Ltd.  1994. Janeczko, K. "Spatiotemporal Patterns of the Astroglial  Proliferation in rat Brain Injured at the Postmitotic Stage  of Postnatal Development: a Combined Immunocytochemical and  Autoradiographic study. Brain Research. 485, 1989: 236­243. Kaczmarek, Leonard, and Levitan, Irwin. The Neuron: Cell and  Molecular Biology. New York: Oxford University Press, 1991. Kincaid­Colton, Carol, and Streit, Wolfgang. "The Brain's Immune  System." Scientific American. Nov 1995.  Liuzzi, F, and Tedeschi, B. "Axo­glial Interactions at the Dorsal  Root Transitional Zone Regulate Neurofiliment Protein  Synthesis in Axotomized Sensory Neurons." Journal of  Neuroscience. 12 (1992): 4783­4792.  Murphy, S, and Pearce, B. "Functional Receptors for  Neurotransmitters on Astroglial cells." Journal of  Neuroscience 22 (1987): 381­394. Noble, Mark. "Developmental Biology of the Optic Nerve." Neural  Development and Regeneration: Cellular and Molecular  Aspects.  NATO ASI Series H: Cell Biology, Vol 22. 1987. Selak, I, Skaper, S, Varon, S. "Pyruvate Participation in the low  Molecular Weight Trophic Activity for CNS Neurons in Glia­ Conditioned Media." Journal of Neuroscience 5 (1985): 23­28. Schnell, L. Schwab, M. "Axonal Regeneration in the Rat Spinal  Cord Produced by an Antibody Against Myelin­associated Neurite  Growth Inhibitors. Nature. 343 (1990): 269­272. Van Noorden, S. "Tissue preparation and immunostaining techniques  for light microscopy."  Immunocytochemistry:  Modern Methods  and Applications. Wright Bristol (1986): 26­53.

                                                         Knapp 5 Yamada, H, Miyake, T, and Kitamura, T. "Regeneration of Axons in  the Carp Spinal Cord." Zoological Science. 12(3) (1995):  325­ 332.