Tarea 10

BiologíaMolecular

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Replicación del ADN Una de las características más notables del ADN es su capacidad de replicarse. Vale decir que el ADN es capaz de formar copias de sí mismo. El proceso de autoduplicación del ADN se lleva a cabo en el período S del ciclo celular. Esta etapa es un paso previo obligado para realizar la división celular en la etapa M de mencionado ciclo. Los genes deben poseer tres funciones principales, como portadores del material hereditario: ∑ Deben ser capaces, por medio de una replicación fiel, de transmitir la información genética de generación en generación.

Figura N° 2: Ciclo Celular

∑ Deben contener la información necesaria para sintetizar todas las proteínas fundamentales para permitir el normal desarrollo de la célula. ∑ Deben aceptar cambios ocasionales como forma de evolución, es decir, deber aceptar la capacidad de mutar. La replicación permite que el ADN sea capaz de cumplir con las funciones anteriormente mencionadas. La réplica del material hereditario es un producto directo de este proceso; la información para la síntesis de las proteínas está asegurada por medio de la replicación y los errores en la replicación posibilitan y generan cambios que pueden llevar a la evolución. La replicación del ADN es Semiconservativa, puesto que las dos cadenas del ADN sirven de patrón para la síntesis de las nuevas cadenas. Cada doble hélice hija, producto del proceso de autoduplicación, tendrá una cadena recién sintetizada (nueva) y otra cadena que, con anterioridad, formaba parte de la molécula parental.

Figura N° 3: Replicación Semiconservativa del ADN. Obsérvese en la figura que las cadenas del ADN parental se conservan y pasan a formar parte de las cadenas hijas. En el esquema, las cadenas nuevas se visualizan en negrita.

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La replicación se llevará a cabo en el núcleo de la célula eucariota, e intervendrán una dotación de enzimas que se encargarán de abrir la doble hélice, incorporar los nucleótidos y disminuir la tensión que se genere por delante de ella. Enzimología de la Replicación: Con el fin de esclarecer el proceso de replicación, describiremos primero todas las enzimas que intervienen y luego desarrollaremos el proceso en su conjunto. ∑ ADN polimerasa: Es la principal enzima de este proceso. Ella es capaz de sintetizar nuevas cadenas de ADN , a partir de una hebra patrón y las unidades estructurales correspondientes (desoxirribonucleótidos). Los desoxirribonucleótidos, para ser incorporados por esta, deben estar trifosfatados. Es decir que se necesitarán dATPs, dGTPs, dTTPs y dCTPs, para poder sintetizar las nuevas cadenas de ADN. Otra de las características principales de esta enzima, es que polimerizará los nucleótidos en la dirección 5´a 3´. Como consecuencia de esto, la dirección en la cual leera la cadena patrón de ADN será de 3´a 5´ . Un rasgo a tener en cuenta es que la ADN polimerasa NO puede iniciar su síntesis sin la existrencia de un cebador de ARN. No solamente polimeriza los nucleótidos, sino que se ha comprobado que es capaz de corregir los posibles errores que se cometan durante la autoduplicación. ∑ Helicasas: Son las enzimas encargadas de separar las dos hebras del ADN. Estas enzimas son responsables de la ruptura de las uniones puente de Hidrógeno que se establecen entre las bases de las dos cadenas del ADN. Para poder separar las dos hebras del ADN se necesitará energía, que es obtenida de la hidrólisis del ATP. Por cada dos pares de bases que separan, se gastan dos moléculas de ATP. ∑ Proteínas estabilizadoras de la cadena: Una vez que las cadenas del ADN son separadas, la estabilidad de las mismas disminuye considerablemente. El ADN tiende a reasociarse y, son estas proteínas quienes impiden que el ADN vuelva a su conformación inicial. Su presencia es fundamental para mantener las cadenas estiradas. ∑ Topoisomerasas: Al producirse la duplicación, el ADN adquiere cierto grado de superenrollamiento. Imaginemos que la molécula de ADN es como una bandita elástica, a la cual le conferimos vueltas alrededor de su eje longitudinal. Si ahora tomamos uno de sus extremos y separamos cada una de sus partes veremos que, por delante de donde se produce la separación, la bandita adquirirá una mayor tensión, plegándose sobre sí misma. Lo mismo ocurre con la molécula de ADN, si la Helicasa separa las cadenas delante de donde se está produciendo la replicación aumentará, en forma más que considerable, la tensión de la molécula. Para evitar esto, las topoisomerasas cortan la doble hélice, rotan el ADN y vuelven a unirlo, evitando así que aumente la tensión por delante de la horquilla de replicación. En consecuencia, encontraremos a las Topoisomerasas por delante del lugar donde se está produciendo la duplicación. ∑ ARN polimerasa o Primasa: Esta enzima es la que sintetiza el cebador, un primordio de ARN necesario para que la ADN polimerasa pueda iniciar la síntesis de las

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nuevas cadenas. El cebador es una pequeña porción de ARN de 10 a 12 ribonucleótidos de largo que se mantendrá unido a la cadena de ADN molde hasta que sea removido. Mecanismo de la Replicación: Ya dijimos que la duplicación se llevará a cabo durante el período S del ciclo celular y que es un proceso fundamental para que la célula pueda dividirse. El ADN actuará como patrón, ya que la ADN polimerasa agregará los nucleótidos de las nuevas cadenas por complementariedad de bases. El lugar donde transcurre la replicación se denomina Horquilla de Replicación, esta estructura tiene forma de “Y”, y es la zona donde se sintetiza el ADN para formar las dos moléculas hijas (Ver figuras Nº 4 y 5). Las horquillas de replicación se originan en una estructura denominada Burbuja de Replicación, una región en la que las cadenas de la hélice de ADN se separan una de otra, actuando como patrón para la síntesis de las nuevas cadenas de ADN. Las zonas donde se producen las Burbujas de replicación no son aleatorias, se ha demostrado que existen secuencias de bases que indican los lugares precisos donde la replicación ha de comenzar. Cada Burbuja de Replicación posee dos Horquillas de Replicación, una de las cuales se desplaza hacia la derecha y otra hacia la izquierda. Este proceso necesita, en primera instancia, que las dos cadenas del ADN se separen. Para esto, las Helicasas se unirán a la cadena de ADN e hidrolizarán las uniones Puente de Hidrógeno que las mantienen unidas. La consecuente apertura de la doble hélice hace que las cadenas simples adquieran inestabilidad, esta es compensada por la unión de las proteínas estabilizadoras de la cadena simple. La ADN polimerasa no es capaz de iniciar la síntesis a partir de los desoxirribonucleótidos libres, por lo tanto necesitará que la Primasa sintetice en forma previa el Primer o Cebador. Una vez incorporado el Cebador, la ADN polimerasa incorporará los nucleótidos en forma complementaria a las bases de la cadena patrón. Una vez que la Horquilla avance, la tensión por delante de la misma aumentará, para evitar esto las Topoisomerasas cortarán la doble hélice, la rotarán y volverán a unirla. Debido a la orientación antiparalela del ADN, una de las cadenas de la horquilla de replicación quedará en sentido 3´a 5´, por lo cual la ADN polimerasa podrá trabajar en forma continua (recordemos que esta enzima Figura N° 4: Horquilla de replicación. Síntesis de la leía en dirección 3´a 5´y cadena continua y de la discontinua. polimerizaba en dirección 5´a 3´). En cambio, la otra cadena de la Horquilla, quedará orientada en la dirección inversa (5´a 3´), por lo cual en cada Horquilla de Replicación deberán actuar al menos dos ADN polimerasas. Una de ellas podrá actuar en forma contínua, puesto que, a medida que se abra la doble hélice se encontrará con el extremo 3´ de la cadena patrón,

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pudiendo así incorporar el nucleótido correspondiente. En cambio, la otra ADN polimerasa se encontrará, cuando la apertura de la doble hélice avance, con el extremo 5’ de la cadena patrón, por lo cual será necesario incorporar otro cebador de ARN para poder continuar la síntesis. En resumen: cuando la cadena patrón presente la dirección 3´a 5´, la síntesis se realizará en forma Continua. Por el contrario, cuando la cadena patrón . presente la dirección 5´a 3´, la síntesis se realizará en forma Discontinua.

Una de las consecuencias de la síntesis Discontinua es que quedarán pequeños fragmentos de ADN, de unos 100 a 200 pb, intercalados con los cebadores. A estas porciones de ADN se los denomina Fragmentos de Okazaki, en honor al científico que los describió por primera vez. En el caso de la cadena conductora (la que se polimeriza en forma continua) es necesario la presencia de un solo Cebador, en cambio, en la cadena retardada (la que se polimeriza en forma discontinua) se necesita más de un Primer. Luego de terminada la síntesis de ambas cadenas, los Cebadores son removidos por una enzima y la ADN polimerasa agrega los nucleótidos faltantes. La enzima denominada Ligasa, se encarga de unir ambos extremos del ADN.

Figura N° 5: Proceso de Replicación del ADN. Obsérvese la Horquilla de Replicación en la cual se encuentran actuando las dos ADN polimerasas. La cadena con dirección 3´a 5´ se replica en forma continua y la de dirección opuesta lo hace en forma discontinua. La Primasa sintetiza el Cebador. La Topoisomerasa actúa en forma adelantada a la Horquilla de Replicación, disminuyendo el superenrollamiento positivo.

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EnergéticadelaReplicación: Ya hemos mencionado que las unidades estructurales utilizadas en este proceso son los desoxirribonucleótidos. También se dijo que los mismos debían encontrarse trifosfatados para poder ser utilizados por la ADN polimerasa. Es así como se utilizarán Desoxiadenina trifosfato (dATP), Desoxiguanina trifosfato (dGTP), Desoxicitosina trifosfato (dCTP) y Desoxitimina trifosfato (dTTP). Antes de incorporar el nucleótido a la cadena patrón, la ADN polimerasa escinde dos de los tres grupos fosfato de los mismos, quedando así monofosfatados y liberándose por cada uno un PPi. Esta ruptura de los enlaces de alta energía que mantenía unidos a los P libera energía, que es utilizada para impulsar las reacciones catalizadas por la ADN polimerasa. ReplicaciónenCélulasProcariotasyEucariotas: La gran mayoría de la información con la que contamos, en materia de la replicación del ADN, se obtuvo a partir de investigaciones realizadas en organismos Procariotas. Sin embargo, no hay diferencias sustanciales entre ambos procesos. La principal diferencia radica en que las células Procariotas replican el ADN en forma desnuda, puesto que en las células Eucariotas el ADN se encuentra es estado de Cromatina. Esta Cromatina esta básicamente formada por ADN y proteínas básicas denominadas Histonas. Como veremos más adelante, las Histonas se unen al ADN y ayudan al empaquetamiento del mismo. Las proteínas nucleares frenan el accionar de la ADN polimerasa, por lo tanto, la velocidad de replicación en las células Eucariotas es diez veces menor que en las células Procariotas. Basándose en esto, también es posible explicar la diferencia entre la longitud de los Fragmentos de Okazaki. En las células Procariotas, los segmentos de Okazaki poseen una longitud de 1000 a 2000 pb en cambio, en las células Eucariotas, los Fragmentos adquieren longitudes de apenas 100 a 200 pb. Una de las explicaciones posibles es la disposición de las histonas a lo largo de la molécula de ADN, esta longitud de 200 pb coincide con los tramos de ADN que quedan desprovistos de mencionadas proteínas. Figura N° 6: Replicación del ADN. La figura muestra el proceso por el cual se inicia la burbuja de replicación. A) La replicación se inicia en una secuencia de 300 pb, que indican el origen de la misma. B) La doble hélice se abre, conformando la burbuja de Replicación, la Primasa sintetiza el Cebador. C) Una vez sintetizado el cebador, la ADN polimerasa comienza a sintetizar la nueva cadena de ADN. D) Se originan dos Horquillas de replicación completas, una de las cuales se desplaza hacia la izquierda con la cadena continua en la parte superior y la retrasada en la parte inferior, y la otra hacia la derecha, con la cadena continua en la parte inferior y la cadena retrasada en la parte superior.